Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.
Abstract
כימות של מתילציה DNA יכולה להיות מושגת באמצעות רצף ביסולפאט, אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל, בהקשר דנ א חד גדילי. רצף ביסולפאט יכול להיות ממוקד (באמצעות PCR) או לבצע על הגנום כולו ומספק כימות מוחלטת של ציטוזין מתילציה ברזולוציה-הבסיס יחיד. בהתחשב באופי ברורים של DNA גרעיני - ו מיטוכונדריאלי, ובייחוד במבנה משני, adaptions של ביסולפאט שיטות רצף על חקירת ציטוזין מתילציה ב mtDNA צריכה להיעשות. מבנה משניות ושלישוניות mtDNA יכול בהחלט להוביל ביסולפאט רצף חפצים שמוביל שווא-תוצאות חיוביות בשל גישה המסכן דנטורציה לא שלם של ביסולפאט ל- DNA חד-גדילי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות עיכול אנזימטי של ה-DNA BamHI יחד עם bioinformatic ניתוח צינור כדי לאפשר כימות מדויק של ציטוזין מתילציה רמות ב mtDNA. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לעיצוב תחל רצף ביסולפאט ספיציפית mtDNA, כדי להימנע מיקוד מקטעי הגרעיני מיטוכונדריאלי לא רצויים (NUMTs) מוכנס לתוך הגנום הגרעיני.
Introduction
גנום מיטוכונדריאלי הוא מבנה כפול גדילי מעגלית של-16.5-קילו base (kb), המהוות של כבד, ופיסה אור. גנום מיטוכונדריאלי נוכח מספר עותקים בתוך כל תא, maternally-בירושה, ו מקודד מרכיבים חיוניים של קומפלקסי שרשרת הנשימה1. בדומה הגנום חיידקי, בניגוד הגנום הגרעיני, גנום מיטוכונדריאלי מאורגן במבנים רבים משניות ושלישוניות, כגון מבנים מפותל supercoiled2, אשר יכול לגמול גישה קשה במהלך רצף ניסויים3.
בגרעין, מתילציה של הדנ א היא סימן epigenetic בהרחבה למדה משחק תפקיד בתהליכים רבים, ובמיוחד בוויסות של ביטוי גנים. מתילציה DNA הגנום יונקים, מתרחשת בעיקר על 5-מיקום הטבעת פירימידין של deoxycytidines, בעיקר על CG dinucleotides (או CpG). מתילציה ציטוזין נמצא ב-70% של CpG כל הגנום של תאים סומטיים וחשבונות ~ 1% של סך שה-DNA בסיסים4. ה-DNA methylations בכללותה תוארה גם בהקשרים שאינם-CpG, כגון רו ח, CpT עלות לקליק, קיים בכמויות שונות ב- DNA גרעיני, עם ערכים עד 25% של כל cytosines מפוגל בתאי גזע עובריים5,6,7.
בעוד ציטוזין מתילציה של הגנום הגרעיני מקובל, קיום מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA) הוא עדיין שנוי במחלוקת. המחקר הראשון מתילציה חוקר mtDNA בוצעה בתאים בתרבית איפה mtDNA מתילציה זוהה בקלות, למרות ברמות נמוכות בהשוואה ל- DNA גרעיני8. בתאים אנושיים וטכנולוגיים מאתר, mtDNA מתילציה זוהה גם ברמות נמוכות (2-5%). באמצעות מבחני להסתמך על לכידת 5 methylcytosine כגון מפוגל immunoprecipitation דנ א (MeDIP) ואחריו PCR כמותי, mtDNA מתילציה זוהה גם מגוון העכבר של האדם ואת תאי שורות9,10, 11,12. באמצעות נוגדנים נגד 5-methylcytosine assay אליסה או ספקטרומטר מסה, רמות משמעותי של מתילציה DNA אובחנו שברים מיטוכונדריאלי מטוהרים13,14,15, 16. עם זאת, רוב מבחני במחקרים הנ ל משמש טכניקות לא תוכננו כדי לספק כימות מוחלטת של מתילציה DNA ברזולוציה-הבסיס יחיד.
ניתוח מתילציה של הדנ א resolutive וסטטיסטי יכולה להיות מושגת על ידי טכניקה בשם "ביסולפאט רצף", אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל חד גדילי הדנ א בהקשר17 . באמצעות רצף ביסולפאט, מערך של מחקרים זיהה את הנוכחות של ציטוזין מתילציה ברמות שונות. מתילציה mtDNA באזור D לופ, את 12S או האזור מטוסי אף-16 זוהה ברצון האנושי18,19,20,21,22,23 ו העכבר24 רקמות ותאים, לעומת זאת, עם השתנות מסקרן, 1-20% של סך cytosines על פני לימודי.
לעומת אלה מחקרים רבים, יש רק מעט מחקרים, כולל הקבוצה שלנו, השנויות במחלוקת על הימצאות mtDNA מתילציה3,25,26,27 או חקרו את הרלוונטיות הביולוגי של רמות נמוכות מאוד של רמות (להלן 2%) mtDNA28. לאחרונה, דווח כאן את ההתבוננות חפץ ביסולפאט-רצף פוטנציאליים ביסולפאט מיטוכונדריאלי כל רצף3. סיפקנו ראיות מבנה שניוני של דנ א מיטוכונדריאלי יכול להוביל תוצאות חיוביות שגויות ב רצף ביסולפאט, ובכך מפריז מתילציה רמות. אנו מספקים כאן פרוטוקול כדי למנוע חפץ של ביסולפאט-המרה של mtDNA. פרוטוקול זה משתמש של עיכול אנזימטי פשוטה של ה-DNA כדי לשבש mtDNA משני מבנים ולאפשר גישה מלאה ביסולפאט בעקבות ביסולפאט רצף פרוטוקול. בנוסף, אנו מספקים של צינור bioinformatic הנלווים לניתוח של רצף ביסולפאט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טיפול אנזים הגבלה
- Linearize mtDNA על ידי טיפול הכולל דנ א אנושי עם האנזים הגבלה BamHI, שחותך במיקום 14258 ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי.
הערה: עכבר ה-DNA, לשימוש של אנזים הגבלה BglII בתנאים זהים להלן. - לכל אחד לטעום איפה mtDNA מתילציה כדי להיות מוערך, להכין שפופרת אחת של התגובה 0.2 מ"ל ולהוסיף את הבאים מערבבים: 3 μg הדנ א (לכמת על-ידי fluorometry), 15 μL מאגר 3, 3 μL BamHI ומים עד 150 μL
- מניחים צינורות הצנטרפוגה תרמי במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
2. ביסולפאט ההמרה
- להמיר דנ א BamHI שטופלו באמצעות ביסולפיט כמתואר29.
- השתמש 200-500 ng שטופלו BamHI DNA עבור כל תגובה ההמרה הנפח הכולל של 20 μL. ההתאוששות הדנ א הוא 50-70%.
- Elute ה-DNA המרה ביסולפאט במאגר • תנאי μL 10.
- לכמת חד גדילי הדנ א על-ידי fluorometry.
- אופציונלי: חנות המרה ביסולפאט DNA ב-20 ° C לפני שתמשיך את הנותרים של הפרוטוקול. לאחסון לטווח ארוך, לאחסן המרה ביסולפאט DNA ב-80 מעלות צלזיוס
3. עיצוב של ביסולפאט רצף תחל
- עיצוב צבעי יסוד רצף ביסולפאט באמצעות כלים מקוונים Methprimer30 BiSearch31,32.
הערה: Methprimer BiSearch מאפשרות לחפש רצפים מחייב פריימר על רצף גנומית איפה cytosines מומרים thymines, בדומה לטיפול פוסט-ביסולפאט. - עבור הגברה מיטבי, לא משוחד, להימנע CpG dinucleotides ב תחל ולעצב את גודל אמפליקון בין 100-300 bp.
- ודא תחל בעיצוב ספציפי ל- DNA מיטוכונדריאלי באמצעות הפונקציה של BiSearch חיפוש פריימר. להוסיף את תחל כבר מעוצב ביסולפאט המרה, סמן את התיבה ביסולפאט וכוללים גנום הפניה ופרמטרים PCR.
הערה: רשימת מוצרים PCR אפשרי יוצג. - להעתיק העליון רצפים פריימר 1-5, הדבק אותם בטופס ההזמנה של סינתזה oligonucleotide.
הערה: רשימה של האדם רצפי פריימר mtDNA העכבר אשר אומתה במעבדה מוצגת בטבלה1. - הבדיקה תחל תוך שימוש ביסולפאט המרה PCR בעקבות agarose בג'ל כפי שמתואר בשלב 4. מבחן למטב כל זוגות פריימר בנפרד, להבטיח שגודל אמפליקון הנכון מופיע על הג'ל agarose.
הערה: אם תחל ריבוב נדרשים, להוסיף primers רבים לאחד יחיד PCR התגובה והמחש את המוצרים PCR agarose בג'ל או, שיטה יותר resolutive כגון לזיהוי בג'ל, כדי להבחין בין מוצרים דומים גודל.
4. ביסולפאט המרה PCR והפקת ג'ל
- כדי להגביר את האזורים של הריבית, לבצע PCR באמצעות אנזימים להתחיל חם. בקצרה, לערבב 100 ng המרה DNA 500 תחל חוש וחוש אנטי-מיקרומטר, 1 µL dNTP מיקס (10 מיקרומטר של כל dNTP), פולימראז ב- U-תגובה 7.5 בהנפח הכולל של µL 50. להפעיל את ה-PCR עם התנאים הבאים: 5 דקות ב 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
מחזורי 35; 10 דקות 72 מעלות צלזיוס. השתמש תחל גם בנפרד או מרובב. - אופציונלי: כאשר ריבוב תחל, שימוש 200 ng המרה DNA ו אופניים התנאים הבאים: 5 דקות 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) מחזורי 35; 10 דקות 72 מעלות צלזיוס.
הערה: טמפרטורה עשוי להשתנות בהתאם טמפרטורת ההיתוך של צבעי יסוד. - נושא ה-PCR מוצרי ג'ל אלקטרופורזה על 2% agarose ב100 וולט.
- תחת אור UV עדין, לחלץ את מוצרי ה-PCR עם איזמל ולהוסיף microtubes. אל תחשוף PCR מוצרים לאור UV מופרז כדי למנוע נזק לדנ א. להימנע זמן החשיפה מעל גיל 30 s.
- לטהר את המוצרים PCR באמצעות ג'ל לטיהור כפי שתואר לעיל3.
- לכמת את ה-DNA מטוהרים מהשלב 4.5 באמצעות fluorometry. המשך שלב 5 או מאגר דגימות ב-20 ° C.
מחזורי 35; 10 דקות 72 מעלות צלזיוס. השתמש תחל גם בנפרד או מרובב.5. רצף ספריית הכנה ביסולפאט
- לבצע הכנה ספריה של המרה ביסולפאט מוצרי ה-PCR.
אופציונלי: מגה-פלקס PCR מוצרים בשלב זה. - לבצע סוף-תיקון באמצעות עד 100 ננוגרם של מוצר ה-PCR. מוסיפים 3 µL סיום ההכנה אנזים 6.5 µL סוף תיקון התגובה מאגר (10 x) למוצר ה-PCR µL 55.5 בשפופרת 0.2 מ"ל. למקם, דגירה צינור הצנטרפוגה תרמי למשך 30 דקות ב- 20 ° C ואחריו 30 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס.
- מאתרים ומפסיקים מתאמים רצף על ידי ערבוב ה-DNA לתקן-סוף עם 15 µL בלאנט/ת א ליגאז מיקס, 2.5 µL מתאם, משפר מצדו µL 1. אם משתמש < 100 מוצר ה-PCR ng כקלט, לדלל מתאם 10 פעמים.
- מניחים את התערובת (שלב 5.3) הצנטרפוגה תרמי, דגירה 15 דקות ב 20 º C. להשהות הצנטרפוגה תרמי ולהוסיף 3 µl משתמש אנזים ברכבת התחתית. לערבב, למקם את הצינור בחזרה הצנטרפוגה תרמי, דגירה 15 דקות ב 37 º C.
- גודל לבחור את ה-DNA ובין אם-לא מתאם באמצעות חרוזים מוצק שלב הפיך הנייח (אלוהים אדירים) עם יחס בדרגות שונות של חרוזים ל- DNA בהתאם לגודל המוצר ה-PCR.
- הוסף 13.5 µL H2O ל- DNA ובין אם-לא מתאם שלב 55 ו 5.4 µL resuspended אלוהים אדירים חרוזים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ומקום צינור על דוכן מגנטי. כאשר הפתרון ברור, להעביר את תגובת שיקוע צינור ולמחוק את שפופרת המכילה את החרוזים.
הערה: תגובת שיקוע מכיל את ה-DNA ובין אם-לא מתאם, חלקים לא רצויים גדול מאוגדים החרוזים שהושלכו. - להוסיף 25 µL resuspended אלוהים אדירים חרוזים תגובת שיקוע מהשלב 5.6, לערבב, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. למקם את הצינורית על הדוכן מגנטי ולמחוק את תגובת שיקוע כאשר הפתרון ברור.
הערה: תגובת שיקוע שהושלכו מכיל DNA לא רצויים, ואילו ה-DNA ובין אם-לא מתאם מאוגד חרוזים. - בעוד הצינורית על הדוכן מגנטי, הוסף 200 µL 80% אתנול (הטרי) לשטוף את החרוזים. דגירה 30 s, הסרה, להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה עבור סך של 2 שוטף.
- חרוזים אוויר יבש במשך 5 דקות תוך הצינור הוא מעמד מגנטי עם מכסה פתוח.
- הסר את הצינורית של המגנט, elute ה-DNA במאגר • תנאי 23 µL ומערבבים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
- מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי, כאשר הפתרון ברור, להעביר 2 µL צלחת PCR 96-ובכן עבור הגברה טרום-PCR (שלב 5.14).
- להעביר את µL 21 כ השאר צינור 0.2 מ"ל עבור הגברה PCR (שלב 5.17).
הערה: הקפד לא להעביר כל חרוזים כמו חרוזים יכול לעכב תגובות אנזימטיות של הצעדים הבאים. - המשך שלב 5.14 או מאגר דגימות ב-20 ° C.
- בצע קדם-PCR ההגברה ידי RT-qPCR כדי להעריך את מספר מחזורי הדרושים כדי להגביר את ה-DNA ובין אם-לא מתאם. לכל תגובה, להוסיף הפעולות הבאות ב- PCR 96-ובכן צלחת 2 µL המכילה DNA (שלב 5.11): פריימר אינדקס µL 0.4 0.4 µL אוניברסלי PCR פריימר, 7.2 µL H2O, מיקס מאסטר RT-qPCR 10 µL.
- מקם את הצלחת במכונת ה-PCR בזמן אמת ונושא את הצלחת לתנאים הבאים: 30 s ב 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 מחזורים; 5 דקות 65 ° C.
- להעריך את מספר מחזורי הגברה הדרושים עבור כל דגימה על-ידי חיסור Ct-ערך אחד ערך ה-Ct קדם הגברה RT-qPCR התואם לסוף השלב הליניארי של תגובת ה-PCR.
- להגביר את ה-DNA ובין אם-לא מתאם מ שלב 5.12 על ידי ערבוב: 21 µL DNA, 25 µL PCR מיקס מאסטר, פריימר אינדקס µL 1, פריימר PCR אוניברסלי µL 1 ו 2 µL H2O. ב הצנטרפוגה תרמי, נושא כל מדגם לתנאים הבאים: 30 s ב 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [מחושב Ct משלב 5.16] מחזורי; 5 דקות 65 ° C.
הערה: זכור להשתמש רק אחד פריימר אינדקס עבור דגימה כדי לאפשר ריבוב. המדד נוסף במהלך PCR. - לטהר את החרוזים DNA אלוהים אדירים מוגבר, elute במאגר • תנאי µL 22.
- לשלוט באיכות הספרייה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה או חלופה בשיטה. חפשו גדלים שיא הספריה המתאימה (PCR מוצרים בגודל בתוספת מתאם).
- לאמוד את גודל בסיס-זוג ממוצע של המוצרים ספריה על ידי השמצות ניתוח: הגדרות כלליות מתקדם, לחץ פעמיים על "השולחן" תחת השמצות ניתוח. הגדרת האזור מ- 100-1000 bp ' ולחץ על ' אישור'. תחת אזור שולחן, האזור שהוגדר מופיע, ספריית גודל ממוצע (bp) מחושבת.
- לכמת ספריות על-ידי fluorometry. המשך שלב 6 או חנות ספריות ב-20 ° C.
6. רצף הדור הבא
- לחשב את הריכוז nM של ספריות באמצעות הנוסחה:
- לדלל ספריות nM ריכוז למשל 2 ננומטר אותו (לבחור 4 nM, 2 ננומטר, 1 ננומטר, או 0.5 ננומטר בהתאם ספריית ריכוזים). מאגר כל ספריות להשגת מאגר של 2 ספריות ננומטר.
- Denature ו לדלל ספריות בעקבות המדריך כלי עריכה ברצף. בקיצור: Denature הבריכה 2 ננומטר על-ידי הוספת 0.2 N NaOH, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק Dilute הבריכה denatured לדילול הסופי 10 בלילה. Denature ו לדלל ספריה שליטה זמינים מסחרית לדילול הסופי ו־12-5 בערב. אל צינור חדש, מערבבים הבריכה 10 בלילה עם 20% ו־12-5 pM בקרת ספרייה.
הערה: המרה ביסולפאט מציג את מורכבות נמוכה מאוד. 20% בקרת ספרייה ספייק בתגרום רצף באיכות טובה יותר. - להפעיל לחץ דם 150 לזווג-קצה רצף שימוש בכלי רצף עמוק.
7. חישובית ניתוח - אומדן מתילציה רמות
- ליצור קבצי .fastq (המכונה כאן sample1_R1.fastq.gz ו- sample1_R2.fastq.gz), ליצור אינדקס ביסמרק של הגנום כולו עניין (כאן בתיקיה בשם bismarkIndex) ולוודא כי רצף גנומית של chrM זמין ב- fasta תבנית (כאן בתיקיה בשם chrM).
- לעבד מראש קריאות כדי להסיר מתאמים ודעות קדומות שהציג את צבעי יסוד: השתמש בכלי Trim_galore33. הסר את שני נוקלאוטידים 5' סוף שתי קריאות ואחורה.
trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o.... / trim1 - לזווג sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - ליישר קריאות מעובד מראש כדי הגנום כולו באמצעות ביסמרק34
ביסמרק, dovetail - באם -o-/-/ bismarkIndex /-1./sample1_R2_val_2.fq.gz./sample1_R1_val_1.fq.gz-2
הערה: אם aligner אחר, ודא כי מושמטות קריאות זה לא יכול להיות מיושרים באופן ייחודי. - תמצית קורא מיפוי כרומוזום ה M, כאן על ידי שימוש Samtools35
samtools למיין - O -l 0 BAM -o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam
samtools מדד sample1_sorted.bam
samtools להציג -u sample1_sorted.bam chrM | samtools למיין - n - O BAM -o sample1_chrM.bam - לחלץ את המידע מתילציה
bismark_methylation_extractor -p - CX-- מקיף - cytosine_report genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - השתמש את .bedGraph, את עמודי או הקבצים CX_report.txt לניתוח נוסף. השתמש בקובץ sample1_chrM.CX_report.txt ויזואליזציה ולבדיקה.
- לבצע חיתוך נוסף בשלב preprocessing, אם אזורים מרובים הם נחקר, דעה קדומה פריימר עשויים להיות גלויים ב- M-הטיה החלקות שנוצרו במהלך המיפוי. עיין בתיעוד של ביסמרק לקבלת מידע נוסף.
8. חישוב ניתוח - מבחן של הבדלים
- ודא כי קובץ ה-CX_report.txt מכיל 7 עמודות, כרומוזום (כאן chrM), עמדה, סטרנד, מספר הקריאות מפוגל, מספר קריאות unmethylated, הקשר C רצף שמסביב, עבור כל C על כרומוזום מ'.
- כפי CX_report מכסה chrM בשלמותו, בדוק את תת-הקבוצה כדי region(s) אשר מוגבר.
- השתמש במבחני ללא פרמטרי להבדלים בין מדגמים, כגון מבחן המדויק של דייגים של בודדות או מבחן השלט של האזור כולו.
הערה: כימות לעיתים קרובות תהיו קרובים מתילציה 0%, וזו הסיבה מדוע בהנחה נורמליות אינה הולמת. - באופן דומה, להמחשת, לדמיין quantiles או לחשב מרווחי הביטחון בינומי פרופורציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שני צעדים של פרוטוקול זה מכריעים כאשר חוקרים mtDNA מתילציה. 1) פתיחת המבנה משני ועיצוב 2) של צבעי בסיס ספציפי דנ א מיטוכונדריאלי.
על ידי ה-DNA הגנומי האנושי עם האנזים הגבלת BamHI (איור 1), יהיה לחתוך את מבנה ה-DNA מיטוכונדריאלי במיקום נוקלאוטיד 14,258 ואת המבנה משני ייפתח.
ירידת ערך אפשרי של ביסולפאט המרה עם מבנה משני mtDNA ללא פגע, סביר מאוד שלא להעריך את קצב unconversion mtDNA. על ידי רצף ביסולפאט, הקצב unconversion mtDNA נחקר באופן מעוכלים, מתעכל סך ה-DNA של תאי שריר השלד האנושי, ב 5 אזורים שונים של הגנום מיטוכונדריאלי: העקירה לולאה (D-Loop), סינתזת פנילאלנין, 12S ריבוזום (tRNA - F + 12S), מטוסי אף-16 הריבוזום (16), NADH דהידרוגנאז 5 (ND5) וג'ין ציטוכרום b (CYTB) קידוד ה-mRNA (איור 2). קצב unconversion נע בין 0 - 15.1% על פני כל האיזורים ובדוקים עבור mtDNA מעוכל. עם זאת, כאשר ה-DNA היה מתעכל לפני המרה ביסולפאט, הקצב unconversion ירד ל מקסימלית של 1% על פני כל האיזורים (איור 3). לפיכך, הממחישות את החשיבות של מערכת העיכול BamHI לפני ביסולפאט המרה כדי להימנע מופרזת של mtDNA מתילציה רמות.
זיהום של DNA גרעיני היא בלתי נמנעת כאשר לבודד את גנום מיטוכונדריאלי, מאז כמעט כל גנום מיטוכונדריאלי שוכפל לתוך הגנום הגרעיני, זה נתן לידי הוספות הגרעין של הגנום מיטוכונדריאלי כינה גרעיני מקטעי מיטוכונדריאלי (NUMTs)36. כדי להבטיח כי רמת מתילציה DNA שנותחה שיתאימו דנ א מיטוכונדריאלי, לא NUMTs, יש חשיבות החיצוני ביותר לעיצוב תחל הספציפיים גנום מיטוכונדריאלי. איור 4 מראה כיצד לבדוק את תחל ירידה לפרטים, טבלה 1 מציגה האנושית ואת העכבר mtDNA פריימר רצפים.
| שם | רצף | מיקום | גודל אמפליקון | חישול טמפרטורה | סטרנד | ||
| אנושי | |||||||
| D-לולאה | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisense | |||
| D-לולאה | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisense | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisense | |||
| מטוסי אף-16 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | הגיוני | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | הגיוני | |||
| העכבר | |||||||
| 12S | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisense | |||
| מטוסי אף-16 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisense | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisense | |||
| מטוסי אף-16 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | הגיוני | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | הגיוני | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | הגיוני | |||
טבלה 1: פריימר רצפים עבור האדם ואת העכבר mtDNA. שימו לב כי חישול טמפרטורות של ה-PCR תחל להשתנות עקב הבדלים טמפרטורת ההיתוך של צבעי יסוד.
איור 1 : ג'ל אלקטרופורזה של דנ א BamHI-מעוכלים, או מעוכל. ה-DNA גנומי של שרירי השלד האנושי היה לא מטופל או שטופלו BamHI במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, בג'ל התנהלו על פי 1.5% agarose ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : מפה של גנום מיטוכונדריאלי האדם. אזורים בגנום מיטוכונדריאלי נחקרים על ידי רצף ביסולפאט ואתר אנזים הגבלה BamHI מוצגים. ה-DNA מיטוכונדריאלי מכיל 13 mRNAs 2 ribosomal RNAs, 22 RNAs העברה. קיצורים: PH1: כבד-strand יזם 1; PH2: כבד-strand לקדם 2; PL: יזם אור-strand; . או: מקורם של שכפול של כבד-strand; OL: מקור שכפול של אור-strand. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : BamHI העיכול לפני ההמרה ביסולפאט מוריד את קצב unconversion mtDNA בתאי שריר השלד האנושי. על ידי רצף ביסולפאט, נחקרו מעוכל, מתעכל מיטוכונדריאלי DNA unconversion אחוז-חמישה אזורים שונים של הגנום מיטוכונדריאלי בתאים אנושיים שרירי השלד (N= 3). הכיכר מלאה מייצג אתרי CpG ומייצג לכיכר פתוחה אתרי CpG שאינם. התוצאות מוצגים עם מרווח min-max, מבחן סימן שימש כדי לבדוק את ההבדלים unconversion משמעותית. D-לולאה (6-298) P= 1.83E-42; D-לולאה (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12S: P= 8.38E-16; 16: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-לולאה (6-298) כולל מקור שכפול וכוללת tRNA - F + 12S סטרנד כבד יזם 2. נתונים אלה כבר פורסם במקום 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : השימוש Bisearch כדי לוודא תחל ירידה לפרטים לכיוון גנום מיטוכונדריאלי. A) המרה ביסולפאט תחל רצפים מתווספים הפונקציה BiSearch תחל חיפוש (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). תיבת ביסולפאט הוא תיקתק, גנום הפניה נבחרה. B) דוגמה של מוצרים PCR פוטנציאליים שנוצר על שרשראות antisense והיגיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול ביסולפאט-רצף אשר היא תוכננה במיוחד כדי לחקור mtDNA מתילציה. ההבדלים עם ביסולפאט-רצפי פרוטוקולים המשמשים עבור הדנ א טמון הניצול של צעד עיכול אנזים הגבלה מוקדמת, ניתוח bioinformatic פסק דין החוצה שווא חיוביים. הנובעות NUMT רצפים.
אנו מספקים פרוטוקול כדי להימנע ביסולפאט-רצף חפצים כאשר חוקרים mtDNA מתילציה. חפצים רצף ביסולפאט שמוביל שווא-תוצאות חיוביות היו שדווחה בעבר37. הסרת לא מספקת של חלבונים אביזר דנ א מאת proteinase ש-k היה תיאר37. דנטורציה לא שלם או חלקי reannealing יכול להוביל המופרת ההמרה לא שלם, אולי על-ידי הנמכת הגישה של ביסולפאט אל חד גדילי הדנ א37. החפץ מאוחר יותר יכול להיות במשחק ב mtDNA שבו מבנה המשני לפגום גישה cytosines. לפי מיטב ידיעתנו, התוספת של צעד עיכול אנזים הגבלה לפני המרה ביסולפאט בהקשר של הערכת mtDNA מתילציה דווחה לראשונה בשנת 20163,28. בידיים שלנו, גם לעיכול מוקדמת באנזים הגבלה חד חותך באופן דרמטי הוריד זיהוי של3,cytosines אשר28.
כאן, אנו מספקים צינור bioinformatic כדי לנתח ביסולפאט רצף תוצאות וכדי לזהות חפצים רצף ביסולפאט בהקשר של רצף גנום מיטוכונדריאלי כל ביסולפאט. שיטה זו מקורו התצפית שלנו mtDNA הזה אי-המרת קצב היה הפוך בקורלציה עם רצף עומק3,28. התבוננות זו מרמזת כי מבנה משניות ושלישוניות אפילו mtDNA מחליש את הפיצול של mtDNA על אזורים ספציפיים במהלך הבנייה של רצף ספריות, עלול לפגוע גם גישה מלאה של ביסולפיט ל mtDNA. מאז מערכת העיכול עם אנזים אחד חותך משחרר מבנים משניות ושלישוניות, התוצאות שלנו מצביעים על כך mtDNA מבנה הוא מקור של החפץ ביסולפאט לאמת בשיטות המתוארות בזאת על כימות של ציטוזין מתילציה ב mtDNA.
זיהום בלתי נמנע של DNA גרעיני בהכנה מיטוכונדריאלי מהווה אתגר. זה מוביל מזהמים רצפים NUMT רצף פעולות הקריאה, אשר ייתכן הטיה שערוך של ציטוזין מתילציה ב mtDNA, גם כאשר מבצע ממוקד ורצף ביסולפאט לא לגמרי מיטוכונדריאלי הגנום. כדי למנוע הטיה כזו, העיצוב של ביסולפאט ייחודי רצף תחל מאפשרת לשלול זיהום עם מתילציה ב NUMTs. NUMTs span מחוזות האנושי של גנום מיטוכונדריאלי עכבר עם 100% זהות מסוימים, בלתי אפשרי, לכן, עיצוב ייחודי תחל ב אזורים mtDNA מסוימים. בעת ביצוע רצף גנום מיטוכונדריאלי לגמרי ביסולפאט, קביעת רצף זמן קריאות יכולה להקל על אפליה בין mtDNA NUMTs. קריאות ושילוב הגנום כולו ולהשתמש רק קריאות ממופה באופן ייחודי גנום מיטוכונדריאלי יכול לקדם להבטיח זיהוי mtDNA מתילציה.
לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש מעבר הגנום מיטוכונדריאלי, לדוגמה, במקרים אחרים של רצף ביסולפאט איפה מבנה שניוני של ה-DNA מייצג מקור פוטנציאלי של החפץ. הקשר בין רמות מתילציה ועומק רצף יכול ייחקרו כדי להעריך את הצורך העיכול עם אנזים ההגבלה לפני ביסולפאט רצף של רצפי DNA מורכב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים להכריז.
Acknowledgments
המרכז קרן נובו נורדיסק מחקר מטבולית בסיסית היא מרכז מחקר עצמאי ב אוניברסיטת קופנהגן חלקית במימון של תרומה בלתי מוגבלת של הקרן נובו נורדיסק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
