Summary
Denna studie använder en dubbelsidig belysning ljus ark fluorescence mikroskopi (LSFM) teknik kombinerat med optisk clearing för att studera murina hjärtat.
Abstract
Ljus-ark fluorescensmikroskopi har använts för snabb bild förvärv med en hög axiell upplösning från mikrometer till millimeter skala. Traditionella ljus ark tekniker innebär användning av en enda belysning stråle riktad vinkelrätt mot vävnadsprover. Bilder av stora prover som produceras med hjälp av en enda belysning balk innehålla ränder eller artefakter och lider av en minskad upplösning tack vare spridningen och ljus absorberas av vävnaden. Denna studie använder en dubbelsidig belysning balk och en förenklad tydlighet optiska clearing teknik för murina hjärtat. Dessa tekniker möjliggör djupare imaging genom att ta bort lipider från hjärtat och producera ett stort fält av imaging, större än 10 x 10 x 10 mm3. Som ett resultat, denna strategi gör det möjligt att kvantifiera de ventrikulära dimensionerna, spåra hjärt härstamning och lokalisera den rumsliga fördelningen av hjärt-specifika proteiner och jonkanaler från den postnatala till vuxen mus hjärtan med tillräcklig kontrast och upplösning.
Introduction
Ljus-ark fluorescensmikroskopi var en teknik som utvecklades först 1903 och används idag som en metod att studera genuttryck och också att producera 3D- eller 4-D modeller av vävnad prover1,2,3. Detta imaging metoden använder en tunn plåt av ljus att lysa upp ett enda plan ett urval så att endast det planet fångas av detektorn. Provet kan då flyttas i axiell riktning-att fånga varje lager, ett avsnitt i taget, och rendera en 3D-modell efter efterbehandling av förvärvade bilder4. Dock på grund av absorption och spridning av fotoner, har LSFM begränsats till prover som är antingen några mikrometer tjock eller optiskt transparent1.
Begränsningar i LSFM har lett till omfattande studier av organismer som har vävnader som är optiskt transparenta, såsom zebrafiskar. Studier på hjärt utveckling och differentiering genomförs ofta zebrafiskar eftersom det finns bevarade gener mellan människor och zebrafiskar5,6. Även om dessa studier har lett till framsteg i hjärt forskning som rör kardiomyopatier6,7, finns det fortfarande ett behov av att genomföra liknande forskning på högre organismer såsom däggdjur.
Hjärt däggdjursvävnader utmaning en på grund av tjockleken och opacitet av vävnad, upptaget på grund av hemoglobin i röda blodkroppar och den striping som uppstår p.g.a. ensidig belysning av provet enligt traditionell LSFM metoder1 , 8. för att kompensera för dessa begränsningar, vi föreslagit att använda dubbelsidiga belysning och en förenklad version av klarhet teknik9 kombinerat med ett brytningsindex på lösningen (fälgar). Detta system möjliggör därför avbildning av ett prov som är större än 10 x 10 x 10 mm3 samtidigt bibehålla en bra upplösning i axiell och laterala plan8.
Detta system var först kalibreras med hjälp av fluorescerande pärlor arrangerade i olika konstellationer inom glas slangen. Systemet användes sedan till bild efter förlossning och vuxen murina hjärtan. Det första fotograferades postnatal mus hjärtat på 7 dagar (P7) att avslöja den ventrikulära kaviteten, tjockleken på ventrikulära väggen, ventil strukturer och förekomsten av trabeculation. För det andra, en studie genomfördes för att identifiera celler som skulle differentieras till hjärtmuskelcellerna genom en postnatal mus hjärtat på 1 dag (P1) med Cre-märkt hjärtmuskelceller och gula fluorescerande protein (YFP). Slutligen var vuxna möss vid 7,5 månader avbildas för att observera förekomsten av nedsatt yttre medullär kalium (ROMK) kanaler efter gen terapi8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla sådana förfaranden som inbegriper användning av djur har godkänts av den institutionella granskning kommittéer (IACUC) vid University of California, Los Angeles, Kalifornien.
1. imaging System Setup
Obs: Se figur 1 och figur 2.
- Hämta en kontinuerlig våg (CW) laser med 3 våglängder: 405 nm, 473 nm och 532 nm. Plats 2 speglar (M1 och M2) 150 mm isär och justera dem med sina spegel plan vid 45° till balken.
Obs: Detta steg utförs för att omdirigera laser från den dubbelsidiga belysning setup. Resulterande balken kommer att vara i samma riktning som den första strålen. - Passera strålen genom ett 25 mm diameter irisbländare/hål (PH), en 50-mm diameter neutral densitet filter (NDF) med en optisk densitet rad 0 - 4.0, en balk expander (BE), en 30 mm springa (S) med bredd ~ 0 - 6 mm och en spegel (M3) , alla placerade 150 mm från varandra. Placera spegeln med dess spegel plan vid 45° till balken.
- Passera strålen genom en 50: 50 stråldelare placerat 150 mm från M3. Placera en spegel (M6) 150 mm från stråldelare och justera den så att dess spegel planet är i 45° till balken som avges i riktning framåt. Använd den reflekterade strålen bildar ena sidan av bladet dual-belysning ljus.
- Placera en spegel (M4) 150 mm från stråldelare och justera den så att dess spegel planet är i 45° till bjälken var som avges i en 90° vinkel från stråldelare. Placera en andra spegel (M5) 150 mm från M4 och justera den så att dess spegel planet är i 45° till strålen reflekteras från M6. Använd balken som avges från M5 för att bilda den andra sidan av arket dual-belysning ljus.
- Ställa in systemets dubbelsidiga belysning i en symmetrisk mode (se figur 1). Placera en cylindrisk lins (CL1) [diameter (d) = 1; brännvidd (f) = 50 mm] 150 mm i linje med balken som avges från M5 på ena sidan och en annan identisk cylindrisk lins (CL2) 150 mm i linje med balken som avges från M6 på andra sidan av den dubbla-belysning setu s. Placera 2 speglar (M7 och M8) varje i linje med de cylindriska linserna på ett avstånd av 50 mm att återspegla balken på 90 °.
- Bilda en akromatisk doublet från ett par linser. Placera den första linsen, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm från M7 och andra linsen, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm från L1. Upprepa detta på andra sidan av den dubbla-belysningen med identiska objektiv (L3, L4) placeras på samma avstånd från M8.
- Plats speglar, M9 och M10, 60 mm från linser L2 och L4, respektive, och i linje med balken. Placera belysning mål, OL1 och OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm från M9 och M10 och i linje med balken. Balken som avges från målen bildar ljus arket för imaging proverna.
- Använda en 3D-skrivare för att skriva ut provhållaren från akrylnitril-butadien-styren (ABS). Bädda in en cover glasbit [brytningsindex (RI) = 1.4745] på varje sida av kammaren, vinkelrätt mot belysning balken, att minimera brytningsindex obalansen. Jämnt placera kammaren mellan balkar som avges från objektiv.
- Installera en stereo Mikroskop med 1 X förstoring mål och en vetenskaplig kompletterande metalloxid halvledare (sCMOS) kamera vinkelrätt mot belysning plan (se figur 2).
2. imaging System kalibrering
- Hämta fluorescerande polystyren pärlor som är 0,53 μm i diameter.
- Förbereda det fluorescerande pärla provet genom att späda ut pärla lösningen i en brytningsindex matchande lösning (fälgar) med 1% low-melt pekar agaros till 1:150, 000. Skär en bit av borosilikatglas rör med en inre diameter på 12 mm och en ytterdiameter på 18 mm till en längd av 30 mm.
Obs: Borosilikatglas slangen används för att matcha brytningsindex (1,47). - Blanda det utspädda pärla provet med 1% agaros och Pipettera pärla/agaros lösningen i borosilikatglas slangen. Tillåta Agarens stelna i rumstemperatur (23 ° C).
- Fyll ABS kammaren (från steg 1,7) med en 99,5% glycerol lösning. Placera borosilikatglas slangen som innehåller pärlor inne i kammaren. Placera ABS kammaren i imaging system så att det är i mitten av Gaussisk strålen skapas av dubbla belysning systemet.
- Bifoga en 3D-motoriserad translationell scenen i borosilikatglas slangen att kontrollera rörelsen och läggning av provet i ABS kammaren (se kompletterande Figur1).
- Hämta bilder med hjälp av sCMOS kamera med en hastighet av 30 bilder per sekund (fps). Med motor controller, flytta provet 1 mm i sidled riktning och skaffa bilder på varje 1-mm ökning med sCMOS kamera. Fortsätt tills hela provet har varit avbildad.
- Stapla förvärvade bilderna med en visualisering programvara (se Tabell för material). Mät punkt sprida funktion (PSF) systemet med hjälp av dessa pärla bilder. Använd denna polyesterstapelfibrer för deconvolution under bildbehandling i senare steg.
3. provberedning
- Dissekera hjärtan från en vild typ P1 mus och en dubbel heterozygot sarcolipin-Cre knockin mus med Rosa26-YFP genen (SlnCre / +; R26YFP reporter / +) på P7.
Obs: Eutanasi utfördes med hjälp av pentobarbital och den teknik som beskrivs av Robbins et al. 10. dissektion utfördes enligt den teknik som beskrivs av nationella hjärta, lungor och blod Institute (NHLBI)10,11. - Utföra en kemisk clearing av murina hjärtan som beskrivs av Kevin Sung o.a. 12.
Obs: Följande steg bör utföras i dragskåp eftersom de kemikalier som används är giftiga.- Skölj hjärtan 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 3 x 10 min. Efter sköljning, placera hjärtan i en lösning med 4% i PARAFORMALDEHYD och inkubera dessa prover vid 4 ° C över natten.
- Placera proverna en 4% akrylamid lösning innehållande 0,5% w/v i 2, 2'-Azobis sapropterindihydroklorid. Möjliggöra proven till Inkubera vid 4 ° C över natten. Efter den natten inkubationen, ta bort proverna och inkubera dem vid 37 ° C i 2-3 h.
- Skölj av prov med PBS och sedan placera dem i en lösning av 8% w/v sodium dodecyl sulfate och 1,25% w/v borsyra. Inkubera proverna vid 37 ° C tills de är klara. Detta kan ta flera timmar beroende på tjockleken på provet. Efter röjning, ta bort proverna och placera dem i 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning för 1 dag.
- Förbereda ett brytningsindex på lösningen med 40 g Nonjonaktivt täthet lutning medium (se Tabell för material) i 30 mL 0,02 M fosfatbuffert (PB), 0,1% Tween-20 och 0,01% natriumazid. Ge lösningen ett pH på 7,5 med natriumhydroxid.
- Lägg rensade provet i fälgar med brytningsindex 1,46-1.48 och 1% agaros. Sätt provet i borosilikatglas slangar och tillåta Agarens stelna i rumstemperatur (23 ° C).
- Bifoga en 3D-motoriserad translationell scenen i borosilikatglas slangen att kontrollera förflyttning och orientering av provet inom 3-D tryckt ABS kammare (se kompletterande Figur1).
4. vuxen hjärta avbildning
- Injicera 8,7 x 1012 virus av typen adeno-associerade virus vektor 9 (AAV9) som innehåller ett hjärt-specifika troponin T arrangören (cTnT) och grönt fluorescerande protein (GFP) i en 100-μL volym i svansen ven av en 2-månaders vildtyp (C57BL/6) mus.
Obs: AAV9 utvecklades enligt den teknik som beskrivs av Yuan et al. 13. Detta medför GFP att binda till den nedsatt yttre medullär kaliumkanal (ROMK) producerar AAV9-cTnT-ROMK-GFP (se Tabell för material). - Dissekera vuxen mus hjärtan vid 7,5 månader ålder enligt den teknik som beskrivs av NHLBI11. Bereda proverna med steg 3.1-3.3.
- Anslut MoCo motor manöverdonet. Fästa ställdonet till borosilikatglas slangen att kontrollera förflyttning och orientering av provet inom 3-D tryckt ABS kammare.
- Placera provet så att det är i mitten av Gaussisk strålen skapas av dubbla belysning systemet. Hämta bilder med hjälp av sCMOS kamera med en hastighet av 100 fps.
- Med motor controller, flytta provet 1 mm i axiell riktning och skaffa bilder på varje 1-mm ökning med sCMOS kameran. Fortsätt tills hela provet har varit avbildad.
Obs: Systemet styrs av en egen utvecklad instrument-styrprogram. - Stapla förvärvade bilderna med en visualisering programvara (se Tabell för material). Utveckla 3D-bilder med hjälp av dessa bildstaplar och visualisering programvara14. Deconvolve polyesterstapelfibrer från steg 2,6 med den förvärvade bildstapel. Ange ett pixelvärde tröskel intensitet att iaktta konturerna av hjärtat och lägga till pseudo färg i bilderna baserat på denna gråskala intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den teknik som beskrivs används här en dubbelsidig belysning balk kombineras med en optisk clearing av mus hjärtat vävnadsprover för att uppnå en djupare imaging djup och en större imaging volym med tillräcklig imaging upplösning (figur 1). För att kalibrera systemet, placerades fluorescerande pärlor inuti glas slangen och inom imaging system. Pärlor var sedan avbildas och visualiseras i x-y-planet, y-z-planet, och i det x-z-planet, för att få punkten sprida funktion (PSF) för systemet8. Systemet kalibrering produceras en resolution i lateral riktning mot dlaterala ≈ 2.8 µm och en upplösning i axiell riktning dXZ ≈ 17,4 µm och dYZ ≈ 17,9 µm när du använder glycerol som den inbäddning medium8.
Efter de fluorescerande pärlorna användes för kalibrering, användes det imaging systemet till bild mus hjärtan på 1 dag och 7 dagar efter förlossning (figur 2)8. Den ventrikulära kaviteten dimensioner, hjärtklaffar och ventrikulära trabeculation är påtaglig i dessa bilder av mus hjärtat. För att studera en hjärtmuskelcellen differentiering inom hjärtat, var heterozygota knockin möss med Cre-märkt hjärtmuskelcellerna avbildade efter förlossning. Bilder av Cre-märkt hjärtmuskelcellerna finns i varje plan riktning tillsammans med en 3D-rendering av hjärtat8 (figur 3).
Förutom att studera postnatal möss, användes också bildgivande systemet att studera vuxen mus hjärtat. Inledningsvis användes genterapi att introducera GFP-märkta ROMK kanaler in i musen hjärtat. Vid 7,5 månader, mus hjärtat fotograferades och dessa ROMK kanaler var visualiserat i ventrikulära väggen (figur 4). Detta steg inom förfarandet illustrerar möjligheten för detta system bild stora prover och skilja strukturer inte sett med histologiska färgning inom hjärtat. Figur 4 visar de ROMK kanalerna från varje planet riktning tillsammans med en 3D-rendering av hjärtat8.
Figur 1 : Schematisk bild av systemets ljus ark fluorescence mikroskopi. Detta är en 3-dimensionell rendering av ljus ark fluorescence mikroskopi systemet, inklusive avstånden mellan komponenterna och brännvidder av de komponenter som används i systemet. Denna siffra har ändrats från JAD Ding o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Top view ljus ark mikroskopi system med detektion. Detta är ovanifrån av dubbelsidiga belysning mikroskopi systemet där regionen mörka blå representerar balken på varje plats inom systemet. Ingår en 2-dimensionell utvidgade avsnitt som visar en av de regioner som består av målet akromatisk dubletter och belysning. Detta utvidgade avsnitt visar också principen om lätta blad bildande och hur balkarna kombineras för att bilda en dubbelsidig belysning. Denna siffra har ändrats från JAD Ding o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : 3D-bilder av postnatal murina hjärtat. (en) i denna panel visas en bild av postnatal mus hjärtat dag 7 visar ventrikeln hålrummet. (b) i denna panel visas en bild av postnatal mus hjärtat dag 7 visar tjockleken på ventrikeln väggen. (c) i denna panel visas bilden av postnatal mus hjärtat på dag 1 som visar placeringen av strukturerna som ventil. (d) denna bild visar en förstorad avsnitt från postnatal mus hjärtat på dag 1 som visar en pectinate muskel som ligger i atrium av hjärtat. (e) denna bild visar trabeculation i ventrikeln inom postnatal mus hjärtat vid dag 1. Skalstapeln: 1 mm. Röda inringade regionen inom infällt visar två genomskinliga mus hjärtan efter att ha genomgått den tydlighet tekniken och som infogas i borosilikatglas slangen. Denna siffra har ändrats från JAD Ding o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bilder av Cre-märkt hjärtmuskelcellerna i en postnatal mus hjärta från varje plan. P1 mus hjärtat fotograferades med Cre-märkt hjärtmuskelcellerna i varje tvärsnitt plan: (en) XY, (b), YZ, och (c), XZ. Dessa tvärsnittsdata bilder visar förekomsten av Cre-märkt hjärtmuskelcellerna i atrium och ventrikeln P1 musen. (d) bilderna slogs också för att skapa en 3D-rendering av hjärtat. Röda inringade regionen inom infällt visar två genomskinliga mus hjärtan efter att ha genomgått den tydlighet tekniken och som infogas i borosilikatglas slangen. Skalstapeln: 1 mm. Denna siffra har ändrats från JAD Ding o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Vuxen mus hjärtbilder visar de ROMK kanalerna från varje plan. Mus hjärtat fotograferades vid 7,5 månader att Visa närvaro och läge av ROMK kanaler. Hjärtat fotograferades i varje tvärsnitt plan: (en) XY, (b), YZ, och (c), XZ. Gråskalan värdet anger den optiska intensiteten i bilden, med ljusare områden motsvarar mer ljusintensitet och de mörka regionerna motsvarar mindre ljusintensitet. (d) bilderna slogs också för att skapa en 3D-rendering av hjärtat, och de ursprungliga grayscaled bilderna var pseudo färgade så att de ROMK kanalerna visas gröna. Röda inringade regionen inom infällt visar en enkel genomskinlig vuxen mus hjärtat efter att ha genomgått den tydlighet tekniken och som infogas i borosilikatglas slangen. Skalstapeln: 1 mm. Denna siffra har ändrats från JAD Ding o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: bilden av ABS kammaren med Borsilikat slangen inom arket ljus för bildsystem. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LSFM system och teknik som beskrivs här använder tredjeparts en dubbelsidig belysning balk kombineras med en optisk clearing till bild mus hjärtat på postnatal och vuxna stadier av sin utveckling. En traditionell enda belysning balk lider photon spridning och absorption genom tjockare och större vävnad prover1,3. Dubbelsidiga balkar ger en mer jämn belysning av provet, vilket minimerar effekten av striping och andra artefakter som ofta ses i bilder som produceras av en ensidig belysning. Denna teknik ökar också storleken på provet som kan avbildas genom att justera positionen för den dubbla Gaussiska balkar8. Maximal separation av dessa balkar möjliggör imaging ett vävnadsprov flera millimeter i storlek, såsom vuxen mus hjärtat, medan en enda belysning begränsade storleken på provet mindre hjärtan såsom hjärtan zebrafiskar och Drosophila .
Fluorescens imaging i vävnader som inte är optiskt transparent är mer utmanande eftersom ljusspridning inte kan vara enhetlig inom hela vävnadsprov. Detta begränsar i djupet till som ett prov kan avbildas och effektiviteten av fluorescens imaging. Av denna anledning är det vanligt att använda organismer såsom zebrafiskar, som naturligt har optiskt genomskinlig vävnad5. Det finns dock för att utföra fluorescens bildtagningsstudier på organismer som inte naturligt har optiskt transparent hud, olika optiska clearing tekniker som har utvecklats för att ta bort färgning av vävnaden. En sådan optisk clearing teknik är tydlighet, där vävnaden är placerade i en hydrogel, sedan inkuberas under en lång tid och slutligen placeras i en clearing-lösning som minskar mängden reflexion och refraktion mellan provet och andra medier1 ,9. I denna studie, denna teknik ändrades för att minska mängden clearing reagens som används och kräver inte tillsats av vakuumpumpar eller kväve gas8.
Även om denna teknik ger en förbättrad bildupplösning för tjockare ogenomskinliga prover, finns det begränsningar för denna strategi som skulle kunna förbättras i framtida studier. Ytterligare studier har utförts med Bessel-balkar och en två-photon ickelinjära magnetisering att ge en bättre upplösning tillräckliga imaging djup15,16. Dessa metoder har för närvarande används för att studera mindre hjärt modeller men kan anpassas för att studera de dynamiska processerna inom ett växande embryo. Ändringar i metoden tydlighet för större vävnadsprover kan förbättra effektiviteten i fluorescerande imaging genom att minska antalet fluorophores som kan potentiellt också förlorade under röjningen bearbeta8. Nyligen har vi integrerat detta LSFM system med virtuell verklighet att belysa utvecklingsmässiga kardiell mekanik17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill uttrycka tacksamhet till Thao Nguyen och Atsushi Nakano från UCLA för att tillhandahålla möss provet till bild. Denna studie stöddes av bidrag NIH HL118650 (till Tzung K. Hsiai), HL083015 (till Tzung K. Hsiai), HD069305 (till N. C. Chi och Tzung K. Hsiai.), HL111437 (till Tzung K. Hsiai och N. C. Chi), HL129727 (till Tzung K. Hsiai) och University of Texas stjärnor finansiering (till Juhyun Lee).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
