Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte

doi: 10.3791/57764 Published: June 30, 2018

Summary

Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Abstract

Het gebruik van lymfkliertest modellen om na te bootsen menselijke nierziekte wordt steeds gewoner. Ons onderzoek is gericht op de beoordeling van de functie van de glomerulaire diabetische nefropathie en podocyte-specifieke VEGF-A knock-out muizen; Dit protocol beschrijft daarom de volledige nier werk-up gebruikt in ons lab ter beoordeling van deze Muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. In vergelijking met alternatieve methoden gepresenteerd in de literatuur te beoordelen glomerulaire functie, maakt het gebruik van de methode beschreven in dit document het glomerulaire fenotype volledig worden geëvalueerd vanuit meerdere invalshoeken. Met behulp van deze methode, kan de onderzoeker het fenotype van de nier van het model te bepalen en beoordelen van het mechanisme over de vraag waarom het fenotype ontwikkelt. Deze vitale informatie over het mechanisme van de ziekte is vereist bij het onderzoeken van potentiële therapeutische mogelijkheden in deze modellen. De methoden toestaan voor gedetailleerde functionele beoordeling van de barrière van de glomerulaire filtratie door meting van de urine albumine Kreatinine ratio en individuele glomerulaire waterdoorlaatbaarheid, evenals zowel structurele als Ultra structurele onderzoek met behulp van de periodieke Zure Schiff Vlek- en elektronenmicroscopie. Bovendien maakt een analyse van de genen dysregulated op het niveau van mRNA en eiwit mechanistische analyse van glomerulaire functie. Dit protocol beschrijft het generieke maar flexibele methoden die kunnen worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Introduction

Het gebruik van lymfkliertest modellen om na te bootsen menselijke nierziekte wordt steeds gewoner. Dergelijke lymfkliertest modellen bevatten spontane modellen zoals spontaan hypertensieve ratten (SHR)1, streptozotocin (STZ)-geïnduceerde diabetische ratten en muizen2, en de db/db type II diabetesmuizen3, genetisch gemanipuleerde modellen zoals primaire podocyte-specifieke focale segmentale glomerulaire sclerose (FSGS)4, de podocyte-specifieke vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF-A) knock-out (VEGF-A KO) model5, modellen en syndroom van Alport6modellen en verworven modellen zoals de 5/6 Nefrectomie7 en de unilaterale ureterale obstakel (UUO)-model8. Om te beoordelen de verschillende aspecten van de glomerulaire functie in deze modellen, zijn verschillende technieken beschikbaar. Het doel van deze paper methode is om aan te tonen van een uitgebreide werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van nierziekte teneinde volledig glomerulaire functie.

De grondgedachte achter het gebruik van deze methode is dat hierdoor het glomerulaire fenotype volledig worden geëvalueerd vanuit meerdere invalshoeken. Dit omvat de beoordeling van de glomerulaire permeabiliteit, zowel aan proteïne en te water, de glomerulaire structurele afwijkingen, veranderingen in de expressie/splitsen van mRNAs en eiwitten essentieel voor normale glomerulaire functie. Met behulp van deze methode, is de onderzoeker kunnen bepalen van het fenotype van de nier van het model en het beoordelen van het mechanisme over de vraag waarom het fenotype ontwikkelt. Dit is essentiële informatie over het mechanisme van ziekte, die vereist is bij het onderzoeken van potentiële therapeutische mogelijkheden in deze modellen.

In de literatuur is het een gemeenschappelijk optreden te worden gepresenteerd met een muismodel van glomerulaire ziekte waar het fenotype wordt bepaald door een verhoogd niveau van eiwit in de urine. Er is echter bewijs om te suggereren dat een enkele methode om te bepalen van de glomerulaire functie niet altijd effectief is; meten van de urine albumine uitscheiding tarief of de urine albumine Kreatinine ratio (uACR) biedt alleen informatie op totale nierfunctie, en niet van de afzonderlijke glomeruli. Eerdere studies hebben aangetoond dat de permeabiliteit in verschillende glomeruli van de dezelfde nier5,9,10 variëren kan. Bovendien, is beoordeling van de permeabiliteit van individuele glomeruli een gevoeliger manier beoordelen glomerulaire functie; de techniek van het meten van de individuele glomerulaire waterdoorlaatbaarheid (LpA / Vik) gebleken meer gevoelig voor veranderingen in het glomerulaire functie dan het meten van de uACR9. Deze test is het nuttig in muismodellen die resistent zijn tegen Proteïnurie, zoals die op een achtergrond van c57BL/6-11. Het voordeel van de huidige methode papier is dat het onderzoekt zowel de totale renale permeabiliteit aan albumine, alsmede de individuele glomerulaire permeabiliteit voor water.

Onderzoek van de glomerulaire structurele afwijkingen wordt vaak beoordeeld door een batterij van vlekken zoals periodieke Zure Schiff (BK), trichrome, en zilveren vlekken. Deze kunnen een opgeleide renale patholoog te beoordelen van het niveau van nierziekte via een methode van scoren. Hoewel alle goede methoden, veranderingen in het glomerulaire macro-structuur niet altijd worden nageleefd modellen acute nier schade12. Deze methode stelt voor dat de glomerulaire ultra-structuur naast het uitvoeren van de technieken van de renale histologie hierboven beschreven, ook moet worden beoordeeld via elektronenmicroscopie (EM). Een gekleurd glomerulus kunt kijken relatief normale onder een regelmatige lichte Microscoop; echter, na beoordeling met EM, kleine veranderingen in het glomerulaire kelder membraan (GBM) breedte, podocyte voet proces geweest, endothelial fenestrations, en de sub-podocyte ruimte dekking wordt geanalyseerd. Het is daarom essentieel dat zowel de glomerulaire ultra-micro-structuur en wordt beoordeeld om te bepalen van het mechanisme van de glomerulaire dysfunctie.

Naast de beoordeling van glomerulaire structurele afwijkingen, moeten veranderingen in mRNA en eiwit expressie en splicing, evenals eiwit activering (b.v., fosforylatie) worden onderzocht om te verder het ophelderen van de mechanismen van de glomerulaire ziekte. Wanneer we kijken naar glomerulaire ziekte, of, bijvoorbeeld wanneer KO/over-expressing een gen concreet in glomerulaire cellen, zoals de podocyte-specifieke VEGF-A KO muis5, is het belangrijk dat de eiwitten en mRNA wijzigingen alleen binnen worden onderzocht de glomerulaire cellen, en niet de hele nier. Dit protocol beschrijft een methode waarin de glomeruli zijn geïsoleerd van de muis nier cortex, en vervolgens het eiwit/RNA worden geïsoleerd. Hierdoor kan specifieke analyse van het eiwit/mRNA disregulatie in de glomeruli van het model van de ziekte.

Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Britse wetgeving en de goedkeuring van de lokale ethisch comité. Dierlijke studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Bristol onderzoek ethisch comité.

1. urine albumine Kreatinine Ratio (uACR)

Opmerking: De uACR wordt gebruikt ter beoordeling van de permeabiliteit van de GFB aan albumine. De aanwezigheid van eiwit in de urine geeft verhoogde permeabiliteit over de GFB, die is genormaliseerd naar creatinine aan besturingselement voor variaties in het debiet van de urine. Albuminurie is een gemeenschappelijk marker voor chronische nierziekte.

  1. Verzamelen van urine op de experimentele basislijn en op gezette tijden (eenmaal per aan zodra maandelijkse) tot het experimentele eindpunt.
  2. Muis metabole kooien met water en verrijking dieet instellen. Muizen (mannelijke, leeftijd 6-8 weken) in afzonderlijke kooien voor 6 h in een stille ruimte plaatsen.
  3. Terugkeer muizen naar reguliere huisvesting en verzamelen urine uit de lege kooien. Een minimum van 50 µL is vereist.
    Opmerking: Als de muis geen urine in de bepaalde tijd produceert, herhalen op een andere dag in een warmere kamer.
  4. Centrifugeer de urine bij 500 x g gedurende 10 min. Verzamel de urine en sediment te beoordelen podocyte verlies te behouden. Bewaar de urine bij-20 ° C op de korte termijn op dit punt.
  5. Verdun de urine in 1% bovien serumalbumine (BSA) in 1 x Tris gebufferde zoutoplossing (TBS pH 7.5) op een 1:500 met 1:10000 verdunning, afhankelijk van de ernst van de albuminurie.
    Opmerking: Het einde volume moet > 400 µL. optimaliseren om te bepalen van de juiste verdunning op elk moment richt.
  6. Kwantificeren van de concentratie van de urine albumine met behulp van een muis albumine enzym gekoppelde immunosorbent analyse (ELISA) per de instructies van de fabrikant.
    1. Kort jas de ELISA-plaat, die is geoptimaliseerd voor binding aan eiwitten, met 100 µL van de anti-muis albumine primair antilichaam (10 µg Fe/mL in 0,5 M carbonaat-bicarbonaat pH 9,6) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    2. De overtollige antilichaam Wash de putjes vijfmaal met 1 x TBS plus 0,05% Tween (pH 8,0), en voeg 200 µL van het blokkeren van de oplossing (1 x TBS met 1% BSA pH 8,0) 's nachts bij kamertemperatuur.
  7. Wassen plaat vijfmaal en voeg 100 µL van de normen (seriële verdunning: 2000 µg/mL tot 15.63 µg Fe/mL in 1 x TBS met 1% BSA, pH 8,0), de blanco, en de verwaterde monsters in drievoud. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, dan wassen plaat vijfmaal.
    1. Voeg 100 µL van HRP detectieantilichaam aan elk putje (10 ng/mL in 1xTBS met 1% BSA, pH 8,0) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    2. Wassen van de plaat vijfmaal en voeg 100 µL van enzym substraat oplossing aan elk putje. Laat de plaat in het donker ontwikkelen gedurende 15 minuten en stop de reactie door toevoeging van 100 µL van 0.18 M zwavelzuur (H2SO4).
      Let op: H2dus4 corrosief is.
  8. Bepaal de concentratie van de albumine van elk monster door het lezen van de plaat duikt met een extinctie van 450 nm. Gebruik de standaard curve te kwantificeren van de albumine aanwezig zijn in elk monster. Als de technische herhaalt een CV waarde meer dan 5% hebben, herhaalt u de bepaling voor deze monsters.
  9. U kunt ook beoordelen de concentratie van de urine albumine met behulp van elektroforese. Voeg toe 5 µL van 4 x eiwit monster laden buffer aan 15 µL van urine. Verwarm monsters tot 95 ° C gedurende 10 minuten en laadt vervolgens in een 4-12% Tris voorgegoten gel.
    1. De gel op 100 V en vlek 's nachts in Coomassie blue per fabrikant protocol worden uitgevoerd.
    2. Na de beeldvorming van de gel, door densitometrie te gebruiken om te beoordelen van albumine concentratie van de verandering van de vouw ten opzichte van controle.
      Opmerking: Indien geen banden worden waargenomen voor albumine wanneer verwacht, beoordeelt de eiwitconcentratie van de urine en regel het volume van de urine toegevoegd aan de gel.
  10. Het monster van het ruwe urine in dH2O op 1:1, 1:5 en 1:10 verdunnen.
    Opmerking: Het einde volume moet > 70 µL. optimaliseren om te bepalen van de juiste verdunning van elk monster.
  11. Kwantificeren van de concentratie van de urine creatinine met behulp van een chemische test per de instructies van de kit. Kort, laden 20 µL van creatinine normen, leeg, of verdunde urine aan een 96 goed plaat in drievoud.
  12. Bepaal de Kreatinine concentratie van elk monster door het lezen van de plaat duikt met een extinctie van 490 nm vóór en na de toevoeging van de zure oplossing (Let op, bijtende; aanraking met de huid vermijden).
    Opmerking: Het verschil tussen de waarden van de extinctie is recht evenredig met de Kreatinine concentratie in elk monster. Een standaard curve is de generatie van de normen. Als de technische herhaalt een CV waarde meer dan 5% hebben, herhaalt u de bepaling voor deze monsters.
  13. Het genereren van de uACR (µg/mg). Normaliseren van de gegevens op de waarde van de basislijn van elke muis voor grafische weergave.

2. de weefsels en bloed collectie

Opmerking: De nier- en glomerulaire weefsel kunnen worden gebruikt ter beoordeling van de structuurfondsen, eiwit en mRNA expressie markers van nierziekte. Het bloed kan worden gebruikt ter beoordeling van de markers van nierfunctie, zoals creatinine, die kan omhoog-geregeld bij nierziekte, die een vermindering van de capaciteit van de filtratie van de glomeruli aangeeft.

  1. Voorbereiding van de volgende oplossingen: verse 2,5% Glutaaraldehyde in 0,1 M natrium cacodylate (pH 7.3), 4% paraformaldehyde in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zoogdieren Ringer's oplossing (115 mM natriumchloride (NaCl), 10 mM Natriumacetaat (CH3COONa), 1.2 mM natriumfosfaat (nb2HPO4) 25 MM natriumbicarbonaat (NaHCO3), 1.2 mM magnesium-sulfaat (MgSO4), 1 mM calciumchloride (CaCl2), 5,5 mM D (+)-glucose, pH 7.4) met 1% BSA en 1 x PBS.
    Let op: 2,5% Glutaaraldehyde: overgevoeligheid, toxisch, irriterend; gebruik in een zuurkast kast. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, gebruik in een zuurkast kast. 4% PFA: fixeer, gebruik in de zuurkast kabinet
  2. Voorbereiding van de volgende materialen: Isofluraan, kleine ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)-gecoat bloed buizen, 23-25G naalden, 5 mL EDTA gecoat spuiten, 10 mL glazen flesjes, plastic flesjes van 10 mL, 0,5 mL plastic buizen, wegwerp weefsel mallen, droogijs, vloeibare N 2, chirurgische instrumenten van de muis, en optimale scherpe medium (OCT).
  3. Plaats de muis onder de diepe anesthesie, die wordt gecontroleerd door de muis wordt niet-reagerend aan een prik van de naald op de voetsteun, met behulp van een Isofluraan kamer, of gelijkwaardige routes van terminal anesthesie zoals injecteerbare verdoving agenten (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneaal [IP]; «««Avertin, 240 mg/kg IP), of kooldioxide (CO2) blootstelling (75% CO2/25% O2).
  4. Ruiming muis via cardiale lekke band in het linkerventrikel en verzamelen van zoveel bloed mogelijk. Overbrengen naar de bloed EDTA-gecoate buis voor maximaal 4 uur. Indien gewenst, kunnen muizen via cervicale dislocatie worden afgemaakt met zorgvuldigheid niet te scheuren van de halsslagader.
  5. Ontleden uit de nieren via de buik en wassen in ijs koud 1 x PBS.
  6. Onderzoeken van de corticale glomeruli, verwijderen van één pool van nier cortex en snijd in 1 mm3 stuks. Herhaal de zelfde techniek met weefsel van de medulla te onderzoeken de diep juxta-Wallenberg glomeruli. Plaats in 5 mL 2,5% Glutaaraldehyde oplossing in een flesje van glas EM. Bewaren bij 4 ° C.
    Let op: 2,5% Glutaaraldehyde oplossing: overgevoeligheid, toxisch, irriterend; gebruik in een zuurkast kast
    Opmerking: proces binnen 1 maand voor de beste resultaten.
  7. Voor histologie, verwijder het bovenste derde van een nier, om ervoor te zorgen dat zowel corticale als juxta-Wallenberg glomeruli zullen aanwezig zijn, en positiebepaling in 5 mL 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 24 h. overdracht tot 5 mL van 70% EtOH voor 24 uur voordat het inbedden in paraffine.
    Let op: 4% PFA: fixeer, gebruik in de zuurkast kabinet
  8. Voor immunofluorescentie, plaatst u een derde van de nier, om ervoor te zorgen dat zowel corticale als Wallenberg glomeruli zullen aanwezig zijn, in het weefsel schimmel en de vacht in oktober plaats op droog ijs om te bevriezen en opslaan bij-80 ° C.
  9. Voor eiwitten en RNA bevriezen plaats 3 x 2 mm3 stuks van nier cortex in 0,5 mL plastic buizen en module in vloeistof N2. Winkel bij-80 ° C. Voor langetermijnopslag weefsels voor RNA, plaatst u weefsel in 5 delen van RNA stabilisatie oplossing en opslaan bij-80 ° C.
  10. Voor het isoleren van de glomeruli, sneetje op de resterende nierweefsel en plaats in 5 mL van zoogdieren Ringer's oplossing met 1% BSA op ijs. Voorbereidingen treffen voor de glomeruli onmiddellijk zeef.

3. de plasma Kreatinine

Opmerking: De Plasma Kreatinine kan worden omhoog-geregeld bij nierziekte, die een vermindering van de capaciteit van de filtratie van de glomeruli aangeeft. Het bloed ureum stikstof (broodje) niveaus kunnen ook worden beoordeeld, hoewel het protocol wordt hier niet beschreven.

  1. Centrifugeer het bloedmonster bij 500 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
  2. Het verzamelen van het plasma, die kan worden opgeslagen bij-20 ° C op de korte termijn op dit punt.
  3. Kwantificeren van de plasma Kreatinine concentratie met behulp van een chemische creatinine assay per de instructies hierboven voor urine creatinine in protocol 1.11.
  4. Bepaal de Kreatinine concentratie van elk monster door het lezen van de plaat duikt met een extinctie van 490 nm vóór en na de toevoeging van de zure oplossing.
    Opmerking: Het verschil tussen de waarden van deze absorptie is recht evenredig met de Kreatinine concentratie in elk monster. Een standaard curve is de generatie van de normen. Als de technische herhaalt een CV waarde meer dan 5% hebben, herhaalt u de bepaling voor deze monsters.

4. isolatie van de Glomeruli

Opmerking: Glomeruli kunnen worden geïsoleerd om te kunnen beoordelen van de permeabiliteit van individuele glomeruli ex vivo, evenals de expressie van specifieke proteïne en mRNA markers van glomerulaire ziekte.

  1. Neem het nierweefsel geplaatst in zoogdieren Ringer's oplossing met 1% BSA en ontleden de glomeruli met behulp van een standaard zeven techniek13. Kort, stapelen de 70 µm (onder), 100 µm 125 µm, 175 µm, 250 µm en 425 µm (boven) zeven op een bekerglas van glas.
  2. Prak de nier, met behulp van een zuiger van de spuit, in de 425 µm zeef en doordrukken met behulp van ijs koud zoogdieren Ringer's oplossing met 1% BSA. Zoals de bits van de nier worden doorgedrukt, verwijderen van de bovenste zeef en overgaan tot hetzelfde doen op de volgende. Herhaal totdat alleen de 100 µm en 70 µm zeven blijven.
  3. Overdracht van de glomerulaire oogst behouden door de 100 µm en 70 µm zeven tot 10 mL van de verse zoogdieren Ringer's oplossing met 1% BSA, op ijs.
    Opmerking: Als het aantal glomeruli per mL Ringer's oplossing weinig is, verminderen het volume van Ringer's oplossing gebruikt voor het verzamelen van de glomeruli van de laatste twee zeven.
  4. Verwijderen van 5 mL van de oplossing met glomeruli in twee afzonderlijke buizen (elke 2.5 mL) en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en module bevriezen de glomeruli in vloeistof N2 alvorens bij-80 ° C voor eiwitten en RNA extractie op een later tijdstip op te slaan.
  5. Plaats de resterende oplossing met glomeruli in een waterbad bij 37 ° C voor meting van de glomerulaire LpA / Vikex vivo. Vul binnen 3 uur voor het verwijderen van de nier.

5. glomerulaire waterdoorlaatbaarheid (LpA / VIk)

Opmerking: De glomerulaire LpA / Vik assay maakt de meting ex vivo van de permeabiliteit van individuele glomeruli in een snelle een reproduceerbare wijze. Een toename van de glomerulaire LpA / Vik geeft aan verstoring van de GFB, die is suggestief van nierziekte.

  1. Instellen van de glomerulaire LpA / Vik tuig in zalm et al.10beschreven. Zie afbeelding 1 voor een gedetailleerd diagram van de set-up.
  2. Voorbereiding van de volgende oplossingen: oplossing van de zoogdieren Ringer's met 1% BSA (pH 7.4) en zoogdieren Ringer's oplossing met 8% BSA (pH 7.4). Warm beide tot 37 ° C.
  3. Trek micropipetten uit glazen capillaire buizen (optische dichtheid: 1.2 mm). Een 5-8 µm diafragma tip genereren door het snijden van de micropipet onder een microscoop.
  4. Gebruik de glomerulaire LpA / Vik rig Overstaptijd intact individuele glomeruli die vrij zijn van Bowman van capsule en tubulaire fragmenten op de micropipet met behulp van zuiging. Een gedetailleerde samenvatting van de oncometric-bepaling wordt gevonden in zalm et al.10. Kortom, zodra een glomerulus is gevangen en beveiligd en op de zuig micropipet opgeslagen, beginnen met het opnemen van de video van de glomerulus onder de Microscoop.
  5. In de eerste plaats equilibreer de glomerulus in de 1% BSA Ringer's oplossing voor 30 s voordat u de perifusate naar de geconcentreerde 8% BSA Ringer's oplossing voor 10 s. Vervolgens schakelt u de perifusate terug naar 1% BSA Ringer's oplossing en de opname tegenhouden.
  6. De glomerulus wegwassen en herhaal het proces voor 10-15 glomeruli per muis. Zorgen de stroomsnelheid van de perifusate zijn identiek en niet te snel (10 mL/min) om niet te verstoren de glomerulaire structuur.
  7. Meten van het oorspronkelijke tarief van glomerulaire krimp voor het berekenen van de glomerulaire waterdoorlaatbaarheid (LpA) genormaliseerd naar het glomerulaire volume (Vik). Gedetailleerde informatie met betrekking tot de analyse kan worden gevonden in zalm et al.10.

6. Periodieke Zure Schiff (BK) vlek

Opmerking: De vlek PAS zal worden gewezen op de membranen van de kelder van glomerulaire capillaire loops en de tubulaire epitheel. Hierdoor gedetailleerde visualisatie van de glomerulaire cellen, mesangial matrix en potentieel expansie en eventuele veranderingen van de GBM (d.w.z., verdikking en onregelmatigheden).

  1. Het gedeelte van de paraffine-ingebedde, PFA-vaste nier cortex gebruikend microtome bij 5 µm dikte in poly-L-lysine gecoate dia's. Droog bij 37 ° C gedurende 1 h. Controleer de sectie bevat geen plooien en de eventuele gaten, die de morfologie onder de Microscoop kunnen verstoren.
  2. Deparaffinize dia's door aan het broeden tweemaal in xyleen (Let op, irriterend; gebruik in rook kabinet) gedurende 3 minuten elke, tweemaal in 100% EtOH gedurende 3 minuten elk, en vervolgens eenmaal in 95%, 70% en 50% EtOH gedurende 3 minuten elk, allemaal bij kamertemperatuur. Opnieuw het hydrateren van de dia's in dH2O.
  3. Incubeer de dia's in periodieke zure oplossing (Let op, irriterend; gebruik in rook kabinet) (1 g/dL) voor 5 min en dan spoelen de dia's in diverse wijzigingen dH2O. gebruikt een container met 100 mL dH2O bij kamertemperatuur.
    Let op: periodieke zure oplossing: Irriterend; gebruik in de zuurkast kabinet
  4. Incubeer dia's van Schiff van reagens (Parasoaniline HCl 6 g/L en natrium Metabisulfiet 4% HCl 0,25 mol/L) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Dia's in stromend kraantjeswater gedurende 5 minuten wassen.
  5. Counterstain met haematoxyline voor 3 s voordat het grondig spoelen dia's in stromend kraantjeswater voor 15 min.
    Opmerking: Sommige optimalisatie mogelijk moet bepalen van de optimale tijd voor Haematoxyline kleuring.
  6. Dia's met behulp van het omgekeerde van het deparaffinization-protocol in stap 6.2 uitdrogen. Eindig met xyleen.
  7. Lucht droog dia's en zware montering met montage xyleen gebaseerde media.
  8. Afbeelding op een lichte Microscoop bij 400 X vergroting te beoordelen glomerulaire structuren. Evalueren van het volgende: verdikking en onregelmatigheden van de GBM, instortende van capillaire lussen fibrotische weefsel, sclerose, cellulaire proliferatie (endotheel, podocyte, en mesangial, of ontstekingscellen infiltreren de tuft).
    Opmerking: Voor een uitgebreide evaluatie van glomerulaire pathofysiologie, letsels elders in de nier moeten worden geëvalueerd, zoals de tubuli.

7. transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

Opmerking: TEM maakt het mogelijk het onderzoek van ultra structurele afwijkingen in de nier, zoals de GBM podocyte voet processen en de endothelial fenestrations, die niet zichtbaar met de lichte microscopie zijn. Dit is belangrijk in de modellen waar nierschade niet zo uitgesproken is (dat wil zeggen, geen albuminurie en belangrijke structurele afwijkingen).

  1. Neem de 2,5% gluteraldehdye - vaste blokjes nier en na oplossen in 1% osmium tetroxide voor 1 h. wassen in 50 mL 0,1 M cacodylate buffer (pH 7.3) en vervolgens 50 mL dH2O (3 x 15 min veranderingen).
    Let op: 2,5% Glutaaraldehyde: overgevoeligheid, toxisch, irriterend; gebruik in een zuurkast kast. 0,1 M natrium cacodylate: giftig, gebruik in een zuurkast kast
  2. Met EtOH dehydrateren en inbedden in Araldite hars.
  3. Knip van de secties bij 50-100 nm dikte en vlek met 3% (waterige) uranyl acetaat en Reynolds voorsprong citraatoplossing.
  4. Digitale microfoto overnemen in verschillende gebieden van de glomerulus op 940 X, 1250 X, en 6200 X om er zeker van te zijn dat de podocytes, GEnCs, GBM en mesangium kunnen worden geïdentificeerd.
  5. Gebruik ImageJ voor het analyseren van de geblindeerde glomeruli. Stel de schaal voor elke opname 6200 X door het tekenen van een lijn tussen twee punten van bekende afstand, zoals een liniaal. Ga naar het analyseren en vervolgens Stel schaal, waar de lengte van de lijn zal worden weergegeven in pixels. Typ in de bekende afstand en meeteenheden. De protocollen voor het meten van elke parameter hieronder gebruiken.
    Opmerking: Deze analyse vereist ongeveer 1 dag per muis. Voor voldoende statistisch onderscheidingsvermogen, gebruikt u de gemiddelde metingen van 3 glomeruli van 3 muizen.
    1. Voor GBM, plaatst u een vaste digitale raster (10 x 10) over de opname van de 6200 X en meten van de dikte van de GBM op het punt waar de rasterlijnen de GBM kruisen. Meten van de basale endothelial cel membraan tot aan de celmembraan voor basale podocyte voet proces in een loodrechte raaklijn aan de endothelial cel membraan met behulp van de rechte lijn-tool. Bepaal de gemiddelde meting voor elke glomerulus uit 10 afzonderlijke metingen.
    2. Voor het nummer endothelial fenestration, meet de lengte van de GBM aanwezig zijn in de opname van de 6200 X en Tel het aantal endothelial fenestrations per eenheid lengte van GBM. Neem een gemiddelde van ten minste 4 microfoto per glomerulus.
    3. Voor de podocyte voet proces breedte, een vaste digitale raster (10 x 10) over de 6200 X opname invoegen. Meet de breedte van de podocyte voet processen die de grenzen van het raster. Meet de breedte op het breedste deel van het proces van de voet waar het samenkomt met de GBM; Zorg ervoor de lijn loodrecht op de tangens van de basale membraan van podocyte. Bepaal de gemiddelde meting voor elke glomerulus uit 10 afzonderlijke metingen.
    4. Podocyte Breedte gleuf, plaatst een vaste digitale raster (10 x 10) over de opname van de 6200 X. Meet de breedte van de gleuf het pessarium podocyte die de grenzen van het raster. Dit is het punt waar de voet processen dichtstbijzijnde samen op het breedste gedeelte van elke voet proces, van podocyte membraan aan membraan zijn. Zorg ervoor dat de meting staat loodrecht op de tangens van de basale membraan van podocyte. Bepaal de gemiddelde meting voor elke glomerulus uit 10 afzonderlijke metingen.
    5. Voor het aantal podocyte voet processen, meet de lengte van de GBM aanwezig zijn in de opname van de 6200 X en het aantal podocyte voet processen per eenheid lengte van GBM. Neem een gemiddelde van ten minste 4 microfoto per glomerulus.
    6. Zie gedetailleerde methode in Neal et al.voor de dekking van de sub-podocyte ruimte. 14.
  6. Met behulp van de 940 X microfoto, onderzoeken glomeruli voor de aanwezigheid van abnormale structuur, stortingen en infiltreert met het blote oog.

8. immunofluorescentietest voor Podocyte en endotheel Markers

Opmerking: Immunokleuring kunt visualisatie van de eiwit-expressiepatronen, zoals endothelial capillaire lussen, die in de glomerulaire ziekte kunnen samenvouwen.

  1. Plaats de OCT-schimmel met bevroren nier bij-20 ° C gedurende 2 uur vóór het segmenteren. Ervoor zorgen dat het snijvlak van de nier wordt zorgvuldig geplaatst tegen de onderkant van de OCT-mal om goed georiënteerde weefselsecties.
  2. Met behulp van een cryostaat, bedekt sectie weefsel bij een 5 µm dikte aan poly-L-lysine dia's.
    Opmerking: Zorg ervoor er zijn geen plooien of gaten in het weefsel gedeelte, dat de morfologie verstoren kan.
  3. Herstellen na verwijdering uit de cryostaat, dia's in 4% PFA voor 10 min. Wash dia's 3 x 5 min in een container met 100 mL voor dH2O.
    Let op: 4% PFA: fixeer, gebruik in de zuurkast kabinet
  4. Om te minimaliseren van de hoeveelheid antilichamen gebruikt, tekenen rond secties met een hydrofobe pen. Laat niet de secties droog.
  5. Incubeer oplossing (3% BSA en 5% normaal serum in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te blokkeren.
  6. Verwijder de blokkerende oplossing met een aspirator en incubeer secties met primair antilichaam (Nephrin, podocin of PECAM-1) verdund 1:250 (3% BSA in 1 x PBS). Plaatsen van dia's in een bevochtigde ruimte bij 4 ° C's nachts. Als een vochtige kamer niet beschikbaar is, licht plaatst u een kleine strook van parafilm over de dia antilichaam-gecoat. Wees voorzichtig bij het verwijderen van de volgende dag over het niet verstoren van de sectie.
  7. Dia's 3 x 5 min in 1 x PBS wassen.
  8. Incubeer met passende fluorescerende secundair antilichaam verdunning 1:1000 (3% BSA in 1 x PBS) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  9. Dia's 3 x 5 min in 1 x PBS wassen. Monteren met fluorescerende montage DAPI met media.
  10. Het imago van dia's met een fluorescente microscoop bij 400 X vergroting te bekijken van de glomeruli. Zorgen voor dat dit om te voorkomen dat vooringenomenheid is verblind.
  11. Gebruik ImageJ voor het analyseren van de kleuring intensiteit, genormaliseerd naar het glomerulaire gebied, en het patroon van vlekken, dat wil zeggen, aantal capillaire lussen genormaliseerd naar het glomerulaire gebied, in een geblindeerde wijze.

9. eiwit extractie en het westelijke bevlekken

Opmerking: Westelijke bevlekken laat ons toe om de expressie eiwitten bekend als dysregulated bij nierziekte beoordelen. Bijvoorbeeld, geeft een afname van de podocin en nephrin expressie podocyte verlies.

  1. Extract van eiwit van nier cortex en gezeefde glomeruli; het protocol is hetzelfde voor elk en het volume van lysis buffer is aangepast voor het bedrag van weefsel.
  2. Nier/glomeruli op ijs ontdooien voordat u NP-40 lysis buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8) met protease en phosphatase inhibitors toevoegt. Meng het monster voor 30 s.
  3. Incubeer de gehomogeniseerde monsters op ijs voor 30 min, vortexing op gezette tijden.
  4. Centrifugeer de monsters bij 10.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
  5. Verwijder de bovendrijvende substantie aan een verse buis op ijs.
    Opmerking: verwachten om te herstellen van ongeveer 1 mg eiwit per monster.
  6. Het denatureren van de proteïnen die met behulp van de standaard 4 x Laemmli buffer. Kook het mengsel bij 95-100 ° C gedurende 5 minuten.
  7. Beoordelen van de expressie van glomerulaire cel marker eiwitten (Nephrin, Podocin, PECAM-1, enz.) en de fosforylatie en expressie van eiwitten bekend/hypothetische worden aangepast in de nier/glomeruli van het model van de ziekte met behulp van westelijke bevlekken) standaardmethode; Mahmood en Yang15).
    Opmerking: Het protocol zal variëren afhankelijk van de grootte en de overvloed van de proteïne van belang.

10. RNA extractie en Polymerase-kettingreactie (PCR)

Opmerking: mRNA uitdrukking analyse stelt ons in staat om te bepalen hoe genen bij nierziekte, zoals wijzigingen in genexpressie en alternatieve splicing worden geregeld.

  1. Terwijl de nier cortex nog steeds bevroren is, grondig in 3 mL reagens van fenol met behulp van een stamper en vijzel te vermalen. Als gebruikmaakt glomerulaire extracten, voeg 1 mL reagens van fenol en meng het monster voor 30 s.
    Let op: TRIzol-reagens: Irriterend; gebruik in de zuurkast kabinet
  2. Het uitvoeren van een RNA extractie met behulp van de methode beschreven door Chomczynski en Sacchi16.
    Opmerking: Commerciële RNA extractie kits zijn beschikbaar als alternatief voor deze methode.
  3. Het beoordelen van de kwantiteit en kwaliteit van RNA verkregen met behulp van een van de verschillende methoden beschikbaar. RNA is aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C op dit punt. Voorkomen dat herhaling bevriezen ontdooien.
    Opmerking: Als nieuw voor deze methode, controleren de kwaliteit van het RNA voordat u verdergaat met de volgende stap door de RNA op een agarose gel om te zorgen voor een duidelijke 28 en 18S ribosomal band. Verwachten om te herstellen tussen 2 tot en met 5 µg van RNA met behulp van deze methode.
  4. DNase behandelen 1 µg RNA (make volume maximaal 10 µL met RNase-gratis water plus 1 µL van DNase en 1 µL van DNase buffer) gedurende 1 uur bij 37 ° C. Stop de reactie met 1 µL van DNase eindeoplossing bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
  5. Voeg 0,5 µL van oligo (dT) en willekeurige inleidingen. Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
  6. Doven onmiddellijk op het ijs gedurende 5 minuten.
  7. Voeg de volgende; MMLV reverse-transcriptase enzym (400 U; vervangen door DEPC H2O in de RT - controlemonster), MMLV buffer (1 x), dNTP mix (0.5 mM) en ribonuclease remmer (40 U); maken van maximaal 50 µL met DEPC water.
  8. Incubeer reactie mix bij 37 ° C gedurende 1 uur, gevolgd door 95 ° C gedurende 5 minuten aan het enzym deactiveren.
    Opmerking: Voor het genereren van een hogere opbrengst van cDNA, Incubeer bij 37 ° C gedurende maximaal 3 uur.
  9. Het beoordelen van de kwantiteit en kwaliteit van cDNA met behulp van de verschillende methoden beschikbaar.
  10. Gebruik PCR te beoordelen van de mRNA uitdrukking, egaliseren en lamineren patronen van genen veronderstelde te zijn dysregulated in het glomerulaire ziekte-model. Het protocol zal variëren afhankelijk van het gen van belang.

Representative Results

Urine werd verzameld met behulp van metabole kooien van wild type (WT), afleidbare podocyte-specifieke VEGF-A knock out (VEGF-A KO) en VEGF-A KO X Neph-VEGF165b muizen (VEGF-A KO muizen die over het uitdrukken van de menselijke VEGF-A165b isovorm in de podocytes in een constitutieve wijze). Bij meting van de urine albumine Kreatinine ratio in de weken 0, 4, 10 en 14 na doxycycline inductie van VEGF-A KO ontwikkeld VEGF-A KO muizen progressieve albuminurie door 10 weken in vergelijking met WT littermate besturingselementen. De absolute waarden te zien in figuur 2A, en de genormaliseerde tot de basislijn van de waarden van elke muis in figuur 2B. Albuminuria in niet waargenomen in de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (Figuur 2), die aangeeft dat VEGF-A165b is echter beschermende in het model van albuminurie5.

De glomerulaire LpAVik werd gemeten in individuele glomeruli gezeefd uit WT, VEGF-A KO en VEGF-A X Neph-VEGF-A165b nieren. Een voorbeeld van hoe een glomerulus is gevangen en de krimp waargenomen wanneer perifused met 8% BSA wordt weergegeven in figuur 3A. Deze krimp wordt vervolgens gebruikt voor het bepalen van de glomerulaire LpA / Vik voor elke glomerulus (figuur 3B). VEGF-A KO muizen had een aanzienlijk verhoogde glomerulaire LpA / Vik 14 weken post VEGF-KO inductie in vergelijking met WT controle glomeruli. Hoewel lager in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen, de verhoogde glomerulaire LpA / Vik was niet wordt gehinderd door overmatige expressie van VEGF-A165b op 14 weken5.

PAS kleuring van nier cortex secties 14 weken na de inductie van VEGF-A KO openbaarde niet eventuele glomerulaire structurele afwijkingen in de VEGF-A KO of VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (figuur 4A). Echter bij de analyse van de glomerulaire ultra-structuur via EM, VEGF-A KO muizen had ontwikkeld een verhoogde GBM-breedte, daalde het aantal endothelial fenestrae, daalde van SPS dekking en toegenomen gemiddelde podocyte Breedte gleuf (figuur 4C-4F ). De gemiddelde podocyte voet breedte en aantal spleten bleef onveranderd (figuur 3B en 3 G) verwerken. Overmatige expressie van VEGF-A165b in de VEGF-A KO muizen voorkomen van de wijzigingen op de GBM en gleuf breedte (figuur 4C en 4F). VEGF-A165b had echter geen effect op de gewijzigde fenestrae nummer en SPS dekking (Figuur 4 d en 4E)5.

RT-PCR uitgevoerd op RNA geëxtraheerd uit gezeefde glomeruli bleek dat de menselijke VEGF-A165b mRNA alleen aanwezig in de VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b muizen (figuur 5A is). Wanneer eiwit wilt uitpakken vanaf de gezeefde glomeruli en beoordeling van de niveaus van eiwitten via het westelijke bevlekken, de glomerulaire eiwit expressie van VEGFR-2 bleek te zijn verminderd in VEGF-A KO muizen, die werd verhinderd door overmatige expressie van VEGF-A165b ( Figuur 5B en 5 C)5.

Figure 1
Figuur 1. Schetsmatig instellen voor de glomerulaire permeabiliteit (Lpvan A) rig. (A) de glomerulus is gevangen op (B) de micropipet binnen een houder met behulp van zuiging, die op een mount voor stabiliteit is geklemd. (C) rechthoekige microslide. (D) 4 X doelstelling van een microscoop met een videocamera. (E) 1% BSA oplossing opgewarmd tot 37 ° C. (F) 8% BSA oplossing opgewarmd tot 37 ° C. (G) afstandsbediening Tik op dragende twee perifusate-bevattende lijnen, waardoor snelle perifusate uitwisseling. (H) Route van perifusate naar de microslide, die vervolgens de glomerulus baadt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Urine albumine Kreatinine ratio. (A) de uACR-waarden in de weken 0, 4, 10 en 14 na de inductie van VEGF-A KO in WT, VEGF-A KO en VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen. (B) dezelfde uACR waarden genormaliseerd naar de waarde van de basislijn (week 0) van elke individuele muis. De uACR aanzienlijk verhoogd in muizen VEGF-A KO op weken 10 en 14 vergeleken met WT littermate besturingselementen, waardoor werd in de VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (* p < 0.05; Two-way ANOVA, correctie voor vergelijking tussen paren; n = 4-12 muizen per tijdstip; foutbalken: standaardfout van het gemiddelde [SEM]). Dit cijfer is gewijzigd van Stevens et al.5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Meting van de glomerulaire waterdoorlaatbaarheid. (A) de glomerulus is betrapt op het micropipet via de zuigkracht; de perifusate is overgestapt van 1% BSA (Ai) naar 8% BSA (Aii) en glomerulaire krimp wordt waargenomen. (B) metingen vóór en na de 8% BSA-schakeloptie worden gebruikt om te bepalen van de glomerulaire LpA / Vik. (C) VEGF-A KO muizen ontwikkelen een grotere glomerulaire LpA / Vik 14 weken post inductie van VEGF-A KO in vergelijking met de WT-besturingselementen. Dit was niet significant voorkomen in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (* p < 0.05; One way ANOVA, Bonferroni correctie voor vergelijking tussen paren; n = 4-9 muizen, 15-30 de glomeruli; foutbalken: SEM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Glomerulaire structurele analyse. (A) PAS kleuring van de nier cortex deed niet geven eventuele structurele afwijkingen in de glomeruli van WT, VEGF-A KO en VEGF-A X Neph-VEGF-A165b muizen (Ai - iii). EM geopenbaard Ultra structurele afwijkingen in de glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) de gemiddelde FPW veranderde niet tussen groepen. (C) de GBM steeg in de glomeruli VEGF-A KO, die werd verhinderd door VEGF-A165b. (D) het aantal fenestrae werd afgenomen in VEGF-A KO glomeruli, die bleef ongewijzigd door VEGF-A165b. (E) de SPS dekking was daalde in VEGF-A KO glomeruli, die ook bleef onveranderd door VEGF-A165b. (F) het gemiddelde breedte gleuf werd verhoogd in de glomeruli VEGF-A KO, die werd verhinderd door VEGF-A165b. (G) het nummer van de gleuf was onveranderd tussen de drie groepen (* p < 0.05; One way ANOVA, Bonferroni correctie voor vergelijking tussen paren; n = 3 muizen, 9 glomeruli; foutbalken: SEM). Dit cijfer is gewijzigd van Stevens et al.5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. mRNA en eiwit expressie van markers. (A) RT-PCR bleek dat menselijke VEGF-A165b mRNA uitdrukking alleen zichtbaar in de gezeefde glomeruli van VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b muizen. (B) westelijke bevlekken aangegeven dat VEGFR-2 eiwit expressie down-gereglementeerde in VEGF-A KO glomeruli was, die was verhinderd in VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b glomeruli (* p < 0.05; One way ANOVA, Bonferroni correctie voor vergelijking tussen paren; n = 3 - 6 muizen; foutbalken: SEM). Dit cijfer is gewijzigd van Stevens et al.5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. De kritische stappen in elke methode voorzien in gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, met inbegrip van de beoordeling van de permeabiliteit van de nieren als geheel (uACR en plasma Kreatinine metingen), de doorlaatbaarheid van individuele glomeruli (glomerulaire LpA / Vik), onderzoek van de structurele wijzigingen (PAS Trichrome blauw en EM), eiwit lokalisatie (IF), en de glomerulaire genexpressie (RT-PCR en het westelijke bevlekken). Deze methoden zijn de sleutel tot de volledige beoordeling van de glomerulaire functie in muismodellen van nierziekte.

Bij de beoordeling van de permeabiliteit van de GFB, hebben tal van studies gekozen voor het gebruik van de conventionele uACR of 24 h albumine excretie snelheid als een doeltreffende maatregel17,18. Hoewel deze technieken toestaan beoordelingvan de GFB permeabiliteit als geheel, staat het niet toe voor de beoordeling van de individuele glomerulaire permeabiliteit en variatie onder de glomeruli. Eerdere studies hebben gevonden meting van de glomerulaire LpA / Vi een gevoeliger maatregel van wijzigingen in de GFB permeabiliteit5,9. Inderdaad, in de representatieve resultaten aangetoond in dit document, op 14 weken na de inductie van VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b muizen hebben een aanzienlijk lager uACR t.o.v. VEGF-A KO muizen; Dit resultaat komt echter niet tot uiting in de glomerulaire LpA / Vik metingen, waar VEGF-A165b belette niet aanzienlijk dat verhoogt in de GFB permeabiliteit (Figuur 1 en Figuur 2)5. Dit toont het belang van het gebruik van meerdere tests te beoordelen van zowel de permeabiliteit van de nier en de permeabiliteit van individuele glomeruli. Bovendien, de glomerulaire LpA / Vik oncometric assay suggereert dat de doorlaatbaarheid van individuele glomeruli van de dezelfde nier kan sterk variëren, met name in ziekte modellen5,10, 19. een beperking tot het meten van de glomerulaire LpA / Vik is dat het kan alleen worden uitgevoerd op de experimentele eindpunt; Dus, regelmatig uACR metingen moeten geven een indicatie van het experimentele eindpunt.

Naast de beoordeling van de functionele fenotype, moedigt de huidige methode ook een evaluatie van de structurele en ultrastructurele fenotype. Dit kan gedaan worden met behulp van een aantal vlekken zoals PAS, trichrome, en zilveren vlekken; elke om te beoordelen van verschillende aspecten van de glomerulaire morfologie. In acute modellen van glomerulaire ziekte, die vaak het geval in muismodellen is, is moeilijk te detecteren eventuele belangrijke structurele afwijkingen met behulp van deze vlekken, tenzij u een opgeleide renale patholoog. Daarom, uitvoeren van EM wordt voorgesteld om het beoordelen van de ultrastructuur van de GFB, waarmee de kwantitatieve meting van parameters zoals de GBM endothelial fenestrae grootte en aantal en podocyte kenmerken. Dergelijke metingen vereist minimale opleiding uit te voeren en kan de onderzoeker om de cel-typen/structuren beïnvloed in een model van de ziekte. In het voorbeeld in de representatieve resultaten, de muis VEGF-A KO bleek te zijn van een milde model van glomerulaire ziekte, dus waren geen grote structurele afwijkingen aanwezig op de PAS kleuring. Echter de podocyte-specifieke VEGF-A KO, er veranderingen aan de GBM podocytes en de endotheliale cellen veroorzaken bij het onderzoek van de glomerulaire ultra-structuur-5. Helaas, de voorbereiding van de nier voor EM beschreven in de huidige methode niet mogelijk detectie van het endotheel glycocalyx, waarvan ook bekend is dat aanzienlijke gevolgen hebben voor de permeabiliteit van de GFB19. Om nauwkeurige meting van de glycocalyx-diepte, moet de nier perfuse-vaste met 2,5% Glutaaraldehyde met 1% Alcian blauw voor endothelial glycocalyx etikettering, zoals beschreven in Oltean et al.19.

Zodra het functionele en structurele fenotype zijn beoordeeld, kunnen de expressie/activatie patronen van verschillende genen en wegen dan specifiek in de glomeruli worden beoordeeld. Voorafgaande Ultra structurele evaluatie kan geven wat informatie over de cel typen/glomerulaire structuren betrokken, die aangeeft of podocyte - of endotheel-specifieke genen/trajecten dienen te worden onderzocht. Bijvoorbeeld in de representatieve resultaten van de muizen VEGF-A KO, werd een vermindering van het aantal endothelial fenestrae waargenomen (figuur 3D); Daarom werd de glomerulaire eiwit expressie van een endothelial markering bekend te worden betrokken bij de VEGF-A-traject onderzocht; VEGFR-2 (figuur 4B)5. Naast de uitdrukking van eiwitten in de glomeruli, kan ook hun localisatie worden gevisualiseerd met behulp van als. In een studie door Zhang et al.20, werd podocyte-specifieke overexpressie van GLUT1 bevestigd in de podocytes door als mede het lokaliseren van de verhoogde GLUT1 met podocin.

In vergelijking met alternatieve methoden gepresenteerd in de literatuur te beoordelen glomerulaire functie, maakt het gebruik van de methode beschreven in dit document aan het beoordelen van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte het glomerulaire fenotype volledig worden geëvalueerd van meerdere aspecten. Met behulp van deze methode, is de onderzoeker kunnen bepalen van het fenotype van de nier van het model en het beoordelen van het mechanisme over de vraag waarom het fenotype ontwikkelt. Deze vitale informatie over het mechanisme van de ziekte is vereist bij het onderzoeken van potentiële therapeutische mogelijkheden in deze modellen. Deze methode kan eenvoudig worden toegepast op toekomstige onderzoek naar glomerulaire functie, zowel bij de beoordeling van ziekte fenotypes en potentiële therapeutics.

Kortom, beschrijft dit generieke en flexibele protocol een volledige nier werk-up voor Muismodellen van glomerulaire ziekte, waardoor een enorme hoeveelheid informatie met betrekking tot de nieren en glomerulaire functie te worden verkregen uit een simpele muisklik. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Britse Hartstichting, Richard Bright VEGF Research Trust en het MRC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Metabolic Cages Harvard Apparatus 52-6731
Tris buffered saline (10x) Sigma-Aldrich T5912-1L
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories E90-134
TMB ELISA Substrate solution ThermoFisher Scientific 34028
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
SPECTRstar nano BMG Labtech SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution ThermoFisher Scientific AM7020
4-15% precast protein gel BIORAD 4568084
4x Laaemmli Sample buffer BIORAD 161-0747
Mini Trans-Blot cell BIORAD 1703930
10x Tris running buffer BIORAD 1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye ThermoFisher Scientific 20278
Creatinine Companion Exocell 1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution Sigma-Aldrich G5882
Sodium Cacodylate Sigma-Aldrich C0250
10x Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific AM9625
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M2643
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G8270
EDTA Blood Collection tubes BD 367835
23-25G Needle BD PMC0735
EDTA Sigma-Aldrich E9884
10 ml Glass Vial Thomas Scientific 0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes ThermoFisher Scientific 10110101
0.5 ml Tubes ThermoFisher Scientific 10681894
Disposable Tissue Molds ThermoFisher Scientific 22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit ThermoFisher Scientific 13-005-204
Optimal Cutting Medium ThermoFisher Scientific 23-730-571
4% Paraformaldehyde ThermoFisher Scientific AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes Harvard Apparatus EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves Cole-Parmer WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System Sigma-Aldrich 395B-1KT
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136
Xylene MerckMillipore 108298
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425-72EA
Mounting Medium ThermoFisher Scientific 8030
Osmium tetroxide solution Sigma-Aldrich 75632
Aradite Resin Agar Scientific CY212
Uranyl Acetate Agar Scientific AGR1260A
Lead Citrate Agar Scientific AGR1210
Cryostat ThermoFisher Scientific e.g. 957000H
Hydrophobic Pen Abcam ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody Acris BP5030
Anti-Podocin Sigma-Aldrich P0372-200UL
Anti-CD31 BD Biosciences 550274
Alexa Fluor Secondary Antibody ThermoFisher Scientific A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer ThermoFisher Scientific FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78437X4
10x Transfer Buffer BIORAD 1610734
PVDF Membrane ThermoFisher Scientific LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies Abcam ab6721
ECF Substrate for Western Blotting Fisher 10713387
TRIzol ThermoFisher Scientific 15596018
Dnase I New England Biolabs M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M053S
Oligo dT ThermoFisher Scientific 18418012
Random Primers ThermoFisher Scientific 48190011
dNTP ThermoFisher Scientific 18427088
Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
DEPC Water ThermoFisher Scientific AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope Leica Microsystems
Image J Analysis Software Image J
PCR Thermocycler ThermoFisher Scientific
TEM Microscope Britannica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humtstrom, M. Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats. Journal of Hypertension. 30, (6), 1087-1091 (2012).
  2. Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14, (9), 279-290 (2016).
  3. Tesch, G. H., Lim, A. K. Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300, (2), F301-F310 (2011).
  4. Fogo, A. B. Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment. Seminars in Nephrology. 23, (2), 161-171 (2003).
  5. Stevens, M., et al. VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney. Journal of Physiology. 595, (19), 6281-6298 (2017).
  6. Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis. Kindey International. 71, (7), 615-618 (2007).
  7. Kujal, P., Vernerova, Z. 5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number. Ceskoslenska Fysiologuie. 57, (4), 104-109 (2008).
  8. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75, (11), 1145-1152 (2009).
  9. Oltean, S., et al. VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303, (7), F1026-F1036 (2012).
  10. Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli. Journal of Physiology. 570, (Pt 1), 141-156 (2006).
  11. Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice. Kidney International. 54, (6), 1999-2007 (1998).
  12. Betz, B., Conway, B. R. An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research. Current Diabetes Reports. 16, (18), (2016).
  13. Savin, V. J., Terreros, D. A. Filtration in single isolated mammalian glomeruli. Kidney International. 20, (2), 188-197 (1981).
  14. Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space. Journal of the American Society of Nephrology. 16, (5), 1223-1235 (2005).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4, (9), 429-434 (2012).
  16. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162, (1), 156-159 (1987).
  17. Adembri, C., et al. Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat. Critical Care. 15, (6), R277 (2011).
  18. Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Phytotherapy Research. 27, (10), 1474-1480 (2013).
  19. Oltean, S., et al. Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 26, (8), 1889-1904 (2015).
  20. Zhang, H., et al. Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299, (1), F91-F98 (2010).
Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).More

Stevens, M., Oltean, S. Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease. J. Vis. Exp. (136), e57764, doi:10.3791/57764 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter