Summary
Denna rapport beskriver en snabb och tillförlitlig metod för att validera mRNA mål av cellulära microRNA. De metoden använder syntetiska biotinylerade låst nukleinsyra LNA-baserade miRNA härmar för att fånga rikta mRNA. Därefter streptividin-belagda magnetiska pärlor är anställda att pulldown målet mRNA för kvantifiering av qPCR polymeras-kedjereaktion.
Abstract
MikroRNA (Mirna) är en klass av små icke-kodande RNAs som post-transcriptionally reglerar cellulära genuttryck. MicroRNA binda till 3' oöversatta regionen (UTR) rikta mRNA hämmar protein översättning eller i vissa fall orsaka mRNA nedbrytning. Bindningen av miRNA till den 3' UTR målet mRNA medieras av en 2-8 frö nukleotidsekvensen i 5' slutet av miRNA. MicroRNA roll som cellulära reglerande molekyler är väl etablerad, fortfarande identifiering av den mål mRNA funktionell betydelse en utmaning. Bioinformatiska verktyg har använts för att förutsäga sekvenser inom den 3' UTR av mRNA som potentiella mål för miRNA bindande. Dessa verktyg har också använts för att bestämma evolutionära bevarande av sådana sekvenser bland närbesläktade arter i ett försök att förutsäga funktionella roll. Men dessa beräkningsmetoder ofta genererar falska positiva resultat och är begränsade till att förutsäga canonical samverkan mellan miRNA och mRNA. Experimentella rutiner som mäter riktaband av miRNA till sitt mRNA mål är därför nödvändigt att fastställa funktionella interaktion. I den här rapporten beskriver vi en känslig metod för att validera direkt interaktion mellan den cellulära miRNA miR-125b och den 3' UTR av PARP-1 mRNA. Vi utarbeta ett protokoll där syntetiska biotinylerade-miRNA härmar var transfekterade i däggdjursceller och miRNA-mRNA anläggningen i cellulära lysate drogs med streptividin-belagda magnetiska pärlor. Slutligen, målet mRNA i de drog ner nukleinsyra komplexa kvantifierades använder en qPCR-baserad strategi.
Introduction
MikroRNA (Mirna) är små icke-kodande RNAs som negativt reglerar protein uttryck1. Prekursorer av miRNA bosatta i kluster genom många regioner i genomet, oftast inom intergenic regioner och introner protein-kodande gener2,3. Biogenes av MicroRNA involvera transkription av den pri-MicroRNA från miRNA-encoding gener4. De pri-MicroRNA genomgå sekventiell behandling, först i kärnan och sedan i cytoplasman att generera enda stranded mogen MicroRNA4,5. Därefter, de mogna MicroRNA är införlivade i RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC): ett multimeric protein-RNA komplex som innehåller en medlem av familjen Argonaute av proteiner för målet erkännande4,5, 6,7. Mogen MicroRNA i den komplexa RISC huvudsakligen binder till den 3' UTR av målet mRNA8,9,10 men kan också binda ibland i kodning och 5' UTR regionen av mRNA10,11 . Bindningen av miRNA till mRNA sekvenser resultat i translationell ljuddämpningssystemet12,13,14 och i vissa fall mRNA destabilisering15. Eftersom en enda miRNA kan rikta många mRNA, dessa reglerande molekyler är inblandade i nästan varje cellulär process och har varit inblandade i olika sjukdom villkor16,17,18.
Detaljerad förståelse av hur MicroRNA reglera cellulär vägar kräver identifiering av den mål-mRNA. Det finns flera bioinformatik plattformar att förutsäga förmodad miRNA:mRNA interaktioner19,20. Dessa förutsägelser lita på perfekt Watson-Crick bas parkoppling mellan den 2 – 8 nukleotidsekvensen utsäde av miRNA och en kompletterande sekvens inom de mål mRNA4,21. Dessutom dessa verktyg generera sekundärt strukturera av miRNA:mRNA duplex, beräkna termodynamiska parametrar av denna molekylär interaktion och Visa bevarande av de bindande platserna över arter att förbättra funktionella betydelse för målet prognos. Tyvärr har dessa verktyg också begränsning av förutsäga falska positiva mål på en mycket hög grad (~ 27 – 70%)15,22. Viktigast av allt, misslyckas dessa i silico -plattformar att känna igen de icke-kanoniska interaktionerna mellan MicroRNA och deras mål23. Sådana prediktiva analyser kombineras därför ofta med experimentella metoder för att validera funktionellt relevanta mål.
Flera metoder har utvecklats för att experimentellt validera miRNA:mRNA interaktion. Genetiska experiment med miRNA härmar, ge svampar och hämmare som förändrar nivåerna av MicroRNA i cellen ledtrådar för dess reglerande effekt på målet gen uttryck24,25,26. Dessutom reporter baserat analyser via samtidig transfection av en klon som innehåller regionen 3' UTR i de målet mRNA och miRNA härmar eller hämmare i celler förete bevis för regleringsverksamheten MicroRNA26. Medan dessa metoder är avgörande för att studera post-transcriptional reglering av genuttryck genom MicroRNA, är transfection effektivitet och pleotropic effekterna av förändringar i cellulära miRNA nivåer stora begränsningar av dessa genetiska metoder23, 26. Därför är kompletterande biokemiska metoder som sond direkt interaktion mellan miRNA och dess mål anställd för att bättre förstå MicroRNA cellulär funktion.
En allmänt använd metod att studera direkt interaktion mellan miRNA och dess mål är immunoprecipitation av den RISC komplexa följt av detektion av mRNA mål inom den komplexa27,28,29,30 . Nyligen, en förbättrad metod för RISC-fällan var också utnyttjas för att identifiera miRNA mål; det par stabilisering av mål inom de RISC-miRNA-mRNA intermediärer med rening av mRNA mål. Dock dessa methodsface de inneboende utmaningarna av icke-specifika samspelet mellan RNA och RNA-bindande proteiner som är vanligtvis åtskilda av cellulära fack31,32. Dessa analyser är dessutom beroende av förekomsten av AGO2 protein för immunoprecipitation RISC komplexa33. Med tanke på att AGO2 inte är den enda argonaute att medla effektiv miRNA:mRNA interaktioner, kan uteslutandet av andra argonautes leda till partisk resultat34. Därför behövs alternativa strategier för att studera riktaband av miRNA till mRNA.
I betänkandet vi utarbeta en one-step metod för avsökning direkt interaktion mellan en miRNA och dess mål mRNA. Det första är 3' biotinylerade låst nukleinsyra (LNA) miRNA härmar transfekterade i däggdjursceller. Sedan fångas miRNA:mRNA komplex i cellulära lysate med streptividin belagda magnetiska pärlor. MRNA målet bunden till dess kompletterande miRNA kvantifieras med hjälp av qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transfection av 3'-biotinylerade miRNA
Obs: Utför följande steg släpper en steril LAF.
- Utsäde 4 x 105– 5 x 105 HEK-293T celler per brunn i 2 mL komplett Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) [DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1 x penna-strep antibiotikum]. Odla cellerna i en inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2 över natten.
- Nästa dag, kontrollera hälsa och följsamhet av pläterad celler under ett ljusmikroskop.
Obs: Kontrollera att cellerna har följts och uppnått lämplig morfologi innan du fortsätter till nästa steg. HEK-293T cellerna är vanligtvis klar för transfection 18 – 24 h post plätering. - I ett sterilt 1,7 mL mikrofugrör, späd 75 picomoles av biotinylerade miRNA i 200 µL minimal väsentliga media. Överför denna blandning till en annan 1,7 mL microfuge tube innehållande Liposom baserat transfection reagens (8 µL per brunn) utspätt i 200 µL minimal väsentliga media. Blanda noga, men försiktigt, genom pipettering och Inkubera under 20 – 25 minuter vid rumstemperatur för att tillåta bildandet av transfection komplexen.
- Ta bort det gamla mediet från 6 väl kultur plattan genom skonsam pipettering och fylla på varje brunn med 1,6 mL av nylagad komplett DMEM (utan 1 x penna-strep antibiotika).
- Lägg till de transfection komplex (från 1,3) drop-wise till celler i 6-väl plattan med väl kalibrerad pipett. Snurra plattan försiktigt samtidigt lägga komplexen för att säkerställa deras jämn fördelning över plattan.
Obs: Detta steg är mycket avgörande för att uppnå hög verkningsgrad transfection och måste utföras med omsorg och tålamod. - Odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 för minst 36 h.
2. förberedelse av streptividin belagda magnetiska pärlor — jag
- Återsuspendera streptividin magnetiska pärlor grundligt av vortexa. Överföra 30 µL pärla suspension (per prov) till ett 2 mL nuclease-fri mikrofugrör.
- Placera röret med pärla suspension på magnetiska pärla separator stativet (”magnet” nedan) i 2 min. Efter att säkerställa att pärlorna är dras åt sidan av röret i kontakt med magneten, och ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en mikropipett.
- Tillsätt 100 µL av pärla tvättbuffert (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) till pärlorna. Ta bort röret från magneten. Virvel för 15 s vid rumstemperatur att tvätta pärlorna.
- Placera röret som innehåller pärlor på magneten i 2 min, och noggrant avlägsna och Kassera supernatanten.
- Upprepa steg 2.3 och 2.4 för sammanlagt tre tvättar. Efter den sista tvättningen, ta bort röret från magneten.
- Tillsätt 100 µL av RNase frigöra lösning (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) till pärlor, blanda väl genom vortexa för 15 s, och odla i rumstemperatur för 5 min. Placera röret som innehåller pärlor på magneten i 2 min, och noggrant ta bort och Kassera supernatanten.
- Upprepa steg 2,6 totalt tre gånger.
- Lägga till bead resuspension lösning (0,5 M NaCl) till pärlor, vortex 15 s, och inkubera vid rumstemperatur för 5 min. Placera återsuspenderade pärlorna på magneten i 2 min och ta försiktigt bort supernatanten.
- Tillsätt 200 µL pärla blockerar lösning (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL jäst tRNA) i pärlorna. Mix av mild vortexa för 15 s vid rumstemperatur. Inkubera vid 4 ° C i 16 timmar (över natten) på en multi tube rotator.
3. beredning av Cell Lysates
- Skörda de transfekterade cellerna HEK-293T genom skonsam skrapa med hjälp av en steril cell skrapa inuti laminar huven och sedan överföra varje prov i en steril 2 mL mikrofugrör.
- Pellet skrapade cellerna genom centrifugering vid 1500 x g för 5 min. återsuspendera pelleten i 1 x sterila PBS (fosfat buffert saltlösning), pH 7,2. Centrifugera igen vid 1 500 x g för 5 min att få en pellet gratis av övriga media. Genast störta röret som innehåller pelleten i isen.
- Förbereda färska komplett cell lyseringsbuffert (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH-7,5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x proteashämmare).
Obs: Ett lager av cell lysisbuffert saknar IGEPAL, Superase och proteas hämmare cocktail kan vara förberett i förväg och förvaras i rumstemperatur. Förbered en ny batch komplett cell lyseringsbuffert genom att lägga till de ovanstående kosttillskott vid de rekommenderade slutliga koncentrationerna till lager cell lysis bufferten och lagra den på is. - Lägg till 260 µL iskall komplett cell lyseringsbuffert till varje prov i mikrofugrör (dvs. varje mikrofugrör innehåller celler skördas från en brunn av 6-väl plattan) och återsuspendera cellpelleten till en homogen suspension av pipettering.
- Lysera celler med metoden frysning-tining: Inkubera rören vid-80 ° C i 10 – 15 min. Då kan cellerna att tina upp på isen.
- Centrifugera den resulterande cellen lysate vid 16 000 x g i 5 min i en kyld bänkmonterade centrifug vid 4 ° C.
- Överföra den rensade cellen lysate till en steril 1,7 mL mikrofugrör på is. Kassera pelleten.
Obs: Den avslutande volymen i avmarkerad lysate bör vara ~ 240 – 250 µL. - Lägg 5 M NaCl till den rensade lysate till en slutlig koncentration på 1M och underhålla proverna på is.
4. beredning av streptividin magnetiska pärlor — II
- Förbereda färska komplett nedrullningsbara tvättbuffert (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase och 1 x proteashämmare cocktail)
Obs: Ett lager av nedrullningsbara tvättbuffert saknas IGEPAL, Superase och proteas hämmare cocktail kan vara förberett i förväg och förvaras i rumstemperatur. Förbered en ny batch komplett cell lyseringsbuffert genom att lägga till de ovanstående kosttillskott vid de rekommenderade slutliga koncentrationerna till lager cell lysis bufferten och lagra den på is. - Placera det röret som innehåller beredda pärlorna (från steg 2,9) på magneten för 2 min. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 150 µL iskall komplett nedrullningsbara tvättbuffert i pärlorna. Virvel för 15 s och inkubera i rumstemperatur i 30 – 60 s. plats rören på magneten för 2 min. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten.
- Upprepa steg 4,3 för totalt 3 gånger.
- Återsuspendera pärlorna i 300 µL av komplett nedrullningsbara tvättbuffert.
5. pull-down av Target mRNA-miRNA komplex
- Över 300 µL av cellen lysate (från steg 3.8) till den mikrofugrör med 300 µL av pärlor (från steg 4,5).
- Inkubera blandningen på en nutating mixer för 1 h i rumstemperatur.
- Placera röret på magneten för 5 min. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten.
- Tillsätt 300 µL iskall komplett nedrullningsbara tvättbuffert i pärlorna. Virvel för 15 s vid rumstemperatur och placera röret på magneten för 5 min. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten.
- Upprepa steg 5,4 två gånger.
- Återsuspendera pärlorna i 100 µL nuclease-gratis vatten och inkubera på is.
6. total RNA-extraktion, cDNA syntes och qPCR
- Extrahera total-RNA från de återsuspenderade pärlorna (från steg 5,6) med hjälp av en lämplig metod (se Tabell för material). Återsuspendera den extraherade total-RNA i 25 µL nuclease-gratis vatten. Fastställa RNA-koncentrationen och kvalitet med en spektrofotometer (absorbans vid 260/280). Förbereda ett fungerande lager av RNA på 50 ng/µL.
- Utföra cDNA syntes, i exemplar, med 50 ng av total-RNA (från steg 6.1) med hjälp av en lämplig cDNA syntes kit (se Tabell för material) med oligo dT grundfärger i en slutlig volym av 20 µL (tabell 1). Sedan lasten PCR-rören i qPCR instrumentet att utföra termisk cykling enligt de villkor som beskrivs i tabell 2.
-
Utföra qPCR på CDNA (från steg 6,2) med hjälp av SYBR Green kemi (se tabell för material):
- Utföra alla qPCR reaktioner i exemplar i en 96 väl klart bottenplatta i sterila förhållanden.
- Alikvotens 9 µL av reaktionsblandningen från qPCR master mix (se tabell 3) till varje brunn av plattan. Lägg 1 µL av cDNA till varje brunn för att uppnå en slutlig volym av 10 µL. försegla PCR-plattan med värmebeständig PCR-plattan sealer sedan och ladda in qPCR instrumentet
- Utföra termisk cykling enligt de villkor som beskrivs i tabell 4.
- Normalisera uttrycksnivåerna (Ct-värden) för varje prov till uttrycksnivåerna som för den kodade kontrollen. Använda dessa värden för att beräkna fold förändringar i uttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MicroRNA reglera cellulära processer genom bindning till målet mRNA. Identifierande mRNA mål är därför en nyckel till att förstå miRNA funktion. Här utarbeta vi en metod för att identifiera mRNA målet för cellulära miRNA. Detta protokoll är anpassade från Wani o.a. 35 med ändring av utnyttja biotinylerade LNA-baserade miRNA härmar till pulldown rikta mRNA. Användningen av LNA-baserade oligonukleotiden härmar ökar specificiteten av målet bindande på grund av ändrade ribos ringen utan toxiska effekter36,37,38högre stabilitet. Vi använde denna metod att dra ner PARP-1 mRNA som mål för cellulära miRNA miR-125b. Den högsta nivån av miR-125b uttryck upptäcks i hjärnvävnad som reglerar nervcellernas funktion39,40. I ett försök att identifiera mål för miR-125b i neuronala celler, nyligen rapporterade vi att miR-125b negativt reglerar PARP-1 uttryck genom att binda till den 3' UTR av PARP-1 mRNA41.
PULLDOWN av miRNA:mRNA komplex
Vi använde HEK-293T celler för att studera samspelet mellan miR-125b och PARP-1 mRNA, eftersom dessa celler används allmänt i cellulär, biokemiska, och molekylärbiologi studier. En schematisk bild av det protokoll som används för mål-mRNA avbildas i figur 1. Först seedade HEK-293T celler (4 x 105– 5 x 105 celler per brunn) över natten i en 6-väl vävnadsodling tallrik och inkuberas vid 37 ° C med 5% CO2 för 18 – 24 h. Därefter var 75 picomoles 3'-biotinylerade miR-125b härmar och 3'-biotinylerade äggröra kontroller transfekterade in i cellerna med Liposom baserat transfection metod. Transfekterade cellerna inkuberas vid 37 ° C och 5% CO2 för en ytterligare 36 h och skördas. Därefter cellulär lysates transfekterade celler var förberedda genom frysning-tining lysis metoden. De nylagade cellulär lysates inkuberades med blockerade streptividin belagda magnetiska pärlor på en bänk topp nutating mixer för 1 h i rumstemperatur. Efter detta pärlorna bearbetades och tvättade med nymalen beredd iskall nedrullningsbara tvättbuffert på den magnetiska avskiljaren. Slutligen, pärlorna var resuspended i 100 µL av nuclease gratis vatten för vidare analys.
Identifiering av mål mRNA i den nedrullningsbara miRNA:mRNA komplex
Att upptäcka målet mRNA av miR-125b från nedrullningsbara blandningen, vi anställt en qPCR-analys (figur 1). Vi designade framåt och bakåt primers (FP och RP) inom ORF att förstärka PARP-1 mRNA (figur 2tabell 5b). Vi också utformat primers uppsättningar för att upptäcka p53 mRNA, en känd mål av miR-125b42, som positiv kontroll och ingår primers för att förstärka aktin mRNA som en icke-specifik negativ kontroll. Dessutom, för att ytterligare bekräfta specificiteten av förstärkning, utformat vi primers för att upptäcka 3' UTR regionerna PARP-1, p53 och aktin. Vi genomförde qPCR med de metoder som beskrivs i protokollet (avsnitt 6).
Figur 3 visar qPCR baserat förstärkning av målet mRNA's i förhållande till kodade kontroller från renat pärlorna. PARP-1 mRNA var markant högre i prover drog ner med biotinylerade miR-125b härmar jämfört med kontrollerna äggröra. Som väntat styra högre mRNA nivåer av positivt p53 mRNA och minimal förstärkning av den negativa kontrollen aktin mRNA observerades i dessa prover. Liknande nivåer av förstärkning erhölls med primers inriktning den 3' UTR av PARP-1 och p53 jämfört med negativ kontroll actin (figur 3B). QPCR resultat av Regionkommittén ORF (figur 3A) och den 3' UTR regioner (figur 3B) av PARP-1 mRNA och p53 mRNA visade vissa nivåer av variabilitet. Flera faktorer inklusive affinitet, antal miRNA bindningsställen och skillnader i primer sekvens beroende förstärkning kan bidra till de variabla nivåerna av amplifiering i figur 3. Ändå, dessa data stöder genomförbarheten och specificitet av metoden för validering av mRNA mål av cellulära microRNA.
Figur 1: Schematisk bild av protokollet för target capture analysen använder biotinylerade-miRNA härmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Primer design för förstärkning av mRNA mål. Schematisk framställning av primers används för att upptäcka målet mRNA av miR-125b. En uppsättning primers (som jag) utformades inom regionen ORF avskrifter och den andra uppsättning primers (ange II) ritades i regionen 3' UTR i målgener. FP och RP representerar framåt och bakåt primers för varje set. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: miR-125b target identifiering av qPCR. (A) mRNA nivåer med hjälp av primer rikta I, vilket förstärker ORF regionen mRNA. Högre nivåer av PARP-1 och p53 mRNA (positiv kontroll) observerades jämfört med aktin mRNA (negativ kontroll). (B) förstärkning av regionen 3' UTR i målet mRNA använder primer som II. Ingen amplifiering observerades ingen mall kontrollerna (NTC). Alla reaktioner utfördes i exemplar och data analyserades med hjälp av lämpliga data analys programvara utifrån metoden 2-ΔCt . Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Beståndet | Slutlig volym för 20 μL reaktion |
| Mall (RNA) | 50 ng/µL | 1,0 ΜL |
| Reaktion buffert | 5 x | 4.0 ΜL |
| Oligo dT primer | Master lager | 2 ΜL |
| Omvänt transkriptas | Master lager | 1 ΜL |
| Nuclease-fri destillerat vatten | - | 12 ΜL |
| Totala reaktionsvolym | 20 ΜL |
Tabell 1: cDNA syntes reaktionsblandningen.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 min |
| 95 ° C = 5 min |
| 10 ° C = Håll |
Tabell 2: cDNA syntes termisk cykling villkor.
| Komponent | Beståndet | Slutlig volym 10 μL reaktion |
| cDNA produkt | - | 1,0 ΜL |
| iTaq Universal SYBR mix | 2 x | 5.0 ΜL |
| Mål (ORF/3 ' UTR) F.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Mål (ORF/3 ' UTR) R.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Nuclease-fri destillerat vatten | - | 3 ΜL |
| Totala reaktionsvolym | 10 ΜL |
Tabell 3: qPCR reaktionsblandningen.
| 95 ° C = 10 min |
| 30 cykler av: |
| 95 ° C = 10 s |
| 56 ° C = 30 s |
| 72 ° C = 30 s |
| Smälta kurva analys |
| 65 ° C = 31 s |
| Linjär Ramp rate = 0,5 ° C/s |
| Förvärv = 0,5 ° C intervall |
Tabell 4: qPCR termisk cykling villkor.
| (A): biotinylerade Oligos | ||
| Biotinlyated Oligos | Beståndet | Sekvens (5' till 3') |
| har-miR-125b | 25 ΜM | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-Biotin |
| Kodade kontroll | 25 ΜM | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-Biotin |
| (B) grundfärger | ||
| Målet Primer (ORF) | Beståndet | Sekvens (5' till 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 ΜM | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| AKTIN (FP) | 100 ΜM | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| AKTIN (RP) | 100 ΜM | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (C) grundfärger | ||
| Målet Primer (3' UTR) | Beståndet | Sekvens (5' till 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 ΜM | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
Tabell 5: Oligonukleotiden namn och sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifiering av mRNA mål av cellulära MicroRNA är viktigt för att förstå deras reglerande funktion. Flera beräkningsverktyg är anställda att förutsäga mål baserat på utsäde sekvens komplementaritet och bevarande av målet sekvenser19,20. Även om dessa verktyg är värdefulla, kan de generera höga nivåer av både falska positiva och falska negativa. Därför är dessa förutsägelser tillsammans med experimentella metoder såsom immunoprecipitation av RISC komplexa och pull-down av miRNA:mRNA komplexa att bekräfta riktaband av MicroRNA till deras respektive mål27,31. Rapporten innehåller en experimentell strategi som utnyttjar biotinylerade miRNA härmar till pulldown rikta mRNA. Biotin pulldown kan användas för identifiering av miRNA mål med hög känslighet och låg falsk positiv ränta35,43. Därför, denna metod kan också utnyttjas för identifiering av miRNA mål koppling sekvens-baserad screening av fångade RNA poolen. Men finns det flera begränsningar till denna metod44. Över uttryck för ett exogent miRNA kunde ändra transkriptionell nätverket av cellerna, som orsakar åtföljande förändringar i mRNA som inte är på grund av miRNA förordning. Dessa kan övervinnas genom att använda mycket låga mängder härmar så att inte stör endogena miRNA förordning. Dessutom krävs ordentliga kontroller när MicroRNA är exogent uttryckt för att undvika icke-specifik bindning. Noggrann tvättning och blockera steg kan effektivt minimera bakgrundsljud och öka specificiteten hos de riktade miRNA. Några studier har visat att ändringar av miRNA 3' eller 5' slutar inte tolererades väl45, men flera studier har effektivt används biotin taggade miR-härmar som ett effektivt verktyg för att utforska mRNA mål.
Den andra fördelen med denna metod är utnyttjandet av LNA-baserade (låst nukleinsyra) miRNA härmar. LNA nukleinsyra ändringen tillåter bildandet av stabil oligonukleotider etagevåningar med hög affinitet46,47. Dessutom består de anpassade gjort biotinylerade LNA miRNA härmar av tre RNA-strängar. En 3'-biotinylerade miRNA strand med sekvens enligt miRBase anteckningen och en passagerare strand kompletterar den miRNA som är uppdelad i två LNA-modifierade RNA strands47. RISC innehåller endast miRNA strand medan två passageraren delarna bryts snabbt därmed stärka mål specificitet. För att öka förtroendet hos våra resultat, har vi även inkluderat en validerade mål p53 av miR-125b som positiv kontroll och β-aktin, som inte har en miR-125b bindningsställe i dess mRNA som en negativ kontroll. De resultat som erhålls med denna metod med dessa kontroller (figur 3) visar specificiteten av målet mRNA identifiering. Även om LNA miRNA härmar stabilisera och kraftigt gynna Watson-Crick bas ihopkoppling, bör det påpekas att användningen av LNA miRNA härmar med biotin etikett kommer att eliminera varken falsk positiv eller negativ. Dessutom är det sannolikt att de kan resultera i bekräftelse av computational förutsägelser som inte är biologiskt relevanta. Däremot, om denna metod är tillsammans med sekvensering att identifiera mRNA mål, kan falska negativa genereras, eftersom LNA härmar gunst kanoniska base parning som kan utesluta icke-kanoniska basen ihopkoppling interaktioner som inträffar med infödda microRNA.
Det protokoll som presenteras här är anpassade från Wani et al, med flera ändringar35. För att ytterligare minska bakgrundsljud, har vi bildat omfattande tvätt steg, modifierade parametrar för transfection effektivitet, buffert förberedelse och inkubation, pulldown villkor och PCR-datainsamling och analys. Dessutom använde vi två primer uppsättningar för att förstärka målet mRNA efter den pull-down, som syftar till att förstärka en region av ORFEN av mRNA och den andra uppsättningen av primers för att förstärka en region inom den 3' UTR målet mRNA. Nyttjande av två uppsättningar av primers ökar specificiteten för målet mRNA anrikningen.
Det bör noteras att en begränsning av denna metod är en basal nivå av buller som uppstår från icke-specifika mål. Ytterligare ändringar, till exempel förbättringar i blockering, tvätt och inkubation villkor föreskriva högre mål specificitet och känslighet. Sammanfattningsvis är den analysmetod som beskrivs i denna rapport en snabb och tillförlitlig metod som kan antas för att validera mRNA mål av MicroRNA med en PCR baserat strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella och icke-finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag DA037779 (till JP), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 och MD007586 (till C.D.). Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA arbetet stöddes också av den RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, och bevilja (U54 RR026140 från NCRR/NIH, den U54 Grant MD007593 från NIMHD/NIH och Tennessee Center for AIDS Forskning (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M.
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B.
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).
