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Genetics

बायोटिन आधारित Pulldown परख सेलुलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मान्य करने के लिए

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57786
Automatic Translation
1,2,3, 2, 2, 2
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

इस रिपोर्ट में सेल्युलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मान्य करने के लिए एक तेज़ और विश्वसनीय विधि का वर्णन है । विधि सिंथेटिक biotinylated बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) का उपयोग करता है आधारित miRNA नकल लक्ष्य mRNA पर कब्जा करने के लिए । इसके बाद, streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों को qPCR पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा ठहराव के लिए लक्ष्य mRNA को pulldown करने के लिए कार्यरत हैं ।

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) छोटे गैर कोडिंग RNAs कि पोस्ट-transcriptionally सेलुलर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित के एक वर्ग के हैं । MiRNAs बाइंड करने के लिए 3 ' unअनुवादित क्षेत्र (UTR) लक्ष्य mRNA के लिए प्रोटीन अनुवाद को बाधित या कुछ उदाहरणों में mRNA क्षरण के कारण. लक्ष्य mRNA के 3 ' UTR करने के लिए miRNA के बंधन miRNA के 5 ' अंत में एक 2 – 8 न्यूक्लियोटाइड बीज अनुक्रम द्वारा मध्यस्थता है. जबकि सेलुलर विनियामक अणुओं के रूप में miRNAs की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित है, कार्यात्मक प्रासंगिकता के साथ लक्ष्य mRNAs की पहचान एक चुनौती बनी हुई है । Bioinformatic उपकरण miRNA बाध्यकारी के लिए संभावित लक्ष्यों के रूप में mRNAs के 3 ' UTR के भीतर अनुक्रम भविष्यवाणी करने के लिए नियोजित किया गया है । इन उपकरणों को भी कार्यात्मक भूमिका की भविष्यवाणी करने का प्रयास में संबंधित प्रजातियों के बीच इस तरह के दृश्यों के विकासवादी संरक्षण का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया है । हालांकि, इन गणनात्मक तरीकों अक्सर झूठी सकारात्मक परिणाम उत्पंन और miRNA और mRNA के बीच विहित बातचीत की भविष्यवाणी करने के लिए सीमित हैं । इसलिए, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं है कि अपने mRNA लक्ष्य के लिए miRNA के प्रत्यक्ष बंधन उपाय कार्यात्मक संपर्क स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं । इस रिपोर्ट में, हम सेलुलर miRNA मीर-125b और 3 ' UTR के प्प-1 mRNA के बीच सीधी बातचीत को मान्य करने के लिए एक संवेदनशील पद्धति का वर्णन करते हैं । हम एक प्रोटोकॉल जिसमें सिंथेटिक biotinylated-miRNA नकल स्तनधारी कोशिकाओं में transfected थे और miRNA-mRNA परिसर में सेलुलर lysate नीचे streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ खींचा गया था विस्तृत । अंत में, खींच-डाउन न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स में mRNA लक्ष्य qPCR-आधारित कार्यनीति का उपयोग करके quantified गया.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) छोटे गैर कोडिंग RNAs है कि नकारात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति1को विनियमित रहे हैं । miRNA के अग्रदूतों जीनोम के कई क्षेत्रों के माध्यम से समूहों में रहते हैं, intergenic क्षेत्रों और प्रोटीन के introns-कोडिंग जीन2,3के भीतर सबसे अधिक बार । miRNAs की उत्पत्ति पंचायती राज-miRNA से miRNAs की प्रतिलिपि शामिल-4जीन एंकोडिंग । पंचायती राज-miRNAs क्रमिक प्रसंस्करण से गुजरना, नाभिक में पहले और फिर कोशिका द्रव्य में एकल असहाय परिपक्व miRNAs4,5उत्पंन करने के लिए । इसके बाद, परिपक्व miRNAs को आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने कॉम्प्लेक्स (RISC) में शामिल किया गया है: एक multimeric प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स जिसमें लक्ष्य मान्यता के लिए प्रोटीन के Argonaute परिवार के सदस्य शामिल हैं4,5, 6,7. परिपक्व miRNAs RISC परिसर में मुख्य रूप से 3 ' UTR लक्ष्य mRNAs8,9,10 के लिए बाध्य लेकिन यह भी कोडिंग और 5 UTR10,11 के mRNA क्षेत्र में कभी कभार बांध कर सकते है . mRNA के लिए miRNA के बंधन में शोधों के परिणाम मुंह बंद करने12,13,14 और कुछ मामलों में mRNA स्थिरीकरण15. के बाद से एक एकल miRNA कई mRNAs लक्ष्य कर सकते हैं, इन विनियामक अणुओं लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया में शामिल है और विभिंन रोग की स्थिति में फंसाया गया है16,17,18।

कैसे miRNAs सेलुलर रास्ते विनियमित की विस्तृत समझ लक्ष्य mRNAs की पहचान की आवश्यकता है । एकाधिक bioinformatics प्लेटफार्मों ख्यात miRNA: mRNA बातचीत19,20भविष्यवाणी करने के लिए उपलब्ध हैं । इन भविष्यवाणियों सही वाट्सन-क्रिकेटरों आधार 2 – 8 न्यूक्लियोटाइड बीज अनुक्रम miRNA और लक्ष्य mRNA4,21के भीतर एक पूरक अनुक्रम के बीच युग्मन पर निर्भर करते हैं । इसके अतिरिक्त, इन उपकरणों miRNA के माध्यमिक संरचना उत्पंन: mRNA द्वैध, इस आणविक बातचीत की ऊष्मा मापदंडों की गणना और प्रजातियों के पार बाध्यकारी साइटों के संरक्षण दिखाने के लिए लक्ष्य की कार्यात्मक प्रासंगिकता बढ़ाने के लिए भविष्यवाणी. दुर्भाग्य से, इन उपकरणों को भी एक बहुत ही उच्च दर (~ 27-70%)15,22पर झूठी सकारात्मक लक्ष्यों की भविष्यवाणी की सीमा है । सबसे महत्वपूर्ण बात, silico प्लेटफार्मों में इन23अपने लक्ष्य के साथ miRNAs की गैर विहित बातचीत को पहचानने में विफल । इसलिए, इस तरह के पूर्वानुमान विश्लेषण अक्सर प्रयोगात्मक तरीकों के साथ संयुक्त कर रहे है कार्यात्मक प्रासंगिक लक्ष्यों को मांय ।

एकाधिक दृष्टिकोण miRNA: mRNA संपर्क को प्रयोग के रूप में मांय करने के लिए विकसित किया गया है । आनुवंशिक miRNA नकल का प्रयोग प्रयोगों, स्पंज और अवरोधकों कि सेल में miRNAs के स्तर को बदलने के लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति24,25,26पर अपने विनियामक प्रभाव के लिए सुराग प्रदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, एक सह के माध्यम से रिपोर्टर आधारित परख अभिकर्मक लक्ष्य mRNA और miRNA की नकल या कोशिकाओं में अवरोधकों के 3 ' UTR क्षेत्र युक्त क्लोन के26miRNAs के विनियामक समारोह के सबूत प्रदान करते हैं । हालांकि इन तरीकों miRNAs द्वारा जीन अभिव्यक्ति के बाद transcriptional विनियमन अध्ययन महत्वपूर्ण हैं, अभिकर्मक दक्षता और pleotropic सेलुलर miRNA स्तर में परिवर्तन के प्रभाव इन आनुवंशिक दृष्टिकोण की प्रमुख सीमाएं हैं23, 26. इसलिए, पूरक जैव रासायनिक तरीकों कि जांच miRNA और उसके लक्ष्य के बीच सीधी बातचीत बेहतर miRNAs के सेलुलर समारोह को समझने के लिए कार्यरत हैं ।

miRNA और इसके लक्ष्य के बीच सीधा संपर्क का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि जटिल27,28,29,30 के भीतर mRNA लक्ष्य का पता लगाने के बाद RISC परिसर के immunoprecipitation है . हाल ही में, एक बेहतर RISC ट्रैप विधि भी miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था; यह RISC के भीतर लक्ष्यों के जोड़ों स्थिरीकरण-miRNA-mRNA मध्यवर्ती mRNA लक्ष्यों की शुद्धि के साथ । हालांकि, इन methodsface आरएनए और आरएनए-बंधन प्रोटीन है कि आम तौर पर सेलुलर डिब्बों31,३२द्वारा अलग कर रहे है के बीच गैर विशिष्ट बातचीत की अंतर्निहित चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । इसके अलावा, इन परख RISC परिसर३३के immunoprecipitation के लिए AGO2 प्रोटीन की उपस्थिति पर निर्भर हैं । यह देखते हुए कि AGO2 केवल argonaute कुशल miRNA मध्यस्थता: mRNA बातचीत नहीं है, अंय argonautes के बहिष्कार पक्षपातपूर्ण परिणाम३४के लिए नेतृत्व कर सकता है । इसलिए, वैकल्पिक रणनीतियों mRNA करने के लिए miRNA के प्रत्यक्ष बंधन का अध्ययन करने की जरूरत है ।

इस रिपोर्ट में, हम एक miRNA और इसके लक्ष्य mRNA के बीच सीधी बातचीत की जांच के लिए एक कदम दृष्टिकोण को विस्तृत करते हैं । सबसे पहले, 3 ' biotinylated लॉक न्यूक्लिक एसिड (LNA) miRNA नकल transfected कोशिकाओं में स्तनधारी हैं । फिर, miRNA: सेलुलर lysate में mRNA परिसर streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर कब्जा कर लिया है । इसके पूरक miRNA के लिए बाध्य mRNA लक्ष्य qPCR का उपयोग quantified है.

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Protocol

1. अभिकर्मक of 3 '-biotinylated miRNA

नोट: एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड के अंदर निम्न चरणों का पालन करें ।

  1. बीज 4 x 105-5 x 105 HEK-293T कोशिकाओं को पूरा Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 2 मिलीलीटर में [DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1x पेन-strep एंटीबायोटिक के साथ पूरक] । संस्कृति एक मशीन में कोशिकाओं ३७ ° c, 5%2 सह रात भर में सेट ।
  2. अगले दिन, स्वास्थ्य और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत मढ़वाया कोशिकाओं के पालन की जांच करें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कक्षों का पालन किया है और अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले उपयुक्त आकृति विज्ञान प्राप्त है । HEK-293T कोशिकाओं को आम तौर पर अभिकर्मक के लिए तैयार कर रहे हैं 18 – 24 ज पद चढ़ाना.
  3. एक बाँझ १.७ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में, पतला ७५ picomoles biotinylated miRNA के २०० µ एल में न्यूनतम आवश्यक मीडिया के. इस मिश्रण को एक और १.७ एमएल microfuge ट्यूब के साथ Liposome आधारित अभिकर्मक रिएजेंट (8 µ l/) को न्यूनतम आवश्यक मीडिया के २०० µ l में पतला स्थानांतरित करें । अच्छी तरह से मिश्रण है, लेकिन धीरे से, pipetting और 20 के लिए गर्मी-कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए अभिकर्मक परिसरों के गठन की अनुमति देते हैं ।
  4. कोमल pipetting द्वारा 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली से पुराने मीडिया को दूर करने और हौसले से तैयार पूरा DMEM (1x कलम-strep एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) के १.६ मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से भरना ।
  5. अभिकर्मक परिसरों में (१.३ से) एक अच्छी तरह से नपे-तुले पिपेट का उपयोग कर 6-well प्लेट में कोशिकाओं को ड्रॉप-वार जोड़ें । थाली के पार अपनी वर्दी वितरण सुनिश्चित करने के लिए परिसरों को जोड़ते हुए प्लेट धीरे से घूमता है ।
    नोट: यह कदम उच्च दक्षता अभिकर्मक को प्राप्त करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और देखभाल और धैर्य के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  6. संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं और 5% सह2 के लिए कम से ३६ ज ।

2. Streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों की तैयारी-मैं

  1. streptavidin चुंबकीय मोती अच्छी तरह से भंवर द्वारा reसस्पेंड । एक 2 मिलीलीटर nuclease-मुक्त microfuge ट्यूब के लिए मनका निलंबन (प्रति नमूना) के 30 µ एल स्थानांतरण ।
  2. 2 मिनट के लिए चुंबकीय मनका विभाजक खड़े हो जाओ ("चुंबक" इसके बाद) पर मनका निलंबन युक्त ट्यूब प्लेस । यह सुनिश्चित करने के बाद कि मोतियों को चुंबक के साथ संपर्क में ट्यूब की तरफ खींचा जाता है, ध्यान से एक micropipette का उपयोग करके supernatant को हटा दें.
  3. मनका धो बफर के १०० µ एल जोड़ें (10 मिमी Tris-सीएल पीएच ७.५, ०.५ mm EDTA, 1 M NaCl) मोतियों को । चुंबक से ट्यूब निकालें । कमरे के तापमान पर 15 एस के लिए भंवर मोती धोने के लिए ।
  4. 2 मिनट के लिए चुंबक पर मोती युक्त ट्यूब प्लेस, और ध्यान से हटाने और supernatant को त्यागें ।
  5. दोहराएं चरण २.३ और २.४ कुल तीन बहाकर के लिए । अंतिम धोने के कदम के बाद, चुंबक से ट्यूब हटा दें ।
  6. जोड़ें १०० µ l के RNase मुक्त समाधान (०.१ M NaOH, ०.०५ एम NaCl) मोतियों को, 15 एस के लिए भंवर से अच्छी तरह से मिश्रण है, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । 2 मिनट के लिए चुंबक पर मोती युक्त ट्यूब प्लेस, और ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें ।
  7. कुल तीन बार के लिए २.६ चरण दोहराएँ ।
  8. मनका resuspension समाधान (०.५ M NaCl) मोतियों को जोड़ें, भंवर 15 एस, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । 2 मिनट के लिए चुंबक पर reसस्पैंड मोतियों प्लेस, और ध्यान से supernatant हटा दें ।
  9. मनका अवरुद्ध समाधान के २०० µ एल जोड़ें (1 µ g/µ l BSA, 2 µ g/µ l खमीर tRNA) को मोतियों की माला. कमरे के तापमान पर 15 एस के लिए कोमल भंवर से मिश्रण । एक बहु ट्यूब रोटेटर पर 16 घंटे (ओवर-नाइट) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।

3. सेल Lysates की तैयारी

  1. transfected HEK-293T कोशिकाओं लामिना हूड के अंदर एक बाँझ सेल खुरचना का उपयोग कर, तो एक बाँझ 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में प्रत्येक नमूने हस्तांतरण कोमल scraping द्वारा फसल ।
  2. 5 मिनट के लिए १,५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा scraped कोशिकाओं गोली, 1x बाँझ पंजाब (फास्फेट बफर खारा), पीएच ७.२ में गोली reसस्पेंड । एक अवशिष्ट मीडिया से मुक्त गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए १,५०० x g पर फिर से केंद्रापसारक । तुरंत बर्फ में गोली युक्त ट्यूब डुबकी ।
  3. तैयार ताजा पूरा सेल lysis बफर (१५० मिमी NaCl, 25 मिमी Tris-सीएल, पीएच-७.५, 5 मिमी डीटीटी, ०.५% IGEPAL, ६० यू/एमएल Superase, 1x चिढ़ाना अवरोधक) ।
    नोट: सेल lysis बफर की कमी IGEPAL, Superase, और चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल की एक शेयर पहले से तैयार किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत । स्टॉक सेल lysis बफर करने के लिए अनुशंसित अंतिम सांद्रता पर ऊपर की खुराक जोड़ने और यह बर्फ पर भंडारण द्वारा पूरा सेल lysis बफर के एक ताजा बैच तैयार करें ।
  4. जोड़ें २६० बर्फ के µ एल-ठंडा पूरा सेल lysis बफर microfuge ट्यूब में प्रत्येक नमूने के लिए (यानी, प्रत्येक microfuge ट्यूब शामिल कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से प्लेट की एक अच्छी तरह से काटा) और समरूप द्वारा एक pipetting निलंबन में सेल गोली reसस्पेंड ।
  5. लाइसे-गल विधि का उपयोग कर कोशिकाओं: 10-15 मिनट के लिए-८० ° c पर ट्यूबों मशीन । फिर, कोशिकाओं को बर्फ पर गल जाने दें ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक प्रशीतित benchtop केंद्रापसारक में 5 मिनट के लिए १६,००० x g पर परिणामी सेल lysate केंद्रापसारक ।
  7. बर्फ पर एक बाँझ १.७ मिलीलीटर microfuge ट्यूब करने के लिए मंजूरी दे दी सेल lysate स्थानांतरण । गोली छोड़ें ।
    नोट: अंतिम खंड की मंजूरी दे दी lysate होना चाहिए ~ 240 – 250 µ एल.
  8. 5M NaCl 1m की एक अंतिम एकाग्रता के लिए मंजूरी दे दी lysate जोड़ें और बर्फ पर नमूने बनाए रखने के लिए ।

4. Streptavidin चुंबकीय मोतियों की तैयारी — II

  1. तैयार नए सिरे से पूरा पुल-डाउन धो बफर (10 मिमी KCl, १.५ मिमी MgCl2, 10 मिमी Tris-सीएल पीएच ७.५, 5 मिमी डीटीटी, 1 मीटर NaCl, ०.५% IGEPAL, 60U/एमएल Superase, और 1x चिढ़ाने के कॉकटेल)
    नोट: पुल के एक शेयर-नीचे धोने बफर कमी IGEPAL, Superase, और चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल पहले से तैयार किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत । स्टॉक सेल lysis बफर करने के लिए अनुशंसित अंतिम सांद्रता पर ऊपर की खुराक जोड़ने और यह बर्फ पर भंडारण द्वारा पूरा सेल lysis बफर के एक ताजा बैच तैयार करें ।
  2. तैयार मोती युक्त ट्यूब प्लेस (२.९ कदम से) 2 मिनट के लिए चुंबक पर. ध्यान से निकालें और supernatant को त्यागें ।
  3. बर्फ के १५० µ एल जोड़ें-ठंडा पूरा पुल नीचे मोतियों को धोने बफर । 15 एस के लिए भंवर और कमरे के तापमान पर 30 के लिए मशीन-60 एस जगह 2 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों. ध्यान से निकालें और supernatant को त्यागें ।
  4. 3 बार की कुल के लिए ४.३ चरण को दोहराएँ ।
  5. ३०० µ में मोतियों को reसस्पेंड पूरा पुल नीचे धोने बफर के एल ।

5. पुल-लक्ष्य mRNA-miRNA परिसरों के नीचे

  1. अंतरण ३०० µ l के सेल lysate (step ३.८ से) के microfuge ट्यूब से युक्त ३०० µ l के मोतियों की माला (step ४.५ से).
  2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक nutating मिक्सर पर मिश्रण की मशीन ।
  3. 5 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब प्लेस. ध्यान से निकालें और supernatant को त्यागें ।
  4. बर्फ के ३०० µ एल जोड़ें-ठंडा पूरा पुल नीचे मोतियों को धोने बफर । कमरे के तापमान पर 15 एस के लिए भंवर और 5 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह है । ध्यान से निकालें और supernatant को त्यागें ।
  5. दोहराएं चरण ५.४ दो बार ।
  6. nuclease के १०० µ एल में मोतियों को पुनः निलंबित-मुफ्त पानी और बर्फ पर गर्मी ।

6. कुल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, और qPCR

  1. (५.६ कदम से) reसस्पैंड मोतियों से कुल आरएनए निकालें एक उपयुक्त विधि का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) । nuclease-मुक्त पानी के 25 µ एल में निकाली कुल आरएनए reसस्पेंड । आरएनए एकाग्रता और एक spectrophotometer (260/280 पर अवशोषक) का उपयोग कर गुणवत्ता का निर्धारण । ५० एनजी पर आरएनए के एक काम शेयर तैयार/µ एल
  2. सीडीएनए संश्लेषण प्रदर्शन, triplicates में, कुल आरएनए के ५० एनजी का उपयोग (६.१ कदम से) एक उचित सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) 20 µ एल की एक अंतिम मात्रा में oligo डीटी प्राइमरों का उपयोग (तालिका 1). फिर, तालिका 2में वर्णित शर्तों के अनुसार थर्मल सायक्लिंग प्रदर्शन करने के लिए qPCR साधन में पीसीआर ट्यूबों लोड ।
  3. सीडीएनए पर qPCR प्रदर्शन (६.२ कदम से) SYBR हरी रसायन विज्ञान का उपयोग (सामग्री की तालिका देखें):
    1. सभी qPCR प्रतिक्रियाओं में triplicates में एक ९६ अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे थाली बाँझ स्थितियों में प्रदर्शन ।
    2. Aliquot 9 µ एल रिएक्शन मिश्रण से qPCR मास्टर मिक्स ( तालिका 3देखें) प्लेट के प्रत्येक कुआं में । फिर, 10 µ के एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सीडीएनए के 1 µ एल जोड़ें l. हीट प्रतिरोधी पीसीआर प्लेट मुहर लगाने और qPCR साधन में लोड का उपयोग कर पीसीआर प्लेट सील
    3. तालिका 4में वर्णित शर्तों के अनुसार थर्मल साइकलिंग करें ।
    4. अभिव्यक्ति स्तर (सीटी मान) प्रत्येक नमूने के तले हुए नियंत्रण के अभिव्यक्ति स्तर को सामान्य. व्यंजक में फ़ोल्ड परिवर्तन परिकलित करने के लिए इन मानों का उपयोग करें ।

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Representative Results

MiRNAs लक्ष्य mRNAs के लिए बाध्यकारी द्वारा सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित । इसलिए, mRNA लक्ष्य की पहचान miRNA फ़ंक्शन को समझने के लिए एक कुंजी है । यहां हम सेलुलर miRNA के mRNA लक्ष्य की पहचान करने के लिए एक विधि विस्तृत । यह प्रोटोकॉल वानी एट अल से अनुकूलित है । ३५ के उपयोग के संशोधन के साथ biotinylated LNA आधारित miRNA नकल pulldown लक्ष्य mRNA. LNA आधारित oligonucleotide नकल का उपयोग विषाक्त प्रभाव३६,३७,३८के बिना संशोधित ribose अंगूठी की उच्च स्थिरता के कारण लक्ष्य बंधन की विशिष्टता को बढ़ाता है । हम सेलुलर miRNA मीर-125b के लक्ष्य के रूप में प्प-1 mRNA नीचे खींचने के लिए इस विधि कार्यरत हैं । मीर-125b अभिव्यक्ति का उच्चतम स्तर मस्तिष्क के ऊतकों में पाया जाता है जो न्यूरॉन फंक्शन३९,४०को नियंत्रित करता है । एक में मीर के लक्ष्यों की पहचान करने की कोशिश में 125b ंयूरॉन कोशिकाओं में, हाल ही में हम रिपोर्ट है कि मीर-125b नकारात्मक प्प-1 प्प४१के 3 ' UTR के लिए बाध्य द्वारा अभिव्यक्ति का नियमन ।

Pulldown ऑफ miRNA: mRNA कॉम्प्लेक्स

हम मीर-125b और प्प-1 mRNA के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए HEK-293T कोशिकाओं का इस्तेमाल किया, क्योंकि इन कोशिकाओं को व्यापक रूप से सेलुलर, जैव रासायनिक, और आणविक जीवविज्ञान अध्ययन में इस्तेमाल कर रहे हैं । mRNA लक्ष्य के लिए प्रयुक्त प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दर्शाया गया है । सबसे पहले, HEK-293T कोशिकाओं (4 x10 5-5 x 10 5 प्रति कोशिकाओं) एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में रातोंरात वरीयता प्राप्त किया गया और 5% के साथ ३७ ° c पर मशीन 18 के लिए सह2 -24 एच । इसके बाद, ७५ picomoles के 3 '-biotinylated मीर-125b नकल और 3 '-biotinylated तले हुए नियंत्रणों को transfected आधारित liposome पद्धति का उपयोग कर कोशिकाओं में अभिकर्मक गया. Transfected कोशिकाओं ३७ ° c और 5% CO2 में एक अतिरिक्त ३६ एच के लिए और काटा गया । तदुपरांत सेलुलर lysates की transfected कोशिकाओं को फ्रीज-गल lysis विधि द्वारा तैयार किया गया । हौसले से तैयार सेलुलर lysates कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक बेंच शीर्ष nutating मिक्सर पर अवरुद्ध streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ मशीन थे । इस के बाद, मोती संसाधित और चुंबकीय विभाजक पर ताजा तैयार बर्फ ठंड पुल डाउन धोने बफर का उपयोग कर धोया गया । अंत में, मोतियों को आगे के विश्लेषण के लिए nuclease मुक्त पानी की १०० µ एल में reसस्पैंड कर दिया गया ।

पुल-डाउन miRNA में लक्ष्य mRNA का पता लगाना: mRNA कॉम्प्लेक्स

इस पुल-नीचे मिश्रण से मीर-125b के लक्ष्य mRNA का पता लगाने के लिए, हम एक qPCR परख (चित्रा 1) कार्यरत हैं । हम आगे और रिवर्स प्राइमरों (FP और आरपी) ओआरएफ के भीतर प्प-1 mRNA बढ़ाना (चित्रा 2, टेबल 5b) बनाया । हम भी p53 mRNA, मीर के एक ज्ञात लक्ष्य-125b४२का पता लगाने के लिए प्राइमर सेट डिजाइन, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और शामिल प्राइमरों को एक गैर विशिष्ट नकारात्मक नियंत्रण के रूप में actin mRNA बढ़ाना । इसके अलावा, आगे प्रवर्धन की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, हम प्प के 3 ' UTR क्षेत्रों-1, p53 और actin का पता लगाने के लिए प्राइमरों डिजाइन किए हैं । हमने प्रोटोकॉल (अनुभाग 6) में वर्णित विधियों का उपयोग करके qPCR किया है ।

चित्रा 3 लक्ष्य के qPCR आधारित प्रवर्धन से पता चलता है mRNA शुद्ध मोतियों से तले हुए नियंत्रण के सापेक्ष है । प्प-1 mRNA का स्तर चिह्नित नमूनों में उच्च था biotinylated मीर के साथ खींच-नीचे 125b नकल जब तले नियंत्रण की तुलना में । जैसा कि अपेक्षित, सकारात्मक नियंत्रण के उच्च mRNA स्तर p53 mRNA और नकारात्मक नियंत्रण actin mRNA के न्यूनतम प्रवर्धन इन नमूनों में मनाया गया था. प्रवर्धन के समान स्तर प्प के 3 ' UTR लक्ष्यीकरण प्राइमरों का उपयोग कर प्राप्त किया गया-1 और p53 नकारात्मक नियंत्रण actin (चित्र 3 बी) की तुलना में । ओआरएफ क्षेत्रों के qPCR परिणाम (3 एआंकड़ा) और UTR क्षेत्रों (चित्रा बी1) प्प-१ mRNA और p53 mRNA के कुछ स्तरों परिवर्तनशीलता का पता चला । बाध्यकारी समानता, miRNA बंधन साइटों की संख्या, और प्राइमर अनुक्रम निर्भर प्रवर्धन में अंतर सहित कई कारकों चित्रा 3में प्रवर्धन के चर स्तर के लिए योगदान कर सकते हैं । फिर भी, इन आंकड़ों दृढ़ता और सेलुलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मांय करने के लिए विधि की व्यवहार्यता और विशिष्टता का समर्थन ।

Figure 1
चित्रा 1: लक्ष्य पर कब्जा परख biotinylated-miRNA नकल का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: mRNA लक्ष्य के प्रवर्धन के लिए प्राइमर डिजाइन । mRNA मीर-125b के लक्ष्य का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । प्राइमरों का एक सेट (सेट मैं) टेप के ओआरएफ क्षेत्र और प्राइमरों के दूसरे सेट के भीतर डिजाइन किया गया था (सेट द्वितीय) लक्ष्य जीन के 3 ' UTR क्षेत्र में डिजाइन किया गया था । FP और आरपी प्रत्येक सेट के लिए आगे और रिवर्स प्राइमर का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मीर-125b qPCR द्वारा पहचान लक्ष्य । (क) mRNA स्तरों प्राइमर सेट मैं, जो लक्ष्य mRNA के ओआरएफ क्षेत्र को परिवर्धित का उपयोग कर । प्प-1 और p53 mRNA (सकारात्मक नियंत्रण) के उच्च अभिव्यक्ति स्तर मनाया गया जब actin mRNA (नकारात्मक नियंत्रण) की तुलना में । (ख) लक्ष्य mRNA के 3 ' UTR क्षेत्र के प्रवर्धन प्राइमर सेट द्वितीय का उपयोग कर । कोई प्रवर्धन नहीं टेंपलेट नियंत्रण (एनटीसी) में मनाया गया । सभी प्रतिक्रियाओं triplicates में प्रदर्शन किया गया और डेटा 2-ΔCt विधि पर आधारित उपयुक्त डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

घटक शेयर 20 μL प्रतिक्रिया के लिए अंतिम मात्रा
टेम्पलेट (आरएनए) ५० एनजी/µ एल १.० μL
प्रतिक्रिया बफर 5x ४.० μL
Oligo डीटी प्राइमर मास्टर स्टॉक 2 μL
रिवर्स Transcriptase मास्टर स्टॉक 1 μL
Nuclease-मुक्त आसुत जल - 12 μL
कुल प्रतिक्रिया की मात्रा 20 μL

तालिका 1: सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण.

१०५ ° c = 30 s
४२ ° c = ६० min
९५ ° c = 5 min
10 ° c = पकड़ो

तालिका 2: सीडीएनए संश्लेषण थर्मल सायक्लिंग शर्तों ।

घटक शेयर 10 μL प्रतिक्रिया के लिए अंतिम मात्रा
सीडीएनए उत्पाद - १.० μL
iTaq सार्वत्रिक SYBR मिश्रण 2x ५.० μL
लक्ष्य (ओआरएफ/3 ' UTR) F.P. 10 माइक्रोन ०.५ μL
लक्ष्य (ओआरएफ/3 ' UTR) R.P. 10 माइक्रोन ०.५ μL
Nuclease-मुक्त आसुत जल - 3 μL
कुल प्रतिक्रिया की मात्रा 10 μL

तालिका 3: qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण ।

९५ ° c = 10 min
के 30 चक्र:
९५ ° c = 10 s
५६ ° c = 30 s
७२ ° c = 30 s
पिघल वक्र विश्लेषण
६५ ° c = 31 एस
रैखिक रैंप दर = ०.५ ° c/
अधिग्रहण = ०.५ ° c अंतराल

तालिका 4: qPCR थर्मल सायक्लिंग शर्तों ।

(क): Biotinylated ओलिगोस्पर्मिया
Biotinlyated ओलिगोस्पर्मिया शेयर अनुक्रम (5 ' से 3 ')
त्यही-मीर-125b 25 माइक्रोन UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-बायोटिन
नियंत्रण तले 25 माइक्रोन GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-बायोटिन
(ख) प्राइमर
टारगेट प्राइमरी (ओआरएफ) शेयर अनुक्रम (5 ' से 3 ')
प्प-1 (FP) १०० माइक्रोन GAGGTGGATGGGTTCTCTGA
प्प-1 (आरपी) १०० माइक्रोन ACACCCCTTGCACGTACTTC
p53 (FP) १०० माइक्रोन TGTGACTTGCACGTACTCCC
p53 (आरपी) १०० माइक्रोन ACCATCGCTATCTGAGCAGC
ACTIN (FP) १०० माइक्रोन GCTCGTCGTCGACAACGGCTC
ACTIN (आरपी) १०० माइक्रोन CAAACATGATCTGGGTCATCTT
(ग) प्राइमर
टारगेट प्राइमर (3 ' UTR) शेयर अनुक्रम (5 ' से 3 ')
प्प-1 (FP) १०० माइक्रोन ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT
प्प-1 (आरपी) १०० माइक्रोन CTACCCATCAGCAACTTAGCG
p53 (FP) १०० माइक्रोन GGCCCATATCTGTGAAATGC
p53 (आरपी) १०० माइक्रोन CTGCAGGAAGGCAGGTTTT

तालिका 5: Oligonucleotide नाम और अनुक्रम ।

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Discussion

सेलुलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों की पहचान उनके विनियामक समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । कई गणना उपकरण बीज अनुक्रम complementarity और लक्ष्य के संरक्षण के अनुक्रम19,20के आधार पर लक्ष्य की भविष्यवाणी करने के लिए कार्यरत हैं । हालांकि इन उपकरणों मूल्यवान हैं, वे दोनों झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक के उच्च स्तर उत्पंन कर सकते हैं । इसलिए, इन भविष्यवाणियों RISC जटिल और पुल के नीचे miRNA के immunoprecipitation के रूप में प्रयोगात्मक तरीकों के साथ युग्मित कर रहे हैं: mRNA परिसर में miRNAs के प्रत्यक्ष बंधन की पुष्टि करने के लिए उनके संबंधित लक्ष्य27,31। यह रिपोर्ट एक प्रायोगिक रणनीति है कि biotinylated miRNA pulldown लक्ष्य mRNA के लिए नकल का उपयोग करता है विवरण । बायोटिन pulldown उच्च संवेदनशीलता और कम झूठी सकारात्मक दर३५,४३के साथ miRNA लक्ष्यों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, इस विधि भी कब्जा कर लिया आरएनए पूल के अनुक्रम आधारित स्क्रीनिंग युग्मन द्वारा miRNA लक्ष्यों की पहचान के लिए शोषण किया जा सकता है । हालांकि, इस विधि४४करने के लिए कई सीमाएं हैं । पर एक exogenous miRNA की अभिव्यक्ति कोशिकाओं के transcriptional नेटवर्क को संशोधित सकता है, mRNA में फलस्वरूप परिवर्तन है कि miRNA विनियमन के कारण नहीं कर रहे हैं । ये नकल की बहुत कम मात्रा का उपयोग करके दूर किया जा सकता है ताकि perturb अंतर्जात miRNA विनियमन के लिए नहीं । miRNAs गैर-विशिष्ट बाइंडिंग से बचने के लिए व्यक्त exogenously हैं, तो भी, उचित नियंत्रण आवश्यक हैं । सावधान धोने और अवरुद्ध कदम प्रभावी ढंग से पृष्ठभूमि शोर को कम करने और लक्षित miRNA की विशिष्टता में वृद्धि कर सकते हैं । कुछ अध्ययनों से पता चला है कि miRNA के संशोधनों ' 3 या 5 ' समाप्त होता है अच्छी तरह से सहन नहीं कर रहे हैं४५, फिर भी, कई अध्ययनों कुशलता से इस्तेमाल किया है बायोटिन टैग की नकल mRNA लक्ष्य का पता लगाने के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में ।

इस विधि के अंय लाभ LNA आधारित (बंद न्यूक्लिक एसिड) miRNA नकल का उपयोग है । LNA न्यूक्लिक एसिड संशोधन उच्च अपनत्व४६,४७के साथ स्थिर oligonucleotides डुप्लेक्स के गठन की अनुमति देता है । इसके अलावा, कस्टम मेड biotinylated LNA miRNA नकल तीन आरएनए किस्में से मिलकर बनता है । miRBase एनोटेशन के अनुसार अनुक्रम के साथ एक 3 '-biotinylated miRNA कतरा और एक यात्री miRNA है कि दो LNA में विभाजित है के लिए पूरक किनारा-संशोधित आरएनए४७किस्में । RISC केवल miRNA कतरा को शामिल करते हुए दो यात्री किस्में तेजी से इस प्रकार लक्ष्य विशिष्टता बढ़ाने नीचा दिखा रहे हैं । हमारे निष्कर्षों का विश्वास बढ़ाने के लिए, हमने मीर-125b के एक मान्य लक्ष्य p53 को एक सकारात्मक नियंत्रण और β-actin के रूप में भी शामिल किया है, जिनके पास कोई मीर-125b बाइंडिंग साइट अपनी mRNA में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नहीं है. इन नियंत्रणों (चित्रा 3) के साथ इस विधि का उपयोग कर प्राप्त परिणाम लक्ष्य mRNA पहचान की विशिष्टता दिखा । हालांकि LNA miRNA नकल को स्थिर और बहुत वाटसन-क्रिकेटरों आधार बाँधना एहसान, यह बताया जाना चाहिए कि LNA miRNA का उपयोग बायोटिन लेबल के साथ नकल न तो झूठी सकारात्मक और न ही नकारात्मक को खत्म करेगा । इसके अलावा, यह संभावना है कि वे गणनात्मक भविष्यवाणियों कि जैविक रूप से प्रासंगिक नहीं हो सकता है की पुष्टि में परिणाम हो सकता है । दूसरी ओर, यदि इस विधि mRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए sequencing के साथ युग्मित है, झूठी नकारात्मक उत्पन्न किया जा सकता है, क्योंकि LNA नक़ल आधार बाँधना है कि गैर-विहित आधार बाँधना कि देशी miRNAs के साथ घटित शामिल कर सकते हैं एहसान इष्ट.

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत वानी एट अल से अनुकूलित है, कई संशोधनों के साथ३५। आगे पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए, हम व्यापक धुलाई कदम शामिल किया है, अभिकर्मक दक्षता, बफर तैयारी और मशीन, pulldown शर्तों और पीसीआर डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए मापदंडों संशोधित । इसके अलावा, हम दो प्राइमर सेट का इस्तेमाल किया पुल नीचे के बाद लक्ष्य mRNA बढ़ाना, एक के लिए लक्ष्य mRNA के ओआरएफ के एक क्षेत्र बढ़ाना और प्राइमरों के दूसरे सेट के लिए लक्ष्य mRNA के 3 ' UTR के भीतर एक क्षेत्र बढ़ाना डिजाइन तैयार की । प्राइमरों के दो सेट का उपयोग लक्ष्य mRNA संवर्धन के लिए विशिष्टता को बढ़ाता है ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस विधि की एक सीमा शोर है कि गैर विशिष्ट लक्ष्यों से उठता है की एक बेसल स्तर है । इस तरह के अवरुद्ध में सुधार के रूप में और संशोधन, धुलाई और गर्मी की स्थिति उच्च लक्ष्य विशिष्टता और संवेदनशीलता प्रदान कर सकते हैं । सारांश में, इस रिपोर्ट में वर्णित परख एक तेज और विश्वसनीय तरीका है कि एक पीसीआर आधारित रणनीति का उपयोग कर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मांय अपनाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय और गैर वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) अनुदान DA037779 (जेपी के लिए), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 और MD007586 (C.D. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया । इस कार्य को RCMI ग्रांट G12MD007586, द वेंडरबिल्ट CTSA ग्रांट UL1RR024975, द Meharry ट्रांसलेशनल रिसर्च सेंटर (MeTRC) CTSA ग्रांट (U54 RR026140 से NCRR/NIH, U54 अनुदान MD007593 से NIMHD/NIH, और टेनेसी सेंटर फॉर एड्स के सहयोग से भी समर्थन मिला रिसर्च (P30 AI110527) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १३६ miRNA mRNA LNA biotinylation पीसीआर 3 ' UTR
बायोटिन आधारित Pulldown परख सेलुलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मान्य करने के लिए
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Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, … More

Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).

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