Summary
Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.
Abstract
MicroARN (miARN) sont une classe de petits ARN non codants qui post-traductionnelle régulent l’expression des gènes cellulaires. MiARN et la lier à la région 3' non traduite (UTR) de cibler les ARNm à inhiber la traduction des protéines ou dans certains cas entraîner une dégradation des ARNm. La liaison de la miRNA pour la région 3' UTR de la cible qu'adn messagère est médié par une séquence de graine de nucléotides de 2 à 8 à l’extrémité 5' de miRNA. Alors que le rôle des miARN comme molécules régulatrices cellulaires est bien établi, identification de l’ARNm cible avec pertinence fonctionnelle demeure un défi. Outils bioinformatiques ont été utilisées pour prédire les séquences au sein de la région 3' UTR des ARNm comme des cibles potentielles pour la liaison de miRNA. Ces outils ont également été utilisés pour déterminer la conservation évolutive de telles séquences entre espèces apparentées pour tenter de prédire le rôle fonctionnel. Cependant, ces méthodes de calcul souvent génèrent des faux positifs et se limitent à prévoir canonique interaction entre l’ARNm et miRNA. Par conséquent, les procédures expérimentales qui mesurent une liaison directe de miRNA vers sa cible d’ARNm sont nécessaires pour établir des interaction fonctionnelle. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode sensible pour valider une interaction directe entre le cellulaire miARN miR-125 b et les 3' UTR de PARP-1 ARNm. Nous élaborons un protocole dans lequel mimétiques synthétiques biotinylé-miRNA ont été transfectés dans des cellules de mammifères et le complexe de miRNA-ARNm dans le lysat cellulaire a été tiré vers le bas avec la Streptavidine des billes magnétiques. Enfin, la cible qu'adn messagère dans la complexe d’acides nucléiques tiré vers le bas a été quantifiée à l’aide d’une stratégie axée sur le qPCR.
Introduction
MicroARN (miARN) est de petite taille non-coding RNAs qui régulent négativement protein expression1. Précurseurs de miRNA résident en grappes à travers de nombreuses régions du génome, plus fréquemment dans les régions intergéniques et les introns de2,de gènes codant pour des protéines3. Biogenèse des miARN impliquent la transcription de la pri-miARN de miRNA-codage gènes4. Le pri-miARN subissent un traitement séquentiel, dans le noyau, puis dans le cytoplasme pour produire seul brin miARN matures4,5. Par la suite, les miARN matures est incorporés dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC) : un complexe de protéine-ARN de multimères qui comprend un membre de la famille Argonaute de protéines pour cible reconnaissance4,5, 6,7. MiARN matures dans le complexe RISC principalement se lie à la région 3' UTR de cibles ARNm8,9,10 , mais peut également lier occasionnellement dans le codage et la région 5' UTR des ARNm10,11 . La liaison du miARN à l’ARNm des séquences résultats translationnelle silencieux12,13,14 et dans certains cas de déstabilisation ARNm15. Puisqu’un seul miRNA peut cibler plusieurs ARNm, ces molécules régulatrices sont impliqués dans presque tous les processus cellulaires et ont été impliqués dans diverses maladies conditions16,17,18.
Compréhension détaillée de comment les miARN réglemente voies cellulaires exige une identification de l’ARNm cible. Il existe plusieurs plates-formes de bio-informatique prédire les processus putatif des interactions19,20. Ces prédictions s’appuient sur la parfaite Watson-Crick base appariement entre la séquence 2 – 8 graines des nucléotides de la miRNA et une séquence complémentaire au sein de la cible ADN messagère4,21. En outre, ces outils génèrent une structure secondaire du processus duplex, calculer les paramètres thermodynamiques de cette interaction moléculaire et voir la conservation des sites de liaison à travers les espèces afin d’améliorer la pertinence fonctionnelle de la cible prédiction. Malheureusement, ces outils ont également la limitation de la prédiction de faux objectifs faisait positives à un taux très élevé (~ 27 – 70 %)15,22. Plus important encore, ces plates-formes en silico ne reconnaissent pas les interactions non-canoniques des miARN avec leurs cibles23. Par conséquent, ces analyses prédictives sont souvent combinées avec des méthodes expérimentales pour valider les objectifs pertinents sur le plan fonctionnel.
Plusieurs approches ont été développées afin de valider expérimentalement les interactions des processus. Les expériences génétiques à l’aide d’imitations de miRNA, éponges et inhibiteurs qui modifient les niveaux des miARN dans la cellule fournissent des indices pour son effet régulateur sur la cible gene expression24,25,26. En outre, journaliste basé à dosages par co transfection d’un clone contenant la région 3' UTR de l’imite de miRNA et de l’ARNm cible ou inhibiteurs en cellules de fournissent la preuve de la fonction régulatrice des miARN26. Bien que ces méthodes sont essentielles étudier la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes de miARN, transfection efficacité et pleotropic effets des altérations cellulaires miRNA niveaux sont les principales limites de ces approches génétiques23, 26. Par conséquent, les méthodes biochimiques complémentaires qui sonde l’interaction directe entre les miARN et sa cible sont employés afin de mieux comprendre le fonctionnement cellulaire des miARN.
Une méthode couramment utilisée pour étudier l’interaction directe entre les miARN et sa cible est l’immunoprécipitation des complexes le RISC, suivie par la détection d’ARNm cible dans le complexe de27,28,,29,30 . Récemment, une méthode améliorée de piège RISC était également utilisée pour identifier les cibles de miRNA ; Il est couplé stabilisation des cibles dans les intermédiaires de RISC-miRNA-ARNm à la purification des cibles de l’ARNm. Cependant, ces methodsface les défis inhérents des interactions non spécifiques entre les ARN et la liaison à l’ARN des protéines qui sont habituellement séparés par compartiments cellulaires31,32. En outre, ces tests dépendent de la présence de la protéine AGO2 pour l’immunoprécipitation du complexe RISC33. AGO2 n’étant pas le seul argonaute de médier les interactions des processus efficaces, exclusion des autres argonautes pourrait conduire à des résultats biaisés34. Par conséquent, des stratégies alternatives sont nécessaires pour étudier la liaison directe de miRNA d’ARNm.
Dans ce rapport, nous élaborons une approche en une seule étape pour sonder une interaction directe entre un miRNA et sa cible ADN messagère. Tout d’abord, 3' biotinylated verrouillé d’acide nucléique (LNA) miRNA imite est transfectés dans des cellules de mammifères. Ensuite, le processus complexe dans le lysat cellulaire est capturées à l’aide de billes magnétiques de streptavidine enduite. La cible de l’ARNm liée à sa complémentaire miRNA est quantifiée à l’aide de qPCR.
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Protocol
1. la transfection de 3'-biotinylé miRNA
Remarque : Effectuez les opérations suivantes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile.
- Semences 4 x 10,5-5 x 105 HEK-293 t cellules / puits dans 2 mL d’achever modifié Eagle (DMEM de Dulbecco) [DMEM additionné de 10 % de sérum foetal bovin (FBS) et 1 x antibiotique strep-Pen]. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant la nuit.
- Le lendemain, vérifier la santé et l’adhérence des cellules plaqués sous un microscope optique.
Remarque : Assurez-vous que les cellules ont adhéré et atteint la morphologie appropriée avant de passer à l’étape suivante. Les cellules HEK-293 t sont généralement prêtes pour la transfection 18 – 24 heures post placage. - Dans un tube à centrifuger stérile de 1,7 mL, diluer 75 picomoles de biotinylé miRNA dans 200 µL de milieu essentiel minimal. Transférer ce mélange dans un autre 1,7 mL microtubes tube contenant un Liposome transfection basée réactif (8 µL/puits) dilué dans 200 µL de milieu essentiel minimal. Mélanger soigneusement, mais doucement, en pipettant également et incuber pendant 20 à 25 min à température ambiante pour permettre la formation de complexes transfection.
- Retirez la plaque de culture bien 6 anciens médias en pipettant également, doux et de reconstituer chaque puits avec 1,6 mL de fraîchement préparée DMEM complet (sans 1 x antibiotiques strep-Pen).
- Ajouter goutte-à-goutte les complexes de transfection (de 1,3) aux cellules de la plaque 6 puits à l’aide d’une pipette bien calibrée. Agiter doucement la plaque tout en y ajoutant les complexes afin d’assurer leur répartition uniforme dans l’ensemble de la plaque.
Remarque : Cette étape est très critique pour la réalisation de transfection de haute efficacité et doit être effectuée avec soin et patience. - La culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 36 h.
2. préparation de la Streptavidine recouvert de billes magnétiques — j’ai
- Remettre en suspension les billes magnétiques de streptavidine soigneusement au vortex. Transférer 30 µL de suspension de la perle (par exemple) à un tube à centrifuger exempte de nucléase 2 mL.
- Placer le tube contenant la suspension de la perle sur le stand de séparateur de billes magnétiques (« aimant » ci-après) pendant 2 min. Après s’être assuré que les perles sont attirés par le côté du tube en contact avec l’aimant, retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette.
- Ajouter 100 µL de tampon de lavage perle (10 mM Tris-Cl pH de 7,5, EDTA de 0,5 mM, 1 M NaCl) aux talons. Retirer le tube de l’aimant. Vortexer pendant 15 s à température ambiante pour laver les perles.
- Placer le tube contenant l’aimant pendant 2 min, les perles et soigneusement retirer et jeter le surnageant.
- Répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour un total de trois lavages. Après l’étape de lavage final, retirez le tube de l’aimant.
- Ajouter 100 µL de RNase libérant une solution (NaOH 0,1 M, 0,05 M NaCl) aux talons, mélanger bien au Vortex pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placer le tube contenant l’aimant pendant 2 min, les perles et soigneusement retirer et jeter le surnageant.
- Répétez l’étape 2.6 pour un total de trois fois.
- Ajouter la solution de remise en suspension de perle (0,5 M de NaCl) aux talons, vortex 15 s et incuber à température ambiante pendant 5 min. Placer les billes remises en suspension sur l’aimant pendant 2 min et retirer délicatement le surnageant.
- Ajouter 200 µL de perle bloquant la solution (µg 1/µL BSA, 2 µg/µL tRNA de levure) aux talons. Mélange doux Vortexer pendant 15 s à température ambiante. Incuber à 4 ° C pendant 16 h (nuit) sur un rotateur multitube.
3. préparation des lysats cellulaires
- Récolter les cellules HEK-293 t transfectées en grattant doucement à l’aide d’un grattoir de cellules stériles à l’intérieur de la hotte laminaire, puis transférer chaque échantillon dans un tube à centrifuger stériles de 2 mL.
- Pellet les cellules grattées par centrifugation à 1 500 g pour 5 min. Resuspendre le culot dans 1 x PBS stérile (tampon Phosphate salin), pH 7,2. Centrifuger à nouveau à 1 500 g pendant 5 min obtenir un culot gratuit des restes de fluides. Immédiatement plonger le tube contenant des granulés dans la glace.
- Préparer le tampon de lyse cellulaire complet frais (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH à 7,5, 5mM DTT, 0,5 % IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x inhibiteur de protéase).
Remarque : Un stock de tampon de lyse cellulaire manque cocktail inhibiteur de la protéase, Superase et IGEPAL peut-être être préparé à l’avance et conservé à température ambiante. Préparer un nouveau lot de tampon de lyse cellulaire complet en ajoutant des suppléments ci-dessus aux concentrations finales recommandées pour le tampon de lyse cellulaire stock et en stockant sur glace. - Ajouter 260 µL de tampon de lyse cellulaire complet glacée à chaque échantillon dans le tube à centrifuger (c.-à-d., chaque tube à centrifuger contienne des cellules prélevées d’un puits de la plaque 6 puits) et Resuspendre le culot dans une suspension homogène de pipetage.
- Lyse des cellules à l’aide de la méthode de gel / dégel : Incuber les tubes à-80 ° C pendant 10 à 15 min. Ensuite, permettre les cellules à dégeler sur la glace.
- Centrifuger la cellule résultante lysate à 16 000 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse de paillasse réfrigérés à 4 ° C.
- Transférer la cellule défrichée lysate d’un tube à centrifuger stérile de 1,7 mL sur la glace. Jeter le culot.
Remarque : Le volume final d’effacées lysat devrait être ~ 240 – 250 µL. - Ajouter 5 M NaCl à la défrichées lysat à une concentration finale de 1M et de maintenir les échantillons sur la glace.
4. préparation des billes magnétiques de streptavidine — II
- Préparer le tampon de lavage de menu déroulant complet frais (KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl2, pH 10 mM Tris-Cl 7.5, 5 mM TNT, 1 M NaCl, 0,5 % IGEPAL, 60U/mL Superase et cocktail inhibiteur de la protéase 1 x)
Remarque : Un stock de tampon de lavage de la liste déroulante manque cocktail inhibiteur de la protéase, Superase et IGEPAL peut être préparé à l’avance et conservé à température ambiante. Préparer un nouveau lot de tampon de lyse cellulaire complet en ajoutant des suppléments ci-dessus aux concentrations finales recommandées pour le tampon de lyse cellulaire stock et en stockant sur glace. - Placer le tube contenant les perles préparés (de l’étape 2,9) sur l’aimant pour 2 min. Retirez avec précaution et éliminer le surnageant.
- Ajouter 150 µL de tampon de lavage glacée à menu déroulant complet aux talons. Vortexer pendant 15 s et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 s. Place les tubes sur l’aimant pour 2 min. Retirer soigneusement et éliminer le surnageant.
- Répétez l’étape 4.3 pour un total de 3 fois.
- Remettre en suspension les perles dans 300 µL de tampon de lavage complet de menu déroulant.
5. menu déroulant des cibles ARNm-miRNA Complexes
- Transférer 300 µL du lysat cellulaire (de l’étape 3,8) pour le tube à centrifuger contenant 300 µL de perles (de l’étape 4.5).
- Incuber le mélange sur un mélangeur oscillant pendant 1 h à température ambiante.
- Placer le tube sur l’aimant pour 5 min. Retirez avec précaution et éliminer le surnageant.
- Ajouter 300 µL de tampon de lavage glacée à menu déroulant complet aux talons. Vortexer pendant 15 s à température ambiante et place le tube sur l’aimant pendant 5 min. Retirez délicatement et éliminer le surnageant.
- Répétez l’étape 5.4 deux fois plus.
- Remettre en suspension les perles dans 100 µL d’eau exempte de nucléase et incuber sur glace.
6. total Extraction de l’ARN, synthèse de cDNA et qPCR
- Extraire l’ARN total les billes remises en suspension (de l’étape 5,6) utilisant une méthode appropriée (voir Table des matières). Remettre en suspension l’extrait de l’ARN total dans 25 µL d’eau exempte de nucléase. Déterminer la concentration d’ARN et de la qualité à l’aide d’un spectrophotomètre (absorbance à 260/280). Préparation d’un stock de travail de l’ARN à 50 ng/µL.
- Effectuer la synthèse de cDNA, en géométrie, en utilisant 50 ng d’ARN total (de l’étape 6.1) à l’aide d’une synthèse de cDNA appropriée nécessaire (voir Table des matières) à l’aide des amorces oligo dT dans un volume final de 20 µL (tableau 1). Ensuite, charge à la tubes PCR dans l’instrument de qPCR pour effectuer des cycles thermiques selon les conditions décrites dans le tableau 2.
-
Effectuer qPCR sur l’ADNc (de l’étape 6.2) à l’aide de chimie SYBR Green (voir Table des matières) :
- Effectuer toutes les réactions de qPCR en géométrie dans une plaque de fond bien claire 96 dans des conditions stériles.
- Aliquote 9 µL du mélange réactionnel de qPCR master mix (voir tableau 3) dans chaque puits de la plaque. Ensuite, ajouter 1 µL de l’ADNc dans chaque puits afin d’obtenir un volume final de 10 µL. flasque de la PCR à l’aide de film adhésif résistant à la chaleur PCR et charger dans l’appareil qPCR
- Effectuez des cycles thermiques selon les conditions décrites dans le tableau 4.
- Normaliser les niveaux d’expression de chaque échantillon pour les niveaux d’expression du contrôle brouillé (valeurs de Ct). Utilisez ces valeurs pour calculer le pli des changements dans l’expression.
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Representative Results
MiARN réglemente les processus cellulaires en se liant à l’ARNm cible. Identification des cibles ARNm sont donc une clé pour comprendre le fonctionnement du miRNA. Ici, nous élaborons une méthode pour identifier les cibles ARNm de miRNA cellulaire. Ce protocole est adapté à partir de Wani et al. 35 avec la modification d’utilisant biotinylé axée sur la LNA miRNA imite à menu déroulant cibles ARNm. L’utilisation des oligonucléotides axée sur la LNA imite améliore la spécificité de liaison de la cible en raison de la plus grande stabilité de l’anneau mis à jour le ribose sans effets toxiques36,37,38. Nous avons utilisé cette méthode pour tirer vers le bas de l’ARNm de PARP-1 comme cible de miRNA cellulaire miR-125 b. Le plus haut niveau d’expression de miR-125 b est détecté dans le tissu de cerveau qui régule la fonction neuronale39,40. Dans le but d’identifier les cibles de miR-125 b en cellules neuronales, récemment nous avons rapporté que miR-125 b régule négativement l’expression de PARP-1 en se liant à la 3' UTR de PARP-1 ARNm41.
Menu déroulant de processus complexes
Nous avons utilisé des cellules HEK-293 t pour étudier l’interaction entre miR-125 b et l’ARNm de PARP-1, étant donné que ces cellules sont largement utilisés dans les systèmes cellulaires, biochimiques et des études de biologie moléculaire. Une représentation schématique du protocole utilisé pour la cible de l’ARNm est représentée dans la Figure 1. Tout d’abord, les cellules HEK-293 t (4 x 10,5-5 x 105 cellules / puits) ont été ensemencées au jour le jour dans une plaque de culture de tissu de 6 puits et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 18 à 24 h. Par la suite, 75 picomoles de 3'-biotinylé miR-125 b imite et 3'-biotinylé brouillé contrôles ont été transfectées dans des cellules à l’aide de la méthode de transfection de liposome basé. Les cellules transfectées ont été incubés à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 36 h supplémentaires et récoltés. Par la suite cellulaires lysats de cellules transfectées ont été préparés par la méthode de lyse de gel-dégel. Les lysats cellulaires fraîchement préparés sont incubées avec les billes magnétiques de streptavidine bloqués couchée sur une table de mixage oscillant haut banc pendant 1 h à température ambiante. Suite à cela, les perles ont été traités et lavés à l’aide de fraîchement préparé de tampon de lavage de la liste déroulante glacée sur le séparateur magnétique. Enfin, les perles ont été remis en suspension dans 100 µL d’eau libre nucléase pour une analyse ultérieure.
Détection de l’ARNm cible dans le menu déroulant processus complexe
Pour détecter les cibles ARNm de miR-125 b issu du mélange de menu déroulant, nous avons utilisé un test de qPCR (Figure 1). Nous avons conçu des amorces et inverses (FP et RP) au sein de l’ORF pour amplifier les ARNm de PARP-1 (Figure 2tableau 5 b). Nous avons également conçu des ensembles d’amorces pour la détection des ARNm de p53, un objectif connu de miR-125 b42, comme témoin positif et inclus des amorces pour amplifier l’actine ARNm comme témoin négatif non spécifiques. En outre, pour confirmer la spécificité de l’amplification, nous avons conçu des amorces pour détecter les régions 3' UTR de PARP-1, p53 et l’actine. Nous avons effectué qPCR en utilisant les méthodes décrites dans le protocole (article 6).
La figure 3 montre l’amplification de qPCR basé des cibles ARNm de par rapport aux témoins brouillés depuis les perles purifiées. Le niveau de l’ARNm de PARP-1 était nettement plus élevé dans les échantillons tirés vers le bas avec biotinylé miR-125 b imite par rapport aux contrôles brouillés. Comme prévu, des niveaux plus élevés d’ARNm du positif contrôlent p53 ARNm et amplification minimale de l’actine contrôle négatif Qu'arnm a été observée dans ces échantillons. Des niveaux similaires de l’amplification ont été obtenus avec les amorces ciblant la 3' UTR de PARP-1 et p53 par rapport à l’actine contrôle négatif (Figure 3 b). Le qPCR résulte des régions ORF (Figure 3 a) et la région 3' UTR régions (Figure 3 b) de l’ARNm de PARP-1 et p53 ARNm ont montré des niveaux de variabilité. Plusieurs facteurs, dont l’affinité de liaison, nombre de sites de fixation de miRNA et les différences dans la séquence d’amorce dependent amplification peut-être contribuer aux niveaux variables de l’amplification à la Figure 3. Néanmoins, ces données appuient fortement la faisabilité et la spécificité de la méthode de validation des cibles ARNm des miARN cellulaire.
Figure 1 : représentation schématique du protocole pour le dosage de capture de cible à l’aide de biotinylé-miRNA imite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : conception d’amorce pour l’amplification des cibles ARNm. Représentation schématique des amorces utilisées pour détecter les cibles ARNm de miR-125 b. Une série d’amorces (figure I) a été conçu dans la région de l’ORF de la transcription et l’autre série d’amorces (Set II) a été conçu dans la région 3' UTR des gènes cibles. FP et RP représentent des amorces et inverses pour chaque jeu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : identification des cibles de qPCR miR-125 b. Les niveaux d’ARNm (A) à l’aide d’amorces I, qui amplifie la région ORF de cibles ARNm. Des niveaux plus élevés d’expression de PARP-1 et p53 ARNm (contrôle positif) ont été observés par rapport à l’actine ARNm (témoin négatif). B l’Amplification de la région 3' UTR de cible ADN messagère utilisant des amorces figure II. Pas d’amplification a été observée chez les contrôles aucun modèle (NTC). Toutes les réactions ont été effectuées dans la géométrie et les données ont été analysées en utilisant le logiciel d’analyse de données appropriées selon la méthode 2-ΔCt . Barres d’erreur représentent erreur type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Composant | Stock | Volume final de 20 réaction μL |
| Modèle (ARN) | 50 ng/µL | 1,0 ΜL |
| Tampon de réaction | x 5 | 4,0 ΜL |
| Apprêt oligo dT | Stock de maître | 2 ΜL |
| Transcriptase inverse | Stock de maître | 1 ΜL |
| Eau distillée exempte de nucléase | - | 12 ΜL |
| Volume de réaction totale | 20 ΜL |
Table 1 : mélange de réaction de synthèse de cDNA.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 min |
| 95 ° C = 5 min |
| 10 ° C = Hold |
Tableau 2 : ADNc synthèse cyclisme conditions thermiques.
| Composant | Stock | Volume final de 10 réaction μL |
| produit de l’ADNc | - | 1,0 ΜL |
| iTaq mix SYBR universel | x 2 | 5.0 ΜL |
| Cible (ORF/3 ' UTR) F.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Cible (ORF/3 ' UTR) R.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Eau distillée exempte de nucléase | - | 3 ΜL |
| Volume de réaction totale | 10 ΜL |
Tableau 3 : qPCR mélange réactionnel.
| 95 ° C = 10 min |
| 30 cycles de : |
| 95 ° C = 10 s |
| 56 ° C = 30 s |
| 72 ° C = 30 s |
| Analyse des courbes de fonte |
| 65 ° C = 31 s |
| Vitesse de montée linéaire = 0,5 ° C/s |
| Acquisition = intervalles de 0,5 ° C |
Tableau 4 : qPCR cyclisme conditions thermiques.
| (A) : biotinylé Oligos | ||
| Biotinlyated Oligos | Stock | Séquence (5'-3') |
| a-miR-125 b | 25 ΜM | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-biotine |
| Contrôle brouillé | 25 ΜM | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-biotine |
| (B) amorces | ||
| Cible primaire (ORF) | Stock | Séquence (5'-3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 ΜM | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| ACTINE (FP) | 100 ΜM | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| ACTINE (RP) | 100 ΜM | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (C) des amorces | ||
| Apprêt de cible (3' UTR) | Stock | Séquence (5'-3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 ΜM | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
Tableau 5 : Noms des oligonucléotides et séquences.
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Discussion
Identification de cibles ARNm des miARN cellulaire est importante pour comprendre leur fonction régulatrice. Plusieurs outils informatiques sont utilisés pour prédire des cibles fondées sur la complémentarité de séquence de semences et de la conservation de cible séquences19,20. Bien que ces outils sont utiles, ils peuvent générer des niveaux élevés de faux positifs et faux négatifs. Par conséquent, ces prédictions sont couplées avec des méthodes expérimentales comme l’immunoprécipitation de RISC complexe et pull-down de processus complexes pour confirmer une liaison directe des miARN à leurs cibles respectives27,31. Ce rapport détaille une stratégie expérimentale qui utilise biotinylé miRNA imite à menu déroulant cibles ARNm. Menu déroulant biotine peut être utilisé pour l’identification des cibles de miRNA avec haute sensibilité et faible taux de faux positifs35,43. Ainsi, cette méthode peut aussi être exploitée pour l’identification des cibles de miRNA par couplage de dépistage basé sur la séquence de la piscine de RNA capturée. Cependant, il y a plusieurs limites à cette méthode44. La surexpression d’un miRNA exogène pourrait modifier le réseau transcriptionnel des cellules, provoquant des changements qui en découle en ARNm qui ne sont pas en raison de la réglementation de miRNA. Ce pourraient être surmontés en utilisant de très faibles quantités d’imite manière à ne pas pour perturber règlement miRNA endogène. En outre, des contrôles appropriés sont nécessaires lorsque miARN est exprimés exogène pour éviter les liaisons non spécifiques. Attention lavage et blocage des étapes peuvent efficacement réduire au minimum le bruit de fond et augmenter la spécificité de la miRNA ciblée. Peu d’études ont montré que les modifications des extrémités 3' ou 5' de miRNA ne sont pas bien tolérés45, néanmoins, plusieurs études ont utilisé efficacement biotine tag miR-mimétiques comme un outil efficace pour explorer les cibles ARNm.
L’autre avantage de cette méthode est l’utilisation des imitateurs de miRNA axée sur la LNA (verrouillée acide nucléique). La modification de l’acide nucléique LNA permet la formation de duplex oligonucléotides stable avec une affinité élevée46,47. En outre, le custom made biotinylé LNA miRNA imite se composent de trois brins de RNA. Un brin de miRNA 3'-biotinylé avec séquence selon les directives de l’annotation miRBase et un brin passager complémentaire de la miRNA qui est découpée en deux LNA-modified RNA brins47. RISC incorpore seulement le brin de miRNA pendant que le voyageur deux brins sont rapidement dégradés améliorant ainsi la spécificité de cible. Pour augmenter la confiance de nos constatations, nous avons également inclus une p53 cible validée de miR-125 b comme un contrôle positif et la β-actine, ce qui n’a pas un site de liaison de miR-125 b dans son ARNm comme témoin négatif. Les résultats obtenus à l’aide de cette méthode avec ces contrôles (Figure 3) montrent la spécificité de l’identification des ARNm cibles. Bien que LNA miRNA imite stabilise et grandement favorise l’appariement Watson-Crick base, il faut savoir que l’utilisation de LNA miRNA imite avec étiquette biotine éliminera ni faux positifs, ni négatifs. En outre, il est probable qu’ils peuvent entraîner de confirmation des prédictions de calculs qui ne peuvent pas être biologiquement pertinente. En revanche, si cette méthode est couplée avec le séquençage pour identifier les cibles ARNm, faux négatifs peuvent être générés, car LNA imite favor base canonique appariement qui peut exclure de la base non canonique, appariement des interactions qui se produisent avec des miARN natives.
Le protocole présenté ici est une adaptation de Wani et al., avec plusieurs modifications35. Pour réduire encore le bruit de fond, nous avons incorporé les étapes d’un lavage, modifié les paramètres pour l’efficacité de transfection, préparation du tampon et incubation, conditions de conversion et d’acquisition de données PCR et analyse. En outre, nous avons utilisé deux paires d’amorces pour amplifier la cible ARNm après le menu déroulant, décor pour amplifier une région de l’ORF de cibler des ARNm et la deuxième série d’amorces pour amplifier une région au sein de la région 3' UTR de l’objectif de mRNA. Utilisation de deux ensembles d’amorces améliore la spécificité à l’enrichissement du ARNm cible.
Il est à noter qu’une limitation de cette méthode est un niveau basal du bruit qui se dégage des cibles non spécifiques. Autres modifications telles que des améliorations dans le blocage, les conditions de lavage et d’incubation peuvent fournir sensibilité et une spécificité de cible plus élevée. En résumé, l’essai décrit dans le présent rapport est une méthode rapide et fiable qui peut être adoptée pour la validation des cibles ARNm des miARN par une PCR basé de stratégie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers et non financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions DA037779 (à J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 et MD007586 (au C.D.). Le travail a été également soutenu par la RCMI Grant G12MD007586, les Vanderbilt CSTC Grant UL1RR024975, le centre de recherche translationnelle Meharry (MeTRC) CSTC accorde (U54 RR026140 de RRRNC/NIH, le U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH et le centre du Tennessee pour le sida Recherche (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
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