Summary
Her presenterer vi en protokoll for å tillate nøyaktige kvantifisering av Mitokondrielt DNA (mtDNA) metylering. I denne protokollen beskriver vi en enzymatisk fordøyelsen av DNA med BamHI kombinert med en bioinformatic analyse rørledning hvilke kan brukes å unngå overvurdering av mtDNA metylering nivåer forårsaket av sekundære strukturen i mtDNA.
Abstract
Kvantifisering av DNA metylering oppnås ved hjelp av bisulfite sekvensering, som utnytter for natrium bisulfite konvertere unmethylated cytosine til uracil, i en enkelt-strandet DNA sammenheng. Bisulfite sekvensering kan være målrettet (bruker PCR) eller utført på hele genomet og gir absolutt kvantifisering av cytosine metylering i enkelt base-oppløsning. Gitt forskjellige slags kjernefysisk- og Mitokondrielt DNA, særlig i den sekundære strukturen, bør tilpasninger av bisulfite sekvensering metoder for å undersøke cytosine metylering i mtDNA gjøres. Sekundære og tertiære strukturen i mtDNA kan faktisk føre til bisulfite sekvensering gjenstander fører til falske positiver på grunn av ufullstendige rødsprit dårlig tilgang av bisulfite single-strandet DNA. Her beskriver vi en protokoll med en enzymatisk fordøyelsen av DNA BamHI kombinert med bioinformatic analyse rørledning tillate nøyaktige kvantifisering av cytosine metylering nivåer i mtDNA. Dessuten, vi gir retningslinjer for utforming bisulfite sekvensering primerne gjelder for mtDNA, for å unngå målretting uønskede kjernefysiske mitokondrie segmenter (NUMTs) inn kjernefysiske genomet.
Introduction
Mitokondrie genomet er en sirkulær, double-strandet struktur av ca 16,5 kilo base (kb), utgjør en tung og en lys strand. Mitokondrie genomet finnes i flere eksemplarer i hver celle moderskap-arvet, og koder viktige komponenter av respiratoriske kjeden komplekser1. Lik bakteriell genomer og i motsetning til kjernefysiske genomet, mitokondrie genomet er organisert i flere sekundære og tertiære bygninger, som i kveilet og supercoiled2, som kan gjengi tilgang vanskelig under sekvensering eksperimenter3.
I kjernen er metylering av DNA en grundig studert epigenetic merke som spiller en rolle i mange prosesser, spesielt i regulering av genuttrykk. I pattedyr genomer skjer DNA metylering primært på 5-plasseringen av pyrimidine ringen av deoxycytidines, hovedsakelig på CG dinucleotides (eller CpG). Cytosine metylering er funnet på 70% av alle CpG i genomet av somatiske celler og står for ~ 1% av totale DNA baser4. DNA methylations har også blitt beskrevet i ikke-CpG sammenhenger, som CpA, CpT og CpC og finnes i forskjellige mengder i kjernefysiske DNA, med verdier opp til 25% av alle methylated cytosines i embryonale stamceller5,6,7.
Mens cytosine metylering av det kjernefysiske genomet er allment akseptert, er eksistensen av Mitokondrielt DNA (mtDNA) metylering fortsatt kontroversielt. Den første studien undersøker mtDNA metylering ble utført i kulturperler celler der mtDNA metylering ble lett oppdaget, men på lavere nivåer i forhold til kjernefysiske DNA8. I både menneskelig og murine celler, ble mtDNA metylering også funnet på lave nivåer (2-5%). Bruke analyser stole på 5 methylcytosine fange som denaturert DNA immunoprecipitation (MeDIP) etterfulgt av kvantitative PCR, mtDNA metylering ble også funnet i forskjellige mus og menneskelige og celler linjer9,10, 11,12. Bruker antistoffer mot 5-methylcytosine i en ELISA-analysen eller massespektrometri, ble betydelige nivåer av DNA metylering oppdaget renset mitokondrie fraksjoner13,14,15, 16. men mest av analyser i nevnte studiene brukte teknikker som ikke ble utformet for å gi absolutt kvantifisering av DNA metylering i enkelt base-oppløsning.
Kvantitative og resolutive DNA metylering analyse kan oppnås ved en teknikk kalt "bisulfite sekvensering", som utnytter for natrium bisulfite konvertere unmethylated cytosine til uracil i enkelt-strandet DNA sammenheng17 . Bruker bisulfite sekvensering, har en konstellasjon av studier oppdaget tilstedeværelsen av cytosine metylering på ulike nivåer. Metylering mtDNA i regionen D-loop, 12S eller regionen 16S ble lett funnet i menneskelige18,19,20,21,22,23 og mus24 vev og celler, men med en interessant variasjon, 1-20% av totale cytosines på tvers av studier.
I forhold til disse tallrike studier, har bare noen få studier, inkludert fra vår gruppe, omstridt tilstedeværelsen av mtDNA metylering3,25,26,27 eller spurte biologiske relevans svært lave nivåer av mtDNA nivåer (under 2%)28. Nylig rapportert vi observasjon av en potensiell bisulfite-sekvensering gjenstand i hele mitokondrie bisulfite sekvensering3. Vi ga bevis som sekundær strukturen av Mitokondrielt DNA kan føre til falske positiver i bisulfite sekvensering, og dermed overestimating metylering nivåer. Vi gir her en protokoll for å hindre en gjenstand av bisulfite-konvertering av mtDNA. Denne protokollen bruker en enkel enzymatisk fordøyelsen av DNA å avbryte mtDNA sekundære strukturer og gi full tilgang til bisulfite etter en bisulfite sekvensering protokoll. I tillegg gir vi en tilhørende bioinformatic rørledning for analyse av bisulfite sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. restriksjoner enzym behandling
- Linearize mtDNA ved å behandle totale menneskelige DNA med begrensning enzymet BamHI, som kutter sted 14258 i menneskelig Mitokondrielt DNA.
NOTE For musen DNA, bruk begrensning enzymet BglII under like idet neden. - For hver prøve der mtDNA metylering er vurderes, forberede en 0,2 mL reaksjon tube og legge til følgende blanding: 3 μg genomisk DNA (kvantifisert ved fluorometry), 15 μL Buffer 3, 3 μL BamHI og vann opp til 150 μL
- Plassere rør i en termisk cycler 4 h på 37 ° C.
2. bisulfite konvertering
- Konvertere BamHI-behandlet DNA ved hjelp av natrium bisulfite som beskrevet andre steder29.
- Bruk 200-500 ng BamHI-behandlet DNA for hver konvertering reaksjon i et totalvolum på 20 μL. DNA utvinning er 50-70%.
- Elute Bisulfite-konvertert DNA i 10 μL elueringsrør buffer.
- Kvantifisere single-strandet DNA av fluorometry.
- Valgfritt: Lagre bisulfite-konvertert DNA på 20 ° C før du fortsetter med resten av protokollen. For langvarig lagring, kan du lagre bisulfite-konvertert DNA ved-80 ° C
3. utformingen av Bisulfite sekvensering primere
- Utforme primere for bisulfite sekvenser ved hjelp av elektroniske verktøy Methprimer30 og BiSearch31,32.
Merk: Methprimer og BiSearch kan søke etter primer bindende sekvenser på genomisk sekvenser hvor cytosines konverteres til thymines, på samme måte som etter bisulfite behandling. - Optimale og objektiv forsterkning, unngå CpG dinucleotides i primerne og amplicon størrelse mellom 100-300 bp.
- Kontroller at designet primere er spesifikke for Mitokondrielt DNA funksjonen i Bisearch's Primer søk. Sett inn allerede utformet bisulfite konvertert primerne, sjekke av bokse med bisulfite og inkluderer en referanse genomet og PCR parametere.
Merk: En liste over mulige PCR-produkter vil vises. - Kopier toppen 1-5 primer sekvenser og lime dem inn i et bestillingsskjema for oligonucleotide syntese.
Merk: En liste over menneskelige og mus mtDNA primer sekvenser som er validert i laboratoriet vises i tabell 1. - Test primere med bisulfite konvertert PCR etter agarose gel geleelektroforese som beskrevet i trinn 4. Teste og optimere alle primer par separat og sikre riktig amplicon størrelsen vises på agarose gel.
Merk: Hvis det trengs multipleksing primere, legge til flere primere for en enkelt PCR reaksjon og visualisere PCR produktene agarose gel geleelektroforese eller, mer resolutive metode som polyakrylamid gel geleelektroforese, å skille produkter av samme størrelse.
4. bisulfite konvertert PCR og Gel utvinning
- For å forsterke områdene av interesse, kan du utføre PCR bruker et varmt start Taq utvalg. Kort, mix 100 ng konvertert DNA, 500 µM følelse og anti-følelse primere, 1 µL dNTP mix (10 µM i hver dNTP) og utvalg på 7,5 U/reaksjon i et totalt volum på 50 µL. kjøre PCR med følgende vilkår: 5 min på 95 ° C (60 s 94 ° C, 60 s 55 ° C *, 60 s 72 ° C)
35 sykluser; 10 min 72 ° C. Bruke primere enten separat eller multiplekset. - Valgfritt: Når multipleksing primere, bruk 200 ng konverteres DNA og sykling følgende: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C, 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 sykluser; 10 min 72 ° C.
Merk: Temperatur kan variere etter Smeltetemperaturen for primere. - Underlagt PCR produkter å gel geleelektroforese på 2% agarose på 100 volt.
- Under mild UV lys, trekke ut PCR produkter med en skalpell og legge til microtubes. Ikke utsett PCR produkter til overdreven UV lys å unngå DNA skade. Unngå eksponering over 30 s.
- Rense PCR produktene bruker gel rensing som beskrevet tidligere3.
- Kvantifisere renset DNA fra trinn 4.5 bruker fluorometry. Fortsett til trinn 5 eller store samples ved 20 ° C.
35 sykluser; 10 min 72 ° C. Bruke primere enten separat eller multiplekset.5. bisulfite sekvensering biblioteket forberedelse
- Utføre biblioteket utarbeidelse av bisulfite-konvertert PCR produkter.
Valgfritt: multiplex PCR produkter på dette stadiet. - Utføre slutten-reparasjon Bruk opptil 100 ng PCR produkt. Legge 3 µL slutten prep enzym og 6.5 µL slutten reparasjon reaksjon buffer (10 x) til 55,5 µL PCR produktet i en 0,2 mL tube. Plasser og ruge rør i en termisk cycler i 30 min ved 20 ° C etterfulgt av 30 min på 65 ° C.
- Ligate sekvensering adaptere ved å blande slutten-reparert DNA med 15 µL Blunt/TA ligase mix, 2,5 µL adapter og 1 µL Ligation enhancer. Hvis bruker < 100 ng PCR produkt som inndata, fortynne adapter 10 ganger.
- Plasser blandingen (trinn 5.3) i en termisk cycler og ruge 15 min på 20 ° C. Midlertidig cycler termisk og legge 3 µl bruker enzym til røret. Mix og sett røret i termisk cycler og ruge 15 min på 37 ° C.
- Størrelse Velg adapter-samskrevet DNA ved hjelp av Solid fase reversibel immobilisering (SPRI) perler med varierende forhold av perler DNA avhengig av PCR-produktstørelse.
- Legge til 13,5 µL H2O adapter-samskrevet DNA fra trinn 5.4 og 55 µL resuspended SPRI perler. Inkuber ved romtemperatur for 5 min og sted rør på en magnetisk stand. Når løsningen er klart, overføre nedbryting til en ny tube og kast rør som inneholder perler.
Merk: Nedbryting inneholder adapter-samskrevet DNA og store uønskede fragmenter er bundet til den kasserte perler. - Legge til 25 µL resuspended SPRI perler nedbryting fra trinn 5.6, bland og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Sett røret på magnetiske stå og kaste nedbryting når løsningen er klart.
Merk: Kasserte nedbryting inneholder uønskede DNA, mens adapter-samskrevet DNA er bundet til perler. - Røret er på magnetiske stativet, Legg 200 µL 80% etanol (nylagde) for å vaske perler. Inkuber 30 s og fjern og Forkast nedbryting. Gjenta dette trinnet for totalt 2 vasker.
- Luften tørr perler for 5 min mens røret er på magnetiske stå med en åpen lokk.
- Fjerne røret fra magneten, elute DNA i 23 µL elueringsbufferen og bland. Inkuber ved romtemperatur i 2 minutter.
- Sett røret på en magnetisk stand og når løsningen er klart, overføre 2 µL til en 96-brønns PCR plate for pre-PCR forsterkning (trinn 5.14).
- Overføre resten ca 21 µL til en ny 0,2 mL tube for PCR forsterkning (trinn 5.17).
Merk: Sørg for ikke å overføre noen perler perler kan hemme enzymatiske reaksjoner med neste trinn. - Fortsett til trinn 5.14 eller store samples ved 20 ° C.
- Utfør pre-PCR forsterkning av RT-qPCR til å beregne antall sykluser for å forsterke adapter-samskrevet DNA. Per reaksjon, legger du til følgende i 96-brønnen PCR plate inneholder 2 µL DNA (trinn 5.11): 0,4 µL indeks primer, 0.4 µL universell PCR primer, 7,2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR master mix.
- Plasser platen i en real-time PCR-maskin og underlagt platen til følgende: 30 s på 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 sykluser; 5 min 65 ° C.
- Anslå antall forsterkning sykluser nødvendig for hvert utvalg ved å trekke en Ct-verdien til Ct-verdien av pre forsterkning RT-qPCR tilsvarer slutten av lineær fase av PCR reaksjonen.
- Forsterke adapter-samskrevet DNA fra trinn 5,12 ved å blande: 21 µL DNA, 25 µL PCR master mix, 1 µL indeks primer, 1 µL Universal PCR primer og 2 µL H2O. I en termisk cycler, underlagt hver prøve følgende: 30 s på 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [beregnet Ct fra trinn 5,16] sykluser; 5 min 65 ° C.
Merk: Husk å bare bruke én indeks primer per prøve for å tillate multipleksing. Indeksen settes under PCR. - Rens forsterket DNA SPRI perler og elute i 22 µL elueringsrør buffer.
- Kontroll biblioteket kvaliteten av gel geleelektroforese eller alternativ metode. Se etter riktig bibliotek peak størrelser (PCR produkt(er) størrelse pluss adapter).
- Beregne den gjennomsnittlige base par størrelsen på biblioteket produkt(er) smøre analysen: globale innstillinger, dobbeltklikk på "tabell" under smøre analyse. Definere regionen fra 100-1000 bp og klikk OK. Under Områdedefinert regionen vises og biblioteket gjennomsnittlig størrelse (bp) beregnes.
- Kvantifisere biblioteker av fluorometry. Gå videre til trinn 6 eller store biblioteker på 20 ° C.
6. neste generasjons sekvensering
- Beregn konsentrasjonen nM biblioteker med formelen:
- Fortynne biblioteker til den samme nM konsentrasjon f.eks 2 nM (Velg 4 nM, 2 nM, 1 nM eller 0,5 nM avhengig av biblioteket konsentrasjoner). Samle alle biblioteker for å oppnå en pool av 2 nM biblioteker.
- Denature og fortynne biblioteker etter sekvensering instrument guiden. Kort sagt: Denature 2 nM bassenget ved å legge 0,2 N NaOH og Inkuber ved romtemperatur for 5 min. Dilute denaturert bassenget til en siste fortynning av 10 pM. Denature og fortynne en kommersielt tilgjengelig kontroll biblioteket til en siste fortynning av 12 5 pM. Slik ny bland 10 pM bassenget med 20% 12 5 pM kontroll biblioteket.
Merk: Bisulfite konvertering introduserer svært lav kompleksitet. 20% kontroll biblioteket spike-i blir resultatet bedre sekvensering kvalitet. - Kjøre en 150 bp sammen-end sekvensering med en dyp sekvensering instrument.
7. beregningsorientert analyse - anslag metylering nivåer
- Generere .fastq filer (her kalt sample1_R1.fastq.gz og sample1_R2.fastq.gz), vil generere en bismark indeks over hele genomet av interesse (her i en mappe kalt bismarkIndex) og kontroller at genomisk sekvensen av chrM er tilgjengelig i fasta format (her i en mappe kalt chrM).
- Forhåndsbehandle leser for å fjerne kort og bias introdusert av primerne: bruke verktøyet Trim_galore33. Fjerne to nukleotider fra 5' slutten i begge revers lyder.
trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. /--trim1--sammenkoblede sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Justere forhåndsutfylte behandlet leser til hele genomet bruker Bismark34
Bismark - dovetail - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
Merk: Hvis en annen aligner blir brukt, kontroller at leser at ikke kan justeres unikt forkastes. - Pakke leser tilordning til kromosomet M, her bruker Samtools35
samtools sortere -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.Bam
samtools indeks sample1_sorted.bam
samtools Vis -u sample1_sorted.bam chrM | samtools sortere - n - O BAM -o sample1_chrM.bam - Trekke ut metylering informasjonen
bismark_methylation_extractor -p - CX - cytosine_report - omfattende - genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - Bruk av .bedGraph, .cov eller CX_report.txt filene for videre analyse. Bruke filen sample1_chrM.CX_report.txt for visualisering og testing.
- Utføre ytterligere klipping i forbehandling trinn hvis flere områder er avhørt og en primer skjevhet kan være synlige i M-bias tomter genereres under tilordningen. Se Bismark-dokumentasjonen for mer informasjon.
8. beregningsorientert analyse - Test av forskjeller
- Kontroller at filen CX_report.txt inneholder 7 kolonner kromosom (her chrM) posisjon, strand, antall denaturert leser, unmethylated leser, C sammenheng og omkringliggende sekvens, hver c på kromosom M.
- CX_report dekker chrM i sin helhet, sjekk delsettet til områdene som forsterkes.
- Bruk ikke-parametriske tester for forskjeller mellom utvalgene, for eksempel en fiskere eksakt test for individuelle C eller en tegn-test for en hel region.
Merk: Kvantifisering vil ofte være nær 0% metylering, som er grunnen til hvorfor antar normalitet ikke er riktig. - Tilsvarende for visualisering, enten visualisere quantiles eller beregne binomiske andel konfidensintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To trinnene i denne protokollen er viktig når undersøke mtDNA metylering. 1) åpningen av sekundær strukturen og 2) utformingen av Mitokondrielt DNA-spesifikke primere.
Ved fordøye menneskelige genomisk DNA med begrensning enzymet BamHI (figur 1), Mitokondrielt DNA strukturen vil bli kuttet nukleotid posisjonen 14,258 og sekundære strukturen vil bli åpnet.
Mulig svekkelse av bisulfite konvertering med en intakt mtDNA sekundære struktur er svært sannsynlig å overvurdere mtDNA unconversion hastigheten. Av bisulfite sekvensering, mtDNA unconversion ble undersøkt, i ufordøyd og fordøyd totale DNA fra menneskelig Skjelettmuskel celler, i 5 regioner i mitokondrie genomet: forskyvning Loop (D-Loop), tRNA fenylalanin og 12S ribosom (tRNA - F + 12S), 16S ribosom (16S), NADH dehydrogenase 5 (ND5) og cytochrome b (CYTB) mRNA-koding genet (figur 2). Unconversion rate varierte 0 - 15.1% over alle undersøkte regioner for ufordøyd mtDNA. Men når DNA ble fordøyd konverteringen bisulfite, unconversion prisen falt til maksimalt 1% i alle regioner (Figur 3). Dermed illustrerer betydningen av BamHI fordøyelsen bisulfite konverteringen å unngå overvurdering av mtDNA metylering nivåer.
Forurensning av kjernefysiske DNA er uunngåelig når isolere mitokondrie genomet og siden nesten hele mitokondrie genomet er replikert til kjernefysiske genomet, den har gitt opphav til kjernefysiske innsettinger i mitokondrie genomet kalt kjernefysiske Mitokondrielt segmenter (NUMTs)36. For å sikre at analysert DNA metylering nivåene tilsvarer Mitokondrielt DNA og ikke NUMTs, er det av ytterste viktighet utforme primer som er spesifikke for mitokondrie genomet. Figur 4 viser hvordan kontrollere primer spesifisitet og tabell 1 viser menneskelige og mus mtDNA primer sekvenser.
| navn | Sekvens | Posisjon | Amplicon størrelse | Avspenning temperatur | Strand | ||
| Menneskelige | |||||||
| D-Loop | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisense | |||
| D-Loop | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisense | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisense | |||
| 664 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Følelse | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | Følelse | |||
| Mus | |||||||
| 12S | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisense | |||
| 664 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisense | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisense | |||
| 664 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Følelse | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | Følelse | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | Følelse | |||
Tabell 1: Primer sekvenser for menneskelige og mus mtDNA. Merk at avspenning temperaturer på PCR primere variere på grunn av forskjeller i Smeltetemperaturen for primere.
Figur 1 : Gel geleelektroforese BamHI-fordøyd eller ufordøyd DNA. Genomic DNA fra menneskelig Skjelettmuskel ubehandlet eller behandlet med BamHI 4 h på 37° C og gel geleelektroforese ble kjørt på en 1,5% agarose gel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Kart over menneskelige mitokondrie genomet. Regioner i mitokondrie genomet etterforsket av bisulfite sekvensering og BamHI begrensning enzym området vises. Mitokondrielt DNA inneholder 13 mRNAs, 2 ribosomal RNAs og 22 overføring RNAs. Forkortelser: PH1: heavy-strand promoter 1; PH2: Heavy-strand fremme 2; PL: lys-strand promoter; OH: Opprinnelsen til replikering fra heavy-strand; OL: opprinnelsen til replikering fra lys-strand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : BamHI fordøyelsen bisulfite konverteringen reduserer mtDNA unconversion ofte i menneskelig Skjelettmuskel celler. Av bisulfite sekvensering, ufordøyd og fordøyd Mitokondrielt DNA unconversion prosent var forhørt på fem forskjellige regioner i mitokondrie genomet i menneskelig Skjelettmuskel celler (N= 3). Hele plassen representerer CpG nettsteder, og åpne plassen representerer ikke-CpG nettsteder. Resultatene presenteres med et antall intervall og en tegn-test ble brukt til å teste betydelig unconversion forskjeller. D-Loop (6-298) P= 1.83E-42; D-Loop (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12S: P= 8.38E-16; 16S: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-Loop (6-298) inkluderer opprinnelsen til replikering og tRNA - F + 12S inkluderer tunge strand promoter 2. Disse dataene er publisert andre steder 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bruk av Bisearch å bekrefte primer spesifisitet mot mitokondrie genomet. A) Bisulfite-konvertert primer sekvenser legges til funksjonen BiSearch Primer søk (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). Boksen bisulfite er billett, og en referanse genom er valgt. B) eksempel på potensielle PCR produkter generert på følelse og antisense kjeder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi en bisulfite-sekvensering protokollen som er utviklet til å lage mtDNA metylering. Forskjellene med bisulfite-sekvensering protokollsettet for genomisk DNA ligger i bruken av et tidligere begrensning enzym fordøyelsen skritt og en bioinformatic analyse dommen ut falske positive som oppstår fra NUMT sekvenser.
Vi tilbyr en protokoll for å unngå bisulfite-sekvensering gjenstander når undersøke mtDNA metylering. Bisulfite sekvensering gjenstander fører til falske positiver var tidligere rapportert37. Utilstrekkelig fjerning av DNA tilbehør proteiner av proteinasen K er beskrevet37. Ufullstendig rødsprit eller delvis reannealing kan føre til strekninger av ufullstendig konvertering, muligens ved å senke tilgang til bisulfite til single-strandet DNA37. Senere gjenstand er spill i mtDNA hvor en sekundær struktur vil svekke tilgang til cytosines. Til best av vår kunnskap, er tillegg av en begrensning enzym fordøyelsen trinn før bisulfite konvertering i sammenheng med å estimere mtDNA metylering først rapportert i 20163,28. I våre hender også senket før fordøyelsen med en enkelt-cutter begrensning enzym dramatisk påvisning av uomvendte cytosines3,28.
Her gir vi en bioinformatic rørledning til å analysere bisulfite sekvensering resultater og oppdage bisulfite sekvensering gjenstander i sammenheng med hele mitokondrie genomet bisulfite sekvensering. Denne metoden kommer fra vår observasjon at mtDNA ikke-konverteringsfrekvens var omvendt korrelert med sekvensering dybde3,28. Denne observasjonen foreslår at videregående og enda høyere oppbygning mtDNA svekker fragmentering av mtDNA på bestemte regioner under byggingen av sekvensering biblioteker og kan også gjøre full tilgang til natrium bisulfite til mtDNA. Siden fordøyelsen med en en-cutter enzym befrir sekundære og tertiære strukturer, viser våre resultater at mtDNA struktur er en kilde til bisulfite gjenstand og validere metodene beskrevet her for kvantifisering av cytosine metylering i mtDNA.
Uunngåelig forurensning av kjernefysiske DNA i mitokondrie forberedelse utgjør en utfordring. Dette fører til forurensning i NUMT sekvenser i sekvensering leser, som kan lede estimering av cytosine metylering i mtDNA, selv når utføre målrettet og ikke hele mitokondrie genomet bisulfite sekvensering. For å unngå slike skjevheter, tillater utformingen av unike bisulfite sekvensering primere for å ekskludere forurensning med metylering på NUMTs. NUMTs gjelder for visse regioner av menneskelige og mus mitokondrie genomet med 100% identitet, og det er derfor umulig å utforme unike primere på visse mtDNA områder. Når hele mitokondrie genomet bisulfite sekvensering, sekvensering lenge kan leser lette diskriminering mellom mtDNA og NUMTs. Justere leser hele genomet og bare bruk leser entydig tilordnet mitokondrie genomet kan videre sikre påvisning av mtDNA metylering.
Til slutt kan denne protokollen brukes utenfor mitokondrie genomer, for eksempel i andre forekomster av bisulfite sekvensering der sekundære strukturen av DNA representerer en potensiell kilde til gjenstand. Tilknytningen mellom metylering nivåer og sekvensering dybde kan undersøkes for å vurdere behovet for en fordøyelsen med en begrensning enzym før bisulfite sekvensering av komplekse DNA-sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å erklære.
Acknowledgments
Novo Nordisk Foundation senter for grunnleggende metabolske forskning er en uavhengig forskning ved Universitetet i København delvis finansiert av en ubegrenset donasjon fra Novo Nordisk Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
