Summary
本研究采用双侧光照光片荧光显微镜 (LSFM) 技术, 结合光清除法对小鼠心脏进行研究。
Abstract
光片荧光显微技术已广泛应用于从微米到毫米尺度的高轴向分辨率的快速图像采集。传统的光片技术涉及在样品组织中使用单一光照束定向正交。使用单一光照光束制作的大型样品的图像含有条纹或工件, 由于组织的散射和吸收, 导致分辨率降低。本研究采用双侧光照光束和简化的小鼠心脏清晰度光清除技术。这些技术可以通过去除心脏的脂质和产生一个大的成像领域, 大于 10 x 10 x 10 毫米3, 更深层次的成像。因此, 这一策略使我们能够量化的心室尺寸, 跟踪心脏谱系, 并本地化的心脏特异性蛋白和离子通道的空间分布, 从产后到成年小鼠心脏有充分的对比度和分辨率。
Introduction
光片荧光显微镜是1903年首次开发的一种技术, 目前作为一种研究基因表达的方法, 也用于生产3维或4维组织样本1,2,3的模型。这种成像方法使用一层薄薄的光来照亮样本的单个平面, 以便只有该平面被探测器捕获。然后, 可以在轴向方向移动样本以捕获每一层, 一次一节, 并在获得的图像4后处理后呈现一个3维模型。然而, 由于光子的吸收和散射, LSFM 仅限于几微米厚或光学上透明1的样品。
LSFM 的局限性导致了对生物体的广泛研究, 这些有机体具有光学上透明的组织, 如斑马鱼。有关心脏发育和分化的研究往往是对斑马鱼, 因为有保守的基因之间的人和斑马鱼5,6。尽管这些研究已经导致了与心肌6,7相关的心脏研究的进展, 但仍有必要对哺乳动物等高级生物进行类似的研究。
哺乳动物的心脏组织提出了一个挑战, 由于组织的厚度和不透明, 红细胞中血红蛋白的吸收, 以及在传统的 LSFM 方法下, 由于样品单面光照产生的条带.1,8. 为了弥补这些限制, 我们建议使用双侧照明和简化版的清晰度技术9结合折射率匹配解决方案 (轮辋)。因此, 该系统允许对大于 10 x 10 x 10 毫米3的样本进行成像, 同时在轴向和侧面平面上保持良好的质量分辨率8。
该系统是第一次校准使用荧光珠安排在不同的配置在玻璃管。然后, 该系统用于图像产后和成年鼠心脏。首先, 产后鼠心脏被成像7天 (P7), 以揭示心室腔, 心室壁的厚度, 瓣膜结构, 和 trabeculation 的存在。其次, 研究了在1天 (P1) 用培养的心肌细胞和黄色荧光蛋白 (YFP), 通过使用产后小鼠心脏, 来识别将会分化为细胞的干细胞。最后, 7.5 月的成年小鼠在基因治疗后观察到肾外髓质钾 (ROMK) 通道的存在,8。
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Protocol
所有涉及使用动物的程序都已被加州大学洛杉矶分校的机构审查委员会 (IACUC) 批准。
1. 成像系统设置
注: 见图 1和图 2。
- 检索3波长的连续波 (CW) 激光器: 405 nm、473 nm 和 532 nm。将2镜 (M1 和 M2) 分开150毫米, 并将其与在45°上的镜面平面对准光束。
注意: 执行此步骤可将激光从双面照明设置中重定向。产生的光束将与初始光束的方向相同。 - 通过25毫米直径的虹膜膜片/针孔 (PH) 的光束, 一个50毫米直径中性密度过滤器 (NDF) 与光学密度范围的 0-4.0, 一束膨胀机 (是), 30 毫米狭缝 (S) 与宽度的 ~ 0-6 毫米和镜子 (M3), 所有位置150毫米。将镜子与它的镜面平面放在45°上以光束。
- 通过50:50 光束分配器从 M3 150 毫米的光束。将镜子 (M6) 150 毫米从光束拆分器上放置, 使其镜面在45°到正向发射的光束上。使用反射光束形成双光照光片的一侧。
- 将镜子 (M4) 150 毫米从光束分配器上放置, 使其镜面在45°上, 从光束分配器的90°角度发出光束。将第二个镜子 (M5) 150 毫米从 M4 和对齐, 使其镜面平面在45°上, 从 M6 反射到光束。使用从 M5 发射的光束形成双光照光片的第二侧。
- 以对称的方式设置双面照明系统 (见图 1)。安置一圆筒透镜 (CL1) [直径 (d) = 1 in; 焦距 (f) = 50 毫米] 150 毫米与发射从 M5 在一边和另外一个相同的圆筒透镜 (CL2) 150 毫米与从 M6 在二个照明的另一边发出的光束相一致 setup. 放置2镜 (M7 和 M8), 每个与圆柱透镜的距离为50毫米, 以反映在90°的光束。
- 从一副镜片上形成一种无色的双峰。将第一个透镜, L1 (d = 1 英寸; f = 100 毫米), 100 毫米从 M7 和第二透镜, L2 (d = 1 在; f = 60 毫米), 160 毫米从 L1。在双光照的另一侧重复此操作, 其相同的透镜 (L3、L4) 与 M8 的距离相同。
- 将镜子, M9 和 M10, 分别从透镜 L2 和 L4 60 毫米, 并与光束一致。将照明目标, OL1 和 OL2 (d = 2 英寸; f = 150 毫米), 150 毫米从 M9 和 M10, 并与光束一致。从目标发射的光束形成了用于成像样品的光片。
- 使用3维打印机打印样品持有人从丙烯腈丁二烯苯乙烯 (ABS)。嵌入一块盖玻璃 [折射率 (RI) = 1.4745] 在房间的每一侧, 垂直于照明光束, 以尽量减少折射率不匹配。均匀地把房间放在从物镜发出的光束之间。
- 安装一个立体声显微镜与1X 放大目标和一个科学的互补金属氧化物半导体 (sCMOS) 相机垂直于照明平面 (见图 2)。
2. 成像系统校准
- 检索直径为0.53 微米的荧光聚苯乙烯微珠。
- 在折射率匹配溶液 (轮辋) 中, 用1% 低熔点的琼脂糖将微珠溶液稀释成 1:150,000, 制备荧光珠样品。切下一块硼硅酸盐玻璃管, 内径为12毫米, 外径为18毫米, 长度为30毫米。
注: 硼硅酸盐玻璃管用于与折射率 (1.47) 相匹配。 - 将稀释后的珠样品与1% 琼脂糖和吸管的珠/琼脂糖溶液放入硼硅酸盐管材中。允许琼脂糖在室温下凝固 (23 摄氏度)。
- 用99.5% 甘油溶液填充 ABS 室 (从步骤 1.7)。将含有珠子的硼硅酸盐玻璃管放在腔内。将 ABS 腔置于成像系统中, 使其位于双光照系统所产生的高斯光束的中心。
- 将3维机动平移阶段附加到硼硅酸盐玻璃管上, 以控制 ABS 腔内样品的移动和方向 (参见补充图 1)。
- 使用 sCMOS 相机获取图像, 速度为每秒30帧 (fps)。使用马达控制器, 移动样品1毫米在横向方向和获取图像在每1毫米增量使用 sCMOS 照相机。继续, 直到整个示例被映像。
- 使用可视化软件堆叠获取的图像 (见材料表)。使用这些珠子图像测量系统的点扩展函数 (PSF)。在后续步骤中, 在图像处理过程中使用此 PSF 进行反褶积。
3. 样品准备
- 解剖心脏从野生型 P1 鼠和从双异型 sarcolipin 敲鼠与 Rosa26-YFP 基因 (Sln/+;R26YFP 记者/+) 在 P7。
注: 安乐死是用戊巴比妥和罗宾斯等所描述的技术进行的。10. 解剖是根据国家心脏、肺和血液研究所 (NHLBI)10、11所描述的技术进行的。 - 按照凯文. 宋等的描述, 对小鼠心脏进行化学清除。12。
注: 由于使用的化学品有毒, 因此应在通风罩中执行以下步骤。- 将1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的心脏冲洗10分钟。冲洗后, 放置在4% 多聚甲醛溶液的心脏, 并孵化这些样品在4摄氏度过夜。
- 将样品放在4% 丙烯酰胺溶液中, 含有 22 '-偶盐酸盐的0.5% 瓦特/v。允许样品在一夜之间孵化4摄氏度。夜间孵化后, 取出样品, 在37摄氏度孵化, 2-3 小时。
- 用 PBS 冲洗样品, 然后将其放入溶液中8% 瓦特/v 的月桂酸钠和1.25% 瓦特/钒硼酸。将样品孵化37摄氏度, 直到它们清晰为止。这可能需要几个小时, 这取决于样品的厚度。清除后, 取出样品并将其放置在1x 磷酸盐缓冲盐水中1天。
- 用40克非离子密度梯度介质 (见材料表), 用30毫升0.02 米磷酸盐缓冲 (PB)、0.1% Tween-20 和0.01% 叠氮化钠制备折射率匹配溶液。用氢氧化钠将溶液的 pH 值为7.5。
- 将清除的样品放在轮辋上, 折射率为 1.46-1.48 和1% 琼脂糖。将样品插入硼硅酸盐玻璃管材中, 并允许琼脂糖在室温下凝固 (23 摄氏度)。
- 将3维机动平移阶段附加到硼硅酸盐玻璃管上, 以控制样品在3维印制 ABS 腔内的移动和方向 (参见补充图 1)。
4. 成人心脏成像
- 注射 8.7 x 1012病毒的腺相关病毒载体 9 (AAV9), 其中含有心脏特异性肌钙蛋白 T 启动子 (cTnT) 和绿色荧光蛋白 (GFP) 在 100-ul 的体积, 到尾部静脉的2月野生类型 (C57BL/6) 鼠标。
注: AAV9 是按照元等所描述的技术开发的。13. 这导致 GFP 绑定到产生 AAV9-cTnT-ROMK-GFP 的肾外髓质钾通道 (ROMK) (见材料表)。 - 根据 NHLBI11所描述的技术, 在7.5 月的年龄内解剖成年老鼠的心脏。使用步骤 3.1-3.3 准备样品。
- 将马达控制器连接到电机驱动器。将执行器连接到硼硅酸盐玻璃管, 以控制在3维印刷 ABS 腔内的样品的移动和方向。
- 将样品放置在双光照系统产生的高斯光束的中心。使用 sCMOS 相机获取图像, 速度为 100 fps。
- 使用马达控制器, 移动样品1毫米在轴向方向和获取图像在每1毫米增量与 sCMOS 照相机。继续, 直到整个示例被映像。
注: 系统由定制的仪表控制软件控制。 - 使用可视化软件堆叠获取的图像 (见材料表)。使用这些图像栈和可视化软件14开发3维图像。Deconvolve 从步骤2.6 中的 PSF 与获取的图像栈。设置一个像素阈值的亮度, 以观察心脏的轮廓, 并添加伪颜色的图像基于这种灰度强度。
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Representative Results
这里描述的技术使用了双侧照明光束结合光清除鼠标心脏组织样本, 以达到更深的成像深度和更大的成像量, 有足够的成像分辨率 (图 1)。为了校准系统, 荧光珠被放置在玻璃管和成像系统内。然后将珠子在 x-y 平面、y z 平面和 x z 平面上进行成像和可视化, 以获得系统8的点扩展函数 (PSF)。系统标定产生了在 d侧向≈2.8 µm 的横向方向的分辨率, 以及在使用甘油作为嵌入介质8时, ≈17.4 µm 和 dYZ ≈17.9 µm 的轴向方向的分辨率.
在荧光珠用于校准后, 成像系统被用来在1天和7天的产后 (图 2)8中对老鼠心脏进行图像处理。在这些小鼠心脏的图像中, 心室腔尺寸、心瓣膜和心室 trabeculation 明显。为了研究心脏内的心肌细胞分化, 异型的小鼠在出生后被成像。在每一个平面方向上, 与心脏8 (图 3) 的3维渲染的图像。
除了研究产后小鼠外, 该成像系统还用于研究成年鼠心脏。最初, 基因治疗被用来引入 GFP 标记的 ROMK 通道进入鼠标心脏。7.5 月后, 老鼠心脏被成像, 这些 ROMK 通道被可视化在心室壁 (图 4)。该过程中的这一步骤说明了该系统的能力, 以图像大样本和鉴别结构没有看到与组织学染色的心脏内。图 4显示了每个平面方向的 ROMK 通道, 以及3维心脏8的渲染。
图 1: 光片荧光显微系统示意图.这是光片荧光显微系统的3维渲染, 包括元件与系统中所用元件的焦距之间的距离。这个数字已经从张懿宸丁等。8.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 具有检测功能的光片显微系统的顶部视图.这是双面照明显微系统的最高视图, 暗蓝色区域代表系统内每个位置的光束。包含的是一个2维放大剖面, 它显示了由消色差双峰和光照目标组成的区域之一。这个扩大的部分还显示了光板的形成原理, 以及如何组合梁, 形成一个双面照明。这个数字已经从张懿宸丁等。8.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 3 维的产后小鼠心脏图像.(a) 本小组展示了产后鼠心在7天显示脑室腔的图像。(b) 本小组在7天显示产后老鼠心脏的影像, 显示脑室壁的厚度。(c) 本小组在1天显示了产后老鼠心脏的图像, 显示了阀门结构的位置。(d) 这张图片显示了在1天的产后鼠心脏扩大的部分, 显示了位于心脏心房的果胶肌。(e) 该图像显示在1天的产后鼠心脏心室内 trabeculation。刻度条: 1 毫米。嵌入的红色圆圈区域显示了两颗半透明的小鼠心 , 经过了清晰度技术 , 并入硼硅酸盐玻璃管中。这个数字已经从张懿宸丁等。8.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 从每架飞机的产后老鼠心脏中标记心肌细胞的图像.P1 小鼠心脏在每横断面平面上都被标记为心肌细胞: (a) XY、(b) YZ 和 (c) XZ。这些横断面图像显示, 在 P1 小鼠心房和心室有一个有标记心肌细胞的存在。(d) 图像也被合并, 以创造一个3维的心脏渲染。嵌入的红色圆圈区域显示了两颗半透明的小鼠心 , 经过了清晰度技术 , 并入硼硅酸盐玻璃管中。刻度条: 1 毫米。这个数字已经从张懿宸丁等。8.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 成年老鼠心脏的图像显示每架飞机的 ROMK 通道.老鼠心脏在7.5 月的年龄被成像显示 ROMK 渠道的存在和位置。心脏在每横断面平面被成像: (a) XY, (b) YZ 和 (c) XZ。灰度值表示图像内的光学强度, 与亮度相对较轻的区域较轻的区域对应于光强。(d) 图像也被合并, 以创建一个3维渲染的心脏, 原始 grayscaled 图像是伪彩色的, 使 ROMK 通道出现绿色。在插入到硼硅酸盐玻璃管中后, 在嵌入的红色圆圈区域内显示了一个半透明的成年小鼠心脏。刻度条: 1 毫米。这个数字已经从张懿宸丁等。8.请点击这里查看这个数字的更大版本.
补充图 1: 在成像系统的光片内, ABS 室与硼硅酸盐管的图像.请单击此处下载此文件.
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Discussion
这里描述的 LSFM 系统和技术利用双侧照明光束和光清除相结合, 在产后和成人阶段对鼠标心脏进行图像处理。传统的单一光照光束受光子散射和吸收通过更厚和更大的组织样本1,3。双面光束为样品提供了更均匀的光照, 从而最大限度地减少了条带和其他工件在单面光照产生的图像中经常看到的效果。该技术还可以通过调整双高斯光束8的位置来提高图像的大小。这些光束的最大分离允许成像一个组织样本数毫米的大小, 如成年鼠心脏, 而单一的光照限制样本的大小, 以较小的心脏, 如斑马鱼和果蝇的心脏.
由于光散射可能在整个组织样本中不均匀, 因此在光学上不透明的组织中的荧光成像更具挑战性。这就限制了样本可以成像的深度和荧光成像的有效性。因此, 通常使用像斑马鱼这样的生物, 它自然具有光学透明组织5。然而, 为了对不自然具有光学透明皮肤的生物体进行荧光成像研究, 已经开发出不同的光交换技术来去除组织的着色。一个这样的光清除技术是清晰的, 其中的组织被放置在水凝胶, 然后孵化了很长一段时间, 最后放置在清除解决方案, 减少的反射和折射量的样品和其他媒体1 ,9。在本研究中, 对该技术进行了改进, 以减少使用的清除试剂的用量, 不需要增加真空泵或氮气8。
虽然此技术为较厚的不透明样本提供了改进的图像分辨率, 但在将来的研究中, 这一策略有一定的局限性。另外还研究了贝塞尔光束和双光子非线性励磁, 以在足够的成像深度15、16中提供更好的分辨率。这些方法目前已被用来研究较小的心脏模型, 但可以适应研究动态过程中的一个发展中胚胎。此外, 对更大的组织样本的清晰度方法的更改可以通过减少在清除过程8中可能丢失的显影数量来提高荧光成像的有效性。近年来, 我们将这一 LSFM 系统与虚拟现实相结合, 阐明了发展型心脏力学17。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望向加州大学洛杉矶分校的邵阮和淳浩表示感谢, 他们为小鼠提供了图像样本。这项研究得到了 NIH HL118650 (粽子 k Hsiai) 的资助, HL083015 (粽子 k Hsiai), HD069305 (到北卡罗来纳州和粽子 k Hsiai), HL111437 (粽子 k. Hsiai 和北卡罗来纳州), HL129727 (粽子 k Hsiai), 德克萨斯大学系统明星资助 (Juhyun李)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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