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Biology

कोशिकीय Conjugating शैवाल की एक क्लोनिंग संस्कृति की स्थापना

Published: July 14, 2018 doi: 10.3791/57761
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Department of Chemical and Biological Sciences, Faculty of Science, Japan Women's University, 2Department of Botany, Graduate School of Science, Kyoto University, 3Katsumi Ota Translation Office, 4Wetlands International Japan

Summary

इस अनुच्छेद में, हम एक प्राकृतिक क्षेत्र साइट से एकत्र कोशिकीय conjugating मनोरथ प्रजातियों के क्लोनिक संस्कृतियों की स्थापना का प्रदर्शन ।

Abstract

यह शरीर विज्ञान, आनुवंशिकी, वर्गीकरण, और सूक्ष्म जीव विज्ञान के रूप में विभिंन विषयों, के अध्ययन में उपयोग के लिए सूक्ष्म शैवाल की क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, यह अत्यंत के लिए तकनीक विकसित करने के लिए क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना महत्वपूर्ण है । इस अनुच्छेद में, हम एक conjugating alga की क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना का प्रदर्शन । मैदान से पानी के नमूने एकत्र किए जाते हैं । बाद में, कोशिकाओं को एक गिलास केशिका पिपेट, मीडिया में रखा का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, और एक क्लोनल संस्कृति पैदा करने के लिए उपयुक्त शर्तों के तहत हो ।

Introduction

Conjugating शैवाल (आदेश Zygnematales के), भी conjugatophytes के रूप में जाना जाता है, भूमि1,2पौधों के तत्काल पूर्वजों के निकटतम रहने वाले रिश्तेदारों के रूप में एक महत्वपूर्ण वंशावली स्थिति पर कब्जा । शैवाल की स्थापना की क्लोनिक संस्कृतियों वर्गीकरण, शारीरिक, और आनुवंशिक अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए पिछले वर्षों में नेतृत्व किया है । एक प्राकृतिक क्षेत्र से सूक्ष्मजीवों के अलगाव की तकनीक एक लंबी परंपरा3,4है । हाल के वर्षों में, स्वचालित अलगाव प्रवाह cytometry का उपयोग कर तकनीक भी स्थापित किया गया है5। एक क्लोन संस्कृति की स्थापना के लिए एक एकल कोशिका प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल सबसे आम तरीका एकल सेल अलगाव एक ग्लास केशिका पिपेट6का उपयोग कर रहा है । इस पारंपरिक विधि कौशल और एक सटीक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की आवश्यकता है ।

इस अनुच्छेद में, हम क्षेत्र के नमूनों से शैवाल के नमूने और कोशिकीय conjugating शैवाल की क्लोनिंग संस्कृतियों की स्थापना का प्रदर्शन, जैसे Closterium प्रजातियों, एक ग्लास केशिका पिपेट का उपयोग कर । एक पानी वनस्पति कोशिकाओं से युक्त नमूना एक क्षेत्र साइट से एकत्र की है (जैसे, एक झील, तालाब, या धान क्षेत्र) । कोशिकाओं को एक ग्लास केशिका पिपेट का उपयोग करके पानी के नमूने से अलग कर रहे है और फिर धोया । कोशिकाओं एक परीक्षण ट्यूब में एक 16-एच प्रकाश के तहत 24 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन पूरक मध्यम (सीए माध्यम) से युक्त कर रहे हैं: 8-h अंधेरे शासन । इस विधि भी अंय सूक्ष्म शैवाल क्लोनिंग संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए अलग करने के लिए उपयुक्त है ।

Protocol

1. एक पानी के नमूने के शैवाल युक्त संग्रह

नोट: कोशिकीय conjugatophytes झीलों, दलदल, और धान के खेतों के रूप में स्थिर मीठे पानी के क्षेत्रों में हो जाना । एक शैवाल युक्त पानी के नमूने एक संस्कृति तनाव का उत्पादन करने के लिए इन वातावरणों में से एक से एकत्र किया जाता है । प्रक्रिया शुरू करने से पहले निंनलिखित मदों की जरूरत है: एक प्लवक शुद्ध, एक डिस्पोजेबल पिपेट, और एक बोतल या पानी के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक ५० मिलीलीटर ट्यूब ।

  1. एक झील के वातावरण में एक प्लवक शुद्ध का उपयोग करने के लिए पानी से शैवाल इकट्ठा । एक उपयुक्त नेट का प्रयोग करें, उद्देश्य के आधार पर ।
    नोट: नेट का ऊपरी हिस्सा पानी से पारगंय है । नेट द्वारा पकड़ा शैवाल प्लवक नेट के नीचे कंटेनर में केंद्रित कर रहे हैं । एक मोटे जाल छोटे शैवाल के माध्यम से पारित करने की अनुमति देता है । एक ठीक जाल आसानी से भरा हो जाता है ।
  2. पानी (लगभग ५० मिलीलीटर) को ५० एमएल ट्यूब या १०० मिलीलीटर प्लास्टिक की बोतल में ट्रांसफर करें । प्रयोगशाला में केंद्रित पानी के नमूने लाओ ।
  3. कोशिकीय conjugatophytes भी दलदल या धान के खेतों में उगते हैं । इन उथले पानी के क्षेत्रों में, शैवाल युक्त पानी के नमूने सीधे एक ड्रॉपर के साथ नमूना हो सकता है । फिर, पानी (30-50 एमएल) को ५० एमएल ट्यूब या ५० मिलीलीटर प्लास्टिक की बोतल में ट्रांसफर करें ।
    नोट: पानी को ध्यान से मिट्टी की सतह के ऊपर नमूना लिया जाता है ताकि नमूने में कोई मिट्टी न हो ।

2. शैवाल की पुष्टि

नोट: निम्नलिखित मदों की आवश्यकता है: एक loupe या पोर्टेबल माइक्रोस्कोप और अवलोकन के लिए एक ६० mm डिश.

  1. यह डिस्पोजेबल पिपेट में है, जबकि नमूने में शैवाल की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, सीधे नमूने का निरीक्षण करने के लिए loupe का उपयोग करें ।
    नोट: लंबाई में के बारे में ४००-१,००० µm के बड़े कोशिकाओं (जैसे, Closterium ehrenbergii) आसानी से इस विधि का उपयोग कर मनाया जा सकता है ।
  2. पोर्टेबल माइक्रोस्कोप के तहत शैवाल की पुष्टि करने के लिए, एक प्लास्टिक प्रयोगशाला डिश में पानी के नमूने डालना ।
    1. ६० mm पेट्री डिश के ऊपरी आधे (ढक्कन) के भीतरी भाग पर नमूना (के बारे में 3 मिलीलीटर) रखो, तो निचले आधे जगह, उसके नीचे ढक्कन के भीतरी भाग का सामना करना पड़ भाग के साथ, शीर्ष पर ।
      नोट: इस विधि नमूना ले जाने से रखता है और अवलोकन आसान बनाता है ।

3. अलगाव के लिए एक पाश्चर पिपेट से एक ग्लास केशिका पिपेट की तैयारी

नोट: प्रक्रिया शुरू करने से पहले, निंनलिखित मदों की जरूरत है: निष्फल पाश्चर पिपेट, पाश्चर पिपेट, दस्ताने, एक रबर बल्ब, एक आत्मा दीपक, आत्मा दीपक के लिए मेथनॉल, एक लाइटर, संदंश, कांच के लिए एक कचरा कर सकते है के लिए एक रैक, और एक साफ कमरे या लामिना फ्लो हूड (यदि आवश्यक हो तो) ।

  1. एक शराब बर्नर प्रज्वलित ।
    1. अलगाव के लिए एक अच्छा गिलास केशिका पिपेट उत्पादन करने के लिए, सुनिश्चित करें कि लौ चंचल नहीं है । लौ पैनापन और अपनी नोक पर पाश्चर पिपेट पिघला ।
  2. गर्मी एक बाँझ गिलास पाश्चर पिपेट लौ पर, हाथ से रबर बल्ब की ओर और संदंश का उपयोग करके टिप पक्ष पर समर्थित.
  3. लौ बंद पिपेट पाश्चर ले लो और यह खिंचाव ।
    1. जब गिलास पिघल रहा हो तो जल्दी से पाश्चर पिपेट को लौ से निकाल लें और फिर खींचो ।
      नोट: इस प्रयोग में पाश्चर पिपेट को 15-20 सेमी तक बढ़ाया गया था । सुनिश्चित करें कि पिपेट से लौ खींच के दौरान बंद है ।
  4. कांच केशिका पिपेट के टिप को तोड़ने के लिए उचित लंबाई । क्योंकि झुककर भाग बेहतरीन होता है, यह टिप के लिए आदर्श होता है ।
    नोट: इस अध्ययन में 5-10 सेमी की टिप के साथ एक ग्लास केशिका पिपेट तैयार किया गया था ।
    1. इसे पिघलने के बाद केशिका को त्यागें, और पुष्टि करें कि लौ बाहर रखा है ।
  5. कांच केशिका पिपेट से जारी बुलबुले टिप खोलने के आकार का संकेत मिलता है । कक्ष के पृथक होने के लिए उचित आकार का चयन करें । बुलबुले के बारे में 1 मिमी 10-20 µm की कोशिका चौड़ाई के साथ, Closterium प्रजातियों के अलगाव के लिए उचित है ।

4. एक गिलास केशिका पिपेट द्वारा एकल सेल अलगाव

नोट: निम्नलिखित मदों शुरू करने से पहले की जरूरत है: एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप, घड़ी चश्मा, एक प्लास्टिक पकवान, और बाँझ पिरोया परीक्षण ट्यूब सीए मध्यम (तालिका 1) या वातानुकूलित सीए मध्यम7युक्त.

  1. कुछ घड़ी चश्मा तैयार (22 मिमी व्यास में और 1 मिमी गहराई में), प्रत्येक बाँझ सीए मध्यम की 1 मिलीलीटर युक्त.
  2. क्षेत्र में एकत्र पानी के नमूने से एक लक्ष्य सेल को अलग ।
    1. पानी के नमूने (के बारे में 30-40 एमएल) प्लास्टिक डिश में लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त डालो ।
    2. एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्लास्टिक डिश में नमूना देख जबकि, कांच केशिका पिपेट का उपयोग कर एकल कोशिकाओं उठाओ ।
    3. कोशिका के निकट के कांच केशिका पिपेट को केशिका क्रिया द्वारा सेल की आकांक्षा को सुकर बनाने के लिए लाएं ।
  3. एक घड़ी गिलास बाँझ सीए मध्यम (आंकड़ा 1a) के 1 मिलीलीटर युक्त में कोशिकाओं स्थानांतरण ।
  4. कोशिकाओं को फिर से बाँझ सीए मध्यम से एक नया ग्लास केशिका पिपेट का उपयोग कर उठाओ और यह एक दूसरी घड़ी बाँझ सीए मध्यम (आंकड़ा 1b) युक्त गिलास को हस्तांतरण ।
    नोट: यह प्रक्रिया एक एकल कक्ष स्पॉट प्लेट (चित्रा 1c) में अलग है जब तक दोहराया है ।
  5. एक नया ग्लास केशिका पिपेट का उपयोग कर एकल सेल उठाओ, और अंत में यह एक परीक्षण ट्यूब सीए मध्यम या वातानुकूलित सीए मध्यम (चित्रा 1 डी) के 14 मिलीलीटर युक्त करने के लिए स्थानांतरण । एक 16-एच प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन: 8-एच 2 सप्ताह के लिए अंधेरे चक्र ।
    नोट: कोशिका प्रसार के लिए अज्ञात फैक्टर (ओं), जो आसपास के वातावरण में कोशिकाओं को बढ़ने से स्रावित कर रहे हैं, वातानुकूलित माध्यम में शामिल करने के लिए सेल डिवीजन4की सुविधा है । यदि कोई क्लोनिंग कल्चर स्थापित हो तो कल्चरल मीडियम4से वातानुकूलित सीए मीडियम तैयार करें । संस्कृति को हरा-भरा अगर सफल हो जाएगा ।

Representative Results

५० मिलीलीटर की एक पानी का नमूना (Inba1) झील Inba में एक नमूना बिंदु से एकत्र किया गया था-numa (पीएच ८.१, २४.७ ° c; 35 ° 44 ′ 30.2 ″ N 140 ° 12 ′ 08.2 ″ E) पर Sakura-शि, चिबा, जापान, पर जून 25, २०१६ । पानी का नमूना 4-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया था । संग्रह के बाद अगले दिन Closterium एसपी का एक नमूना सामने आया । वनस्पति कोशिकाओं से युक्त पानी के नमूने से अलग किया गया था । समान आकृति विज्ञान की पंद्रह वनस्पति कोशिकाओं (Inba1-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, और-15) नमूने से अलग किया गया और फिर पिपेट धुलाई विधि का उपयोग कर धोया. पंद्रह पृथक एकल कोशिकाओं स्वतंत्र परीक्षण वातानुकूलित सीए माध्यम के 15 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में संस्कृति थे । मशीन के 2 सप्ताह के बाद, सेल प्रसार 9 टेस्ट ट्यूबों में मनाया गया था [Inba1-1,-3,-4,-5 (चित्रा 2a),-6,-9,-10,-12 (चित्रा 2 बी), और-13; तालिका 2] । नौ क्लोनिंग संस्कृतियों Inba1 नमूना अलग (चित्रा 3) से स्थापित किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1 : एकल-सेल अलगाव का प्रवाह । (क) मूल पानी के नमूने से एकल लक्ष्य मनोरथ कोशिका को पहली घड़ी काँच में बाँझ माध्यम से हस्तांतरित करना. (ख, ग) सेल को फिर से धोने के लिए अगली घड़ी शीशे पर ट्रांसफर करें । यह कार्यविधि तब तक दोहराई जानी चाहिए जब तक कि मध्यम में लक्ष्य से कोई अंय कक्ष/ तीन घड़ी चश्मे एक उदाहरण के रूप में यहां चित्र में दिखाए जाते हैं । (घ) अंतत:, विकास के लिए उचित माध्यम की एक टेस्ट ट्यूब के लिए धोया सेल स्थानांतरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : वनस्पति कोशिकाओं की तस्वीरें Closterium एसपी ने की । (a) Inba1-5 और (b) Inba1-12 यहां दर्शाए गए हैं । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : Inba1 नमूना से एक क्लोनिंग संस्कृति की स्थापना । परीक्षण 2 सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत ट्यूबों नीचे से फोटो खिंचवाने थे । तारांकन कक्ष प्रसार इंगित करता है । स्केल बार = 2 cm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

मीडिया का नाम संदर्भ टिप्पणियाँ
Ca Ichimura और वातानाबे12 कै (नं३)२· 4H२O 2 मिलीग्राम
KNO३ 10 मिलीग्राम
एनएच4नं3 5 मिलीग्राम
β – ना2glycerophosphate · 5H2हे 3 मिलीग्राम
MgSO4· 7H2हे 2 मिलीग्राम
विटामिन बी 12 ०.०१ μg
बायोटिन ०.०१ μg
Thiamine एचसीएल 1 μg
PIV धातुओं ०.१ एमएल
Fe (as EDTA; 1:1 दाढ़) ०.१ एमएल
HEPES ४० मिलीग्राम
१०० मिलीलीटर बनाने के लिए पानी जोड़ें
पीएच NaOH के साथ ७.२ को समायोजित करें
पी चतुर्थ धातु Provasoli और Pintner13 ना2EDTA · 2H2हे १०० मिलीग्राम
FeCl3· 6H2हे १९.६ मिलीग्राम
MnCl2· 4H२हे ३.६ मिलीग्राम
ZnCl2* १.०४ मिलीग्राम
CoCl2· 6H2हे ०.४ मिलीग्राम
ना2मू4· 2H2हे ०.२५ मिलीग्राम
१०० मिलीलीटर बनाने के लिए पानी जोड़ें
Fe (as EDTA; 1:1 दाढ़) Provasoli14 Fe (NH4)2(सू4)2· 6H2O, ७०.२ मिलीग्राम
Na2EDTA · 2H2O, ६६ मिलीग्राम
१०० मिलीलीटर बनाने के लिए पानी जोड़ें
वातानुकूलित सीए मीडियम अबे एट अल.7 14-20 दिनों के लिए ताजा सीए माध्यम में कोशिकाओं की मशीन । गुणात्मक फ़िल्टर कागज का उपयोग कर निस्पंदन द्वारा संस्कृतिपूर्ण माध्यम लीजिए और autoclaving द्वारा फ़िल्टर्ड माध्यम निष्फल (१२१ ° c 15 मिनट के लिए) ।
* NIES, १.०४ मिलीग्राम ZnCl2 में २.२ मिलीग्राम ZnSO4· 7H2ओ की जगह है ।

तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त मीडिया के योगों ।

पानी के सैंपल कक्ष का नाम संस्कृति के बाद की स्थिति तनाव का नाम
Inba1 -1 कक्ष proliferated Inba1-1
-2 नहीं बदला
-3 कक्ष proliferated inba1-3
-4 कक्ष proliferated inba1-4
-5 कक्ष proliferated inba1-5
-6 कक्ष proliferated inba1-6
-7 नहीं बदला
-8 नहीं बदला
-9 कक्ष proliferated inba1-9
-10 कक्ष proliferated inba1-10
-11 नहीं बदला
-12 कक्ष proliferated inba1-12
-13 कक्ष proliferated inba1-13
-14 नहीं बदला
-15 नहीं बदला

तालिका 2: आइसोलेशन परीक्षण सारांश ।

Discussion

वर्तमान विधि का प्रयोग, Closterium सपा के 9 क्लोनिंग संस्कृति उपभेदों । 15 पानी के नमूने से पृथक कोशिकाओं से स्थापित किए गए (Inba1), एक ६०% सफलता दर का प्रतिनिधित्व । प्रजातियों की पहचान भविष्य में रूपात्मक अवलोकन के साथ-साथ, आणविक वंशावली विश्लेषण के रूप में डीएनए विश्लेषण के द्वारा किया जाएगा8.

वर्तमान विधि में पानी के नमूने की ताजगी सफलता दर के लिए महत्वपूर्ण है । क्षेत्र संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके पानी के नमूनों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए बेहतर है । हालांकि Closterium प्रजातियों की कोशिकाओं (जैसे, सी ehrenbergii, सी peracerosum-strigosum-littorale परिसर) के बारे में 7 डी के लिए पानी के नमूने में बनाए रखा जा सकता है यह 4-8 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से, कोशिकाओं के अलगाव वांछनीय है संग्रह के दिन या अगले दिन । यह भी लक्ष्य कोशिकाओं के अलावा अंय किसी भी दूषित पदार्थों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है, तो धोने पुनरावृत्ति की संख्या में वृद्धि (यानी, > 3x) मिट्टी और कोशिकाओं में सूक्ष्मजीवों द्वारा संस्कृतियों के एक संदूषण को रोकने सकता है ।

इस तकनीक की एक सीमा है कि इस प्रोटोकॉल (ca या वातानुकूलित सीए माध्यम) में इस्तेमाल किया संस्कृति मीडिया हमेशा सभी conjugating शैवाल के लिए उपयुक्त नहीं हैं । कुछ मामलों में, यह एक और मध्यम, साथ ही विभिंन प्रकाश और तापमान की स्थिति का उपयोग करने पर विचार करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसके अलावा, के रूप में यह साबित करना है कि क्या एक संस्कृति एक एकल सेल से हो गया है मुश्किल है, यह सही केवल 1 सेल जब एक परीक्षण ट्यूब के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, स्थानांतरण एक नया ग्लास केशिका पिपेट हर बार के साथ किया जाना चाहिए ।

इस पिपेट धुलाई विधि के साथ एक क्लोनिंग संस्कृति की स्थापना एक शास्त्रीय/मानक विधि है और एक अध्ययन के लिए वांछित कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका है । कई अध्ययनों में प्रयुक्त conjugating शैवाल की क्लोनिंग संस्कृतियों8,9,10,11 वर्तमान विधि का उपयोग कर स्थापित किया गया था । यह एक क्लोनिंग संस्कृति के बिना conjugating शैवाल का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, हाल के वर्षों में, डी नोवो पूरे जीनोम दृश्यों को प्राप्त करने के लिए आसान हो गया (उदाहरणके लिए, नोकर ट्विटर sequencer का उपयोग करके), और क्लोन संस्कृतियों की स्थापना आगे डी नोवो अनुक्रमण की सुविधा होगी । दूसरे शब्दों में, इस विधि से इन शैवालों के भविष्य के अध्ययन में पहला कदम उनकी जैव विविधता को बेहतर ढंग से समझना है.

आदेश में एक स्थिर संस्कृति तनाव स्थापित करने के लिए, यह सही प्रोटोकॉल के भीतर कुछ महत्वपूर्ण कदम प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । सबसे महत्वपूर्ण कदम एक इष्टतम एपर्चर के साथ एक गिलास केशिका पिपेट की तैयारी केवल एक ही सेल के पारित होने की अनुमति है । कांच केशिका पिपेट के एपर्चर ब्याज की कोशिका के छोटे अक्ष लंबाई से थोड़ा अधिक होना चाहिए । इष्टतम कांच केशिका पिपेट केशिका क्रिया द्वारा एक एकल कोशिका महाप्राण कर सकते हैं । हालांकि, यदि एपर्चर का व्यास बहुत बड़ा है, केशिका भी contaminant सामग्री या यहां तक कि (एक) अंय जीव (ओं), लक्ष्य सेल के अलावा में आकर्षित करेगा ।

एक इष्टतम एपर्चर के साथ एक गिलास केशिका पिपेट प्राप्त करने के लिए, निम्न बिंदुओं पर ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । कांच केशिका पिपेट ताप जब सबसे पहले, लौ के स्तंभ संकीर्ण होना चाहिए । अगला, जब पाश्चर पिपेट खींच, यह लौ से हटा दिया जाना है; अंयथा, पाश्चर पिपेट के एपर्चर गिर जाएगा ।

उपकरण और इस प्रोटोकॉल में दिखाया कंटेनरों बुनियादी रहे है और संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, बहु-अच्छी तरह से प्लेटें के बजाय एक अच्छी तरह से देखने के चश्मे का उपयोग करके, सेल धोने और अधिक कुशल बनाया जा सकता है । इसके अलावा, कंटेनरों अंय समान लोगों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है । अंतिम चरण में संस्कृति माध्यम के लिए एक एकल कोशिका स्थानांतरित करके, एक क्लोनल संस्कृति स्थापित किया जा सकता है ।

एक निष्फल कंटेनर की तैयारी और एक डाकू में काम कर axenic (दूषित) उपभेदों स्थापित करेगा । संक्रमण को रोकने के लिए, यह ताजा aliquots 3x से अधिक के साथ धुलाई कदम दोहराने के लिए आवश्यक है । कई बार, जीवाणु15एंटीबायोटिक्स जोड़कर भी निष्फल हो जाते हैं ।

इस विधि desmid (Zygnematales) अलगाव पर ध्यान केंद्रित है, लेकिन कांच केशिका पिपेट एपर्चर के आकार को बदलकर, यह अलग आकार प्लवक के अलगाव के लिए लागू किया जा सकता है ।

Acknowledgments

हम Hisayoshi Nozaki (टोक्यो विश्वविद्यालय), Takashi Nakada (कईयो विश्वविद्यालय), युका Marukawa Hashimoto (जापान महिला विश्वविद्यालय), और हिरोयुकी Sekimoto (जापान महिला विश्वविद्यालय) का धन्यवाद करते हैं । हम उनकी टिप्पणियों के लिए समीक्षकों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह अध्ययन विज्ञान, जापान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी से वैज्ञानिक अनुसंधान (No. २६४४०२२३ और 15H04413) के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था, और युकी Tsuchikane के लिए नई प्रौद्योगिकी विकास फाउंडेशन से अनुदान द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sampling
Plankton net RIGO, Japan N-NO380T Mesh size: 32 µm
Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) Nikon, Japan JAN: 4960759 206725 Magnification: 20×
Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan 1985-20 Magnification: 20×
Spuit EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan Sterile spuit No.4
50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) Labcon, USA 3181-345-008
Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) AS ONE Corporation, Japan 1-7403-01
60 mm dish Asahi glass Co. Ltd., Japan 1010-060  For observation of algae.  60 mm/non-treated dish
Preparation of a micropipette
Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) Fisher Scientific, USA 13-678-8B 7 × 225 mm
Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) AS ONE Corporation, Japan 5-5669-01 10 × 40 mm
Stainless forceps AS ONE Corporation, Japan PT-09 110 mm
Single-cell isolation
Watch glass (Blood reaction board) Sekiya Rika Co., Ltd, Japan F14-155-030 to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth
Threaded test tubes  Fujimotorika, Co., Ltd, Japan XX142 18 Ø × 170 mm
Inverted light microscope Olympus, Tokyo, Japan CKX41N for isolation of algae.
Plastic dish Asahi glass Co. Ltd., Japan SH90-15E   90 × 15 mm

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References

  1. Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
  2. Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
  3. Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
  4. Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
  5. Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
  6. Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
  7. Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
  8. Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
  9. Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
  10. Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
  11. Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
  12. Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
  13. Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
  14. Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
  15. Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).

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जीव विज्ञान अंक १३७ शैवाल अलगाव पिपेट धुलाई विधि क्लोनिंग संस्कृति conjugating शैवाल Closterium क्षेत्र नमूना सूक्ष्म शैवाल unialgal उपभेदों Charophyceae desmid
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Tsuchikane, Y., Hamaji, T., Ota, K., Kato, S. Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae. J. Vis. Exp. (137), e57761, doi:10.3791/57761 (2018).

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