Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57786
Automatic Translation
1,2,3, 2, 2, 2
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Abstract

MikroRNA (miRNAs) bir post-transcriptionally hücresel gen ekspresyonu düzenleyen küçük kodlamayan RNA'ların sınıfıdır. MiRNAs bağlama 3' çevrilmeyen bölgesi (UTR) mRNA protein çeviri inhibe veya bazı durumlarda mRNA düşmesine yol için hedef. MiRNA için 3' UTR tarafından 2 – 8 nükleotid tohum dizisi sonunda 5' miRNA aracılı mRNA hedefinin bağlama. Hücresel düzenleyici molekülleri miRNAs rolünü iyi kurulmuş olsa da, fonksiyonel alaka ile hedef mRNA tanımlaması bir meydan okuma olarak kalır. Bioinformatic Araçlar içinde 3' UTR mRNA'ların, dizileri miRNA bağlama için potansiyel hedef olarak tahmin etmek için istihdam edilmiştir. Bu araçlar aynı zamanda işlevsel rolü tahmin etmek için bir girişim böyle dizileri akraba türler arasında evrimsel korunması belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, bu hesaplama yöntemleri kez yanlış pozitif sonuçlar üretmek ve kurallı etkileşim miRNA ve mRNA arasında öngörülen biçilen için sınırlıdır. Bu nedenle, miRNA mRNA hedefine için doğrudan bağlama ölçmek deneysel fonksiyonel etkileşim kurmak için gerekli işlemlerdir. Bu raporda, hücresel miRNA miR-125b ve 3' UTR PARP-1 mRNA arasında doğrudan etkileşim doğrulamak için hassas bir yöntemi açıklanmaktadır. Sentetik biotinylated-miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected ve cep lysate da miRNA-mRNA komplekse streptavidin kaplı manyetik boncuklar ile indirilmiş bir protokol ayrıntılı. Son olarak, hedef mRNA çekti aşağı nükleik asit karmaşık bir qPCR tabanlı strateji kullanarak sayısal.

Introduction

MikroRNA (miRNAs) küçük olumsuz protein ifade1düzenleyen RNA'ların kodlamayan. MiRNA nın kümeleri aracılığıyla intergenic bölgeler ve intron protein kodlayıcı genlerin2,3içinde en sık genom sahip pek çok bölge yer alır. MiRNAs Biyogenez dahil PRI-miRNAs miRNA kodlama, transkripsiyon genler4. PRI miRNAs sıralı işleme, ilk çekirdeği ve daha sonra tek telli olgun miRNAs4,5oluşturmak için sonra sitoplazmaya geçmesi. Daha sonra olgun miRNAs RNA-induced silencing tesisin (RISC) dahil edilmiştir: hedef tanıma4,5, proteinlerin Argonaute ailesinin bir üyesini içerir bir multimeric protein-RNA kompleksi 6,7. Olgun miRNAs karmaşık RISC ağırlıklı olarak 3' UTR hedef mRNA'ların8,9,10 bağlamak ama de zaman zaman kodlama ve mRNA10,11 5' UTR bölgesinde bağlayabilirsiniz . MiRNA mRNA için bağlama sonuçları translasyonel susturmak12,13,14 ve bazı durumlarda mRNA istikrarsızlık15diziler. Bir tek miRNA birçok mRNA'ların hedefleyebilirsiniz düzenleyici bu moleküller hemen hemen her hücresel sürecine dahil ve çeşitli hastalık koşulları da16,17,18karıştığı olmuştur.

Detaylı anlayış nasıl miRNAs hücresel yolları düzenleyen hedef mRNA'ların tanımlaması gerekir. Birden çok Biyoinformatik platform sözde miRNA:mRNA etkileşimleri19,20tahmin etmek kullanılabilir. Bu tahminler mükemmel Watson-Crick baz miRNA 2 – 8 nükleotit tohum sırasını ve hedef mRNA4,21içinde tamamlayıcı bir dizini arasında eşleşmesi üzerinde güveniyor. Buna ek olarak, bu araçlar miRNA:mRNA çift yönlü ikincil yapısını oluşturmak, bu moleküler etkileşim termodinamik parametreler hesaplamak ve bağlayıcı siteleri korunması hedef fonksiyonel alaka geliştirmek için türler arasında göstermek tahmin. Ne yazık ki, bu araçlar aynı zamanda yanlış pozitif hedeflerin çok yüksek oranda (% ~ 27 – 70)15,22tahmin sınırlaması var. En önemlisi, bu silico platformlar miRNAs kanonik olmayan etkileşimleri onların hedefleri23ile tanımak için başarısız. Bu nedenle, böyle akıllı analizleri kez işlevsel olarak ilgili hedefleri doğrulama için deneysel yöntemler ile birleştirilir.

Birden fazla yaklaşımları deneysel miRNA:mRNA etkileşim doğrulamak için geliştirilmiştir. MiRNA taklit eder kullanarak genetik deneyler sünger ve miRNAs hücre düzeyleri alter inhibitörleri hedef gen ifade24,25,26üzerindeki düzenleyici etkisi için ipuçları sağlayabilir. Ayrıca, muhabir deneyleri 3' UTR bölgesinin hedef mRNA ve miRNA taklit eder içeren bir klonu Co transfection ile alan veya hücrelere inhibitörleri miRNAs26düzenleyici fonksiyonu kanıtı sağlamak. Bu yöntemlerin çoğu, düzenleme, gen ekspresyonu miRNAs tarafından çalışma için çok önemli olmakla birlikte, transfection verimlilik ve pleotropic hücresel miRNA düzeylerindeki değişiklikler etkilerini bu genetik yaklaşımlar23önemli sınırlamaları vardır, 26. Bu nedenle, miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim sonda tamamlayıcı biyokimyasal yöntemleri miRNAs hücresel fonksiyonun daha iyi anlamak için istihdam edilmektedir.

MiRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim çalışmaya bir yaygın kullanılan RISC karmaşık ve karmaşık27,28,29,30 içinde mRNA hedef tespiti ve ardından immunoprecipitation yöntemidir . Son zamanlarda, bir Gelişmiş RISC tuzak Yöntemi ayrıca miRNA hedefleri tanımlamak için kullanılmıştır; RISC-miRNA-mRNA ara ürün içinde hedefler istikrar mRNA hedefleri arıtma ile çiftler. Ancak, bu methodsface non-spesifik etkileşim genellikle hücresel kompartmanlarda31,32tarafından ayrılmış RNA ve RNA bağlanıcı proteinler arasında içsel sorunları. Buna ek olarak, bu deneyleri için immunoprecipitation RISC karmaşık33AGO2 protein varlığını bağlıdır. Göz önüne alındığında bu AGO2 verimli miRNA:mRNA etkileşimlerin arabuluculuk sadece argonaute değil, diğer argonautes dışlanması için önyargılı sonuçları34neden olabilir. Bu nedenle, alternatif stratejileri miRNA mRNA için doğrudan bağlama çalışmaya ihtiyaç vardır.

Bu raporda, biz bir miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim problama için bir tek adımlı yaklaşım ayrıntılı mRNA. İlk olarak, 3' biotinylated kilitli nükleik asit (LNA) miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected. Sonra miRNA:mRNA cep lysate karmaşık streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanarak yakalanır. Onun tamamlayıcı miRNA bağlı mRNA hedef qPCR kullanarak sayılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 3'-biotinylated miRNA transfection

Not: bir steril laminar akış başlık içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. 2 mL bir kuyu başına tohum 4 x 105–5 x 105 HEK-293T hücre Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) [DMEM % 10 Fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x kalem-strep antibiyotik ile] tamamlayın. 37 ° C, % 5 CO2 gecede ayarla bir kuluçka hücrelerde kültür.
  2. Ertesi gün, sağlık ve bağlılık hafif bir mikroskop altında kaplama hücre kontrol.
    Not: hücreleri yapıştırılır ve bir sonraki adıma devam etmeden önce uygun morfoloji elde emin olun. HEK-293T hücreleri genellikle 18-24 h transfection için hazır kaplama sonrası.
  3. Steril 1.7 mL microfuge tüp biotinylated miRNA en az temel medya 200 µL içinde 75 picomoles oranında seyreltin. Bu karışımı az temel medya 200 µL içinde seyreltilmiş başka bir 1.7 mL microfuge tüp içeren Lipozom tabanlı transfection reaktifi (8 µL/de) aktarın. Pipetting tarafından iyice, ama nazikçe, mix ve transfection komplekslerinin oluşumu izin vermek için oda sıcaklığında 20-25 dk için kuluçkaya.
  4. Nazik pipetting tarafından eski medya 6 iyi kültür plaka kaldırmak ve her şey taze hazırlanmış tam DMEM (olmadan 1 kalem-strep antibiyotik x) 1.6 mL ile doldurmak.
  5. Transfection kompleksleri (1.3) iyi kalibre edilmiş bir pipet kullanarak 6-şey plaka hücrelerde drop-wise ekleyin. Plaka yavaşça plaka arasında onların tekdüze dağılım sağlamak kompleksleri eklerken girdap.
    Not: Bu adım yüksek verimli transfection ulaşmak için çok önemlidir ve özen ve sabır ile gerçekleştirilmelidir.
  6. 37 ° C ve % 5 CO2 en az 36 h için hücre kültür.

2. hazırlanması Streptavidin kaplı manyetik boncuklar — ben

  1. Streptavidin manyetik boncuklar iyice vortexing tarafından resuspend. Boncuk süspansiyon (örnek) başına 30 µL 2 mL nükleaz ücretsiz microfuge tüp aktarın.
  2. 2 dk manyetik boncuk ayırıcı stand ("mıknatıs" Bundan sonra) boncuk süspansiyon içeren tüpü yerleştirin. Boncuk tüp mıknatıs ile temas halinde tarafına çizilir kontrol ettikten sonra dikkatli bir şekilde bir micropipette kullanarak süpernatant çıkarın.
  3. Boncuk yıkama arabelleği (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) 100 µL boncuk için ekleyin. Tüp mıknatıs kaldırın. Girdap 15 s boncuk yıkamak için oda sıcaklığında.
  4. 2 min için mıknatıs üstündeki içeren tüp yerleştirin ve dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
  5. Adım 2.3 ve 2.4 üç yıkama toplam için yineleyin. Son yıkama adımdan sonra tüp mıknatıs kaldırın.
  6. Boncuk için çözüm (0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl) boşaltma RNase 100 µL ekleyin, karıştırın de tarafından vortexing 15 s ve oda sıcaklığında 5 dk. yerleştirmek için 2 dk için mıknatıs üstündeki içeren tüp kuluçkaya ve dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
  7. 2.6 Toplam üç kez tekrarlayın.
  8. Boncuklar, girdap 15 s, boncuk resuspension çözüm (0.5 M NaCl) ekleyin ve 5 dk. resuspended boncuk 2 min için mıknatıs yerleştirin ve dikkatle süpernatant kaldırmak için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  9. 200 µL çözüm (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL Maya tRNA) engelleme boncuk boncuk için ekleyin. Karıştırmak yanında nazik vortexing 15 s, oda sıcaklığında. 16 h (aşırı gece) çoklu tüp rotator için 4 ° C'de kuluçkaya.

3. hücre Lysates hazırlanması

  1. Nazik bir steril hücre kazıyıcı laminer başlık içinde kullanarak kazıma transfected HEK-293T hücreleri hasat, sonra her örnek bir steril 2 mL microfuge tüp içine aktarın.
  2. 5 dk. Resuspend için Pelet steril PBS (fosfat tampon tuzlu) pH 7.2 x 1 alıntı hücreleri tarafından Santrifüjü 1.500 x g de cips. Santrifüj tekrar 1.500 x g Pelet artık medya ücretsiz almak 5 min için de. Hemen buz Pelet içeren tüp Dalma.
  3. Taze tam hücre lizis arabellek hazırlamak (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH-7.5, 5mM DTT, % 0.5 IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 proteaz inhibitörü x).
    Not: IGEPAL, Superase ve proteaz inhibitörü kokteyl eksik hücre lizis arabelleği bir hisse senedi önceden hazırlanmış ve oda sıcaklığında depolanır. Tam hücre lizis arabellek taze bir dizi hisse senedi hücre lizis arabellek için önerilen son konsantrasyonlarda yukarıdaki takviyeleri ekleyerek ve buz üzerinde depolama hazır olun.
  4. Microfuge tüp (her microfuge tüp 6-şey plaka bir kuyudan hasat hücreleri içerenyani ) her örnekte buz gibi tam hücre lizis arabelleği 260 µL ekleyin ve hücre Pelet homojen bir süspansiyon pipetting tarafından resuspend.
  5. Donma-çözülme yöntemini kullanarak hücreleri parçalayıcı: tüpler için 10-15 dk-80 ° C'de kuluçkaya. O halde, buz erimek için hücreleri izin.
  6. Elde edilen hücre 16.000 x g 5 dakika içinde 4 ° C'de ayarla buzdolabında benchtop santrifüj için de lysate santrifüj kapasitesi
  7. Temizlenen hücrenin lysate steril 1.7 mL microfuge tüp buza aktarın. Pelet atmak.
    Not: Son hacmi lysate temizlenmiş ~ 240-250 olmalıdır µL.
  8. 5 M NaCl lysate temizlenen için 1 M son bir konsantrasyon ekleyin ve buz üzerinde örnekleri korumak.

4. Streptavidin manyetik boncuklar hazırlanması — II

  1. Taze tam açılan yıkama arabellek (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, %0,5 IGEPAL, 60U/mL Superase ve 1 x proteaz inhibitörü kokteyl) hazırlamak
    Not: IGEPAL, Superase ve proteaz inhibitörü kokteyl eksik açılan yıkama arabelleği bir hisse senedi önceden hazırlanmış ve oda sıcaklığında depolanır. Tam hücre lizis arabellek taze bir dizi hisse senedi hücre lizis arabellek için önerilen son konsantrasyonlarda yukarıdaki takviyeleri ekleyerek ve buz üzerinde depolama hazır olun.
  2. Tüp mıknatıs 2 dakika süreyle üzerinde (Kimden adım 2,9) boncuk hazırlanan dikkatle kaldırmak ve süpernatant içeren yerleştirin.
  3. Buz gibi tam açılan yıkama arabelleği 150 µL boncuk için ekleyin. Girdap 15 s ve oda sıcaklığında 2 dakika süreyle mıknatıs üzerine boruları dikkatle kaldırmak ve süpernatant 30 – 60 s. yer için kuluçkaya.
  4. 4.3 Toplam 3 kez tekrarlayın.
  5. Boncuk tam açılan yıkama arabellek 300 µL içinde resuspend.

5. hedef mRNA miRNA kompleksleri, pull-down

  1. Hücrenin lysate 300 µL (adımından 3.8) aktarmak için 300 µL boncuk (Kimden adım 4.5) içeren microfuge tüp.
  2. Karışımı oda sıcaklığında 1 h için nutating Mikser üzerinde kuluçkaya.
  3. 5 dakika süreyle mıknatıs tüp dikkatle kaldırmak ve süpernatant yer.
  4. Buz gibi tam açılan yıkama arabelleği 300 µL boncuk için ekleyin. Girdap 15 oda sıcaklığında ve yerde 5 dakika süreyle mıknatıs tüp dikkatle kaldırmak ve süpernatant s.
  5. 5.4 iki kez daha tekrarlayın.
  6. Boncuk nükleaz ücretsiz su 100 µL içinde resuspend ve buz üzerinde kuluçkaya.

6. Toplam RNA çıkarma, cDNA sentezi ve qPCR

  1. Resuspended boncuk (Kimden adım 5.6) Toplam RNA ayıklamak uygun bir yöntem kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek). Ayıklanan toplam RNA nükleaz ücretsiz su 25 µL içinde resuspend. RNA konsantrasyon ve bir spektrofotometre (260/280 absorbans) kullanarak kalitesini belirler. 50 ng/µL adlı bir çalışma hisse senedi-RNA'ın hazırlayın.
  2. CDNA sentezi, triplicates içinde 50 kullanarak gerçekleştirmek ng (Kimden adım 6.1) Toplam RNA'ın bir uygun cDNA sentez kullanarak kiti ( Tablo malzemelerigörmek) 20 µL (Tablo 1) son bir hacim içinde oligo dT primerler kullanılarak. Sonra Tablo 2' de tanımlanan koşullara göre termal Bisiklete binme gerçekleştirmek için qPCR araç içine yük PCR tüpleri.
  3. QPCR (Kimden adım 6.2) CDNA gerçekleştirmek SYBR yeşil kimya kullanarak (tablo malzemeleri görmek):
    1. Tüm qPCR reaksiyonlar triplicates 96 uzak alt plaka steril koşullarda içinde gerçekleştirin.
    2. QPCR ana tepki karışımı aliquot 9 µL plaka her kuyunun içine karıştırın (bkz. Tablo 3). Daha sonra 1 µL cDNA 10 µL. bir son hacmi elde etmek için her şey için ısıya dayanıklı PCR plaka sealer kullanarak PCR plaka mühür ekleyin ve qPCR araç yük
    3. Tablo 4' te tanımlanan koşullara göre termal Bisiklete binme gerçekleştirin.
    4. Her örnek ifade düzeyde şifreli denetimler için ifade düzeyleri (Ct değerler) normalleştirmek. Kat değişiklikleri ifade hesaplamak için bu değerleri kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MiRNAs hedef mRNA'ların bağlama yaparak hücresel işlemleri düzenler. Bu nedenle, tanımlayıcı mRNA miRNA işlevini anlamak için bir anahtar hedefleridir. Burada hücresel miRNA mRNA hedefi tanımlamak için bir yöntem ayrıntılı. Bu iletişim kuralı Wani ve ark. adapte 35 biotinylated LNA tabanlı miRNA taklit eder için açılan kullanarak değişiklik ile mRNA hedef. LNA tabanlı oligonükleotid taklit eder özgüllük hedef bağlama değiştirilmiş riboz yüzük toksik etkileri36,37,38olmadan daha yüksek kararlılık sayesinde kullanımı; Hücresel miRNA miR-125b hedefi olarak PARP-1 mRNA çekmek için bu yöntem çalıştırmaya başladık. MiR-125b ifade en üst düzeyde nöronal fonksiyon39,40düzenleyen beyin dokusunda algılanır. MiR-125b nöronal hücrelerin hedeflerini tanımlamak için bir girişim, son zamanlarda biz o miR 125b olumsuz PARP-1 ifade 3' UTR PARP-1 mRNA41bağlama yaparak düzenleyen bildirdi.

Açılan miRNA:mRNA kompleksi

Biz HEK-293T hücreleri bu hücreleri hücresel, biyokimyasal ve moleküler biyoloji çalışmaları yaygın olarak kullanılan bu yana miR-125b ve PARP-1 mRNA, arasındaki etkileşimi çalışırdım. MRNA hedef için kullanılan iletişim kuralı bir şematik resim 1' de tasvir edilir. İlk olarak, HEK-293T hücreleri (4 x 105–5 x 105 şey başına) gecede 6-iyi doku kültürü plaka ve % 5 CO2 18-24 h 37 ° C'de inkübe numaralı seribaşı. Bundan sonra 3'-biotinylated miR 125b taklit eder ve 3'-biotinylated şifreli denetimlerin 75 picomoles dayalı lipozom transfection yöntemini kullanarak hücre transfected. Transfected hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 için bir ek 36 h inkübe ve hasat. Bundan sonra hücresel lysates transfected hücre donma-çözülme lizis yöntemi tarafından hazırlanmıştır. Taze hazırlanmış hücresel lysates oda sıcaklığında 1 h için tezgah üst nutating Mikser üzerinde bloke streptavidin kaplı manyetik boncuklar ile inkübe. Bunu takiben boncuk işlenmiş olan ve yıkanmış taze kullanarak buz gibi açılan yıkama arabellek manyetik ayırıcı olarak hazırlanmıştır. Son olarak, boncuk nükleaz boş su daha fazla çözümleme için 100 µL resuspended.

Açılan miRNA:mRNA kompleksi içinde hedef mRNA tespiti

Hedef tespit etmek için mRNA miR-125b aşağı açılır karışımından, çalıştırmaya başladık qPCR tahlil (Şekil 1). Biz ileriye ve geriye doğru astar (FP ve RP) içinde ORF PARP-1 mRNA (Şekil 2tablo 5b) yükseltmek için tasarlanmış. Biz de p53 mRNA, miR-125b42, pozitif kontrol olarak bilinen bir hedef tespit için astar kümelerini tasarlanmış ve aktin yükseltmek için astar dahil mRNA olarak non-spesifik negatif kontrol. Buna ek olarak, daha fazla amplifikasyon özgüllük onaylamak için biz astar PARP-1, p53 ve aktin 3' UTR bölgeleri algılamak için tasarlanmıştır. QPCR Protokolü (Bölüm 6) açıklanan yöntemleri kullanarak gerçekleştirilen.

Şekil 3 şifreli arıtılmış boncuk denetimlerden göre mRNA'ın hedef alan qPCR amplifikasyon gösterir. PARP-1 mRNA düzeyini belirgin yüksek örneklerinde çekti aşağı ile şifreli kontrollere göre zaman biotinylated miR 125b taklit eder. Beklendiği gibi daha yüksek mRNA olumlu p53 mRNA ve mRNA bu örnekleri gözlendi negatif kontrol aktin en az amplifikasyon kontrol. Amplifikasyon benzer düzeyde elde edilen 3' UTR PARP-1 ve p53 hedefleme primerler kullanılarak negatif kontrol aktin (Şekil 3B) göre. QPCR'ın ORF bölgesinden (Şekil 3A) ve 3' UTR bölgeleri (Şekil 3B) PARP-1 mRNA sonuçlar ve p53 mRNA bazı düzeyleri değişkenlik gösterdi. Bağlama benzeşme, miRNA bağlayıcı siteleri ve astar sıra bağımlı amplifikasyon amplifikasyon Şekil 3' te çeşitli düzeyleri için katkıda bulunabilir farklılıkları sayısı da dahil olmak üzere çeşitli faktörler. Yine de, bu veriler güçlü fizibilite ve özgüllük yönteminin hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için destek.

Figure 1
Şekil 1: biotinylated-miRNA taklit eder kullanarak hedef yakalama tahlil için protokolün şematik Gösterim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: astar tasarım mRNA hedefleri amplifikasyon için. Hedef algılamak için kullanılan astar şematik gösterimi mRNA miR-125b. Astar bir dizi (ayarla) tutanaklar ve diğer ORF bölge içinde tasarlanmıştır astar (II Ayarla) dizi 3' UTR bölgede hedef genlerin tasarlanmıştır. FP ve RP her kümesi için ileriye ve geriye doğru astar temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: miR-125b hedef tanımlama tarafından qPCR. (A) mRNA düzeyleri astar kümesini kullanarak, hangi ORF bölgenin yükselterek mRNA hedeflediğim. İfade katlara PARP-1 ve p53 mRNA (pozitif kontrol) gözlendi aktin için karşılaştırıldığında mRNA (negatif kontrol). (B) 3' UTR bölge hedefinin amplifikasyon II mRNA astar kullanarak ayarlayın. Hiçbir amplifikasyon hiçbir şablon içindeki denetimleri (NTC) gözlenmiştir. Bütün tepkiler triplicates içinde gerçekleştirilen ve veri 2-ΔCt yöntemine göre uygun veri analiz yazılımı kullanılarak analiz. Hata çubukları standart hata ortalamaya temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşen Hisse senedi 20 μL tepki için son hacim
Şablon (RNA) 50 ng/µL 1.0 μL
Reaksiyon arabellek 5 x 4.0 μL
Oligo dT astar Ana stok 2 μL
Ters transkriptaz Ana stok 1 μL
Nükleaz ücretsiz distile su - 12 μL
Toplam reaksiyon birim 20 μL

Tablo 1: cDNA sentezi tepki karışımı.

105 ° C = 30 s
42 ° C = 60 dk
95 ° C = 5 dk
10 ° C tutun =

Tablo 2: cDNA sentez Termal Bisiklet koşullarını.

Bileşen Hisse senedi 10 μL tepki için son hacim
cDNA ürün - 1.0 μL
iTaq evrensel SYBR mix 2 x 5.0 μL
Hedef (ORF/3 ' UTR) FP 10 MİKRON 0.5 μL
Hedef (ORF/3 ' UTR) R.P 10 MİKRON 0.5 μL
Nükleaz ücretsiz distile su - 3 μL
Toplam reaksiyon birim 10 μL

Tablo 3: qPCR reaksiyon karışımı.

95 ° C = 10 dk
30 döngüleri:
95 ° C = 10 s
56 ° C = 30 s
72 ° C = 30 s
Eğrisi Analizi eritmek
65 ° C = 31 s
Doğrusal rampa oranı = 0,5 ° C/s
Edinme 0.5 ° C aralıkları =

Tablo 4: qPCR Termal Bisiklet koşullarını.

(A): Biotinylated Oligos
Biotinlyated Oligos Hisse senedi Sıra (5'-3')
vardır-miR-125b 25 MİKRON UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-Biotin
Şifreli kontrol 25 MİKRON GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-Biotin
(B) astar
Hedef astar (ORF) Hisse senedi Sıra (5'-3')
PARP-1 (FP) 100 μM GAGGTGGATGGGTTCTCTGA
PARP-1 (RP) 100 μM ACACCCCTTGCACGTACTTC
p53 (FP) 100 μM TGTGACTTGCACGTACTCCC
p53 (RP) 100 μM ACCATCGCTATCTGAGCAGC
AKTİN (FP) 100 μM GCTCGTCGTCGACAACGGCTC
AKTİN (RP) 100 μM CAAACATGATCTGGGTCATCTT
(C) astar
Hedef astar (3' UTR) Hisse senedi Sıra (5'-3')
PARP-1 (FP) 100 μM ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT
PARP-1 (RP) 100 μM CTACCCATCAGCAACTTAGCG
p53 (FP) 100 μM GGCCCATATCTGTGAAATGC
p53 (RP) 100 μM CTGCAGGAAGGCAGGTTTT

Tablo 5: Oligonükleotid adları ve dizileri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücresel miRNAs mRNA hedefleri tanımlaması düzenleyici işlevleri anlamak için önemlidir. Birkaç hesaplama araçları tohum sıra tamamlayıcılık ve koruma hedef sıraları19,20temel hedeflerini tahmin etmek için istihdam edilmektedir. Bu araçları değerli olmasına rağmen yüksek düzeyde yanlış pozitif ve yanlış negatifleri oluşturabilirsiniz. Bu nedenle, bu tahminler ile onların anılan sıraya göre hedefler27,31miRNAs doğrudan bağlama onaylamak için RISC karmaşık ve aşağı açılır miRNA:mRNA karmaşık bir immunoprecipitation gibi deneysel yöntemleri ile birleştiğinde. Biotinylated miRNA kullanır deneysel bir strateji için açılan taklit eden bu rapor ayrıntılarını mRNA hedef. Biotin açılan miRNA hedefleri tanımlaması için yüksek hassasiyet ve yanlış pozitif oranı düşük35,43ile kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntem aynı zamanda miRNA hedefleri tanımlaması için serisi tabanlı tarama yakalanan RNA havuzu kaplin tarafından yararlanılabilir. Ancak, bu yöntem44bazı sınırlamaları vardır. Eksojen miRNA aşırı ifade sonucu değişiklikleri miRNA düzenleme nedeniyle değildir mRNA neden hücrelerinin transkripsiyon ağ değiştirebilir. Bunlar endojen miRNA yönetmelik huzursuz etmemek için taklit eder çok düşük miktarda kullanarak üstesinden gelebilir. MiRNAs exogenously non-spesifik bağlama önlemek için ifade edilir de, uygun denetimleri gereklidir. Dikkatli yıkama ve engelleme adımları böylece etkin arka plan gürültü en aza indirmek ve hedeflenen miRNA özgüllüğü artırmak. Kaç çalışmalar miRNA 3' veya 5' sona ermeden değişiklikler iyi tolere45değildir, yine de, çeşitli çalışmalar verimli bir şekilde öğesini biotin miR-taklit eder etkin bir araç mRNA hedefleri keşfetmek için kullanılan göstermiştir.

Bu yöntem diğer avantajı LNA tabanlı (kilitli nükleik asit) miRNA taklit eder kullanımı olduğunu. LNA nükleik asit değişiklik istikrarlı oligonucleotides Dubleks yüksek afinite46,47oluşumunu sağlar. Ayrıca, özel yapılmış biotinylated LNA miRNA taklit eder üç RNA iplikçiklerinin oluşur. 3'-biotinylated miRNA strand miRBase ek açıklama göre sıra ile ve iki LNA-modified RNA iplikçiklerinin47yılında ayrılmıştır miRNA için tamamlayıcı bir yolcu strand. RISC sadece miRNA strand iplikçikleri hızla böylece hedef özgüllük arttırmak bozulmuş iki yolcu ederken içermektedir. Cihazla ilgili izlenimlerimizi güvenini artırmak için de miR-125b bir pozitif kontrol ve β-aktin, bir negatif kontrol olarak onun mRNA miR-125b bağlama sitedeki sahip olmayan bir doğrulanmış hedef p53 dahil ettik. Bu denetimlerle (Şekil 3) bu yöntemle elde edilen sonuçları özgüllük hedef mRNA tespiti göster. LNA miRNA taklit eder stabilize etmek ve büyük ölçüde Watson-Crick baz eşleşmesi lehine olsa da, bu biotin etiket LNA miRNA taklit eder kullanımı yanlış pozitif hem de negatif ortadan kaldırır işaret edilmelidir. Ayrıca, biyolojik olarak alakalı olmayabilir Hesaplamalı Öngörüler onayında neden olabilir muhtemeldir. Bu yöntem mRNA hedefleri tanımlamak için sıralama ile birleştiğinde, LNA kurallı Bankası eşleştirme ile yerel miRNAs oluşan etkileşimleri eşleştirme kanonik olmayan Bankası hariç tutabilirsiniz iyilik taklit eder çünkü Öte yandan, yanlış negatifleri, oluşturulan.

Burada sunulan Wani ve ark, çeşitli değişiklikler35ile gelen adapte protokolüdür. Daha fazla arka plan gürültüsünü azaltmak için biz kapsamlı çamaşır adımları dahil, transfection verimliliği, arabellek hazırlık ve kuluçka, açılan koşulları ve PCR veri toplama ve analiz için parametreleri değiştirildi. Buna ek olarak, biz astar iki hedef yükseltmek için kullanılan mRNA ORF bölgenin yükseltmek için tasarlanmış ayarla açılan, bir sonra mRNA ve astar ikinci kümesi bir bölge içinde 3' UTR hedef yükseltmek için hedef mRNA. Astar iki kümesi kullanımı için hedef mRNA zenginleştirme özgüllük geliştirir.

Bu yöntemin bir sınırlama belirsiz hedeflerden doğar bazal bir gürültüsünden olduğunu belirtmek. Belgili tanımlık kütük parçası gelişmeler gibi daha fazla değişiklikleri, daha yüksek hedef özgüllük ve duyarlılık çamaşır ve kuluçka koşulları sağlayabilir. Özet olarak, bu raporda açıklanan tahlil bir PCR kullanarak miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için kabul edilebilir bir hızlı ve güvenilir yöntem strateji dayanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali ve mali olmayan ilgi bildirin.

Acknowledgments

Bu eser kısmen ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe DA037779 (için J.P.), tarafından desteklenen DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 ve MD007586 (CD için). Çalışma Ayrıca RCMI Grant G12MD007586 Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975 tarafından desteklenmiştir Meharry Translational Araştırma Merkezi (MeTRC) CTSA vermek (U54 RR026140 NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 NIMHD/NIH üzerinden ve AIDS Tennessee Merkezi Araştırma (P30 AI110527).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Tags

Genetik sayı: 136 miRNA mRNA LNA biotinylation PCR 3' UTR
Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, … More

Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter