우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.
막 매매 및 apoptosis, 등 기본적인 세포 프로세스의 다양 한 세포 막 모양 전환 동시에 칼슘 이온 농도 있는 지역 변이 발생합니다. 이러한 프로세스에 관련 된 주요 분자 구성 요소 확인 되었습니다; 그러나, 칼슘 이온 기울기 및 세포 막 내의 지질 사이 특정 상호 작용은 훨씬 덜 알려진, 생물 세포의 복잡 한 본질 때문에 주로 및 관측 계획의 성사. 이 격차를 해소 하 합성 접근은 세포 막을 모방에 칼슘 이온의 지역화 된 영향을 성공적으로 구현 됩니다. 셀 내에서 조건을 닮은 모방을 설정 하는 것은 severalfold 문제 이다. 첫째, 적절 한 크기와 막 구성 적절 한 biomimetic 모델 셀의 물리적 특성을 캡처하는 데 필요 합니다. 둘째, 특정 막 위치에 칼슘 이온의 작은 금액을 제공 하는 micromanipulation 설치 필요 합니다. 마지막으로, 감지 하 고 외부 자극에 대 한 지질 막의 응답을 기록 관찰 제도 필요 합니다. 이 문서에서는 칼슘 이온 막 상호 작용, 지질 기 시스템, multilamellar 소포 (MLV)에 연결 된 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리) 구성 된 지역화 된 칼슘에 노출은 공부에 대 한 자세한 biomimetic 접근 그라데이션은 microinjection 시스템을 사용 하 여 형성 했다. 막에 이온 영향의 역학 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 하 고 비디오 프레임 속도에서 기록 했다. 막 자극 결과로 높은 막 관 돌출 (MTPs) 우두머리, 막 거리 중심 안에 형성 된 곡선. 기술된 접근 완전히 비접촉 식 하 고 제어 된 방식으로 지질 막 및 MTP 생산의 리 모델링을 유도 합니다. 이 이렇게 세부의 칼슘 이온 막 상호 작용, 세포 막 재편의 메커니즘을 연구 하는 새로운도 제공 하는 수단을 소개 합니다.
생물 학적 과정, 신호, 세포 분열, 그리고 막 융해에서 특히 그들의 관련에서 칼슘 이온의 역할 많은 기계 연구1의 초점 이다. 세포내 세포질 칼슘 이온 농도 100의 순서는 nM, 동안 바인딩과 그물, 분 비 소포 등 미토 콘 드리 아, 세포에서 칼슘 농도에 millimolars의 최대 수만 레벨에 도달. 이 세포내 막2,3,,45,6,7,8에 걸쳐 가파른 칼슘 이온 농도 기온 변화도 크기 순서를 만듭니다. ,9. 세포 외 칼슘 이온 수준 약 2 m m 이며 따라서, 칼슘 이온 농도의 변화는 extracellular와 세포 수준에서 발생 합니다. 또한, 최근 연구 제공 증거 이벤트 신호는 세포내 칼슘 이온 및 신경 활동의 중요성을 나타내는 세포 외 칼슘 이온 농도의 지역 동요의 조건 하에서 발생할 수 있습니다 동기화 내부-그리고 세포 외 칼슘 이온 변화10.
칼슘 이온 및 생물학 막, 원시 세포 막 지질 bilayer vesicles로 대체는 합성 접근 사이의 상호 작용을 이해 하는 것을 목표로 성공적으로 구현 되었습니다. 지질과 막 단계 전환11,12의 분리 뿐만 아니라 지질 머리 그룹 및 탄 화 수소 체인 패킹, 증가 막 긴장, 및 소포 집계, 변화를 리드 칼슘 이온 솔루션에 소포를 노출 ,,1314,,1516. 칼슘 이온에 노출 시 지질 막의 속성 같은 실험적인 기법을 사용 하 여 x 선, 1H NMR 분 광 또는 열역학적 연구11,16, 로 조사 되었습니다. 17 , 18.이 연구에서 막 구성 종종 닮은 원시 세포 막으로 phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), 및 phosphatidylserine (PS)으로 같은 생리 적 지질을 포함. 추 신: 특히 중요 하다 인공 소포 준비에서 세포내 막 매매, exocytosis, apoptosis19,20를 포함 하는 많은 세포질 과정에 필수적인 구성 요소 이기 때문에.
합성된 지질 소포 크기 종종 몇 마이크로미터 나노미터에서 배열 한다. 다른 기 준비, 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs), 가운데는 몇 마이크로미터 직경에서의 수만,는 밀접 하 게 닮은 그들의 상대적으로 큰 크기 때문에 특별 한 중요성의 개인의 차원 셀21 , 22 , 23.는 GUVs의 사용 가능한 표면 영역에서는 막 공부 될 biophysical 속성에 로컬 화학 기온 변화도의 효과. 외부 자극에 막 표면의 일부만 노출 하 여 막 역학 수 더 면밀 하 게 조사. 예를 들어 GUVs의 표면에 화학 또는 pH 기온 변화도의 지역화 된 응용 프로그램 대량 노출24,25에서 관찰 되지 않는 했다 관 돌출의 형성에 이르게 표시 되었습니다. 막 행동에 관찰된 차이 개장 하는 세포 막의 메커니즘에 대 한 몇 가지 통찰력을 얻기 위해 단일 소포 심문 제도의 발전 방법에 대 한 호출 합니다.
Microinjection와 micromanipulation는 이른 1900 년대26,27,28 200023,단일 기 조작 체계의 최근 발전 관련의 방법에 따라 건물 이 기사는 막에서 리 모델링 및 우두머리 막에서 막 관 돌출 (MTPs)의 형성 칼슘 이온의 로컬 응용 프로그램에 대 한 응답에서 생성 됩니다 접근 제공.
우리의 접근 multilamellar 소포 (MLV)에 연결 하는 우두머리의 biomimetic 막 모델 시스템 (그림 1A)로 구성 된 복잡 한 소포를 이용 한다. MLV는 복잡 한 지질 자료 우두머리를 칼슘 이온 기온 변화도에 노출 동안에 공급을 위한 지질 저수지로 필요 합니다. 이 연결에는 개장 하는 유도 하는 동안 막 긴장의 증가 대 한 보상 및 우두머리 막의 전환 모양 MTP 성장을 위한 지질을 제공 하는 복잡 한 수 있습니다. 또한,는 MLV 용이 하 게 표면 동원 정지 질량은 큰 때문에 우두머리의 비교. 우두머리 MLV 단지, 고체 기판 위에 움직일 때 이전 나노튜브 소포 네트워크 생산, 폴리머 막 상호 작용을 공부 하 고 exocytosis29,30의 후반 단계를 흉내 낸에 대 한 사용 되었습니다. 31,,3233.
이전 프로토콜 활용 콩 극 지 지질 추출 (SPE) 우두머리 MLV 단지28준비 하. SPE PC (45.7%), PE (22.1%), phosphatidylinositol (PI, 18.4%), 포함 하는 인지질 혼합물 phosphatidic 산 (PA, 6.9%), 및 다른 지질 (6.9%)의 혼합으로 구성 됩니다. 여기 우리의 프로토콜 SPE 혼합물 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (나트륨 소금)의 20% 첨가 모방 세포 원형질 막의 내부 전단지 (훨씬 DOP). 추가 1%의 거 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-마약) 얼룩 지질 bilayer 막 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개장의 모니터링을 활성화 하는 데 사용 됩니다. GUVs는 bilayer에 걸쳐 대칭 지질 구성 있고 로컬로 5mm (CaCl2) 염화 칼슘의 농도에 노출 되는. 높은 칼슘 이온 농도와 같은 실험 조건 또한 어디 PS 분자 표현된34는 apoptotic 세포의 외부 막을 전단지를 모방. 우두머리 MLV 단지의 형성에 의해와 켈러35에 의해 처음 개발 된 수정된 재-탈수 방법의 사용을 해야 합니다. 기 준비 프로토콜 솔루션에서 작은 소포를 형성 하는 데 사용 하는 건조 지질 층의 형성을 포함 합니다. 이 솔루션은 다음 탈수 하며 최종 우두머리 MLV 복합물을 형성 하기 위하여 rehydrated. 그림 2A -D 일반적인 우두머리 MLV 복합물의 준비에 대 한 주요 단계를 보여 줍니다.
소포 준비 완료 하 고 복잡 한 소포 유리 기판에 움직일, 오픈 팁 유리 제 micropipette 통해 우두머리의 외부 전단에 적은 양의 칼슘 이온을 제공 microinjection 기술이 사용 됩니다. 팁에서 칼슘 솔루션의 흐름 막 개장 및 세대는 MTPs의 우두머리 막 표면에 지역화 된 칼슘 이온 그라디언트를 생성 합니다. 여 MTPs 칼슘 이온 소스에서 동쪽으로 향하게 하 고 우두머리 내부 성장. 이 MTP 형성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 직접 모니터링할 수 있습니다 및 디지털 카메라를 사용 하 여 기록. 그림 3 막 개장 생성을 위해 사용 하는 실험적인 체제를 보여준다. 이 프로토콜에서 MTPs (그림 2E , 그림 4)의 형성 대량 볼륨 조건에서 수행 하는 칼슘 이온 노출 실험 대조 결과 보여 줍니다. 대량 조건는 GUVs 파열 고 막 패치25유리 표면 관찰 될 수를 형성 한다.
칼슘 이온의 microinjection를 수행 하는 절차로 서 우두머리 MLV 복합물의 대형에 세부 사항 더,이 문서에 설명 되어 있습니다. 프로토콜은 주로 칼슘 이온 microinjection;에 초점을 맞춘합니다 그러나,이 방법은 공부 막 응답 다른 이온 또는 단백질에 로컬 노출 때문에 사용 하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한,는 소포의 구성 막 개장 과정 지질 구성 요소 역할을 분리 조정 될 수 있습니다. 제시 프로토콜 우두머리 MLV 단지를 생산 하기 위해 어떤 정교한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 재현성의 높은 수준에 의해 특징입니다.
생체 모방 셀 시스템의 이온, 단백질, 나노 입자 등 외부 자극에 노출 되 면 막 행동 연구에 대 한 허용. GUVs, 같은 모델, 자주 관 구조와 invaginations24,,4142,43의 형성을 포함 하는 그들의 모양을 조정 하 여 화학 환경에서 변경에 응답할 수 있습니다. .
이 문서는 MTPs 우두머리 표면에서 칼슘 이온의 지역화 된 주입 시 우두머리의 리 모델링을 통해 비접촉 방식으로 생성 하는 방식을 제공 합니다. 프로토콜의 방법으로 칼슘을 생성 하는 microinjection 기술을 채택 하 이온 그라디언트 우두머리에 가까운 형태로 MTPs 표면 셀 플라즈마 멤브레인, 또한 모방 우두머리 MLV 복잡 한 준비를 설명 합니다. 칼슘 이온 막 상호 작용 해결 이전 실험 연구의 대부분 대량으로 칼슘 이온 농도14,17지질 소포 노출. 실험 조건에 따라 같은 대량 노출 관 돌출 형성25와 다른 막 응답 될 수 있습니다.
우두머리 MLV 단지의 형성은 오히려 간단 하며만 회전 증발 기, 초음파 탕, 진공 desiccator 등 표준 실험실 장비. 아직도, 소포 준비 하는 동안 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 그것은 (2.3의 단계는 프로토콜) 완료 되는 소포의 탈수 및 건조 원형 지질 영화 포함 하는 작은 양의 소금 결정은 유리 커버 슬립의 표면에 형성 하는 것이 중요. 실험 중 기 솔루션의 취급 주의 신선한 HEPES 버퍼, 클로 프롬에 신선한 지질 재고 솔루션을 사용 하 여 필수적 이다 우두머리 MLV 단지의 성공적인 준비를 위해. 또한, 유리 커버 슬립 표면에 우두머리 MLV 단지의 안전한 첨부 파일은 micromanipulation 및 microinjection에 대 한 중요 합니다. 우두머리 MLV의 적절 한 접착을 확인 하려면, 복잡 한 (사출 흐름) 없이 micropipette 사용할 수 있습니다 우두머리 표면에 부드럽게 밀어. 단단히 준수 소포 직접적인 물리적 접촉 시 표면 슬라이드 하지 합니다. 실험은 몇 시간 동안 심문 수 있습니다 하는 오픈 버퍼 작은 물방울에서 수행 되기 때문에 증발으로 적용 해야 합니다. 버퍼 물방울에서 증발에 영향을 미칠 수 있는 소포는 불안정 삼투성 조건 변경 됩니다. 삼투성 조건에 복원 하려면 원래 볼륨을 복원 하려면 샘플에 순수한 물의 정기 추가 항상성에 시스템을 반환 합니다.
지질 막 구성, 수정할 때 그것은 중요는 MLV 막 재편 중 우두머리를 지질 자료를 전송 하기 위한 허용 하기 때문에 소포 우두머리 MLV 복잡 한 형태로 생산 됩니다. 이전 연구는 순수 지질와 SPE 혼합물의 구성 요소를 교체 하거나 5-30%, 콜레스테롤의 추가 또한 우두머리 MLV 복잡 한 대형28,44수 나타났습니다. 준비 된 GUVs의 대부분은 unilamellar45.
또한, 다른 divalent 양이온, 마그네슘 이온 등을 테스트 하는 경우는 MTPs 형성 무 겁 게 달려 있다 지질 혼합물에서 부정 청구 훨씬 DOP의 존재. 여 MTPs 훨씬 DOP, 하지 않고이 프로토콜에서 설명 하는 소포를 형성 하지 않는다. 또한, 칼륨과 나트륨, 등 여러차례 양이온 훨씬 DOP를 포함 하는 소포25에서도 MTPs의 형성 발생 하지 마십시오.
준비 및 조작은 GUVs의 중요 한 단계 이외에 microinjection 절차 동안 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 요인이 있다. 칼슘 이온의 성공적인 microinjection 무 겁 게 의존 하 고 제대로 작동 실험 당일 준비 micropipettes 유리. Micropipette 오작동을 일으킬 수 있는 몇 가지 요인이 있다. 일반적인 이유는 막힌된 팁 오프닝 이다. 소포 준비의 부산물 인 작은 지질 입자 솔루션에서 분산 하 고 그로 인하여 생성 한 막힘 micropipette 팁을 준수 하는 경향이. 피 펫 팁을 청소 최고의 소포 해결책에서 그것을 해제 하 고 다시 우두머리 표면 가까이 배치 하 여 이루어집니다. Microinjection 펌프의 분출 기능의 사용 대량 솔루션으로 칼슘 이온의 대규모 주입에 결과 때문에 피해 야 한다. 또한, 작은 기포는 micropipette 내부 침투 방지 적절 한 microinjection, 어떤 경우는 micropipette 새 것으로 교체 해야 합니다. 팁 파손 크게 팁 진동을 최소화 하기 위해 진동 방지 테이블에 실험적인 체제를 배치 하 여 최소화할 수 있습니다.
또한, 케어 최고의 시간 해결 이미지를 취득 하는 동안 photobleaching를 최소화 하기 위해 관측 계획을 선택할 때 주의가 필요 합니다. 넓은 필드 레이저 유도 형광 현미경 검사 법에 객관적인 제한 프로브 깊이에서 상대적으로 높은 이미지 수집 속도 대 한 허용 하기 때문에이 프로토콜에서 이용 되었다. 또한, 거꾸로 현미경의 사용 동시 microinjection 및 지질 소포 및 MTPs 관찰 할 수 있습니다.
제시 방법의 주요 한계 중 하나는 광범위 한 수동 작업의 충분 한 micromanipulation 기술을 요구 사항입니다. 복합물은 자발적인 붓기 과정을 통해 형성 된다, 때문에 GUVs와 MLVs의 크기를 제어할 수 없습니다. 또한,이 프로토콜 막 개장 관련 하 여 추가 정보를 수집 해야 할 수도 있습니다 준비 우두머리 MLV 단지의 막 장력의 제어에 대 한 허용 하지 않습니다. GUVs는 GUVs에서 사용할 수 있는 멤브레인을 활용 하 여 전적으로 달성 하는 건 불가 능할 것 이라고 어느 정도 MTPs의 실질적인 성장에 대 한 후자의 공급 지질 자료와 MLVs에 연결 됩니다. MLVs도 낮추는 우두머리 MLV 복잡 한44, micropipette 포부를 사용 하 여는 기의 장력을 제어 하는 시도 복잡 하 게는 내 모든 측면 표면 장력 변화에 기여. 이 우두머리 MLV-기반 모델 더 나은 모방 세포 막 구조 막 주름과 invaginations46같은 막 저수지에 연결 되어 있는 긴장 정권 낮은 긴장을 제공지 않습니다. 동시에 micropipette 포부 기술은 성공적으로 단일 GUVs에 막 장력 제어에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 Graber 외. 여 작품 제공 세부 막 관 invaginations 바인딩에 따라 단일 GUVs에서 칼슘 이온의 형성에 대량 조건에서 막에 다양 한 긴장 정권40에서. 마지막으로, 칼슘에 모두 로컬 및 대량 노출에서 막 행동의 비교는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다 표면에 막 접착의 향상 된 제어를 필요 합니다.
요약, 제안 된 기술 비접촉 식 막 개장 및 칼슘 이온 지역화 된 자극에 따라 MTPs의 형성 수 있습니다. 셀 blebs 같은 네이티브 생물 세포 막 합성 기 시스템에서 번역에이 방법 센터의 미래 응용 프로그램입니다. 제안된 된 방법 패치 클램프 또는 microelectrode amperometry 같은 다른 단일 셀 심문 제도와 통합 하거나 함께 수 지역화 전략31,,4748난방. 다른 이온 또는 분자의 효과 테스트 간단 하 고 단순히 관심의 분자와 칼슘 이온을 대체 하는 포함 한다. 또한, 복잡 한 합성 지질 소포 세포 재편 및 세포 막 역학의 감지와 관련 된 물리학의 우리의 이해를 확장 수 있습니다 막 횡단 단백질 막 기능화를 통해 생성 될 수 있다 화학 기온 변화도입니다. 마지막으로, 지질 막의 비접촉 식 자극 또한 고분자 소프트 문제 시스템, 새로운 비접촉 식 조작 플랫폼에 대 한 기초를 제공 하 고 번역 될 수 있습니다.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |