Summary
Denne studien bruker en tosidig belysning lys arks fluorescens mikroskopi (LSFM) teknikk kombinert med optisk avregning for å studere murine hjertet.
Abstract
Lys arks fluorescens mikroskopi er mye brukt for rask bildeopptak med høy aksiell oppløsning fra mikrometer millimeter skala. Tradisjonelle lys arks teknikker innebærer bruk av en enkelt belysning bjelke ortogonalt rettet eksempel vev. Bilder av store prøver som er produsert ved hjelp av en enkelt belysning bjelke inneholder striper eller gjenstander og lider en redusert oppløsning spredning og absorpsjon av lys av vev. Denne studien bruker en tosidig belysning stråle og en forenklet KLARHET optisk fjerne teknikk for murine hjertet. Disse teknikkene tillater dypere bildebehandling ved å fjerne lipider fra hjertet og produsere et stort felt av bildebehandling, større enn 10 x 10 x 10 mm3. Som et resultat, denne strategien kan vi kvantifisere ventrikkel dimensjonene, spore cardiac slektslinje og lokalisere den romlige fordelingen av hjerte-spesifikke proteiner og ion-kanaler fra den postnatal til voksen mus hjerter med tilstrekkelig kontrast og oppløsning.
Introduction
Lys arks fluorescens mikroskopi var en teknikk utviklet i 1903, og brukes i dag som å studere genuttrykk og også å produsere 3D eller 4 D modeller vev prøver1,2,3. Denne tenkelig metoden bruker et tynt ark av lys til å lyse opp et enkelt fly av en prøve slik at bare det flyet er fanget av detektoren. Prøven kan deretter flyttes i aksial-retning å fange hvert lag, ett avsnitt om gangen, og gjengi en 3D modell etter post-prosessering av ervervet bilder4. Men absorpsjon og spredning av fotoner, har LSFM vært begrenset til prøvene som enten få mikrometer tykke eller optisk gjennomsiktig1.
Begrensningene for LSFM har ført til omfattende studier av organismer som har vev som er optisk gjennomsiktige, som sebrafisk. Studier med hjerte utvikling og differensiering er ofte utført på sebrafisk siden det er bevart gener mellom mennesker og sebrafisk5,6. Selv om disse studiene har ført til fremskritt i cardiac forskning knyttet til cardiomyopathies6,7, er det fortsatt behov for å utføre lignende forskning på høyere nivå organismer som pattedyr.
Pattedyr hjerte vev presenterer en utfordring på grunn av tykkelse og tetthet av vev, opptaket på grunn av hemoglobin i røde blod celler og striping som oppstår grunnet ensidig belysning av prøven under tradisjonelle LSFM metoder1 , 8. for å kompensere for disse begrensningene, vi foreslått å bruke tosidig belysning og en forenklet versjon av KLARHET teknikk9 kombinert med en brytningsindeks matchende løsning (FELGER). Derfor lar dette systemet for avbilding av et utvalg som er større enn 10 x 10 x 10 mm3 mens opprettholde en god oppløsning i aksial og lateral fly8.
Dette systemet ble først kalibrert med fluorescerende perler ordnet i forskjellige konfigurasjoner i glass slangen. Da ble systemet brukt å image postnatal og voksen murine hjerter. Først ble postnatal musen hjertet avbildet på 7 dager (P7) å avsløre ventrikkel hulrom, tykkelsen på ventrikkel veggen, ventil strukturer og tilstedeværelsen av trabeculation. For det andre, en studie ble utført for å identifisere celler som vil differensiere i cardiomyocytes ved å bruke et postnatal musen hjerte i 1 dag (P1) med grobunn-merket cardiomyocytes og gule fluorescerende protein (YFP). Til slutt, voksen mus på 7,5 måneder ble fotografert for å observere tilstedeværelsen av nyre ytre medullær kalium (ROMK)-kanaler etter gene terapi8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr har blitt godkjent av institusjonelle gjennomgang komiteer (IACUC) ved University of California, Los Angeles, California.
1. imaging System Setup
Merk: Se figur 1 og figur 2.
- Hente med 3 bølgelengder kontinuerlige bølgen (CW) laser: 405 nm, 473 nm og 532 nm. Sted 2 speil (M1 og M2) 150 mm fra hverandre og justere dem med flyene sine speil på 45° av strålen.
Merk: Dette trinnet utføres for å omdirigere laser fra tosidig belysning oppsett. Den resulterende strålen vil være i samme retning som den første strålen. - Passerer strålen gjennom et 25 mm diameter blenderen til aperturkon/pinhole (PH), en 50 mm diameter nøytral tetthet filter (NDF) med en optisk densitet rekke 0 - 4.0, en bjelke expander (BE), et 30 mm slit (S) med bredden på ~ 0 - 6, og et speil (M3) , alle plassert 150 mm fra hverandre. Plass speilet med sin speil fly på 45° av strålen.
- Passere strålen gjennom en 50/50 strålen splitter plassert 150 mm fra M3. Plassere et speil (M6) 150 mm fra strålen splitter og justerer slik at dens speil flyet er på 45° av strålen som slippes ut i retning forover. Bruk reflektert strålen til én side av dual-belysning lys arket.
- Plassere et speil (M4) 150 mm fra strålen splitter og justerer slik at dens speil flyet er på 45° til strålen som var utsendt i 90° vinkel fra strålen splitter. Plassere et andre speil (M5) 150 mm fra M4 og justerer slik at dens speil flyet er på 45° av strålen reflekteres fra M6. Bruk strålen slippes ut fra M5 til den andre siden av dual-belysning lys arket.
- Definere tosidig belysning systemet på en symmetrisk måte (se figur 1). Plasser en sylindrisk linse (CL1) [diameter (d) = 1. brennvidde (f) = 50 mm] 150 mm i tråd med strålen slippes ut fra M5 og en annen identiske sylindriske linse (CL2) 150 mm i tråd med strålen slippes ut fra M6 på den andre siden av dual-belysning setu p. sett 2 speil (M7 og M8) hver linje med sylindriske linsene i en avstand på 50 mm å reflektere strålen ved 90 °.
- Danne en akromatisk doublet fra et par linser. Plasser den første linsen, L1 (d = 1. f = 100 mm), 100 mm fra M7, og andre linsen, L2 (d = 1. f = 60 mm), 160 mm fra L1. Gjenta dette på den andre siden av dual-belysning med identiske linser (L3, L4) plassert på samme avstand fra M8.
- Sted speil, M9 og M10, 60 mm fra linser L2 og L4, henholdsvis, og i tråd med strålen. Plasser belysning målene, OL1 og OL2 (d = 2. f = 150 mm), 150 mm fra M9 og M10 og i tråd med strålen. Strålen slippes ut fra målene danner lys arket ved imaging prøvene.
- Bruke en 3D skriver skrive ut utvalget holderen fra akrylonitril butadien styren (ABS). Bygge et stykke dekke glass [brytningsindeks (RI) = 1.4745] på hver side av kammeret, vinkelrett belysning strålen, minimere brytningsindeks armaturene. Jevnt sett kammer mellom bjelker slippes ut fra målet linser.
- Installere en stereo mikroskop med 1 X forstørrelse mål og et vitenskapelig complementary metal Oxice semiconductor (sCMOS) kamera vinkelrett belysning flyet (se figur 2).
2. imaging System kalibrering
- Hente fluorescerende polystyren perler som 0,53 μm i diameter.
- Klargjør fluorescerende perle prøven ved å fortynne perle løsningen i en brytningsindeks samsvarende løsning (FELGER) med 1% lav-smelte peker agarose til 1:150, 000. Cut et stykke Borosilikatglass rør med en diameter på 12 mm og en ytre diameter på 18 mm til en lengde på 30 mm.
Merk: Borosilikatglass slangen til å matche brytningsindeks (1,47). - Bland utvannet perle prøven med 1% agarose og Pipetter bead/agarose løsningen i borosilicate slangen. Tillate agarose å stivne ved romtemperatur (23 ° C).
- Fyll ABS kammeret (fra trinn 1.7) med en 99,5% glyserol løsning. Plass Borosilikatglass slangen som inneholder perler inne i kammeret. Plass ABS kammeret i tenkelig systemet slik at det er i midten av Gaussian strålen opprettet av dobbel belysning systemet.
- Knytte en 3D motorisert translasjonsforskning scene til Borosilikatglass slangen til å kontrollere bevegelse og orientering av prøven innenfor ABS kammeret (se supplerende figur 1).
- Hente bilder med sCMOS kameraet med en hastighet på 30 bilder per sekund (fps). Bruke motor kontrolleren, bevege prøven 1 mm i laterale retning og hente bilder på hver 1 mm økning med sCMOS kameraet. Fortsett til hele utvalget har blitt avbildet.
- Stakk ervervet bildene benytter en visualisering programvare (se Tabell for materiale). Måle Poenget spredning funksjon (PSF) systemet benytter bildene perle. Bruk denne PSF for deconvolution under bildebehandling i senere trinn.
3. eksempel forberedelse
- Dissekere hjerter fra en wild type P1 mus og en dobbel heterozygote sarcolipin-grobunn knockin mus med Rosa26-YFP genet (Slngrobunn / +; R26YFP reporter / +) på P7.
Merk: Euthanasia ble utført ved hjelp av pentobarbital og teknikken beskrevet av Robbins et al. 10. dissection ble utført etter teknikken beskrevet av den nasjonale hjerte, lunge og blod Institute (NHLBI)10,11. - Utføre en kjemisk clearing av murine hjerter som beskrevet av Kevin Sung et al. 12.
Merk: Følgende trinn skal utføres i avtrekksvifte siden kjemikaliene som brukes er giftig.- Skyll hjerter i 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) 3 x i 10 min. Etter rense, plasser hjerter i en 4% paraformaldehyde løsning og ruge prøvene på 4 ° C over natten.
- Sett prøvene i en 4% akrylamid løsning som inneholder 0,5% w/v av 2, 2-Azobis dihydrochloride. Tillate prøvene å ruge på 4 ° C over natten. Etter den natten inkubering, fjerne prøvene og ruge dem ved 37 ° C i 2-3 h.
- Skyll prøvene med PBS og plassere dem i 8% w/v natrium dodecyl sulfate og 1,25% w/v borsyre. Inkuber prøvene på 37 ° C før de er klare. Dette kan ta flere timer, avhengig av tykkelsen på prøven. Etter clearing, fjerne prøvene og plassere dem i 1 x fosfat-bufret saline for 1 dag.
- Forberede en brytningsindeks matchende løsning med 40 g av ikke-ionisert tetthet gradert medium (se Tabell for materiale) i 30 mL 0.02 M fosfat bufferen (PB), som er 0,1% Tween-20, og 0,01% Natriumazid. Ta løsningen å en pH på 7,5 med natriumhydroksid.
- Plass ryddet prøven i FELGER med en brytningsindeks av 1,46-1.48 og 1% agarose. Prøven inn Borosilikatglass rør og la agarose å stivne ved romtemperatur (23 ° C).
- Knytte en 3D motorisert translasjonsforskning scene til Borosilikatglass slangen å kontrollere bevegelsen og orientering av prøven i 3D trykt ABS kammer (se supplerende figur 1).
4. voksen hjertet Imaging
- Injisere 8,7 x 1012 virus av type adeno-assosiert virus vektor 9 (AAV9) som inneholder hjerte-spesifikke troponin T promoter (cTnT) og grønne fluorescerende protein (GFP) i et 100 μL volum i halen fotsporene til en 2 måneders wild type (C57BL/6)-mus.
Merk: AAV9 ble utviklet etter teknikken beskrevet av Yuan et al. 13. Dette fører GFP binde til nyre ytre medullær kalium kanalen (ROMK) produsere AAV9-cTnT-ROMK-GFP (se Tabell for materiale). - Dissekere voksen mus hjerter på 7,5 måneders alder ifølge teknikken beskrevet av NHLBI11. Forberede prøvene benytter skritt 3.1-3.3.
- Koble motor kontrolleren til motor aktuator. Knytte aktuatoren til Borosilikatglass slangen å kontrollere bevegelsen og orientering av prøven i 3D trykt ABS kammer.
- Plasser prøven slik at det er i midten av Gaussian strålen opprettet av dobbel belysning systemet. Hente bilder med sCMOS kameraet med en hastighet på 100 fps.
- Bruke motor kontrolleren, bevege prøven 1 mm i aksial retning og hente bilder på hver 1 mm økning med sCMOS kameraet. Fortsett til hele utvalget har blitt avbildet.
Merk: Systemet er kontrollert av en spesialutviklede maskinstyring programvare. - Stakk ervervet bildene benytter en visualisering programvare (se Tabell for materiale). Utvikle 3D profilen benytter disse bildestakker og visualisering programvare14. Deconvolve på PSF fra trinn 2.6 med den ervervet bildestakk. Angi en piksel terskelverdi intensitet å observere konturene av hjertet og pseudo fargelegge bildene basert på denne gråtone intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Teknikken er beskrevet brukt her en tosidig belysning bjelke kombinert med en optisk clearing av musen hjertet for å oppnå en dypere tenkelig dybde og en større tenkelig volum med tilstrekkelig tenkelig oppløsning (figur 1). Kalibrer systemet ble fluorescerende perler plassert i glass slangen og innen tenkelig system. Perler ble deretter fotografert og visualisert i x-y flyet, y-z-fly, og i x-z flyet, for å få poenget spre funksjon (PSF) for systemet8. Systemet kalibreringen produsert en oppløsning lateral mot dlateral ≈ 2,8 µm og en oppløsning i aksial retning dXZ ≈ 17.4 µm og dYZ ≈ 17,9 µm ved glyserol som innebygging middels8.
Etter fluorescerende perler ble brukt for kalibrering, ble tenkelig systemet brukt å image musen hjerter på 1 dag og på 7 dager postnatal (figur 2)8. Den ventrikkel hulrom dimensjoner, hjertet ventiler og ventrikkel trabeculation er tydelig i disse bildene av musen hjertet. For å studere en cardiomyocyte differensiering i hjertet, ble heterozygote knockin mus med grobunn-merket cardiomyocytes fotografert postnatal. Bilder av det grobunn-merket cardiomyocytes er i hver fly retning med en 3D-gjengivelse av hjertet8 (Figur 3).
I tillegg til studere postnatal mus, ble tenkelig systemet også brukt til å studere voksen mus hjertet. I utgangspunktet ble genterapi brukt til å innføre GFP-merket ROMK kanaler i musen hjertet. Musen hjertet ble avbildet 7,5 måneder, og disse ROMK kanalene var visualisert i ventrikkel veggen (Figur 4). Dette trinnet i prosedyren illustrerer evne til dette systemet image store prøver og skille strukturer ikke sett histologiske flekker i hjertet. Figur 4 viser ROMK kanalene hver fly retning med en 3D-gjengivelse av hjertet8.
Figur 1 : Skjematisk diagram av lys arks fluorescens mikroskopi. Dette er en 3-dimensjonal gjengivelse av lys ark fluorescens mikroskopi systemet, inkludert avstandene mellom komponentene og brennvidder av komponentene i systemet. Dette tallet har blitt endret fra Yichen Ding et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Ovenfra av lys ark mikroskopi system med deteksjon. Dette er den øverste visningen av tosidig belysning mikroskopi systemet der mørke blå regionen representerer bjelken på hvert sted i systemet. Inkludert er en 2-dimensjonal forstørret del som viser en av regionene akromatisk doublets og belysning mål. Denne forstørret delen viser også prinsippet om lys ark dannelse og hvordan bjelker kombineres til skjemaet en tosidig belysning. Dette tallet har blitt endret fra Yichen Ding et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : 3D-bilder av postnatal murine hjertet. (en) dette panelet viser et bilde av postnatal musen hjertet på dag 7 viser ventrikkel hulrom. (b) dette panelet viser et bilde av postnatal musen hjertet på dag 7 viser den ventrikkel veggtykkelsen. (c) dette panelet viser bildet hjertets postnatal musen på dag 1 viser plasseringen av ventilen strukturer. (d) dette bildet viser en forstørret del fra postnatal musen hjertet på dag 1 viser pectinate muskelen i atriet av hjertet. (e) dette bildet viser trabeculation i ventrikkel hjertet postnatal musen på dag 1. Skala bar: 1 mm. Rød-sirklet regionen innenfor rammemargen viser to gjennomskinnelig musen hjerter etter under KLARHET teknikken og blir satt inn Borosilikatglass slangen. Dette tallet har blitt endret fra Yichen Ding et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bilder av det grobunn-merket cardiomyocytes i et postnatal musen hjerte fra hver planet. P1 musen hjertet ble avbildet med grobunn-merket cardiomyocytes i hver cross-sectional fly: (en) XY, (b) YZ, og (c) XZ. Disse cross-sectional bilder viser tilstedeværelse av grobunn-merket cardiomyocytes i atriet og ventrikkel P1 museklikk. (d) bildene ble også slått sammen for å opprette en 3D-gjengivelse av hjertet. Rød-sirklet regionen innenfor rammemargen viser to gjennomskinnelig musen hjerter etter under KLARHET teknikken og blir satt inn Borosilikatglass slangen. Skala bar: 1 mm. Dette tallet har blitt endret fra Yichen Ding et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Bilder av voksen mus hjertet viser ROMK kanalene hver planet. Musen hjertet ble avbildet på 7,5 måneder av alderen å vise nærvær og plassering av ROMK kanaler. Hjertet ble avbildet i hver cross-sectional fly: (en) XY, (b) YZ, og (c) XZ. Gråtoner verdien angir optisk intensiteten i bildet med de lysere delene tilsvarer mer lysintensitet og de mørke delene tilsvarer mindre lysintensiteten. (d) bildene ble også slått sammen for å opprette en 3D-gjengivelse av hjertet, og originalbildene grayscaled var pseudo farget slik at ROMK kanalene vises grønne. Rød-sirklet regionen innenfor rammemargen viser et enkelt gjennomskinnelig voksen mus hjerte etter under KLARHET teknikken og blir satt inn Borosilikatglass slangen. Skala bar: 1 mm. Dette tallet har blitt endret fra Yichen Ding et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: bildet av ABS kammer med borosilicate slangen i lys arket av tenkelig. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LSFM systemet og teknikken beskrevet her benytter en tosidig belysning bjelke kombinert med en optisk avregning bildet musen hjertet på postnatal og voksen stadier av sin utvikling. En tradisjonell enkelt belysning bjelke lider Foton spredning og absorpsjon gjennom tykkere og større vev prøver1,3. Tosidig bjelker gir en jevnere belysning av prøven, og dermed minimere effekten av striping og andre gjenstander som er ofte sett i bilder produsert av en ensidig belysning. Denne teknikken øker også størrelsen på prøven som kan avbildes ved å justere plasseringen av den doble Gaussian bjelker8. Maksimal separasjon av disse bjelker tillater imaging en Vevsprøve flere millimeter i størrelse, som voksne mus hjertet, mens en enkelt belysning begrenset størrelsen på utvalget til mindre hjerter som hjertene til sebrafisk og Drosophila .
Fluorescens imaging i vev som ikke er optisk gjennomsiktig er mer utfordrende siden lysspredning ikke kanskje uniform gjennom Vevsprøve. Dette begrenser dybden til som et eksempel kan avbildes og effektiviteten til fluorescens bildebehandling. Derfor er det vanlig å bruke organismer som sebrafisk, som selvsagt har optisk gjennomsiktig vev5. Men for å utføre fluorescens imaging studier på organismer som ikke naturlig har optisk gjennomsiktig hud, er det forskjellige optisk clearing teknikker som er utviklet for å fjerne fargen av vev. En slik optisk clearing teknikk er KLARHET, der vev er plassert i en hydrogel, så ruges i lang tid, og til slutt plassert i en lysning som reduserer mengden av refleksjon og brytning mellom prøven og andre medier1 ,9. I denne studien denne teknikken ble endret for å redusere clearing reagens som brukes og krever ikke tillegg av vakuum pumper eller nitrogen gass8.
Selv om denne teknikken gir en forbedret bildeoppløsning for tykkere ugjennomsiktig utvalg, finnes begrensinger for denne strategien som kan bli bedre i fremtidige studier. Flere studier har vært gjennomført med Bessel bjelker og en to-fotonet lineære eksitasjon å gi en bedre løsning på tilstrekkelig tenkelig dypet15,16. Disse metodene har for tiden brukt til å studere mindre hjerte modeller, men kan tilpasses for å studere dynamisk prosessene i et utviklingsland fosteret. Også endringer i metoden KLARHET for større vevsprøver kunne forbedre effektiviteten i lysrør bildebehandling ved å redusere antall fluorophores som potensielt tapt under clearing behandle8. Nylig har vi integrert LSFM systemet med virtuelle virkeligheten å belyse utviklingsmessige cardiac mekanikk17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til Thao Nguyen og Atsushi Nakano fra UCLA for å gi mus prøven bildet. Denne studien ble støttet av tilskudd NIH HL118650 (til Tzung K. Hsiai), HL083015 (til Tzung K. Hsiai), HD069305 (til N. C. Chi og Tzung K. Hsiai.), HL111437 (til Tzung K. Hsiai og N. C. Chi), HL129727 (til Tzung K. Hsiai) og University of Texas stjerner midler (til Juhyun Lee).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
References
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
