Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at lade nøjagtig kvantificering af mitokondriel DNA (mtDNA) methylering. I denne protokol beskriver vi en Enzymatisk nedbrydning af DNA med BamHI kombineret med en bioinformatic analyse pipeline, som kan bruges til at undgå overvurdering af mtDNA methylering niveauer forårsaget af mtDNA sekundær struktur.
Abstract
Kvantificering af DNA methylering kan opnås ved hjælp af bisulfite sekventering, som tager fordel af natrium bisulfite til at konvertere unmethylated cytosin til uracil, i en enkelt-strenget DNA sammenhæng ejendom. Bisulfite sekvensering kan være målrettet (ved hjælp af PCR) eller udføres på den samlede genom og giver absolut kvantificering af cytosin methylering i den fælles base-opløsning. Givet den særskilte karakter af nukleare og mitokondrie DNA, navnlig i den sekundære struktur, bør tilpasninger af bisulfite sekventering metoder for at undersøge cytosin methylering i mtDNA gøres. Sekundære og tertiære struktur af mtDNA kan faktisk føre til bisulfite sekventering artefakter fører til falsk-positive på grund af ufuldstændige denaturering ringe adgang for bisulfite til enkeltstrenget DNA. Her, beskriver vi en protokol med en Enzymatisk nedbrydning af DNA med BamHI kombineret med bioinformatic analyse pipeline tillade nøjagtig kvantificering af cytosin methylering niveauer i mtDNA. Desuden vi give retningslinjer til at designe bisulfite sekventering primere specifikke for mtDNA, for at undgå rettet mod uønskede nukleare mitokondrie segmenter (NUMTs) indsat i det nukleare genom.
Introduction
Den mitokondrielle genom er en cirkulær, dobbelt-strenget struktur af cirka 16,5-kilo base (kb) længe, som udgør en tung og en let strand. Den mitokondrielle genom er til stede i flere eksemplarer i hver celle, maternally-arvet, og koder væsentlige komponenter af respiratorisk kæde komplekser1. Svarende til bakteriel genomer og i modsætning til den nukleare genom, den mitokondrielle genom er organiseret i adskillige sekundære og tertiære strukturer, såsom i snoede og supercoiled strukturer2, der kan gøre adgang vanskeligt under sekventering forsøg3.
I kernen er methylering af DNA et grundigt studeret epigenetiske mark, der spiller en rolle i mange processer, navnlig reguleringen af genekspression. I pattedyr genomer forekommer DNA methylering primært på 5-position af pyrimidin ring af deoxycytidines, for det meste på CG dinucleotides (eller CpG). Cytosin methylering er fundet på 70% af alle CpG i genomet af somatiske celler og tegner sig for ~ 1% af den samlede DNA baserer4. DNA methylations er også blevet beskrevet i ikke-CpG sammenhænge, såsom CpA, CpT og CpC og findes i forskellige mængder i nukleare DNA med værdier op til 25% af alle methylerede cytosines i embryonale stamceller5,6,7.
Mens cytosin methylering af det nukleare genom er bredt accepteret, er eksistensen af mitokondriel DNA (mtDNA) methylering stadig kontroversielt. Den første undersøgelse behandlende mtDNA methylering blev udført i kulturperler celler hvor mtDNA methylering blev let fundet, selv om på lavere niveauer i forhold til nukleare DNA8. I både menneskelige og murine celler, blev mtDNA methylering også fundet på et lavt niveau (2-5%). Ved hjælp af assays afhængige 5 methylcytosine fange såsom methylerede DNA immunoprecipitation (MeDIP) efterfulgt af kvantitativ PCR mtDNA methylering blev også fundet i forskellige mus og menneskelige og celler linjer9,10, 11,12. Ved hjælp af antistoffer mod 5-methylcytosine i en ELISA assay eller massespektrometri, blev betydelige niveauer af DNA methylering opdaget fra renset mitokondrie fraktioner13,14,15, 16. men de fleste af assays i de ovennævnte undersøgelser anvendes teknikker, der ikke var designet til at give absolut kvantificering af DNA methylering i den fælles base-opløsning.
Kvantitative og resolutive DNA methylering analyse kan opnås ved en teknik kaldet "bisulfite sekventering", som tager fordel af natrium bisulfite til at konvertere unmethylated cytosin til uracil i enkeltstrenget DNA sammenhæng17 ejendom . Bruger bisulfite sekventering, har en konstellation af undersøgelser konstateret tilstedeværelsen af cytosin methylering på forskellige niveauer. Methylering mtDNA i D-loop region, 12S eller regionen 16S blev let fundet i menneskelige18,19,20,21,22,23 og mus24 væv og celler, dog med en spændende variation, 1-20% af total cytosines på tværs af undersøgelser.
I forhold til disse talrige undersøgelser, har kun et par undersøgelser, herunder fra vores gruppe, bestridt tilstedeværelsen af mtDNA methylering3,25,26,27 eller spørgsmålstegn ved biologisk relevans meget lave niveauer af mtDNA niveauer (under 2%)28. For nylig, vi rapporterede observation af en potentiel bisulfite-sekventering artefakt i hele mitokondrie bisulfite sekventering3. Vi fremlagde beviser, at den sekundære struktur af mitokondrie-DNA kan føre til falske positiver i bisulfite sekventering, dermed overvurderer methylering niveauer. Vi giver her en protokol for at forhindre en artefakt af bisulfite-konvertering af mtDNA. Denne protokol bruger en simpel Enzymatisk nedbrydning af DNA til at forstyrre mtDNA sekundære strukturer og give fuld adgang til bisulfite efter en bisulfite sekventering protokol. Derudover giver vi en ledsagende bioinformatic rørledning til analyse af bisulfite sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. begrænsning enzym behandling
- Linearize mtDNA ved at behandle samlede menneskelige DNA med begrænsning enzymet BamHI, der skærer på position 14258 i den menneskelige mitokondrie-DNA.
Bemærk: For musen DNA, bruge begrænsning enzymet BglII under identiske forhold som nedenfor. - For hver-prøve, hvor mtDNA methylering er at blive vurderet, forberede en 0,2 mL reaktion tube og tilføje den følgende blanding: 3 μg genomisk DNA (kvantificeres ved fluorometry), 15 μl Buffer 3, 3 μL BamHI og vand op til 150 μl
- Sted rør i en termisk cycler i 4 timer ved 37 ° C.
2. bisulfite konvertering
- Konvertere BamHI-behandlet DNA ved hjælp af natrium bisulfite som beskrevet andetsteds29.
- Bruge 200-500 ng BamHI-behandlet DNA for hver konvertering reaktion i en samlet maengde paa 20 μL. DNA opsving er 50-70%.
- Elueres Bisulfite-konverteret DNA i 10 μL eluering buffer.
- Kvantificere enkeltstrenget DNA af fluorometry.
- Valgfrit: Gemme bisulfite-konverteret DNA ved-20 ° C inden vi går videre, den resterende del af protokollen. Til langtidsopbevaring, gemme bisulfite-konverteret DNA ved-80 ° C
3. designet af Bisulfite sekventering primere
- Design primere til bisulfite sekvensering ved hjælp af online værktøjer Methprimer30 og BiSearch31,32.
Bemærk: Methprimer og BiSearch mulighed for at søge efter primer bindende sekvenser på genomiske sekvenser hvor cytosines er ombygget til thymines, ligeledes til efter bisulfite behandling. - For optimal og upartiske forstærkning, undgå CpG dinucleotides i primere og designe amplikon størrelse mellem 100-300 bp.
- Sikre, at designet primere er specifikke for mitokondrie-DNA ved hjælp af Bisearchs funktion Primer søgning. Indsæt allerede designede bisulfite konverteret primere, kryds bisulfite og omfatter en reference genom og PCR-parametre.
Bemærk: En liste over mulige PCR produkter vil blive vist. - Kopiere top 1-5 primer sekvenser og indsætte dem i en bestilling form for oligonukleotid syntese.
Bemærk: En liste over mennesker og mus mtDNA primer sekvenser, der er blevet valideret i lab er vist i tabel 1. - Test primere ved hjælp af bisulfite konverteret PCR efter Agarosen gelelektroforese, som beskrevet i trin 4. Test og optimere alle primer par separat og sikre den korrekte amplikon størrelse vises på agarosegel.
Bemærk: Hvis multiplexing primere er påkrævet, tilføje flere primere til en enkelt PCR reaktion og visualisere PCR produkter på Agarosen gelelektroforese eller en mere resolutive metode som polyacrylamid gelelektroforese, at skelne mellem produkter af lignende størrelse.
4. bisulfite konverteret PCR og Gel udvinding
- For at forstærke regionerne af interesse, udføre PCR ved hjælp af en hot start Taq-polymerase. Kort, mix 100 ng konverteret DNA, 500 µM følelse og antisense primere, 1 µL dNTP mix (10 µM af hver dNTP) og polymerase på 7.5 U/reaktion i en samlet maengde paa 50 µL. køre PCR med følgende betingelser: 5 min. ved 95 ° C (60 s 94 ° C, 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 cykler; 10 min. 72 ° C. Bruge primere enten separat eller multipleksede. - Valgfrit: Når multiplexing primere, brug 200 ng konverteret DNA og følgende cykling betingelser: 5 min. 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 cykler; 10 min. 72 ° C.
Bemærk: Temperatur kan variere afhængigt af smeltepunktet af primere. - Underlagt PCR produkter til gel elektroforese på 2% Agarosen ved 100 volt.
- I blide UV-lys, udtrække PCR produkter med en skalpel og føje til microtubes. Udsæt ikke PCR produkter til overdreven UV-lys til at undgå DNA-skader. Undgå eksponeringstid over 30 s.
- Rense PCR produkter ved hjælp af gel rensning som beskrevet tidligere3.
- Kvantificere oprenset DNA fra trin 4.5 ved hjælp af fluorometry. Fortsæt til trin 5 eller store prøver ved-20 ° C.
35 cykler; 10 min. 72 ° C. Bruge primere enten separat eller multipleksede.5. bisulfite sekventering bibliotek forberedelse
- Udføre bibliotek forberedelse af bisulfite-konverteret PCR produkter.
Valgfrit: multiplex PCR produkter på dette stadium. - Udføre slutningen-reparation ved hjælp af op til 100 ng af PCR produkt. Tilføje 3 µL ende prep enzym og 6,5 µL ende reparation reaktion buffer (10 x) til 55.5 µL PCR produkt i en 0,2 mL tube. Sted, og der inkuberes rør i en termisk cycler i 30 min. ved 20 ° C efterfulgt af 30 min. ved 65 ° C.
- Ligate sekventering adaptere ved at blande den ende-repareret DNA med 15 µL stump/TA ligase mix, 2,5 µL adapter og 1 µL ligatur enhancer. Hvis du bruger < 100 ng PCR produkt som input, fortyndes adapter 10 gange.
- Placer mix (trin 5.3) i en termisk cycler og Inkuber 15 min. ved 20 ° C. Pause den termiske cycler og tilføje 3 µl bruger enzymet til røret. Bland og placere røret tilbage i den termiske cycler og Inkuber 15 min ved 37 ° C.
- Størrelse vælge adapter-forbundet DNA ved hjælp af Solid fase Reversible immobilisering (SPRI) perler med varierende forhold mellem perler til DNA afhængigt af PCR produktstørrelse.
- Tilføje 13,5 µL H2O til adapter-forbundet DNA fra trin 5.4 og 55 µL genopslemmes SPRI perler. Inkuber ved stuetemperatur til 5 min og sted rør på et magnetisk stativ. Når opløsningen er klar, overføre supernatanten til en ny tube og kassér rør indeholdende perlerne.
Bemærk: Supernatanten indeholder adapter-forbundet DNA og store uønskede fragmenter er bundet til de kasserede perler. - Tilføje 25 µL genopslemmes SPRI perler til supernatanten fra trin 5.6, blandes og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur. Røret anbringes på den magnetiske stå og supernatanten når løsningen er klar.
Bemærk: Den kasserede supernatanten indeholder uønskede DNA, adapter-forbundet DNA er bundet til perler. - Mens røret er på den magnetiske stand, skal du tilføje 200 µL 80% ethanol (frisklavet) for at vaske perlerne. Inkubér 30 s og fjern og kassér supernatanten. Gentag dette trin for en total af 2 vasker.
- Luften tør perler i 5 min mens røret er på magnetisk stå med en åben låget.
- Fjerne røret fra magneten, elueres DNA i 23 µL eluering buffer og bland. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
- Røret anbringes på en magnetisk stand og når løsningen er klar, overføre 2 µL til en 96-brønd PCR plade for pre-PCR-amplifikation (trin 5.14).
- Overføre resten ca 21 µL til en ny 0.2 mL tube til PCR-amplifikation (trin 5.17).
Bemærk: Sørg for ikke at overføre enhver perler da perler kan hæmme enzymatiske reaktioner i næste trin. - Fortsæt til trin 5.14 eller store prøver ved-20 ° C.
- Udføre pre-PCR-amplifikation af RT-qPCR at anslå antallet af cyklusser for at forstærke den adapter-forbundet DNA. Per reaktion, tilføje følgende i 96-brønd PCR plade indeholdende 2 µL DNA (trin 5.11): 0,4 µL indeks primer, 0,4 µL universal PCR primer, 7.2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR master mix.
- Pladen anbringes i en real-time PCR-maskine og pladen på følgende vilkår: 30 s på 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 cykler; 5 min. 65 ° C.
- Estimere antallet af forstærkning cyklusser behov for hver prøve ved at fratrække en Ct-værdi til Ct-værdi af pre forstærkning RT-qPCR svarer til slutningen af den lineære fase af PCR reaktionen.
- Forstærke den adapter-forbundet DNA fra trin 5.12 ved at blande: 21 µL DNA, 25 µL PCR master mix, 1 µL indeks primer, 1 µL Universal PCR primer og 2 µL H2O. I en termisk cycler er underlagt hver prøve på følgende betingelser: 30 s på 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [beregnede Ct fra trin 5.16] cykler; 5 min. 65 ° C.
Bemærk: Husk kun at bruge én indeks primer pr. prøve for at tillade multiplexing. Indekset er indsat under PCR. - Rense amplificerede DNA SPRI perlerne og elueres i 22 µL eluering buffer.
- Kontrol bibliotek kvalitet gel elektroforese eller alternativ metode. Look for korrekte bibliotek peak størrelser (PCR produkt(er) størrelse plus adapter).
- Anslå den gennemsnitlige basepar størrelse på biblioteket produkt(er) med smear analyse: I avancerede globale indstillinger, dobbeltklik på "tabel" under smøre analyse. Definere området fra 100-1000 bp og klik på OK. Under Region tabel, regionen definerede vises og bibliotek gennemsnitlige størrelse (bp) beregnes.
- Kvantificere biblioteker af fluorometry. Fortsæt til trin 6 eller store biblioteker ved-20 ° C.
6. næste Generation Sequencing
- Beregne nM koncentrationen af biblioteker ved hjælp af formlen:
- Fortynd biblioteker til samme nM koncentrationen fx 2 nM (Vælg 4 nM, 2 nM, 1 nM eller 0,5 nM afhængigt af bibliotek koncentrationer). Samle alle biblioteker for at opnå en pulje af 2 nM biblioteker.
- Denaturere og fortyndes biblioteker efter guiden sekvensering instrument. Kort sagt: denaturere 2 nM puljen ved at tilføje 0,2 N NaOH og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Dilute denatureret puljen til en endelige fortynding af 10 pM. Denaturere og fortynde en kommercielt tilgængelig kontrol bibliotek til en endelige fortynding af 12.5 pM. Bland 10 pM pool med 20% kl. 5 pM kontrol bibliotek til en ny tube.
Bemærk: Bisulfite konvertering introducerer meget lav kompleksitet. 20% kontrol bibliotek spike-i vil resultere i bedre sekventering kvalitet. - Køre en 150 bp parret ende sekventering ved hjælp af en dyb sekventering instrument.
7. beregningsmæssige analyse - skøn methylering niveauer
- Generere .fastq filer (her kaldet sample1_R1.fastq.gz og sample1_R2.fastq.gz), generere en bismark indeks over hele genomet af interesse (her i en mappe kaldet bismarkIndex), og sørg for, at den genomiske sekvens af chrM er tilgængelig i fasta format (her i en mappe kaldet chrM).
- Forbehandle læser for at fjerne adaptere og bias indført af primere: Brug værktøjet Trim_galore33. Fjerne to nukleotider fra 5'-enden af både forward og reverse læser.
trim_galore--clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. /--trim1--parret sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Juster pre forarbejdede læser til det hele genom ved hjælp af Bismark34
Bismark--svalehale - bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
Bemærk: Hvis en anden aligner bruges, Sørg for, at læser, der ikke kan være entydigt justeret kasseres. - Ekstrakt læser tilknytning til kromosom M, her ved hjælp af Samtools35
samtools sortere -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.Bam
samtools indeks sample1_sorted.bam
samtools Se -u sample1_sorted.bam chrM | samtools sortere - n - O BAM -o sample1_chrM.bam - Udtrække methylering oplysninger
bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--omfattende--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - Bruge .bedGraph, .cov eller CX_report.txt filer til yderligere analyse. Bruge filen sample1_chrM.CX_report.txt til visualisering og afprøvning.
- Udføre yderligere klipning i trinnet forbehandling, hvis flere regioner er afhørt og en primer bias kan ses i M-bias parceller genereret under kortlægningen. Se Bismark dokumentationen for flere oplysninger.
8. beregningsmæssige analyse - Test af forskelle
- Sikre, at filen CX_report.txt indeholder 7 kolonner kromosom (her chrM), placering, strand, antallet af methylerede læser, antal unmethylated læser, C sammenhæng og omkringliggende sekvens, for hver C på kromosom M.
- Da CX_report dækker chrM i sin helhed, kontrollere undersæt til det eller de områder som forstærkes.
- Bruge ikke-parametrisk test for forskelle mellem prøver, som en fiskere nøjagtige test for individuelle C eller en tegn-test for en hel region.
Bemærk: Kvantificering vil ofte være tæt på 0% methylering, hvilket er grunden til Hvorfor antager normalitet ikke er hensigtsmæssigt. - På samme måde for visualisering, enten visualisere quantiles eller beregne binominal andel konfidensintervaller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To trin i denne protokol er afgørende når undersøger mtDNA methylering. 1) åbningen af sekundær struktur og 2) udformningen af mitokondriel DNA-specifikke primere.
Fordøje det humant genomisk DNA med begrænsning enzymet BamHI (figur 1), den mitokondrielle DNA struktur vil blive skåret på nukleotid position 14,258 og sekundær struktur åbnes.
Den eventuelle værdiforringelse af bisulfite konvertering med en intakt mtDNA sekundær struktur er meget tilbøjelige til at overvurdere mtDNA unconversion sats. Af bisulfite sekventering, mtDNA unconversion sats blev undersøgt, i ufordøjet og fordøjet samlede DNA fra human skeletmuskulatur celler, på 5 forskellige regioner af de mitokondrielle genom: fordrivelse Loop (D-Loop), tRNA phenylalanin og 12S ribosomet (tRNA - F + 12S), 16S ribosom (16S), NADH dehydrogenase 5 (ND5) og cytokrom b (CYTB) mRNA-kodning gen (figur 2). Unconversion sats varierede fra 0 - 15,1% i alle undersøgte regioner for ufordøjet mtDNA. Men når DNA var fordøjet før bisulfite konvertering, den unconversion faldt til et maksimum på 1% på tværs af alle regioner (figur 3). Således illustrerer betydningen af BamHI fordøjelse før bisulfite konvertering at undgå overvurdering af mtDNA methylering niveauer.
Forurening af nukleare DNA er uundgåelige, når isolere den mitokondrielle genom og da næsten det hele mitokondrie genom er blevet replikeret til den nukleare genom, det har givet anledning til nukleare indsætninger af mitokondrie genomet såkaldte nukleare Mitokondrie segmenter (NUMTs)36. For at sikre, at de analyserede DNA methylering niveauer svarer til mitokondrie DNA og ikke NUMTs, er det af yderste vigtighed at designe primere, der er specifikke for den mitokondrielle genom. Figur 4 viser hvordan man kan kontrollere primer specificitet og tabel 1 viser menneskelige og mus mtDNA primer sekvenser.
| Navn | Sekvens | Position | Amplikon størrelse | Udglødning temperatur | Strand | ||
| Menneskelige | |||||||
| D-Loop | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisensstoffer | |||
| D-Loop | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisensstoffer | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisensstoffer | |||
| 260 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Forstand | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | Forstand | |||
| Mus | |||||||
| 220 | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisensstoffer | |||
| 260 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisensstoffer | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisensstoffer | |||
| 260 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Forstand | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | Forstand | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | Forstand | |||
Tabel 1: Primer sekvenser for menneskelige og mus mtDNA. Bemærk at udglødning temperaturer af PCR primere variere på grund af forskelle i smeltepunktet af primere.
Figur 1 : Gel elektroforese af BamHI-fordøjet, eller ufordøjet DNA. Genomisk DNA fra human skeletmuskulatur var ubehandlet eller behandlet med BamHI i 4 timer ved 37° C og gelelektroforese blev kørt på en 1,5% agarosegel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Kort over det menneskelige mitokondrie genom. Regioner af mitokondrie genomet undersøgt af bisulfite sekvensering og BamHI begrænsning enzym websted vises. Mitokondrie-DNA indeholder 13 mRNAs, 2 ribosomale RNA'er og 22 overførsel RNA'er. Forkortelser: PH1: heavy-strand promotor 1; PH2: Heavy-strand fremme 2; PL: lys-strand promotor; ÅH: Oprindelsen af replikering fra heavy-strand; OL: oprindelsen af replikering fra lys-strand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : BamHI fordøjelse før bisulfite konvertering reducerer mtDNA unconversion sats i human skeletmuskulatur celler. Af bisulfite sekventering, denikke-nedbrudte mitokondrie DNA unconversion procent blev forhørt på fem forskellige regioner af mitokondrie genomet i human skeletmuskulatur celler (N= 3). Pladsen fuld repræsenterer CpG websteder, og den åbne plads repræsenterer ikke-CpG websteder. Resultater præsenteres med et min-max interval og en sign test blev anvendt til at teste for betydelige unconversion forskelle. D-Loop (6-298) P= 1.83E-42; D-Loop (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12S: P= 8.38E-16; 16s: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-Loop (6-298) indeholder oprindelsen af replikering og tRNA - F + 12S omfatter tunge strand promotor 2. Disse data er blevet offentliggjort andetsteds 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Brug af Bisearch til at kontrollere primer specificitet mod den mitokondrielle genom. A) Bisulfite-konverteret primer sekvenser er tilføjet til funktionen BiSearch Primer Search (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). Bisulfite boks er markeret, og en reference genom er valgt. B) eksempel af potentiel PCR produkter genereret på fornuft og antisensstoffer kæder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her give vi et bisulfite-sekventering protokol, som er specielt designet til at afhøre mtDNA methylering. Forskelle med bisulfite-sekventering protokoller, der bruges for genomisk DNA ligger i udnyttelsen af en forudgående begrænsning enzym fordøjelsen skridt og en bioinformatic analyse dom ud falsk positive foelger NUMT sekvenser.
Vi leverer en protokol for at undgå bisulfite-sekventering artefakter, når undersøger mtDNA methylering. Bisulfite sekventering artefakter fører til falsk-positive var tidligere rapporteret37. Utilstrækkelig fjernelse af DNA tilbehør proteiner af proteinase K har været beskrevet37. Ufuldstændig denaturering eller delvis reannealing kan føre til strækninger af ufuldstændige konvertering, eventuelt ved at sænke adgang for bisulfite til enkeltstrenget DNA37. Den senere artefakt kunne være på spil i mtDNA hvor en sekundær struktur ville forringe adgangen til cytosines. Til bedste af vores viden, er tilføjelsen af en restriktion enzym fordøjelsen trin før bisulfite konvertering i forbindelse med estimering mtDNA methylering først rapporteret i 20163,28. I vores hænder sænket forudgående fordøjelse med en single-cutter begrænsning enzym også dramatisk påvisning af ikke-konverterede cytosines3,28.
Her, leverer vi en bioinformatic rørledning til at analysere bisulfite sekventering resultater og til at opdage bisulfite sekventering artefakter i forbindelse med hele mitokondrie genom bisulfite sekvensering. Denne metode stammer fra vores observation at mtDNA ikke-konverteringsfrekvens var omvendt korreleret med sekventering dybde3,28. Denne observation antyder at den sekundære og endda tertiære struktur af mtDNA forringer opsplitning af mtDNA på bestemte områder under opførelsen af sekventering biblioteker og kan også forringe fuld adgang af natrium bisulfite til mtDNA. Siden fordøjelse med en one-cutter enzym befrier sekundære og tertiære strukturer, viser vores resultater at mtDNA struktur er en kilde til bisulfite artefakt og validere de metoder, der beskrives heri for kvantificering af cytosin methylering i mtDNA.
Uundgåelig kontaminering af nukleare DNA i mitokondrie forberedelse udgør en udfordring. Dette fører til forurening i NUMT sekvenser i sekventering læser, som kan bias estimering af cytosin methylering i mtDNA, selv når udfører målrettet og ikke hele mitokondrie genom bisulfite sekventering. For at undgå sådanne bias, design af unikke bisulfite sekventering primere giver mulighed for at udelukke kontaminering med methylering på NUMTs. NUMTs spænder over visse regioner af menneskelige og mus mitokondrie genom med 100% identitet, og det er derfor umuligt at designe unikke primere på visse mtDNA regioner. Når du udfører hele mitokondrie genom bisulfite sekventering, sekventering længe kan læser lette forskelsbehandling mellem mtDNA og NUMTs. Tilpasse læser hele genom og kun bruge læser entydigt knyttet til mitokondrie genomet kan yderligere sikre påvisning af mtDNA methylering.
Endelig, denne protokol kan bruges ud over mitokondriets genomer, for eksempel, i andre tilfælde af bisulfite sekventering hvor sekundærstruktur DNA udgør en potentiel kilde til artefakt. Association mellem methylering niveauer og sekventering dybde kan undersøges for at vurdere behovet for en fordøjelse med en restriktion enzym før bisulfite sekventering af komplekse DNA-sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser til at erklære.
Acknowledgments
Novo Nordisk Foundation Center for metaboliske grundforskning er en uafhængig Forskningscenter på Københavns Universitet delvist finansieret af en ubegrænset donation fra Novo Nordisk Fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
