Summary
Denne rapporten beskriver en rask og pålitelig metode for å validere mRNA mål av mobilnettet miRNAs. Metoden bruker syntetiske biotinylated låst nukleinsyre LNA-baserte miRNA etterligner for å fange mål mRNA. Deretter streptavidin-belagt magnetiske perler er ansatt å pulldown målet mRNA for kvantifisering av qPCR polymerasekjedereaksjons.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er en klasse av små noncoding RNAs som post-transcriptionally regulerer mobilnettet genuttrykk. MiRNAs binde til 3 uoversatt regionen (UTR) mot mRNA hemme protein oversettelse eller i noen tilfeller føre mRNA degradering. Binding av miRNA til den 3-' UTR i av målet mRNA er formidlet av en 2-8 nukleotid frø sekvens nederst 5' miRNA. MiRNAs rolle som mobilnettet regulatoriske molekyler er godt etablert, identifikasjon av målet mRNAs med funksjonell relevans er fortsatt en utfordring. Bioinformatic verktøy har vært ansatt å forutsi sekvenser fra den 3-' UTR i av mRNAs som potensielle mål for miRNA bindingen. Disse verktøyene har også blitt benyttet for å fastslå evolusjonære bevaring av slike sekvenser blant beslektede arter i et forsøk på å forutsi funksjonelle rolle. Men metodene beregningsorientert ofte generere falske positive resultater og er begrenset til forutsi kanoniske samspillet mellom miRNA og mRNA. Eksperimentell prosedyrer som måler direkte binding av miRNA til mRNA målet er derfor nødvendig å etablere funksjonell interaksjon. I denne rapporten beskriver vi en følsom metoden for validering av direkte samspill mellom mobilnettet miRNA miR-125b og de 3' UTR av PARP-1 mRNA. Vi utdype en protokoll som syntetisk biotinylated-miRNA imiterer var transfekterte i pattedyrceller og miRNA-mRNA komplekset i mobilnettet lysate ble revet med streptavidin-belagt magnetiske perler. Endelig målet mRNA i trakk ned nukleinsyre komplekse ble kvantifisert ved hjelp av en qPCR-basert strategi.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) er små ikke-koding RNAs som negativt regulerer protein uttrykk1. Forløpere for miRNA ligge i gjennom mange regioner i genomet, oftest innen intergenisk regioner og introns protein-koding gener2,3. Biogenesis av miRNAs involverer transkripsjon av pri-miRNAs fra miRNA-koding gener4. Pri-miRNAs gjennomgå sekvensiell behandling, først i kjernen og deretter i cytoplasma generere enkelt strandet moden miRNAs4,5. Senere, de eldre miRNAs er innlemmet i RNA-indusert stanse komplekset (RISC): en multimeric protein-RNA kompleks som inkluderer medlem av Argonaute proteiner målet anerkjennelse4,5, 6,7. Eldre miRNAs i RISC komplekse hovedsakelig binde til den 3-' UTR i målet mRNAs8,9,10 , men kan også binde noen ganger i koding og 5' UTR regionen av mRNA10,11 . Binding av miRNA til mRNA sekvenser resultater i translasjonsforskning stanse12,13,14 og i noen tilfeller mRNA destabilisering15. Siden en enkelt miRNA kan målrette mange mRNAs, disse regulatoriske molekylene er involvert i nesten alle mobilnettet prosessen og har vært innblandet i ulike sykdom betingelser16,17,18.
Detaljert forståelse av hvordan miRNAs regulere cellular stier krever identifikasjon av målet mRNAs. Flere bioinformatikk plattformer er tilgjengelige til å forutsi mulige miRNA:mRNA vekselsvirkningene19,20. Disse spådommene stole på perfekt Watson-Crick base sammenkoblingen mellom 2-8 nukleotid frø sekvensen av miRNA og en utfyllende sekvens i målet mRNA4,21. I tillegg disse verktøyene generere sekundære strukturen i miRNA:mRNA duplex, beregne termodynamisk parametere av dette molekylær samspillet og vise bevaring av bindende områder over arter å forbedre funksjonelle relevansen av målet prediksjon. Dessverre har disse verktøyene også begrensning av forutsi falske positive mål på et svært høy hastighet (~ 27-70%)15,22. Viktigst, mislykkes disse i sili plattformer i å gjenkjenne miRNAs ikke-kanoniske samhandling med deres mål23. Derfor er slike forutsigende analyser ofte kombinert med eksperimentelle metoder for å validere funksjonelt relevante mål.
Flere tilnærminger har blitt utviklet for å validere eksperimentelt miRNA:mRNA interaksjon. Genetiske eksperimenter med miRNA etterlikner, gir svamper og hemmere som endrer nivåer av miRNAs i cellen ledetråder for sin regulerende effekt på målet gene expression24,25,26. I tillegg reporter basert analyser via co transfection av en klone som inneholder 3 UTR regionen målet mRNA og miRNA imiterer eller hemmere i celler beviser regulatoriske funksjonen miRNAs26. Disse metodene er avgjørende for å studere post-transcriptional regulering av genuttrykk av miRNAs, er hva effektivitet og pleotropic effekter av endringer i mobilnettet miRNA nivåer store begrensninger av disse genetiske tilnærminger23, 26. Derfor er komplementære biokjemiske metoder som probe direkte samspill mellom miRNA og målet ansatt å forstå funksjonen mobilnettet i miRNAs.
En brukte metoden å studere direkte samspill mellom miRNA og målet er immunoprecipitation av RISC sammensatt fulgt av gjenkjenning av mRNA målet innen den komplekse27,28,29,30 . Nylig ble en forbedret RISC felle metode også benyttet for å identifisere miRNA mål; det par stabilisering av mål innen RISC-miRNA-mRNA intermediates med rensing av mRNA mål. Men disse methodsface uspesifisert samspillet mellom RNA og RNA-bindende proteiner som vanligvis er segregerte av mobilnettet rom31,32iboende utfordringer. I tillegg er disse analyser avhengig av tilstedeværelse av AGO2 protein for immunoprecipitation RISC komplekse33. Gitt at AGO2 ikke er den eneste argonaute å megle effektiv miRNA:mRNA vekselsvirkningene, kan utelukkelse av andre argonautes føre til forutinntatte resultater34. Derfor for alternative strategier å studere direkte binding av miRNA til mRNA.
I denne rapporten vi utdype en ett-trinns tilnærming for utprøvende direkte samspill mellom en miRNA og målet mRNA. Først 3 biotinylated låst nukleinsyre (LNA) miRNA imiterer er transfekterte i pattedyrceller. Deretter fanges miRNA:mRNA i mobilnettet lysate bruker streptavidin belagt magnetiske perler. MRNA målet bundet til sin komplementære miRNA er kvantifisert ved hjelp av qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hva av 3-biotinylated miRNA
Merk: Utfører du følgende trinn i sterilt laminær strømning hette.
- Frø 4 x 105–5 x 105 HEK-293T celler per brønn i 2 mL fullføre Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) [DMEM med 10% fosterets Bovine serum (FBS) og 1 x penn-strep antibiotika]. Kultur cellene i en inkubator satt på 37 ° C, 5% CO2 over natten.
- Neste dag, sjekk helse og etterlevelse av belagt cellene under et lys mikroskop.
Merk: Kontroller at cellene har overholdt og oppnådd riktig morfologi før du fortsetter til neste trinn. HEK-293T cellene er vanligvis klar for transfection 18 – 24 h legge plating. - I et sterilt 1,7 mL microfuge rør, fortynne 75 picomoles av biotinylated miRNA i 200 µL minimal viktige medier. Overføre denne blandingen til en annen 1,7 mL microfuge rør som inneholder Liposome basert transfection reagens (8 µL/vel) fortynnet i 200 µL minimal viktige medier. Bland godt, men forsiktig av pipettering og ruge i 20-25 minutter ved romtemperatur for at transfection komplekser.
- Fjern den gamle mediet fra 6 godt kultur plate ved mild pipettering og fylle hver brønn med 1,6 mL nylagde komplett DMEM (uten 1 x penn-strep antibiotika).
- Legge til hva komplekser (fra 1.3) drop-wise i cellene i 6-vel platen ved hjelp av en godt kalibrert pipette. Snurr den forsiktig mens komplekser for å sikre deres jevn fordeling over tallerkenen.
Merk: Dette trinnet er svært viktig for å oppnå høy virkningsgrad hva og må utføres med forsiktighet og tålmodighet. - Kultur cellene på 37 ° C og 5% CO2 minst 36 h.
2. forberedelse av Streptavidin belagt magnetiske perler-jeg
- Resuspend streptavidin magnetiske perler grundig av vortexing. Overføring 30 µL av perle suspensjon (per prøve) til en 2 mL nuclease gratis microfuge tube.
- Sett røret som inneholder perle suspensjon på magnetiske perle skilletegn stand ("magnet" heretter) i 2 minutter. Kontroller at perlene trekkes til siden av røret i kontakt med magnet, forsiktig fjerne nedbryting ved hjelp av brønnene.
- Legge til 100 µL av perle vaskebuffer (10 mM Tris-Cl pH 7.5 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) perler. Fjern røret fra magneten. Vortex 15 s ved romtemperatur å vaske perler.
- Sett røret som inneholder perler på magneten i 2 minutter, og nøye fjerne og forkaste nedbryting.
- Gjenta trinn 2.3 og 2.4 totalt tre vasker. Etter siste vask trinn, fjerne røret fra magneten.
- Legg 100 µL av RNase frigjør løsning (0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl) til perlene, bland godt vortexing for 15 s, og ruge ved romtemperatur for 5 min. sett røret som inneholder perler på magneten i 2 minutter, og nøye fjerne og forkaste nedbryting.
- Gjenta trinn 2.6 totalt tre ganger.
- Legg perle rørets løsning (0,5 M NaCl) til perlene, vortex 15 s, og ruge ved romtemperatur for 5 min. plassere resuspended perler på magneten i 2 minutter, og fjern forsiktig nedbryting.
- Legge til 200 µL av perle blokkerer løsning (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL gjær tRNA) perler. Blandingen av mild vortexing for 15 s ved romtemperatur. Inkuber ved 4 ° C i 16 h (over natten) på et multi tube rotator.
3. forberedelse av cellen Lysates
- Høste transfekterte HEK-293T cellene ved mild skraping bruker sterilt celle skraper inne laminær panseret, deretter overføre hvert utvalg i et sterilt 2 mL microfuge rør.
- Pellets skrapte cellene med sentrifugering 1500 x g for 5 min. Resuspend pellet i 1 x sterilt PBS (fosfat Buffer saltvann), pH 7.2. Sentrifuger igjen på 1500 x g i 5 min å få pellets gratis gjenværende media. Umiddelbart stupe tuben med pellets til is.
- Forberede frisk hele cellen lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH-7.5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x Protease Inhibitor).
Merk: Et lager av cellen lyseringsbuffer mangler IGEPAL, Superase og Protease hemmer cocktail kan være forberedt på forhånd og oppbevares ved romtemperatur. Forberede en ny gruppe med komplett celle lyseringsbuffer ved å legge over kosttilskudd i de anbefalte siste konsentrasjonene til lyseringsbuffer lager cellen og lagre den på is. - Legge til 260 µL av iskalde komplett celle lyseringsbuffer hvert utvalg i microfuge tube (dvs. hver microfuge rør inneholder celler høstet fra en brønn av 6-vel platen) og resuspend celle pellets til en homogen suspensjon av pipettering.
- Lyse cellene med metoden fryse-Tin: ruge rør ved-80 ° C i 10-15 min. Deretter gjør at cellene til å tine opp på is.
- Sentrifuge resulterende cellen lysate 16.000 x g i 5 min i et nedkjølt Borstemmaskin sentrifuge satt på 4 ° C.
- Overføre ryddet cellen lysate til et sterilt 1,7 mL microfuge rør på is. Kast pellet.
Merk: Det siste bindet fjernet lysate skal ~ 240-250 µL. - Legge 5 M NaCl til de ryddet lysate til en siste konsentrasjon av 1M og vedlikeholde prøvene på is.
4. forberedelse av Streptavidin magnetiske perler-II
- Forberede frisk komplett rullegardin vaskebuffer (10 mM KCl, 1, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase og 1 x Protease Inhibitor cocktail)
Merk: Et lager av rullegardinmenyen vaskebuffer mangler IGEPAL, Superase og Protease hemmer cocktail kan være forberedt på forhånd og oppbevares ved romtemperatur. Forberede en ny gruppe med komplett celle lyseringsbuffer ved å legge over kosttilskudd i de anbefalte siste konsentrasjonene til lyseringsbuffer lager cellen og lagre den på is. - Sett røret som inneholder forberedt perler (fra trinn 2.9) på magneten i 2 min. nøye fjerne og slette nedbryting.
- Legge til 150 µL av iskalde komplett rullegardin vaskebuffer perler. Vortex 15 s og Inkuber ved romtemperatur for 30-60 s. sted rørene på magneten i 2 min. nøye fjerne og slette nedbryting.
- Gjenta trinn 4.3 for totalt 3 ganger.
- Resuspend perler i 300 µL av komplett rullegardin vaskebuffer.
5. trekk-ned av målet mRNA-miRNA komplekser
- Overføre 300 µL av cellen lysate (fra trinn 3.8) til microfuge røret med 300 µL av perler (fra trinn 4.5).
- Inkuber blandingen på en nutating mikser 1t ved romtemperatur.
- Sett røret på magnet for 5 min. nøye fjerne og slette nedbryting.
- Legge til 300 µL av iskalde komplett rullegardin vaskebuffer perler. Vortex 15 s ved romtemperatur og sted røret på magneten i 5 min. nøye fjerne og slette nedbryting.
- Gjenta trinn 5.4 to ganger.
- Resuspend perler i 100 µL nuclease uten vann og ruge på is.
6. total RNA utvinning, cDNA syntese og qPCR
- Ekstra totale RNA fra resuspended perler (fra trinn 5.6) bruker en metoden (se Tabell for materiale). Resuspend den utpakkede totale RNA i 25 µL nuclease uten vann. Bestemme RNA konsentrasjonen og kvaliteten med et spektrofotometer (absorbans ved 260/280). Forberede en arbeider lager av RNA på 50 ng/µL.
- Utføre cDNA syntese, i triplicates, bruker 50 ng av totalt (fra trinn 6.1) ved hjelp av en passende cDNA syntese kit (se Tabell for materiale) bruker oligo dT primere i et siste volum på 20 µL (tabell 1). Deretter Last PCR rør inn i qPCR apparatet utføre termisk sykling som forholdene beskrevet i tabell 2.
-
Utføre qPCR på CDNA (fra trinn 6.2) bruker SYBR grønn kjemi (se tabell for materiale):
- Utfør alle qPCR reaksjoner i triplicates i en 96 godt klar bunnplaten i sterile forhold.
- Aliquot 9 µL reaksjonsblandingen fra qPCR master blande (se tabell 3) i hver brønn av platen. Deretter legge 1 µL av cDNA i hver brønn å oppnå et endelig antall 10 µL. forsegle PCR platen med varmebestandig PCR plate sealer og laste inn i qPCR apparatet
- Utføre termisk sykling henhold til vilkårene som er beskrevet i Tabell 4.
- Normalisere uttrykk nivåer (Ct verdier) av hver prøve uttrykk nivåer i kontrollen kryptert. Bruk disse verdiene til å beregne kaste endringer i uttrykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MiRNAs regulere cellular prosesser ved binding til målet mRNAs. Identifisere mRNA mål er derfor en nøkkel å forstå miRNA funksjon. Her utdype vi en metode for å identifisere mRNA målet for mobilnettet miRNA. Denne protokollen er tilpasset fra Wani et al. 35 med endring av utnytte biotinylated LNA-baserte miRNA imiterer til pulldown målrette mRNA. Bruk av LNA-baserte oligonucleotide etterlikner forbedrer spesifisitet av målet binding på grunn av høyere stabiliteten av endrede ribose ringen uten toksiske effekter36,37,38. Vi ansatt denne metoden å trekke ned PARP-1 mRNA som mål for mobilnettet miRNA miR-125b. Høyeste miR-125b uttrykk oppdages i hjernevevet som regulerer neuronal funksjonen39,40. I et forsøk på å identifisere mål for miR-125b i neuronal celler, nylig rapportert vi at miR-125b negativt regulerer PARP-1 uttrykk ved binding til den 3' UTR av PARP-1 mRNA41.
Rullegardinmenyen i miRNA:mRNA komplekset
Vi brukte HEK-293T celler for å studere samspillet mellom miR-125b og PARP-1 mRNA, siden disse cellene er utbredt i mobil, biokjemiske, og molekylærbiologi studier. En skjematisk av protokollen som brukes for mRNA målet er avbildet i figur 1. HEK-293T celler (4 x 105–5 x 105 celler per brønn) var først frø natten i en 6-og vev kultur plate og inkubert på 37 ° C med 5% CO2 for 18 – 24 h. Etter 75 picomoles 3-biotinylated miR-125b forfalsker og 3-biotinylated scrambled kontroller ble transfekterte i cellene ved hjelp av liposome basert transfection metoden. Transfekterte celler ble inkubert på 37 ° C og 5% CO2 for en ekstra 36 h og høstet. Deretter mobilnettet lysates transfekterte celler ble utarbeidet av fryse-Tin lysis metoden. De nylagde mobilnettet lysates ble inkubert med blokkerte streptavidin belagt magnetiske perler på en benk toppen nutating mikser 1t ved romtemperatur. Denne perler ble behandlet og vasket nymalt forberedt iskald rullegardin vaskebuffer på magnetiske skillelinjen. Til slutt, perler ble resuspended i 100 µL nuclease gratis vann for videre analyse.
Deteksjon av mål mRNA i rullegardinmenyen miRNA:mRNA kompleks
Å oppdage målet mRNA av miR-125b fra rullegardinmenyen blandingen, vi ansatt en qPCR analysen (figur 1). Vi har utformet forover og bakover grunning (FP og RP) innen ORF å forsterke PARP-1 mRNA (figur 2tabellen 5b). Vi designet primere sett for å oppdage p53 mRNA, et kjent mål av miR-125b42, som en positiv og inkludert primere for å forsterke begrepsordbok mRNA som en uspesifisert negativ kontroll. I tillegg for å videre bekrefte spesifisiteten av forsterkning, designet vi primere for å oppdage 3 UTR regionene i PARP-1, p53 og utgangen. Vi utførte qPCR ved hjelp av metodene beskrevet i protokollen (inndelingen 6).
Figur 3 viser qPCR basert forsterkning av målet mRNA er i forhold til kryptert kontroller fra renset perler. Nivået av PARP-1 mRNA var tydelig høyere i prøver trakk ned med biotinylated miR-125b etterlikner sammenlignet med eggerøre kontrollene. Som forventet, kontrollere høyere mRNA nivåer av positive p53 mRNA og minimal forsterkning av negativ kontroll begrepsordbok mRNA ble observert i prøvene. Lignende nivåer av forsterkning ble hentet ved hjelp av primerne målretting av 3' UTR av PARP-1 og p53 forhold til negativ kontroll utgangen (figur 3B). QPCR resultater av ORF regioner (figur 3A) og de 3' UTR regioner (figur 3B) av PARP-1 mRNA og p53 mRNA viste noen nivåer av variasjon. Flere faktorer, inkludert forpliktende tilhørighet, miRNA bindende områder og forskjeller i primer rekkefølge avhengig forsterkning kan bidra til de variable beskyttelsesnivåer forsterkning i Figur 3. Likevel, disse dataene støtter gjennomførbarhet og spesifisitet av metoden for validering mRNA mål av mobilnettet miRNAs.
Figur 1: skjematisk fremstilling av protokollen for målet fange analysen ved hjelp av biotinylated-miRNA imiterer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Primer design for forsterkning av mRNA mål. Skjematisk fremstilling av primerne brukes til å oppdage målet mRNA av miR-125b. Ett sett med primere (satt jeg) ble designet i ORF regionen utskrifter og andre sett med primere (angi II) ble designet i 3 UTR regionen av målet genene. FP og RP representerer forover og bakover grunning for hvert sett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: miR-125b target identifikasjon av qPCR. (A) mRNA nivåer ved hjelp av primer sett mot I, som forsterker ORF regionen mRNA. Høyere uttrykk nivåer av PARP-1 og p53 mRNA (positiv kontroll) ble observert sammenlignet med utgangen mRNA (negativ kontroll). (B) forsterkning 3 UTR regionen i målet mRNA bruker primer sett II. Ingen forsterkning ble observert i ingen mal kontrollene (NTC). Alle reaksjoner ble utført i triplicates og dataene ble analysert ved hjelp av riktige data analyseprogramvare basert på metoden 2-ΔCt . Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Lager | Siste volum for 20 μL reaksjon |
| Mal (RNA) | 50 ng/µL | 1.0 ΜL |
| Reaksjon buffer | 5 x | 4.0 ΜL |
| Oligo dT primer | Master lager | 2 ΜL |
| Revers transkriptase | Master lager | 1 ΜL |
| Nuclease-gratis destillert vann | - | 12 ΜL |
| Totalt reaksjon volum | 20 ΜL |
Tabell 1: cDNA syntese reaksjonsblandingen.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 min |
| 95 ° C = 5 min |
| 10 ° C = Hold |
Tabell 2: cDNA syntese sykling varmeforhold.
| Komponent | Lager | Siste volum for 10 μL reaksjon |
| cDNA produktet | - | 1.0 ΜL |
| iTaq Universal SYBR mix | 2 x | 5.0 ΜL |
| Mål (ORF/3 ' UTR) f.p. la | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Mål (ORF/3 ' UTR) R.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Nuclease-gratis destillert vann | - | 3 ΜL |
| Totalt reaksjon volum | 10 ΜL |
Tabell 3: qPCR reaksjonsblandingen.
| 95 ° C = 10 min |
| 30 sykluser av: |
| 95 ° C = 10 s |
| 56 ° C = 30 s |
| 72 ° C = 30 s |
| Smelte Curve analyse |
| 65 ° C = 31 s |
| Lineær rampen rate = 0,5 ° C/s |
| Oppkjøpet = 0,5 ° C intervaller |
Tabell 4: qPCR termiske sykling forhold.
| (A): Biotinylated Oligos | ||
| Biotinlyated Oligos | Lager | Sekvens (5' til 3) |
| har-miR-125b | 25 ΜM | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-Biotin |
| Kryptert kontroll | 25 ΜM | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-Biotin |
| (B) primere | ||
| Målet Primer (ORF) | Lager | Sekvens (5' til 3) |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 ΜM | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| UTGANGEN (FP) | 100 ΜM | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| UTGANGEN (RP) | 100 ΜM | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (C) primere | ||
| Målet Primer (3' UTR) | Lager | Sekvens (5' til 3) |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 ΜM | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
Tabell 5: Oligonucleotide navn og sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifikasjon av mRNA målene for mobilnettet miRNAs er viktig for å forstå deres regulatoriske funksjon. Flere beregningsorientert verktøy er ansatt å forutsi mål basert på frø sekvens komplementaritet og bevaring av målet sekvenser19,20. Selv om disse verktøyene er verdifulle, kan de generere høye nivåer av både falske positiver og feilaktige negativer. Derfor er disse spådommene kombinert med eksperimentelle metoder som immunoprecipitation av RISC komplekse og trekk ned miRNA:mRNA komplekse å bekrefte direkte binding av miRNAs til sine respektive målene27,31. Denne rapportdetaljer en eksperimentell strategi som utnytter biotinylated miRNA etterligner til pulldown målrette mRNA. Biotin pulldown kan brukes for identifikasjon av miRNA mål med høy følsomhet og lav falsk positiv rate35,43. Derfor kan denne metoden også utnyttes for identifikasjon av miRNA mål ved å koble sekvens-basert screening av fanget RNA. Det er imidlertid flere begrensninger på denne metoden44. Over-uttrykk for en ytre miRNA kan endre transcriptional nettverket av celler, forårsaker påfølgende endringer i mRNA som ikke er på grunn av miRNA regulering. Dette kan løses ved hjelp av svært små mengder av forfalsker for ikke for å forurolige endogene miRNA regulering. Også er riktig kontroller nødvendig når miRNAs uttrykkes exogenously for å unngå ikke-spesifikk bindende. Forsiktig vaske og blokkering trinnene kan effektivt redusere bakgrunnsstøyen og øke spesifisitet av de målrettede miRNA. Noen studier har vist at endringer av miRNA 3 eller 5' ender ikke godt tolerert45, likevel flere studier har effektivt brukt biotin merket miR-forfalsker som et effektivt verktøy til å utforske mRNA mål.
Den andre fordelen med denne metoden er bruken av LNA-basert (låst nucleic acid) miRNA imiterer. LNA nukleinsyre endringen gjør at dannelsen av stabile oligonucleotides duplexes med høy affinitet46,47. Videre består tilpasset laget biotinylated LNA miRNA imiterer av tre RNA tråder. En 3-biotinylated miRNA strand med sekvensen som miRBase merknaden og en passasjer strand utfyllende til miRNA som deles i to LNA endret RNA tråder47. RISC inneholder bare miRNA stranden mens to passasjeren tråder er raskt forringes dermed forsterke målet spesifisitet. For å øke tilliten til våre funn, har vi også inkludert et godkjent mål p53 av miR-125b som positive kontroll og β-utgangen, som ikke har en miR-125b binding området i sin mRNA som en negativ kontroll. Resultatene som oppnås med denne metoden disse kontrollene (Figur 3) viser spesifisitet av målet mRNA identifikasjon. Selv om LNA miRNA imiterer stabilisere og sterkt favorisere Watson-Crick base sammenkobling, bør det påpekes at bruk av LNA miRNA imiterer biotin etiketten vil eliminere falske positiver verken negativer. Videre er det sannsynlig at de kan føre bekreftelse av beregningsorientert spådommer som ikke kan være biologisk relevante. På den annen side, hvis denne metoden er kombinert med sekvensering å identifisere mRNA mål, kan feilaktige negativer genereres, fordi LNA etterligner favør kanoniske base sammenkoblingen at kan ekskludere ikke-kanoniske bunnen sammenkoblingen samhandlinger som oppstår med innebygd miRNAs.
Protokollen presenteres her er tilpasset fra Wani et al, med flere endringer35. For ytterligere å redusere bakgrunnsstøy, har vi innarbeidet omfattende vask trinn, endret parameterne for hva effektivitet, buffer forberedelse inkubering, pulldown og PCR datainnsamling og analyse. I tillegg har vi brukt to primer sett for å forsterke målet mRNA etter den rullegardinmenyen, angi utviklet for å forsterke en region av ORF av mRNA og det andre settet med primere for å forsterke et område i den 3-' UTR i av målet mRNA. Utnyttelse av to sett med primere forbedrer spesifisiteten for målet mRNA berikelse.
Det bør bemerkes at en begrensning av denne metoden er en basal støy som oppstår fra ikke-spesifikke mål. Ytterligere endringer som forbedring av blokkering, vask og inkubasjon kan gi høyere mål spesifisitet og følsomhet. Oppsummert er analysen beskrevet i denne rapporten en rask og pålitelig metode som kan bli vedtatt for å validere mRNA målene for miRNAs ved hjelp av en PCR basert strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske og ikke-finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd DA037779 (å J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 og MD007586 (å CD). Arbeidet ble også støttet av RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, gi Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 fra NIMHD/NIH og Tennessee senter for AIDS Forskning (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M.
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B.
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).
