Summary
Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) vormen een klasse van kleine noncoding RNAs die post-transcriptionally cellulaire genexpressie regelen. MiRNAs binden aan de 3' niet-vertaalde regio (UTR) van target mRNA te remmen eiwit vertaling of in sommige gevallen leiden tot aantasting van het mRNA. De binding van de miRNA aan de 3-' UTR van het streefcijfer dat mRNA wordt gemedieerd door een 2 – 8 nucleotide zaad reeks eind 5' miRNA. Terwijl de rol van miRNAs als cellulaire regelgevende moleculen goed ingeburgerd is, blijft identificatie van de target mRNAs met functionele relevantie een uitdaging. Bioinformatic hulpmiddelen zijn tewerkgesteld te voorspellen van reeksen binnen de 3-' UTR van mRNAs als doelwit voor miRNA bindend. Deze hulpprogramma's zijn ook gebruikt om te bepalen van de evolutionaire instandhouding van dergelijke sequenties onder Verwante soorten in een poging om te voorspellen van functionele rol. Echter deze rekenmethoden vaak vals-positieve resultaten genereren en zijn beperkt tot het voorspellen van de canonieke interactie tussen miRNA en mRNA. Experimentele procedures die meten van directe binding van miRNA aan haar doelstelling van mRNA zijn daarom noodzakelijk vast te stellen functionele interactie. In dit verslag beschrijven we een gevoelige methode voor de validatie van de directe interactie tussen de cellulaire miRNA miR-125 ter en de 3' UTR van PARP-1 mRNA. Wij werken een protocol waarin synthetische biotinyleerd-miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen en de miRNA-mRNA-complex in de cellulaire lysate werd gesloopt met streptavidine beklede magnetische kralen. Tot slot, het doel dat mRNA in de trok-down nucleic acid complex werd gekwantificeerd aan de hand van een qPCR gebaseerde strategie.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) zijn klein niet-coderende RNAs die eiwit expressie1negatief te regelen. Precursoren van miRNA bevinden zich in clusters door vele regio's van het genoom, vaakst binnen de intergenic regio's en de introns van eiwit-codeert genen2,3. Biogenese van miRNAs betrekken transcriptie van de pri-miRNAs van miRNA-encoding genen4. De pri-miRNAs ondergaan sequentiële verwerking, eerst in de kern, en vervolgens in het cytoplasma voor het genereren van één gestrande volwassen miRNAs4,5. Daarna de volwassen miRNAs zijn opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC): een multimeric eiwit-RNA complex waarin een lid van de familie van de Argonaute van eiwitten voor de doelgroep erkenning4,5, 6,7. Volwassen miRNAs in de RISC complexe overwegend binden aan de 3-' UTR van doel mRNAs8,9,10 , maar ook af en toe kunt binden in de codering en de 5' UTR regio van de mRNA10,11 . De binding van miRNA naar het mRNA sequenties resultaten in translationeel silencing12,13,14 en in sommige gevallen mRNA destabilisatie15. Aangezien een enkele miRNA veel mRNAs richten kunt, deze regelgevende moleculen zijn betrokken bij bijna alle cellulaire processen en zijn betrokken bij verschillende ziekte voorwaarden16,17,18.
Gedetailleerd begrip van hoe miRNAs cellulaire routes reguleren vereist identificatie van de target mRNAs. Meerdere bioinformatics platforms zijn beschikbaar voor het voorspellen van de vermeende miRNA:mRNA interacties19,20. Deze voorspellingen, is afhankelijk van de perfecte Watson-Crick basis koppeling tussen de 2 – 8 nucleotide zaad opeenvolging van de miRNA en een bijkomende opeenvolging binnen de doelgroep mRNA4,21. Bovendien, deze tools genereren van de secundaire structuur van de miRNA:mRNA duplex, berekenen thermodynamische parameters van deze moleculaire interactie en Toon van instandhouding van de bandplaatsen over soorten te vergroten van functionele relevantie van het doel voorspelling. Helaas hebben deze hulpprogramma's ook de beperking van het voorspellen van valse positieve doelstellingen op een zeer hoog percentage (~ 27 – 70%)15,22. Bovenal deze platforms in silico niet herkennen van de niet-canonieke interactie van miRNAs met hun doelstellingen23. Deze voorspellende analyses zijn daarom vaak gecombineerd met experimentele methoden voor het valideren van functioneel relevante doelstellingen.
Meerdere benaderingen zijn ontwikkeld voor het proefondervindelijk valideren van miRNA:mRNA interactie. Genetische experimenten met behulp van miRNA nabootsers, bieden sponzen en remmers die veranderen van de niveaus van miRNAs in de cel aanknopingspunten voor het regulerende effect daarvan op de doelgroep gen expressie24,25,26. Bovendien, verslaggever gebaseerd testen via co transfectie van een kloon met de UTR regio 3' van de target mRNA en miRNA nabootsers of remmers in cellen bewijs te leveren van de regulerende functie van miRNAs26. Terwijl deze methoden cruciaal zijn voor het bestuderen van post-transcriptional regulering van de genexpressie door miRNAs, zijn transfectie efficiëntie en pleotropic gevolgen van wijzigingen in de cellulaire miRNA niveaus belangrijke beperkingen van deze genetische benaderingen23, 26. Daarom zijn complementaire biochemische methoden die peilen naar directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling werkzaam om beter te begrijpen de cellulaire functie van miRNAs.
Een veel gebruikte methode om te studeren van directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling is immunoprecipitation van de RISC complexe gevolgd door de detectie van mRNA doel binnen de complexe27,28,29,30 . Onlangs, een verbeterde RISC val methode werd ook gebruikt om te identificeren van miRNA doelstellingen; het paren stabilisatie van doelen binnen de RISC-miRNA-mRNA tussenproducten met de zuivering van mRNA doelen. Echter, deze methodsface de inherente uitdagingen van niet-specifieke interacties tussen RNA en RNA-bindende eiwitten, die meestal worden gescheiden door cellulaire compartimenten31,32. Bovendien, zijn deze tests afhankelijk van de aanwezigheid van AGO2 eiwitten voor immunoprecipitation van RISC complexe33. Gezien het feit dat AGO2 niet de enige argonaute te bemiddelen efficiënte miRNA:mRNA interacties, kan uitsluiting van andere argonautes leiden tot vooringenomen resultaten34. Daarom, alternatieve strategieën nodig zijn om te studeren van directe binding van miRNA aan mRNA.
In dit verslag, werken we een one-step-aanpak voor directe interactie tussen een miRNA en haar doelstelling indringende mRNA. Eerst, 3' biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur (LNA) miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen. Vervolgens is het complex in de cellulaire lysate miRNA:mRNA gevangen met behulp van magnetische kralen daar bekleed. Het doel van de mRNA gebonden aan haar complementaire miRNA is gekwantificeerd aan de hand van qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de transfectie van 3'-biotinyleerd miRNA
Opmerking: Voer de volgende stappen binnen een steriele laminar flow hood.
- Zaad 4 x 105–5 x 105 HEK-293T cellen per putje in 2 mL zuiver voltooien Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) [DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1 x Pen-strep antibioticum]. Cultuur van de cellen in een incubator ingesteld bij 37 ° C, 5% CO2 's nachts.
- De volgende dag, Controleer de gezondheid en de hechting van de vergulde cellen onder een lichte Microscoop.
Opmerking: Zorg ervoor dat de cellen hebben gehandeld en bereikt de juiste morfologie voordat u verdergaat met de volgende stap. De HEK-293T cellen zijn meestal klaar voor Transfectie 18 – 24 h post beplating. - Verdund in een steriele 1,7 mL microfuge buis, 75 picomoles van biotinyleerd miRNA in 200 µL van minimale essentiële media. Deze mix overbrengen in een andere 1,7 mL microfuge buis met liposoom gebaseerde transfectiereagens (8 µL per putje) verdund in 200 µL van minimale essentiële media. Meng grondig, maar voorzichtig, door pipetteren en incubeer gedurende 20-25 minuten bij kamertemperatuur te staan van de vorming van de transfectie complexen.
- Verwijder de oude media uit de plaat 6 goed cultuur door zachte pipetteren en vullen elk putje met 1.6 mL vers bereide volledige DMEM (zonder 1 x Pen-strep antibiotica).
- De transfectie complexen (uit 1.3) drop-wise toevoegen aan de cellen in de 6-well plaat met behulp van een goed geijkte pipet. Swirl de plaat zachtjes terwijl het toevoegen van de complexen om ervoor te zorgen hun uniforme verdeling over de plaat.
Opmerking: Deze stap is zeer kritisch is voor het bereiken van hoogrenderende transfectie en moet worden uitgevoerd met zorg en geduld. - Cultuur van de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 voor ten minste 36 uur.
2. bereiding van streptavidine bekleed magnetische kralen — Ik
- Resuspendeer de magnetische kralen van daar grondig door vortexing. 30 µL van schorsing van de kraal (per monster) overbrengen in een 2 mL nuclease-vrije microfuge buis.
- Plaats de buis met de opschorting van de kraal op de magnetische kraal scheidingsteken stand ("magneet" hierna) gedurende 2 minuten. Als u zeker bent dat de kralen worden getrokken naar de kant van de buis in contact met de magneet, verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met behulp van een micropipet.
- Voeg 100 µL van parel was buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.5, van 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl) aan de kralen. Verwijder de buis van de magneet. Vortex voor 15 s bij kamertemperatuur te wassen van de kralen.
- Plaats de buis met parels op de magneet gedurende 2 minuten, en zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 2.3 en 2.4 voor een totaal van drie wast. Na de laatste wasbeurt stap, de buis van de magneet te verwijderen.
- Voeg 100 µL van RNase vrijmaken van oplossing (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) naar de kralen, meng goed door de vortexing voor 15 s, en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaats de buis met parels op de magneet gedurende 2 minuten, en zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 2.6 voor een totaal van drie keer.
- Kraal resuspensie oplossing (0.5 M NaCl) toevoegen aan de kralen, vortex 15 s, en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaatst de geresuspendeerde kralen op de magneet gedurende 2 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant.
- Voeg toe 200 µL van Parel blokkeert oplossing (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL gist tRNA) aan de kralen. Meng door zachte vortexing voor 15 s bij kamertemperatuur. Incubeer bij 4 ° C voor 16 h (overmatige nacht) op een multi buis rotator.
3. voorbereiding van de cel Lysates
- Oogst de transfected cellen van HEK-293T door zachte schrapen met behulp van een steriele cel schraper binnen de laminaire kap, dan breng elk monster in een steriele 2 mL microfuge buis.
- Pellet de geschraapt cellen door centrifugeren op 1.500 x g voor 5 min. resuspendeer de pellet in 1 x steriel PBS (Phosphate Buffer Saline), pH 7,2. Centrifuge weer bij 1.500 x g gedurende 5 min te verkrijgen van een pellet vrij van residuele media. Duik onmiddellijk de buis met pellet in ijs.
- Bereiden van verse volledige cellysis-buffermengsel (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH-7,5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x proteaseinhibitor).
Opmerking: Een voorraad van lysis van de cel buffer ontbreekt IGEPAL, Superase en Protease inhibitor cocktail kan worden voorbereid en opgeslagen bij kamertemperatuur. Bereiden een verse partij van volledige cellysis-buffermengsel door toevoeging van de bovenstaande supplementen bij de aanbevolen definitieve concentraties aan de voorraad cellysis buffer en op ijs op te slaan. - 260 µL van ijskoude volledige cellysis-buffermengsel toevoegen aan elk monster in de microfuge buis (dat wil zeggen, elke microfuge buis cellen geoogst van één putje van de plaat 6-well bevat) en resuspendeer de pellet cel in een homogene suspensie door pipetteren.
- Lyse de cellen met behulp van de methode bevriezen-ontdooien: Incubeer de buizen bij-80 ° C gedurende 10 à 15 min. Vervolgens kunnen de cellen om te ontdooien op ijs.
- Centrifugeren van de resulterende cel lysate bij 16.000 x g gedurende 5 minuten in een gekoelde benchtop centrifuge ingesteld bij 4 ° C.
- De gewiste cel lysate overbrengen in een steriele 1,7 mL microfuge buis op ijs. Gooi de pellet.
Opmerking: Het eindvolume van gewist lysate moet ~ 240-250 µL. - 5 M NaCl aan de gewiste lysate toevoegen om een eindconcentratie van 1M en onderhouden van de monsters op ijs.
4. voorbereiding van de magnetische kralen daar — II
- Bereiden van verse volledige pull-down-was buffer (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase en 1 x proteaseinhibitor cocktail)
Opmerking: Een voorraad van pull-down was buffer ontbreekt IGEPAL, Superase en Protease inhibitor cocktail kan worden voorbereid en opgeslagen bij kamertemperatuur. Bereiden een verse partij van volledige cellysis-buffermengsel door toevoeging van de bovenstaande supplementen bij de aanbevolen definitieve concentraties aan de voorraad cellysis buffer en op ijs op te slaan. - Plaats de buis met de bereid kralen (uit stap 2.9) aan de magneet voor 2 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Voeg 150 µL van ijskoude volledige pull-down-was buffer aan de kralen. Vortex voor 15 s en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 s. plaats de buizen op de magneet voor 2 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 4.3 voor een totaal van 3 keer.
- Resuspendeer de kralen in 300 µL van volledige pull-down-was buffer.
5. pull-down van Target mRNA-miRNA complexen
- Breng 300 µL van de cel lysate (uit stap 3.8) aan de microfuge buis met 300 µL van parels (uit stap 4.5).
- Laat het mengsel op een nutating mixer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken.
- Plaats de buis op de magneet voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Voeg 300 µL van ijskoude volledige pull-down-was buffer naar de kralen. Vortex voor 15 s bij kamertemperatuur en plaats de buis op de magneet voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 5.4 twee meer tijden.
- Resuspendeer de kralen in 100 µL van nuclease-gratis water en uit te broeden op ijs.
6. totale extractie van RNA, cDNA synthese en qPCR
- Uittreksel totaal RNA van de geresuspendeerde kralen (uit stap 5.6) met behulp van een geschikte methode (Zie Tabel van materialen). Resuspendeer de uitgepakte totaal RNA in 25 µL nuclease-gratis water. Bepaal de concentratie van RNA en de kwaliteit met behulp van een spectrofotometer (absorptie bij 260/280). Een voorraad van de werken van RNA bij 50 ng/µL voor te bereiden.
- Uitvoeren van cDNA synthese, in triplicates, met behulp van 50 ng van totale RNA (uit stap 6.1) met behulp van een passende cDNA synthese kit (Zie Tabel van materialen) met behulp van oligo dT inleidingen in een eindvolume van 20 µL (tabel 1). Dan laden PCR buizen in de qPCR instrument voor het uitvoeren van de temperatuurcycli volgens de voorwaarden beschreven in tabel 2.
-
QPCR op de CDNA (uit stap 6.2) uitvoeren met behulp van SYBR groene chemie (zie tabel van materialen):
- Alle reacties van de qPCR in triplicates in een 96 geschiedenisboeken bodemplaat onder steriele omstandigheden uitvoeren.
- Aliquot 9 µL van het reactiemengsel van de meester qPCR mix (Zie tabel 3) in elk putje van de plaat. Dan, voeg 1 µL van het cDNA aan elk putje tot een eindvolume van 10 µL. zegel de PCR-plaat met behulp van de hittebestendige PCR plaat sealer en laden in het qPCR-instrument
- Temperatuurcycli volgens de voorwaarden beschreven in tabel 4uitvoeren
- Normaliseren van de niveaus van de expressie (Ct-waarden) van elk monster voor de expressie van het gecodeerde besturingselement. Gebruik deze waarden voor het berekenen van de vouw wijzigingen in expressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MiRNAs regelen cellulaire processen door binding aan target mRNAs. Identificeren mRNA doelstellingen zijn dus een sleutel tot het begrijpen van miRNA functie. Hier werken we een methode voor het identificeren van mRNA doelwit van cellulaire miRNA. Dit protocol is aangepast van Wani et al. 35 met de wijziging van het gebruik van biotinyleerd LNA gebaseerde miRNA nabootsers aan pulldown target mRNA. Het gebruik van oligonucleotide LNA gebaseerde nabootsers verbetert specificiteit van doelstelling bindend als gevolg van de hogere stabiliteit van de gemodificeerde ribose ring zonder toxische effecten36,37,38. We gebruikt deze methode om neer te trekken PARP-1 mRNA als het doelwit van cellulaire miRNA miR-125 ter. Het hoogste niveau van miR-125 ter expressie wordt gedetecteerd in hersenweefsel dat neuronale functie39,40 regelt. In een poging om de doelstellingen van miR-125 ter in neuronale cellen identificeren, onlangs hebben we gemeld dat miR-125 ter negatief regelt PARP-1 expressie door binding aan de 3' UTR van PARP-1 mRNA41.
Pulldown van miRNA:mRNA Complex
HEK-293T cellen gewend we bestuderen de interactie tussen miR-125 ter en PARP-1 mRNA, aangezien deze cellen veel in de biochemische, cellulaire en moleculaire biologie studies gebruikt worden. Een schematische voorstelling van het protocol dat wordt gebruikt voor het doel van mRNA is afgebeeld in Figuur 1. Eerst, HEK-293T cellen (4 x 105–5 x 105 cellen per putje) werden zaadjes, overnachting in een 6-well weefselkweek plaat en bebroede bij 37 ° C met 5% CO2 voor 18 – 24 h. Daarna werden 75 picomoles van 3'-biotinyleerd miR-125 ter nabootsers en 3'-biotinyleerd krabbelde besturingselementen in de cellen liposoom gebaseerde transfectie methode transfected. Transfected cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 voor een extra 36 h en geoogst. Daarna cellulaire lysates van transfected cellen werden voorbereid door het bevriezen-ontdooien lysis methode. De vers bereide cellulaire lysates waren met de geblokkeerde daar gecoat magnetische kralen op een bank boven nutating mixer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na dit, de parels werden verwerkt en gewassen met behulp van vers bereid ijs koud pull-down was buffer op de magnetische scheidingsteken. Tot slot, de parels werden geresuspendeerde in 100 µL van de nuclease gratis water voor verdere analyse.
Detectie van Target mRNA in het pull-down miRNA:mRNA Complex
Om te ontdekken het doel mRNA van 125 miR-ter van het mengsel van de pull-down, we werknemers een qPCR test (Figuur 1). We ontwierpen de voorwaartse en omgekeerde inleidingen (FP en RP) binnen de ORF te versterken PARP-1 mRNA (Figuur 2tabel 5b). Wij ook ontworpen inleidingen sets voor het opsporen van p53 mRNA, een bekende doelstelling van miR-125 ter42, als positieve controle en opgenomen inleidingen om te versterken van actine mRNA als een niet-specifieke negatieve controle. Bovendien, om verder te bevestigen de specificiteit van de versterking, ontwierpen we inleidingen voor het opsporen van de 3' UTR regio's PARP-1, p53 en actine. Wij uitgevoerd qPCR met behulp van de methoden die worden beschreven in het protocol (punt 6).
Figuur 3 toont de versterking van de qPCR op basis van mRNA ten opzichte van gecodeerde besturingselementen uit de gezuiverde KRALEN is doel. Het niveau van de PARP-1 mRNA was aanzienlijk hoger in monsters trok-down met biotinyleerd miR-125 ter nabootsers in vergelijking met de gecodeerde besturingselementen. Zoals verwacht, controle hogere mRNA niveaus van de positieve p53 mRNA en minimale versterking van de negatieve controle actine die mRNA werd waargenomen in deze monsters. Vergelijkbare niveaus voor amplificatie werden verkregen met behulp van de inleidingen die gericht is op de 3' UTR van PARP-1 en p53 in vergelijking met de negatieve controle actine (figuur 3B). De qPCR leidt van de ORF regio's (figuur 3A), en de 3' UTR regio's (figuur 3B) van PARP-1 mRNA en p53 mRNA toonde sommige niveaus van variabiliteit. Verschillende factoren, waaronder bindende affiniteit, aantal miRNA bandplaatsen en verschillen in primer reeks afhankelijke versterking aan de verschillende niveaus van versterking in Figuur 3 bijdragen kan. Niettemin steunen deze gegevens de haalbaarheid en de specificiteit van de methode voor de validatie van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs.
Figuur 1: schematische weergave van het protocol voor de doelgroep vangen assay met behulp van biotinyleerd-miRNA nabootsers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Primer ontwerp voor versterking van mRNA doelstellingen. Schematische weergave van de inleidingen gebruikt om te ontdekken het doel mRNA van miR-125 ter. Een reeks inleidingen (stel ik) was ontworpen binnen de ORF-regio van de transcripten en de andere reeks inleidingen (Set II) werd ontworpen in de UTR regio 3' van de doelgenen. FP en RP vertegenwoordigen voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor elke set. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: miR-125 ter target identificatie door qPCR. (A) mRNA niveaus met behulp van primer set target ik, die de ORF-regio van versterkt mRNA. Hogere niveaus van de expressie van PARP-1 en p53 mRNA (positieve controle) werden waargenomen in vergelijking met actine mRNA (negatieve controle). (B) versterking van de 3' UTR regio van doelstelling mRNA met primer instellen II. Geen versterking werd waargenomen in de geen sjabloon besturingselementen (NTC). Alle reacties zijn uitgevoerd in triplicates en de data werd geanalyseerd met behulp van de juiste gegevens analysesoftware gebaseerd op de 2-ΔCt -methode. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Component | Voorraad | Eindvolume voor 20 μL reactie |
| Sjabloon (RNA) | 50 ng/µL | 1,0 ΜL |
| Reactie buffer | 5 x | 4.0 ΜL |
| Oligo dT primer | Master voorraad | 2 ΜL |
| Reverse-Transcriptase | Master voorraad | 1 ΜL |
| Nuclease-vrij gedistilleerd water | - | 12 ΜL |
| Volume van de totale reactie | 20 ΜL |
Tabel 1: cDNA synthese reactiemengsel.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 min |
| 95 ° C = 5 min |
| 10 ° C = wachtruimte |
Tabel 2: cDNA synthese thermische fietsen omstandigheden.
| Component | Voorraad | Eindvolume voor 10 μL reactie |
| cDNA product | - | 1,0 ΜL |
| iTaq universele SYBR mix | 2 x | 5.0 ΜL |
| Doel (ORF/3 ' UTR) F.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Doel (ORF/3 ' UTR) R.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Nuclease-vrij gedistilleerd water | - | 3 ΜL |
| Volume van de totale reactie | 10 ΜL |
Tabel 3: qPCR reactiemengsel.
| 95 ° C = 10 min |
| 30 cycli van: |
| 95 ° C = 10 s |
| 56 ° C = 30 s |
| 72 ° C = 30 s |
| Smelten Curve analyse |
| 65 ° C = 31 s |
| Lineaire oprit tarief = 0,5 ° C/s |
| Overname = 0,5 ° C intervallen |
Tabel 4: qPCR thermische fietsen omstandigheden.
| (A): biotinyleerd Oligos | ||
| Biotinlyated Oligos | Voorraad | Volgorde (5' naar 3') |
| heeft-miR-125 ter | 25 ΜM | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-Biotine |
| Gecodeerde controle | 25 ΜM | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-Biotine |
| (B) primers | ||
| Doel Primer (ORF) | Voorraad | Volgorde (5' naar 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 ΜM | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| ACTIN (FP) | 100 ΜM | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| ACTIN (RP) | 100 ΜM | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (C) primers | ||
| Doel de Primer (3' UTR) | Voorraad | Volgorde (5' naar 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 ΜM | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
Tabel 5: Oligonucleotide namen en sequenties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identificatie van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs is belangrijk voor het begrijpen van hun regulerende functie. Verschillende computerhulpmiddelen werkzaam zijn te voorspellen van doelstellingen op basis van zaad reeks complementariteit en de instandhouding van doel sequenties19,20. Hoewel deze hulpprogramma's waardevol zijn, kunnen ze genereren hoge niveaus van zowel valse positieven en valse negatieven. Deze voorspellingen zijn dus gekoppeld aan experimentele methoden zoals immunoprecipitation van RISC complex en pull-down van complexe miRNA:mRNA te bevestigen van directe binding van miRNAs aan hun respectieve doelstellingen27,31. De details van dit verslag een experimentele strategie die gebruikmaakt van biotinyleerd miRNA bootst aan pulldown target mRNA. Biotine pulldown kan worden gebruikt voor de identificatie van miRNA doelen met hoge gevoeligheid en lage valse positieve tarieven35,43. Deze methode kan daarom ook worden benut voor de identificatie van miRNA doelstellingen door de koppeling van de reeks gebaseerde screening van de vastgelegde RNA-pool. Er zijn echter verschillende beperkingen aan deze methode44. Overmatige uitdrukking van een exogene miRNA konden de transcriptionele netwerk van cellen, waardoor de daaruit voortvloeiende wijzigingen in mRNA die niet als gevolg van miRNA verordening wijzigen. Deze kunnen worden overwonnen met behulp van zeer lage bedragen van nabootsers om niet erover endogene miRNA verordening. Ook zijn goede controles vereist wanneer miRNAs exogenously om te voorkomen dat niet-specifieke binding worden uitgedrukt. Voorzichtig wassen en het blokkeren van stappen kunnen effectief achtergrondgeluiden te minimaliseren en vergroten van de specificiteit van de gerichte miRNA. Enkele studies hebben aangetoond dat wijzigingen van miRNA 3' of 5' einden zijn niet goed getolereerd45, niettemin, verschillende studies hebben efficiënt gebruikt Biotine gelabeld miR-nabootsers als een effectief instrument om te verkennen mRNA doelen.
Het andere voordeel van deze methode is het gebruik van LNA gebaseerde (vergrendelde nucleic acid) miRNA nabootsers. Het LNA nucleïnezuur wijziging kunt vorming van stabiele oligonucleotides duplexen met hoge affiniteit46,47. Bovendien, de aangepaste gemaakte biotinyleerd LNA miRNA nabootsers bestaan uit drie RNA strengen. Een 3'-biotinyleerd miRNA streng met volgorde volgens de aantekening miRBase en een aanvulling vormen op de miRNA die is gesplitst in twee LNA gemodificeerde RNA strengen47passagier-onderdeel. RISC bevat alleen de miRNA strand terwijl de twee passagier strengen worden snel afgebroken waardoor versterkt doel specificiteit. Het vergroten van het vertrouwen van onze bevindingen, hebben we ook een gevalideerde doel p53 van miR-125 ter als positieve controle en β-actine, die niet een miR-125 ter bindende site in het mRNA als een negatieve controle hoeft opgenomen. De resultaten verkregen met behulp van deze methode met deze besturingselementen (Figuur 3) blijkt specificiteit van target mRNA identificatie. Hoewel LNA miRNA nabootsers stabiliseren en sterk gunst Watson-Crick basis in paren rangschikken, moet opgemerkt worden dat het gebruik van LNA miRNA nabootsers met biotine label valse positieven noch negatieven kan elimineren. Bovendien is het waarschijnlijk dat ze kunnen leiden tot bevestiging van computationele voorspellingen die niet biologisch relevant kunnen zijn. Aan de andere kant, als deze methode is in combinatie met rangschikken identificeren van mRNA doelen, kunnen valse negatieven worden gegenereerd, omdat LNA bootst gunst canonieke base paren die kan uitsluiten van de niet-canonieke base paren van interacties die met de inheemse miRNAs plaatsvinden.
Het protocol hier gepresenteerd is aangepast van Wani et al., met enkele wijzigingen35. Om verder achtergrondgeluiden te verminderen, hebben we opgenomen uitgebreide wassen stappen, bewerkt de parameters voor Transfectie efficiëntie, buffer voorbereiding en incubatie, pulldown voorwaarden en PCR data-acquisitie en analyse. Bovendien, we twee sets van de primer gebruikt om te vergroten het doel mRNA na de pull-down, ontworpen om aan te vullen van een regio van de ORF van instellen target mRNA en de tweede reeks inleidingen te versterken van een regio binnen de 3-' UTR van het doel mRNA. Gebruik van twee reeksen inleidingen verbetert de specificiteit voor de doelgroep mRNA verrijking.
Opgemerkt moet worden dat een beperking van deze methode is een basale niveau van lawaai dat uit de niet-specifieke doelstellingen voortvloeit. Verdere wijzigingen zoals de verbetering van het tijdelijk blokkeren, wassen en incubatie voorwaarden kunnen bieden hogere doel specificiteit en de gevoeligheid. Kortom is de bepaling in dit verslag beschreven een snelle en betrouwbare methode die kan worden aangenomen om te valideren van mRNA doelstellingen van miRNAs met behulp van een PCR gebaseerde strategie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële en niet-financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies DA037779 (naar J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 en MD007586 (tot C.D.). Het werk werd ook ondersteund door de RCMI Grant G12MD007586, de Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, verlenen de Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 van NCRR/NIH, de U54 Grant MD007593 van NIMHD/NIH en de Tennessee-centrum voor AIDS Onderzoek (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).
