Summary
この研究は、マウスの心を研究するのに光クリアと組み合わせて両面イルミネーション ライト シート蛍光顕微鏡 (LSFM) 法を使用します。
Abstract
光シート蛍光顕微鏡は、ミリメートル単位にマイクロメータから高軸分解能高速イメージ獲得のため広く使用されています。伝統的な光シート テクニックには、単一の照明ビーム直交サンプル組織での使用が含まれます。単一の照明ビームを駆使して生産される大型サンプルの画像はストライプまたは成果物を含めるし、組織によって光の吸収と散乱のため低解像度に苦しみます。本研究では両面照射ビームと簡略化された透明度の光学マウスの心法をクリアします。これらのテクニックは、心の底から脂質を除去することによってより深いイメージングを可能にして、イメージング、10 × 10 × 10 mm3以上の大規模なフィールドを作り出します。その結果、この方法により心室の大きさを定量化、心臓の系統を追跡し心臓特異的蛋白と十分なコントラストを持つ成体マウス心に出生後からイオン チャネルの空間分布をローカライズし、解像度。
Introduction
光シート蛍光顕微鏡は、1903 年に最初に開発された技術をされ、遺伝子発現を研究する、また組織サンプル1,2,3の 3 D または 4 D モデルを生成する方法として今日使用されています。このイメージング法は、飛行機だけは探知器によってキャプチャされるようにサンプルの 1 つの平面を照らす光の薄いシートを使用します。キャプチャする、サンプルの軸方向に移動できるし、レイヤー、一度に 1 つのセクションと、取得した画像4の後処理後 3-D モデルをレンダリングします。ただし、吸収と散乱のため LSFM は、いずれかの数ミクロンまたは光学的に透明な1サンプルに制限されています。
LSFM の制限は、ゼブラフィッシュなど、光学的に透明な組織を持っている生物の広範な研究につながっています。人間とゼブラフィッシュ5,6の間保存の遺伝子があるので、心臓発生と分化を含む研究はゼブラフィッシュに行われる。これらの研究は、心筋症6,7に関連する心臓の研究の進歩につながっている、まだ哺乳類などの上位の生物に似たような研究を実施する必要性があります。
哺乳類心筋厚と組織、赤血球、および伝統的な LSFM の方法1の下でサンプルの片面照射により発生するストライピング ヘモグロビンによる吸収の不透明度のための課題します。,8します。 これらの制限を補うために提案した両面イルミネーションと屈折率マッチング ソリューション (リム) と組み合わせてわかりやすくテクニック9の簡易版を使用します。したがって、このシステムは、イメージングが8機の軸方向と横方向で良い品質の解像度を維持しながら 10 mm3 x 10 x 10 より大きいサンプルのためことができます。
このシステムでは、ガラス チューブ内の異なる構成で整理される蛍光ビーズを用いた校正された最初。その後、システムは、出生後、大人のマウスの心のイメージを使用されました。まず、7 日 (P7)、心室、心室壁の厚さ、弁構造肉の存在を明らかにするため出生後マウスの心臓をイメージしました。第二に、Cre 標識心筋と黄色い蛍光蛋白質 (YFP) 1 日 (P1) に出生後マウスの心臓を用いた心筋細胞に区別するとセルを識別するために調査しました。最後に、遺伝子療法8後腎外側延髄カリウムの存在 (ROMK) チャンネルを観察する 7.5 ヶ月で成体マウスをイメージしました。
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Protocol
動物の使用を含むすべての手続きは、カリフォルニア大学ロサンゼルス、カリフォルニア州で制度検討委員会 (IACUC) によって承認されています。
1. イメージング システム セットアップ
注: は、図 1および図 2を参照してください。
- 3 波長の連続波 (CW) レーザーを取得: 405 nm、473 nm と 532 nm。場所 2 ミラー (M1、M2) 150 mm 離れてビームに 45 ° のミラー面に合わせて整列します。
注: この手順を実行両面の照明セットアップからレーザーをリダイレクトします。結果のビームは最初のビームと同じ方向になります。 - 0 - の光学濃度範囲で、直径 25 mm の虹彩絞り/ピンホール (PH) 直径 50 mm 中性密度フィルター (NDF) を梁を渡す 4.0、ビーム拡大器 (BE) の幅で 30 mm スリット (S) ~ 0 - 6 ミリメートル、およびミラー (M3)、すべては互いから 150 mm を配置。ビームに 45 ° で、ミラー平面が付いているミラーを配置します。
- M3 から 150 mm を配置 50: 50 ビームスプリッターを介してビームを渡します。ビームスプリッターから 150 mm ミラー (M6) を置き、そのミラー平面が 45 ° 前方に放出されるビームになるよう合わせます。反射されたビームを使用して、デュアル照明光シートの片側を形成します。
- ビームスプリッターから 150 mm ミラー (M4) を置き、そのミラー平面は 45 ° ビームスプリッターから 90 ° の角度で生成されたビームになるよう。2 番目のミラー (M5) M4 から 150 mm を置き、そのミラー平面は 45 ° M6 から反射されたビームになるようです。M5 から放出されるビームを使用して、デュアル照明光シートの 2 番目の面を形成します。
- 対称的に両面照明システムを設定 (図 1参照)。1 つ円筒レンズ (CL1) [直径 (d); 1 = 焦点距離 (f) = 50 mm] 150 mm M6 デュアル照明 setu の反対側から放出されるビームに沿って 1 つの側面で別の同一円筒レンズ (CL2) M5 から放出されるビームに沿って 150 mmp. ミラーを置く 2 (M7 および M8) 各シリンドリカル レンズに合わせて 90 ° ビームを反映するように 50 mm の距離で。
- 色消しレンズのペアを形成します。最初のレンズ、L1 (d; 1 = f = 100 mm)、M7 と第二のレンズ、L2 から 100 mm (d; 1 = f = 60 mm)、L1 から 160 mm。M8 から同じ距離を置いた同一レンズ (L3、L4) とデュアル照明の他の側にこれを繰り返します。
- 場所ミラー, M9、M10、L2 および L4、レンズから 60 ミリメートル, とビームに沿って。OL1 と OL2 照明目的の場所 (d; 2 = f = 150 mm)、梁に沿って M9、M10 から 150 mm。目的から放出されるビームは、試料のイメージングのための光シートを形成します。
- アクリロニ トリル ・ ブタジエン ・ スチレン (ABS) から試料ホルダーを印刷するのに 3 D プリンターを使用します。カバーのガラスの部分を埋め込む [屈折率 (RI) = 1.4745] 室内には、屈折のミスマッチを最小限に抑えるため、照明ビームに垂直の各側に。対物レンズから放出されるビームの間にチャンバーを均等に配置します。
- ステレオ顕微鏡倍率客観的かつ科学的な相補的金属酸化物半導体 (sCMOS) カメラの照明に垂直な X 1 面 (図 2を参照) をインストールします。
2. イメージング システム校正
- 直径 0.53 μ m は、蛍光のポリスチレン ビーズを取得します。
- 1: 150, 000 に 1% 低溶融ポインティング agarose が付いて屈折率マッチング ソリューション (リム) のビーズ ソリューションを希釈して蛍光ビーズ サンプルを準備します。30 mm の距離に 12 mm の内径と外径 18 mm のホウケイ酸ガラス管の部分をカットします。
メモ: ホウケイ酸ガラス管は、屈折 (1.47) を一致するように使用されます。 - 1% の agarose が付いて希薄ビード サンプルをミックスし、ビーズ/アガロース溶液をピペット ホウケイ酸チューブに。常温 (23 ° C) を固めるアガロースを許可します。
- 99.5% グリセロールの解決で (ステップ 1.7) から ABS 室を埋めます。チャンバー内ビーズを含むホウケイ酸ガラス管を配置します。それはデュアル照明システムが作成したガウス ビームの中心部で、イメージング システムの ABS のチャンバーを配置します。
- 三次元電動並進ステージを付ける動きと ABS チャンバー内サンプルの向きを制御するホウケイ酸ガラス管 (補足図 1を参照)。
- 30 フレーム/秒 (fps) のレートで sCMOS カメラを使用して画像を取得します。モーター コント ローラーを使用して、横方向にサンプル 1 mm を移動し、sCMOS カメラを使用して各 1 mm ピッチで画像を取得します。サンプル全体のイメージまで続行します。
- 可視化ソフトウェアを使用して取得した画像をスタック (材料の表を参照してください)。これらのビーズ画像を用いたシステムの点拡がり関数 (PSF) を測定します。画像は、後の手順で処理中にデコンボリューションのこの PSF を使用します。
3. サンプル準備
- P1 野生型マウスと Rosa26 YFP 遺伝子をもつ二重ヘテロ接合体 sarcolipin Cre knockin マウスからの心を解剖 (SlnCre/+;R26YFP 記者/+) P7 で。
注: 安楽死ペントバルビ タールとロビンスらで説明する手法を使用して実行されました。10. 国民の中心、肺および血の協会 (NHLBI)10,11で説明する手法によると郭清を行った。 - 前述のケビン成らによってネズミの心のクリア化学を実行します。12。
注: 使用されている化学物質、有毒であるので次の手順が実行ヒューム フードにする必要があります。- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 3 × 1 で心を洗い 10 分 x。洗浄した後、4% パラホルムアルデヒド溶液に心を置き、4 ° C でこれらのサンプルを一晩インキュベートします。
- 4% アクリルアミド溶液 0.5 %w/v 2, 2'-アゾビス塩酸にサンプルを配置します。4 ° C で一晩インキュベートするサンプルを許可します。一晩インキュベートした後、サンプルを削除し、2-3 h の 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
- PBS でサンプルをすすいで 8 %w/v ドデシル硫酸ナトリウムと 1.25 %w/v ホウ酸溶液に配置。彼らが明らかになるまでは、37 ° C でサンプルをインキュベートします。試料の厚みに応じて数時間をかかるでしょう。後、サンプルを削除し、リン酸緩衝生理食塩水 x 1 に 1 日置いてください。
- 40 g イオン密度勾配媒体の解決策に一致する屈折の準備 (材料の表を参照してください) 0.02 M のリン酸バッファー (PB) は、0.1% アジ化ナトリウム、Tween 20 と 0.01% の 30 mL で。水酸化ナトリウム 7.5 の pH にソリューションをもたらします。
- 屈折率 1.46 1.48 と 1% のアガロースのリムにクリアされたサンプルを配置します。ホウケイ酸ガラス管に試料を挿入でき、アガロース室温 (23 ° C) で凝固します。
- 三次元電動並進ステージを動きを制御するホウケイ酸ガラス管に接続し、3次元内でサンプルの向き印刷 ABS 商工会議所 (補足図 1を参照)。
4. 成人の心臓イメージング
- 2 月野生型 (C57BL/6) マウスの尾静脈に 100 μ L のボリュームの特定の心臓トロポニン T プロモーター (cTnT) と緑色蛍光タンパク質 (GFP) を含む 10 型アデノ随伴ウイルスベクター 9 の12ウイルス (AAV9) x 8.7 を挿入します。
注: AAV9 元らによって記述された手法によると開発されました。13。 これが原因で腎外側延髄カリウム チャネル (ROMK) AAV9 cTnT ROMK GFP を生産にバインドする GFP (材料の表を参照してください)。 - NHLBI11で説明する手法によると年齢の 7.5 ヶ月で成体マウスの心を解剖します。ステップ 3.1 3.3 を使用してサンプルを準備します。
- 電動アクチュエータにモーター コント ローラーを接続します。アクチュエータの動きを制御するホウケイ酸ガラス管を付けるし、3次元内でサンプルの向き印刷 ABS 商工会議所。
- サンプルの位置で、デュアル照明システムが作成したガウス ビームの中心です。100 fps のレートで sCMOS カメラを使用して画像を取得します。
- モーター コント ローラーを使用すると、軸方向にサンプル 1 mm を移動し、sCMOS カメラで各 1 mm ピッチで画像を取得します。サンプル全体のイメージまで続行します。
注: システムは、独自に開発した計測器制御ソフトウェアによって制御されます。 - 可視化ソフトウェアを使用して取得した画像をスタック (材料の表を参照してください)。これらの画像のスタックと可視化ソフトウェア14を使用して 3次元画像を開発します。取得した画像のスタックのステップ 2.6 から PSF を deconvolve します。心の輪郭を観察し、この輝度に基づく画像を擬似カラーを追加ピクセルのしきい値の輝度値を設定します。
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Representative Results
ここで説明する手法は深いイメージング深さと十分な解像度の画像 (図 1) とより大きい画像ボリュームを達成するためにマウス心臓組織サンプルの光クリアと組み合わせて両面照射ビームを使用しました。システムを校正するため、蛍光ビーズ イメージング システム内でガラス管の中に置かれました。ビーズがイメージ x y 平面、y-z 平面で可視化し、x-z 平面にしてポイントを取得広がるシステム8関数 (PSF)。システム校正制作 d横≈ の横方向の解像度 2.8 μ m と dXZ ≈ 17.4 μ m と dYZ ≈ 17.9 μ m 埋め込み中8としてグリセロールを使用するときの軸方向の解像度。
校正用、蛍光ビーズが使用された後、イメージング システムは画像マウス中心の 1 日目と 7 日出生後 (図 2)8時に使用されました。心室キャビティ寸法、心臓弁、心室の肉は、マウス中心のこれらのイメージで明白であります。心の中で心筋への分化を研究するには、Cre 標識心筋とノッキン ヘテロマウスを出生後イメージしました。Cre 標識心筋細胞の画像は、心8 (図 3) の 3-D レンダリングとともに各平面方向にあります。
出生後マウスを検討するほか、イメージング システムは大人マウス心臓の研究にも使われました。最初に、マウスの心臓に GFP タグ ROMK チャンネルを導入する遺伝子治療が使用されました。7.5 ヶ月でマウスの心臓をイメージしました、これら ROMK チャンネル心室壁 (図 4) で, 可視化されました。プロシージャ内でこのステップ系の大規模なサンプルをイメージし、心の中で組織学的染色で見られない構造を区別する方法を示します。図 4は、心8の 3-D レンダリングとともに各平面方向から ROMK チャンネルを示しています。
図 1: 光シート蛍光顕微鏡システムの概略図。これは、コンポーネントとシステムで使用されるコンポーネントの焦点距離の長さの間の距離を含めて、光シート蛍光顕微鏡システムの 3 次元レンダリングです。この図はイーチェン鼎らから変更されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 検出光シート顕微鏡システムの平面図します。これは暗い青色の領域がシステム内でそれぞれの場所でビームを表します両面照明顕微鏡システムの平面図です。無彩色のダブレットと照明目的で構成される領域の 1 つを説明する 2 次元拡大セクションには含まれます。この拡大されたセクションはまた、光シート形成の原理とデュアル両面フォーム照明に梁を結合する方法を示します。この図はイーチェン鼎らから変更されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 出生後マウス心臓の 3次元イメージ。(、) このパネル イメージを示しています出生後マウスの心臓の心室キャビティを表示 7 日目で。(b) このパネルは、心室の壁の厚さを示す 7 日目で出生後マウスの心臓の画像を示しています。(c) このパネル弁構造の位置を示す 1 日目に出生後マウスの心臓の画像を示しています。(d) この画像は、心臓の心房にある櫛状筋を示す 1 日目に出生後マウス中心から拡大されたセクションを示します。(e) この画像は、1 日目に出生後マウスの心臓内の心室で肉を示します。スケール バー: 1 mm。はめ込み内の赤い円で囲まれた領域は、わかりやすく技術とホウケイ酸ガラスの管に挿入されるを経て 2 つの半透明マウス心を示しています。この図はイーチェン鼎らから変更されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 各平面から心臓の出生後のマウスで Cre 標識心筋細胞の画像。P1 マウスの心臓を各断面平面における心筋細胞 Cre ラベルとイメージしました: (、) XY、YZ、(b) および (c) XZ。これらの断面画像は、アトリウムと P1 マウスの心室で Cre 標識心筋細胞の存在を表示します。(d) 心の 3-D レンダリングを作成するも合成されました。はめ込み内の赤い円で囲まれた領域は、わかりやすく技術とホウケイ酸ガラスの管に挿入されるを経て 2 つの半透明マウス心を示しています。スケール バー: 1 mm。この図はイーチェン鼎らから変更されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 各平面から ROMK チャンネル アダルト マウスの心臓の画像。マウスの心臓を存在を示した年齢の 7.5 ヶ月と ROMK チャンネルの場所でイメージしました。各断面の平面にイメージを作成した中心部: (、) XY、YZ、(b) および (c) XZ。グレー スケール値より多くの光の強度と以下の照度に対応する暗い領域に対応する明るい部分と、イメージ内の光強度を示します。(d) 画像も心の 3-D レンダリングを作成する合併し、grayscaled 原画だった疑似カラー ROMK チャンネル表示緑。はめ込み内の赤い円で囲まれた領域は、わかりやすく技術とホウケイ酸ガラスの管に挿入されるを経て単一の半透明の大人マウス心臓を示しています。スケール バー: 1 mm。この図はイーチェン鼎らから変更されています。8.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: イメージング システムの光のシート内で、管の ABS の部屋のイメージ。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
LSFM システムとここで説明する手法は、その開発の出生後の大人の段階からイメージ マウスの心臓に光クリアと組み合わせて両面照射ビームを採用しています。伝統的な単一の照明光は光子散乱と吸収より厚くより大きい組織のサンプル1,3から苦しんでいます。両面梁は、サンプルでは、ストライピングや一方的な照明によって生成された画像で見られる他のアーティファクトの影響を最小限に抑えることのより均一な照明を提供します。この手法では、デュアル ガウスビーム8の位置を調整することでイメージを作成することができますサンプルのサイズも大きくなります。これらの梁の最大分離によりイメージング組織サンプル サイズ、大人マウス心臓などに数ミリの単一の照明は、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエの心など小さい心にサンプルのサイズを制限されるに対し.
蛍光イメージング光学的に透明ではない組織では、光散乱生体試料全体に均一ではないかもしれないので、詳細は難しいです。これは、制限に深さおよび蛍光イメージングの効果をサンプルのイメージを作成することができます。このため、光学的透明組織5が当然ある、ゼブラフィッシュなどの生物を使用する一般的です。ただし、蛍光イメージング光学的透明肌を当然持っていない生物に関する研究を行う組織の着色を削除する開発されている異なる光クリア方法があります。このような光のクリアリング技法の 1 つは明快さ、どこ組織は、ハイドロゲル、長期間インキュベート、最後に配置反射とサンプルと他のメディア1 間の屈折の量を低減する決済ソリューションで ,9。本研究ではこの手法はクリア使用される試薬の量を減らすように変更され、真空ポンプまたは窒素ガス8の添加を必要としません。
この手法では厚く不透明なサンプルのためのモデルが用意されていますが、改善された画像の解像度、将来の研究で改善される可能性がこの戦略に制限があります。追加の研究は、ベッセル梁と十分なイメージング深さ15,16でよりよい解決を提供する 2 光子非線形励起と行われています。これらのメソッドは、現在の心臓の小さいモデルを研究に使用されているが、胚内の動的過程の研究に適応することができます。また、わかりやすく方法の変更より大きい組織サンプルは可能性の同時の数を減らすことによって蛍光イメージングの有効性を改善できるため中に失われるクリア8を処理します。最近、私たちは発達心臓力学17を明らかにするバーチャル ・ リアリティがこの LSFM システムを統合されています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、イメージへマウス サンプルを提供するためカリフォルニア大学ロサンゼルス校からグエン ・ テ ・ タオと中野敦に感謝を表したいと思います。この研究は、NIH の HL118650 (Tzung, Hsiai) に、HL083015 (Tzung, Hsiai) に、(N. C. チーと Tzung k. Hsiai.) に HD069305、HL111437 (Tzung, Hsiai n. C. チーし)、HL129727 (Tzung, Hsiai) に、テキサス大学システムは補助金の星 (柱賢への資金によって支えられました。イ)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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