Summary
توضح هذه المقالة طرق محددة للحصول على كميات البيوكيميائية من المنظفات solubilized TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك. بروتوكولات مجتمعة توفر أدوات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية التي يمكن تكييفها لتيسير الدراسات الهيكلية والوظيفية لقنوات أيون الثدييات في بيئة تسيطر عليها غشاء.
Abstract
ترانسدوسي قنوات أيون طالبات المحفزات المتعددة بمختلف أنواعها في التغييرات في اللوستيريك؛ والتشكلات دينامية هذه تشكل تحديا لتحديد ولا تزال غير معروفة إلى حد كبير. مع التطورات الحديثة في واحد-الجسيمات cryo-إلكترون ذرف مجهرية (cryo-م) الضوء على السمات الهيكلية لمواقع ربط مؤثر وتفعيل إليه من عدة قنوات أيون، المسرح معداً لتحليل دينامية متعمقة بهم النابضة آليات استخدام النهج الطيفية. التقنيات الطيفية مثل الإلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) والرنين إلكترون إلكترون مزدوجة (الغزلان) اقتصرت أساسا على دراسة أيون بدائية القنوات التي يمكن تنقيته بكميات كبيرة. الحاجة إلى كميات كبيرة من البروتينات الوظيفية ومستقرة الغشاء أعاق دراسة قنوات أيون الثدييات باستخدام هذه النهج. تقدم الجيش الشعبي الثوري والغزلان العديد من المزايا، بما في ذلك تصميم الهيكل والتغيرات الدينامية لمناطق البروتين المتنقلة، أن كان ذلك بدقة منخفضة، التي قد يكون من الصعب الحصول على البلورات بالأشعة السينية أو البرد-م، ورصد النابضة عكسها مرحلة انتقالية (أي، مغلقة ومفتوحة، توعية، والمتفجرات). هنا، يمكننا توفير بروتوكولات للحصول على ملليغرام من مستقبلات عابر الوظيفية solubilized المنظفات الموجبة قناة الفصيلية الخامس العضو المحتمل 1 (TRPV1) التي يمكن أن يكون المسمى للتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري والغزلان.
Introduction
مع التطورات الحديثة في البرد الجسيمات أحادية الإلكترون مجهرية (cryo-م)، تم الحصول على هياكل قناة أيون الثدييات بمعدل غير عادي. وخاصة الدراسات الهيكلية لطالبات أيون قنوات، مثل فانيلويد المحتملة مستقبلات عابر 1 (TRPV1)، قد وفرت كذلك التفاهم على تفعيل آليات1،2،3، 4 , 5-المعلومات الحيوية حول قنوات أيون جزءا لا يتجزأ من بيئة غشاء غير المطلوبة لفهم آليات النابضة والمخدرات-ملزمة بها طالبات.
قدمت الإلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) والكترون إلكترون مزدوجة الرنين (الغزلان) سبيكتروسكوبيس بعض النماذج آليا إلى نهائي آخر لايون قنوات6،7،،من89 , 10 , 11 , 12 , 13-هذه النهج اقتصرت أساسا على دراسة بدائية وأيون أرتشيال القنوات التي تسفر عن كمية كبيرة من المنظفات تنقية البروتينات عند أوفيريكسبريسيد في البكتيريا. مع تطور إنتاج البروتينات الغشاء حقيقية النواة في خلايا الثدييات للتوصيف الوظيفي والهيكلي14،،من1516والحشرات، من الممكن الآن الحصول على الكيمياء الحيوية كميات من المنظفات تنقية البروتينات للدراسات الطيفية.
تنشأ إشارات الجيش الشعبي الثوري والغزلان من تسمية باراماجنيتيكسبين (SL) (أي، ميثانيثيوسولفوناتي) يعلق على بقايا واحد-سيستين في البروتين. زيادة ونقصان-التسميات التقرير ثلاثة أنواع من المعلومات الهيكلية: الحركة، ووصول، والمسافات. تسمح هذه المعلومات في تحديد ما إذا كانت بقايا مدفونة داخل البروتين، أو يتعرضون للغشاء أو البيئة المائية في الاشتقاق والدول المتجهة يجند13،17،،من1819. في سياق بنية عالية الدقة (عند توفرها)، توفر بيانات الجيش الشعبي الثوري والغزلان مجموعة من القيود لاشتقاق نماذج ديناميكية في بيئتها الأصلية بينما رصد انتقال النابضة عكسها (أي، مغلقة ومفتوحة، توعية، والمتفجرات). وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على مرونة المناطق التي قد يكون من الصعب تحديد من البلورات بالأشعة السينية أو البرد-م باستخدام مجموعات البيانات البيئية هذه لتعيين الهياكل الثانوية، فضلا عن موقع داخل البروتين20. Cryo-م الهياكل التي تم الحصول عليها في دهن نانوديسكس توفر معلومات قيمة حول النابضة أيون القنوات3،،من2122،،من2324، 25؛ ومع ذلك، يمكن أن توفر النهج الطيفية المعلومات الحيوية من الدول كونفورماشونال (مثلاً، التغيرات الحرارية) التي قد يكون من الصعب تحديد استخدام cryo-م.
العديد من الصعوبات التي يجب التغلب عليها لتنفيذ الجيش الشعبي الثوري والغزلان، بما في ذلك عدم وجود وظيفة البروتين عند إزالة جميع مخلفات سيستين (خصوصا وفيرة في القنوات الثديية)، البروتين منخفضة الغلة، وعدم الاستقرار البروتين خلال تنقية وبعد وضع العلامات تدور ، وتجميع البروتين في المنظفات أو الدهنية. وهنا، لقد قمنا بتصميم بروتوكولات للتغلب على هذه الحواجز الهامة وحصلوا على معلومات الأطياف الغزلان والجيش الثوري الشعبي لمستقبلات حسية الثدييات. والغرض هنا وصف منهجيات للتعبير، وتنقية، وضع العلامات، وإعادة تشكيل فأر سيستين-أقل حد أدنى وظيفية TRPV1 (eTRPV1) بناء على تحليلات spectroscopic. هذه المنهجية تعتبر مناسبة لتلك البروتينات الغشاء أن الحفاظ على وظيفتها وعلى الرغم من إزالة بقايا السيستين أو التي تحتوي على سيستين تشكيل ثنائي كبريتيد-السندات. يمكن تكييف هذه مجموعة من البروتوكولات لتحليل spectroscopic قنوات أيون الثدييات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-TRPV1 الطفرات
ملاحظة: بنيت بناء TRPV1 الحد أدنى لتحليل spectroscopic26 من قناة سيستين-أقل طول TRPV127 استخدام الأسلوب بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) (الشكل 1). هذا البناء TRPV1 الحد الأدنى أقل سيستين (يشار إلى eTRPV1 الآخرة) يتكون من بقايا 110-603 و 627-764. تم استنساخ eTRPV1 في مكتب إدارة المشاريع (ناقل على أساس pcDNA3.1) للتحليل الوظيفي و ناقلات مانحة المؤتلف28 التي تحتوي على 8 × الحامض الأميني-المالتوز-ملزمة البروتين (MBP)-التبغ أحفر الفيروس (الإجمالية) للتعبير وتنقية (الشكل 2A). eTRPV1 واحد–سيستئين طفرات تم إنشاؤها باستخدام الطفرات الموجهة من الموقع. تسلسلات المتجهات والقناة المحددة في التكميلية ملف 1: "أساليب تكميلية".
- تصميم كبسولة تفجير الطفرات مع أدوات الإنترنت29.
- خلط في أنبوب 0.2 مل: 5 ميكروليتر من 10 x رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من مزيج دنتب (100 ملم)، ميكروليتر 1 من كل 10 ميكرومترات إلى الأمام وعكس النوكليوتيد، ميكروليتر 1 100 نانوغرام/ميكروليتر eTRPV1 قالب الحمض النووي26، 1.5 ميكروليتر من [دمس]، 1 ميكروليتر من الطفرات الإنزيم ، و 38.5 ميكروليتر من المياه. تدور الخليط قبل وضع الأنابيب في ثيرموسيكلير.
- تؤدي الطفرات PCR.
- أداء (أ) تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، (ب) تمسخ عند 95 درجة مئوية 20 s، (ج) الصلب عند 60 درجة مئوية ل 10 s، و (د) استطالة عند 68 درجة مئوية لمدة دقيقة 4 (30 ثانية لكل 1 كيلو بايت). كرر الخطوات b إلى د دورات 18، ثم تؤدي استطالة عند 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والحفاظ على رد الفعل في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- إضافة 2 ميكروليتر من Dpnأنا الإنزيم إلى رد فعل؛ خلط واحتضان ثم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إجراء التحويل
- ذوبان الجليد كولاي الخلايا المختصة على الجليد.
- ليبرد قبل 14 مل أنبوبة معقمة، إضافة ميكروليتر 75 من الخلايا المختصة و 10 ميكروليتر Dpnأنا-يعامل مزيج PCR. المزيج بلطف.
- تبني رد فعل على الجليد للحد الأدنى 30 المحافظة على الأنبوب في 42 درجة مئوية ل 45 s وثم ضعه مباشرة في الجليد للحد الأدنى 2 لوحة المخلوط في مرق لوريا (رطل)-لوحة أجار تحتوي على كاربينيسيلين (0.2 مغ/مل). احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- حصاد المستعمرات واحدة على الأقل ثلاثة من اللوحة وتطعيم كل في 4 مل رطل التي تحتوي على كاربينيسيلين (0.2 مغ/مل) باستخدام أنبوب معقم 14 مل. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ويهز 250 لفة في الدقيقة.
- تدور أسفل الثقافات بين عشية وضحاها في س 8,000 ز لمدة 10 دقائق، واستخراج الحمض النووي اتباع تعليمات مجموعات الإعداد المصغر المتاحة تجارياً.
- التحقق من وجود طفرات واحدة-سيستين بتسلسل الحمض النووي التلقائي القياسي (انظر الجدول للمواد).
2. الوظيفية تحليل eTRPV1 وطفرات واحدة-سيستين
-
تعداء خط خلية HEK293 30
- الثقافة الخلايا HEK293 في 6-لوحات جيدا في 2 مل من السكر عالية المتوسطة (دميم) كل بئر (37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2، 95% رطوبة). إعداد الخلايا HEK293 \u2012 70 80% روافد.
- إعداد الخليط تعداء في أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي 1.5 مل منفصلة اثنين.
- لرد فعل A، إضافة 0.5 ميكروغرام eTRPV1 أو سيستين المحتوية على المسخ مكتب إدارة المشاريع إلى 250 ميليلتر من الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (مثل MEM غروب). لرد فعل ب، إضافة 3 ميليلتر من تعداء الكاشف إلى 250 ميليلتر من المتوسطة الأساسية الحد الأدنى. احتضان كل رد فعل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- مزيج من ردود الفعل A و B مع ماصة 1 مل. احتضان هذا الخليط لمدة 45 دقيقة في الرايت
- إزالة 500 ميليلتر من وسائط الثقافة من روافد 70-80% جيدا وإضافة 500 ميليلتر من خليط رد فعل. تخزين لوحات بين عشية وضحاها ل Ca2 + التصوير (5% CO2، 37 درجة مئوية ورطوبة 95%).
-
Ca2 + التصوير في الخلايا HEK293 30
- كوفيرسليبس الزجاج قطره 12 ملم مع الإيثانول والمياه النظيفة ووضعها في لوحة 24-جيدا.
- إضافة ميليلتر 75 من بولي-l-يسين في وسط كل ساترة وتخزين اللوحة لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية، 5% CO2، 95% رطوبة).
- إزالة كوفيرسليبس بولي-l-يسين والغسيل الزائد ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة أي بقايا.
- بمجرد كوفيرسليبس على استعداد، المضي قدما لفصل الخلايا من لوحة 6-جيدا.
- قم بإزالة الوسائط وإضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الحارة (37 درجة مئوية) للغسيل.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميليلتر من التربسين، واحتضان لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 500 ميليلتر الحارة وسائط الثقافة (37 درجة مئوية) التوقف عن رد فعل الهضم وخلط مع الماصة؛ تجنب تشكيل الفقاعات. إذا لزم الأمر، قم بضبط تركيز خلية تمييع هذا استثارة مع أكثر ثقافة الإعلام.
- البذور 250 ميليلتر transfected الخلايا HEK293 (روافد 70%) بالإضافة إلى 250 ميليلتر من ثقافة وسائل الإعلام (500 ميليلتر الحجم النهائي للبئر الواحد) في كوفيرسليبس ما قبل المعالجة والسماح لهم يستقر (للحجز) ح 1-2 في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، 95% رطوبة).
- وفي الوقت نفسه، تعد حل تحميل عن طريق إضافة حمض pluronic 0.02 في المائة و 1 ميكرومتر فلوو-4-صباحا إلى المخزن المؤقت المسابقة. مزيج الحل جيد.
- قم بإزالة وسائط الثقافة HEK293 من البئر وإضافة 500 ميليلتر من تحميل الحل. احتضان خلايا ح 1 (37 درجة مئوية، 5% CO2، 95% رطوبة). تغسل الخلايا فلوو-4-تحميل مرتين مع المخزن المؤقت في المسابقة الدافئة.
- ضع ساترة مع الخلايا المحملة في طبق بتري 10 ملم في مرحلة مجهر (باستخدام 10 X الهدف؛ 494 نانومتر الإثارة و 506 نانومتر الانبعاثات) القيام داخل الخلية Ca2 + القياسات.
- قياس التغيرات في كثافة الأسفار بعد بيرفوسينج يغاندس كل منها (مثلاً، 10 ميكرومترات كبخاخات) باستخدام البرمجيات المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
-
مرناً وإعداد بويضات ليفيس النمو 30
- لينيريزي eTRPV1 وواحد-سيستين المحتوية على طفرات مكتب إدارة المشاريع مع Pmeأنا ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. تنظيف الحمض النووي اتباع تعليمات مجموعات تنقية المتاحة تجارياً.
- استخدام خطيا وتنظيفها بالسلطات الوطنية المعينة لتجميع الكشف توج مع مجموعة متاحة تجارياً متوافقة مع بوليميريز الحمض النووي الريبي T7.
- تنظيف توج الكشف وفقا لمجموعات تنقية المتاحة تجارياً. تحديد مقدار الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص في 260 من الطول الموجي نانومتر.
- نقل 5 \u2012 10 مل بويضات X. laevis (متاح تجارياً) في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على 20 مل من محلول ND96 (96 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 5 ملم حبيس، 1 مم مجكل2؛ ودرجة الحموضة 7.4) مع كولاجيناز 1 ملغ/مل ونوتات لمدة 50 دقيقة في الرايت
- شطف بويضات في ND96 حتى يتم الحل واضح؛ إضافة كولاجيناز الطازجة وهزه لمدة 30 دقيقة في دراسة الرايت بويضات تحت مجهر ستيريو ووقف الهضم عند الطبقة الخارجية الحبيبي (طبقة لامعة مع الأوعية الدموية الحمراء) غير موجودة في معظم بويضات (90 في المائة). شطف بويضات في ND96 حتى يتم الحل واضح.
- نقل بويضات لأنبوب البوليستيرين 50 مل مع ND96 بالإضافة إلى 1 مم كاكل2 ويهز لبويضات يهضم تحت حاء 1 سوف تتمسك بالانبوب البوليستيرين.
- أغسل بويضات مع ND96 بالإضافة إلى 1 مم حل كاكل2 والملحق مع 50 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين و 50 ميكروغرام/مل من التتراسيكلين.
ملاحظة: حماية الحلول التي تحتوي على التتراسيكلين من التعرض للضوء. - حدد بويضات كبيرة دون الأغشية التالفة وعرض فصل واضح بين الحيوانات والخضروات القطبين. واسمحوا بويضات استرداد لح 4 قبل microinjection في 16 درجة مئوية.
- استخدام الماصات الزجاجية (نقلت: 1.11 مم، الهوية: 0.5، وطول 8.8 سم) 1-5 نانوغرام من مرناً من طفرات eTRPV1 وواحد-سيستين بحقن بويضات باستخدام نظام نانولتر-حاقن (46 nL/s) ومجهر ستيريو (2 X التكبير). تخزين بويضات في 16 درجة مئوية في ND96 وتستكمل مع كاكل2 والمضادات الحيوية (مع الجنتامايسين/التتراسيكلين 1 x).
- بعد 72 ساعة، قياس العيانية الحالية استخدام نظام اكتساب جهد الكهربائي اثنين المشبك (تيفك)31.
- سحب البورسليكات الزجاج الماصات (0.3 MΩ) وشغل لهم مع 3 م بوكل.
- ضع البويضات في قاعة تسجيل استخدام ماصة نقل ونتخلل الحل حمام (120 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم بوكل، 2 مم مجكل2، 1 عطا، و 10 ملم حبيس الحل؛ الرقم الهيدروجيني 7.4) على سرعة منخفضة.
- تزج كل أقطاب في حمام الحل لضبط هذه الإزاحات ماصة. ادفع برفق أقطاب ماصة (البورسليكات الزجاج الماصات؛ نقلت: 1.5 ملم، الهوية: 1.10، وطول 10 سم) في البويضات حتى يحتفل المسافة بادئة صغيرة تحت مجهر ستيريو (2 X التكبير)، فضلا عن تغيير في غشاء المحتملة.
- تغيير إعدادات مكبر للصوت لتسجيل وضع وقياس التيارات العيانية أثناء تطبيق منحدر المشبك جهد من-80 إلى + 80 أم لتحميل س. 1 نظام التروية مع الحل المستخدم في الخطوة 2.3.12 على درجة الحموضة 7.4 (كعنصر تحكم) وعلى درجة الحموضة 5 للتحقق من نشاط eTRPV1.
3-توليد المؤتلف باكميد وباكولوفيروس للتعبير البروتين
-
باكميد
- تحويل 100 ميكروليتر من الخلايا المختصة DH10Bac كولاي مع 7.5 نغ ناقل الماشوب المانحين التي تحتوي على eTRPV1 و/أو واحد-سيستين طفرات.
- إضافة 900 ميكروليتر من وسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب (20 ملغ/مل تريبتوني، 5 ملغ/مل الخميرة استخراج، 2.5 ملم بوكل، 10 مم مجكل2، 10 مم MgSO4، والجلوكوز 20 مم) واحتضانها ح 6-7 في 37 درجة مئوية و 225 لفة في الدقيقة.
- البذور 100 ميليلتر مباشرة من الخليط، وبتخفيف المسلسل (1/10 و 1/100)، وفي لوحات رطل-أجار تحتوي على 100 ميكروغرام/مل س-غال، 40 ميكروغرام/مل إيبتج، 7 ميكروغرام/مل الجنتاميسين، 10 ميكروغرام/مل التتراسيكلين وكاناميسين 50 ميكروغرام/مل. احتضان اللوحات لمالا يقل عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- حدد أبيض المستعمرات التي 2 ملم في القطر، حيث تفتقر إلى المستعمرات الزرقاء إدراج الاهتمام. استخدام مجهر ستيريو للتحقق من أن مستعمرات بيضاء لا تحتوي على أي بقع زرقاء.
- حصاد المستعمرات واحدة على الأقل ثلاثة وتحويلها إلى أنبوب 14 مل عقيمة التي تحتوي على 4 مل الإعلام رطل وتستكمل مع 7 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 10 ميكروغرام/مل التتراسيكلين و 50 ميكروغرام/مل كاناميسين. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها (ح ~ 16) عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.
- تأخذ 1.5 مل الثقافات بين عشية وضحاها وعزل باكميد المؤتلف الحمض النووي (راجع 1 ملف تكميلي للبروتوكول مفصلاً). تخزين باكميد عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
ملاحظة: إعداد أرصدة والغليسيرول DH10Bac كولاي التي تحتوي على باكميد الحمض النووي. أخذ 300 ميكروليتر من الثقافة وإضافة 200 ميكروليتر من الجلسرين على 50% (تركيز والغليسيرول النهائي من 20%). تخزين قاسمة في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. - التحقق من وجود eTRPV1 في باكميد المؤتلف باستخدام PCR (الرجوع إلى 1 ملف تكميلي للبروتوكول مفصلاً).
-
باكولوفيروس
ملاحظة: لهذا الإجراء، ترانسفيكت الخلايا Sf9 الحشرات في شكل 6-جيدا. وترد جميع المبالغ ووحدات التخزين على أساس كل بئر. تجنب استخدام المضادات الحيوية.- لوحة 1 × 106 Sf9 الخلايا في 2 مل من خلية الحشرات وسائل الإعلام. السماح للخلايا إرفاق لمدة 45 دقيقة على الأقل.
- تمييع 1 ميكروغرام من باكميد الحمض النووي المؤتلف في 100 ميكروليتر من خلية الحشرات وسائل الإعلام. المزيج بلطف.
- تمييع ميكروليتر 6 من تعداء كاشف (TR) في 100 ميكروليتر من خلية الحشرات وسائل الإعلام. المزيج بلطف.
- الجمع بين الحلول الحمض النووي و TR (من خطوات 3.2.2 و 3.2.3، على التوالي). المزيج بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
- إضافة 0.8 مل الإعلام خلية الحشرات إلى خليط الحمض النووي/TR؛ المزيج بلطف.
- قم بإزالة الوسائط الحشرات خلية من الخلايا Sf9 ويغسل مرة واحدة مع 1 مل متوسطة جديدة.
- إزالة المتوسطة الغسيل وإضافة خليط الحمض النووي/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) إلى الخلايا. احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية ح 5 (بدون الانفعالات).
- إزالة الخليط تعداء واستبدال مع 2 مل وسائط الحشرات الخلية التي تحتوي على 0.5% مصل بقرى الجنين (FBS). احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية لمدة خمسة أيام.
تنبيه: منع تبخر خلية الإعلام بسد الآبار فارغة مع وسائط الإعلام، وتغطي لوحة 6-جيدا مع اثنين من طبقات من الفيلم البارافين. - نقل وسائل الإعلام ثقافة الخلية في أنبوب الطرد 15 مل. عزل بمرور أول (P1) من الأسهم الفيروسية بالغزل الأنبوب في 8,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي نظيفة 15 مل وتخزينها مباشرة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: حماية الفيروس من التعرض للضوء بتغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم. - للجيل الثاني (P2) من الأسهم الفيروسية، وضع ثقافة تعليق 25 مل من الحشرات خلية الإعلام في 1 × 106 Sf9 خلايا/مل يحتوي على 2% FBS في قارورة 125 مل (سهل القاع والتهوية). إضافة 25 ميكروليتر من الفيروس P1 إلى ثقافة 25 مل.
- احتضان ثقافة عند 27 درجة مئوية ح 72.
- حصاد الأسهم الفيروسية P2، نقل الثقافة إلى أنبوب 50 مل جديدة والطرد المركزي أنه في 8,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب 50 مل جديدة وتخزينها مباشرة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: حماية الفيروس من التعرض للضوء بتغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم. إجراء تجربة صغيرة الحجم تيتراتي نسبة الفيروس/Sf9 P2 للأمثل TRPV1 التعبير (الرجوع إلى 1 ملف تكميلي لبروتوكول مفصل، القسم 4 بعنوان "تجربة صغيرة للفيروسات P2.") - بالنسبة للتعبير البروتين على نطاق واسع، وتعيين ثقافة تعليق خلية Sf9 1-L في 2 × 106 خلايا/مل في وسائل الإعلام خلية الحشرات وتستكمل مع 0.5% FBS في قارورة زجاج البورسليكات 2.8-L.
- أضف 1 مل مخزون فيروس P2 إلى ثقافة 1-L واحتضان أنه عند 27 درجة مئوية ح 72.
ملاحظة: اليوم الثالث، يجب أن تكون كثافة الخلية على 1.5 إلى 2.5 × 10 تقريبا6 خلايا/مل.
4-eTRPV1 و "تنقية المسخ" واحد-سيستين
- أغشية العزل28
- حصاد الثقافة تعليق خلية الحشرات 1-L بالغزل في س 4,500 ز، 4 درجة مئوية، عن 20 دقيقة تزن بيليه الخلية (فإنه من المتوقع أن يكون حوالي 6-9 ز).
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 25 مل من المخزن المؤقت المثلج A (السكروز 36.5 مم، 2 مم tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب)، و 50 ملم تريس؛ الرقم الهيدروجيني 7.4) حضور مثبطات البروتياز (1 مم فينيلميثيل فلوريد السلفونيل (بمسف)، 3 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، 3 ميكروغرام/مل أبروتينين ، و 1 ميكروغرام/مل بيبستاتين). تفصيل كتل الخلية الحصول على تعليق متجانسة وتدوير عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تقسيم الخلايا باستخدام دليل (دونس الأنسجة المطحنة) أو الخالطون الضغط العالي. إزالة الأنقاض الخلية باستخدام الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الاحتفاظ بتفكيك الخلايا وأنابيب على الجليد خلال العملية برمتها. - جمع المادة طافية وأجهزة الطرد المركزي في 100,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الغشاء في إجمالي حجم 20 مل من المثلج "المخزن المؤقت ب" (150 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪، 2 مم تسيب، 50 مم حبيس؛ ودرجة الحموضة 7.4)، وتستكمل مع مثبطات البروتياز (كما هو الحال في الخطوة 4.1.2).
- الكوة مل 20 تعليق الغشاء في أنابيب 50 مل وفلاش-التجميد في النيتروجين السائل. تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- تنقية البروتين26،28
- ذوبان الجليد مختبرين غشاء على الجليد وأضف 3 مل من n-دوسيسيل-β-د-مالتوبيرانوسيدي (DDM) كل أنبوب (الأسهم 200 ملم). تدوير الأنبوب ح 2 في 4 درجات مئوية.
- الطرد المركزي العينة في 100,000 ز س لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية وإضافة 1 مل راتنج اميلوز رطبة نظيفة. تدوير الخليط ح 2 في 4 درجات مئوية. تحميل خليط البروتين/اميلوز في خطورة تدفق كروماتوغرافيا الأعمدة.
تنبيه: لا تسمح الراتنج لتجف خلال يغسل. - أغسل الراتنج اميلوز البروتين زمنياً مع 10 مرات حجم السرير المثلج "ج المخزن المؤقت" (150 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪، 50 مم حبيس، 0.5 مم DDM، 0.1 ميكروغرام/مل أسوليكتين، 0.5 مم تسيب؛ الرقم الهيدروجيني 7.4). يغسل مع 10 سرير كميات من الجليد "د المخزن المؤقت" (150 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10 ٪، 50 مم حبيس، 0.5 مم DDM، 0.1 ميكروغرام/مل أسوليكتين، ودرجة الحموضة 7.4).
ملاحظة: قبل الغسيل، ديغا "د المخزن المؤقت" دون المنظفات أو الدهون، تطهير مع النيتروجين. تضاف بعد degasification، DDM وأسوليكتين. - الوت البروتين eTRPV1 مع كسور 0.5 مل، ما يصل إلى 5 مل من المثلج يطرد د المخزن المؤقت، وتستكمل مع مالتوس 20 مم. إذا كان ذلك ممكناً، إجراء غسيل وشطف في 4 درجات مئوية.
- تحديد مقدار البروتين عن طريق قياس امتصاص في 280 الطول الموجي نانومتر.
ملاحظة: هذا البروتوكول غلة 0.5 إلى 1.0 ملغ بروتين للتر الواحد للثقافة. يمكن أن تختلف البروتين الغلة لكل متحولة واحدة-سيستين eTRPV1. لتجارب الجيش الشعبي الثوري والغزلان، تنمو \u2012 4 ل 6 من الثقافة.
5-eTRPV1 واحد-سيستين تدور وسم Mutant Site-Directed
- تركز وحدة الطرد مركزي عامل تصفية باستخدام الكسور التي تحتوي على eTRPV1 (استقطاع = 100 كاتشين) \u2012 يصل إلى 2 2.5 ملغ/مل لوسم (دورات 7,000 س ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية).
- إضافة الزائدة إذ مولى (3 مرات، كل 30 دقيقة) الميثيل (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) ميثانيثيوسولفوناتي (متسل) تدور التسمية من حل أسهم 100 ملم في [دمس] للبروتين تتركز (مونومر eTRPV1: متسل في 01:10 نسبة المولى) 17-تبقى رد فعل في الظلام في RT ل 1 ساعة و 30 دقيقة، تليها الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن إزالة MBP عن طريق إضافة حوزتي TEV خلال الاحتضان وسم تدور بين عشية وضحاها. - تحميل eTRPV1 المسمى تدور حول حجم استبعاد لوني لعمود اكويليبراتيد في "المخزن المؤقت ه" (150 مم كلوريد الصوديوم، 20 مم حبيس، 0.5 مم DDM؛ ودرجة الحموضة 7.4)، يسيطر عليها نظام بروتين سريعة لوني سائل (فبلك). جمع الكسور التي تحتوي على تيترامير eTRPV1.
ملاحظة: لا تشمل والغليسيرول 10% في هذه الخطوة، كما أنه يقلل من كفاءة إعادة تشكيل. - تحديد مقدار البروتين عن طريق قياس امتصاص في 280 الطول الموجي نانومتر.
- تقييم نقاء العينة التي يشغل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام (جل خالية من وصمة عار، \u2012 4 20%). النموذج جاهز الآن للقياسات الطيفية في الحل و/أو بروتيوليبوسوميس.
6-eTRPV1 المسمى تدور واحد تشكيل المسخ سيستين
- جاف 10 مغ أسوليكتين استخدام مبخر دوراني تحت الفراغ (دي وان زيرو زيرو [مبر]) لح 1 عند 40 درجة مئوية. لجعل أسوليكتين الدهنية، أضف 1 مل من "المخزن المؤقت و" (200 ملم كلوريد الصوديوم، والمماسح 5 مم؛ ودرجة الحموضة 7.4) و sonicate الخليط لمدة 15 دقيقة أو حتى تصبح العينة متجانسة.
- زعزعة الاستقرار في الدهنية بإضافة DDM بتركيز نهائي 2 مم، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
- التركيز البروتين المسمى في 2 مغ/مل وإضافته إلى الدهنية استخدام نسبة بروتين/دهن 1:5 (الكتلة: الكتلة).
تنبيه: من المهم أن تبقى تركيزات البروتين المذكورة آنفا، حيث يقلل كفاءة وسم تدور تركيزات منخفضة وعالية قد يعجل بالبروتين. - إضافة "و المخزن المؤقت" ضبط خليط البروتين/الحويصلية لتركيز الحرجة مذيل DDM (CMC) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الانفعالات لطيف.
- مضاعفة حجم خليط البروتين/الحويصلية "و المخزن المؤقت" وإزالة المنظفات بالتتابع إضافة مختبرين ثلاثة من حبات الإدمصاص البوليسترين nonpolar (30 ملغ، 50 ملغ و 80 ملغ) على فترات 1-ح مع الانفعالات لطيف في الرايت
- تحميل المخلوط على عامل تصفية عمود (عمود كروماتوغرافيا تدفق الجاذبية) لإزالة الخرز ونقل الخليط بروتيوليبوسوميس إلى أنبوب ultracentrifuge. الطرد المركزي في العينات من 100,000 ز س ح 1 في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 30 ميكروليتر من المخزن المؤقت f.
ملاحظة: نماذج جاهزة لتحليل سبيكتروسكوبيك وحقن في بويضات النمو . إذا كان لا يمكن استخدام العينات في نفس اليوم، فلاش تجميد لهم في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية. - بروتيوليبوسوميس--النمو البويضيه الكهربية26،32
- حقن 50 nL لتخفيف مختلفة من بروتيوليبوسوميس المسمى تدور في بويضات النمو كما هو موضح في القسم 2-2.
- إجراء قياسات تيفك بعد 12 ساعة حقن كما هو موضح في المقطع 2.3.10.
- المضي قدما لإجراء القياسات الطيفية والتحليل (القسم 7).
7-الغزلان وسبيكتروسكوبيس الجيش الشعبي الثوري
-
مطيافية إلكترون إلكترون مزدوجة الرنين (الغزلان).
- إجراء قياسات الغزلان في نابض مطياف الجيش الثوري الشعبي تعمل على تردد الموجات Q (34 جيجا هرتز) ومزودة مكبر للصوت 10-ث مع تسلسل أربعة--نبض الحر الميت-الوقت في 83° استخدام البرمجيات التي توفرها الشركة المصنعة33.
- الملحق 50 ميكرون تنقية المنظفات eTRPV1 المسمى تدور سيستين طفرات في "المخزن المؤقت ه" (الخطوة 5، 5) مع الجلسرين 30% (v/v) للحماية من البرد.
- تحميل العينة في الأنبوبة الشعرية الكوارتز مختومة وتدور على الجزء السفلي من الأنبوب بالطرد المركزي ذات سرعة منخفضة قصيرة (100 x ز).
- ضع الأنبوبة الشعرية في النتروجين السائل لتجميد العينة. ويمكن تخزين العينات عند هذه النقطة في-80 درجة مئوية لقياسات في وقت لاحق.
- وضع العينة مباشرة إلى جهاز رنان الموجات الدقيقة والسماح لها بإعادة توازن في درجة-83 ل 10 \u2012 20 دقيقة.
- قياس العينة استخدام أربعة--نبض الغزلان بروتوكول قياسي، mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – mw1 – τ2 – صدى (π)34. هي أطوال نبض mw1 (π/2) و mw1 (π) ns 10 و 20، على التوالي، و 40 ns ل mw2 (π). تعيين فصل التردد 63 ميجا هرتز.
ملاحظة: يمكن تحليل البيانات الاضمحلال الغزلان الأولية مع الصنع برمجيات (مثلاً في Matlab) التي يفترض مبلغاً من توزيعات الضبابي لوصف المسافات بين زيادة ونقصان تسميات19،35.
-
كونتينووسوافي الجيش الشعبي الثوري (CW) التحليل الطيفي
- إجراء تجارب الأسلحة الكيميائية الجيش الشعبي الثوري في RT على مطياف إكس-باند (9.6 GHz) استخدام برنامج الشركة المصنعة.
- بدء الصك عن طريق تشغيل وحدة تبريد المياه، ووحدة التحكم، والتيار الكهربائي المغناطيس. توصيل البرنامج للصك، ووضع الصك في تناغم والانتظار 30 دقيقة على الأقل لهذا الصك الدفء.
- تحميل 20 ميكروليتر من العينة من الخطوة 5، 5 إلى 25 ميليلتر زجاج أنبوبة شعرية استخدام عمل الشعرية وختم نهاية الأنبوب مع تسرب.
- تحميل الأنبوبة الشعرية في تجويف الميكروويف ونقديا زوجين جهاز رنان أما تلقائياً أو يدوياً باستخدام الدالة التلقائي اللحن من البرنامج.
- جمع الأطياف المشتقة الأولى تحت شروط الصك القياسية: 100 كيلوهرتز الموجات التحوير وتعديل الحقل المغناطيسي ز 1.6 10 ميغاواط الميكروويف السلطة.
- لتحليل البيانات وعرضها، تصحيح الأطياف على الخلفية وتطبيع لهم عن طريق قسمة قيمة الذروة إلى الذروة متكاملة مزدوجة الأطياف.
- تحديد حركة الدوران-التسمية بقياس معكوس عرض الخط الوسطى من مشتقات امتصاص الأطياف (ΔHس-1) الأولى36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توصيف وظيفي الحد الأدنى أقل سيستين TRPV1 بناء (eTRPV1) وطفرات واحدة-سيستين
هو الخطوة الأولى نحو الدراسات الطيفية مهندس وتوصيف نيات بروتين سيستئين-أقل (الشكل 2A) التي هي وظيفية وتسفر عن البيوكيميائية كميات من البروتينات. eTRPV1 وظيفية كما تحددها Ca2 + تصوير وتيفك (الشكل 2-ج). وعلاوة على ذلك، يوفر eTRPV1 كميات كافية من البروتين المنظفات المنقي لتجارب الجيش الشعبي الثوري والغزلان (0.5-1 ملغ للتر الواحد من الخلايا Sf9)26. إدخال واحد سيستينيس في مناطق معينة من البروتين قد يؤثر على وظيفتها. الشكل 2B يعرض بعض الأمثلة لطفرات واحدة-سيستين (E651C و A702C) في eTRPV1 التي تتصرف مثل نوع البرية (WT)، نظراً لقوتها fluorescence يزيد عند إضافة مؤثر TRPV1 (مثلاً، كبخاخات) إلى HEK293 التي تحتوي على eTRPV1 الخلايا، كما هو موضح من قبل Ca2 + التصوير26. من ناحية أخرى، A680C هو مثال نموذجي متحولة سيستين غير الوظيفية، كما الأسفار يتم تمييزه عن الخلفية. وقد استبعد المسخ A680C لمزيد من التحليل. بعد Ca2 + تصوير التجارب، هو اختبار وظيفة واحدة-سيستين طفرات استخدام المشبك تيفك أو التصحيح لتقييم الخصائص الفيزيائية الحيوية الخاصة بهم. ويبين الشكل 2 أن الخص طفرات تصحيح إلى الخارج مميزة من TRPV1 عند الطعن مع الأس الهيدروجيني 5، حسبما يقرره تيفك26. تحليل وظيفي من طفرات واحدة-سيستين هو الحاجز الأول قبل القيام بالتعبير وتنقية البروتوكولات.
توصيف البيوكيميائية eTRPV1 وطفرات واحدة-سيستين
البروتوكول تنقية الموصوفة أعلاه غلة البروتين solubilized المنظفات التي يمكن تسميتها عن طريق تعديل التساهمية سيستين (مثلاً، فلوروفوريس، وتدور المسمى [م] الميثيل-ميثانيثيولسولفوناتي) على طول تسلسل TRPV1 تحليل سبيكتروسكوبيك. الحد الأدنى TRPV1 القناة التي تحتوي على مخلفات سيستين تهاجر كالأنواع مستقرة ومونوديسبيرسي (~ مل 13.6)، على نحو ما يحدده حجم الاستبعاد اللوني (الشكل 3). eTRPV1 وواحد-سيستين المسمى تدور طفرات (E651C SL و A702C-SL) الخص شطف الشخصية والاستقرار المميز ب بناء (الشكل 3) TRPV1 الحد الأدنى26. يمكن أن تختلف الشخصية شطف بين طفرات مختلفة، حيث سيستينيس واحد قد يؤثر على استقرار البروتين. وفي بعض الحالات، شكل طفرات المجاميع؛ ويمكن أن الوت جزء صغير من العينة في حجم العمود (mL 8-9.5)، الحد من كمية البروتين التي تهاجر تيترامير (الشكل 3، السهم السفلي الأحمر) باطلة. في هذه الحالة، يمكن زيادتها خلية ثقافة وحدات التخزين لدفع تعويضات للبروتين المفقودة في الكسر مجمعة، أو أحد يمكن استبعاد هذا المسخ من مزيد من التحليل والمتابعة لاختبار بقايا المجاورة. وتشمل الأمثلة الأخرى على توسيع نطاق الذروة التي تناظر تيترامير. القمم الرئيسية أكبر من 3 مل لا ينصح لتحليل سبيكتروسكوبيك، كما أنها تحتوي على متعدد-تفريق الأنواع. وصف البيوكيميائية المسمى تدور طفرات واحدة-سيستين هو الحاجز الثاني قبل إجراء إعادة تشكيل وتحليل سبيكتروسكوبيك.
الفنية المسمى "توصيف لتشكيل تدور" طفرات واحدة-سيستين eTRPV1
لأن الإشارات الجيش الشعبي الثوري والغزلان يعتمدون على إرفاق تسمية تدور باراماجنيتيك لبقايا سيستين، من المهم للتحقق من ما إذا كان موقع تدور-التسمية يغير وظيفة البروتين. هناك عدة طرق لاختبار وظيفة بعد إعادة تشكيل البروتين المسمى تدور، بما في ذلك تجارب بلير الدهن مستو والمشبك التصحيح تيفك. تيفك يسمح بتقييم عدد كبير من القنوات المسماة تدور أثناء تسجيل التيارات العيانية. تقييم الأداء الوظيفي لطفرات واحدة-سيستين المسمى تدور، يتم تشكيلها القنوات في الدهنية أسوليكتين سابق التشكيل. أثناء هذه الخطوة، من المهم استبعاد والغليسيرول 10% موجود في جميع أنحاء تنقية، منذ والغليسيرول يقلل كفاءة إعادة تشكيل البروتين في الدهنية. ويبين الشكل 4 ممثل نتيجة TRPV1 A702C SL تشكيلها في الدهنية أسوليكتين وميكروينجيكتيد إلى بويضات النمو . كما هو متوقع، يتسبب الأس الهيدروجيني 5 التيارات تصحيح ظاهرياً قوية37 التي يتم حظرها بواسطة المشاركين تطبيق خصم TRPV1 كابسازيبيني (كبز، تتبع الأزرق)26. المسوخ التي لا تحتفظ الوظائف بعد تدور العلامات وإعادة تشكيل ينبغي أن تستبعد من مزيد من التحليل. توصيف وظيفي المعاد تشكيلها المسمى تدور واحد-سيستين طفرات من نقطة التفتيش الثالثة قبل القيام بتحليل سبيكتروسكوبيك.
الهيكلية المسمى "الديناميات تدور" eTRPV1 "طفرات تخضع لمراقبة" الأسلحة الكيميائية-الجيش الشعبي الثوري والغزلان
نيتروكسيدي تدور التسميات حساسة للبيئة المحيطة ومرونة العمود الفقري البروتين الذي التسمية المرفقة17. ومن ثم، الأسلحة الكيميائية-الجيش الشعبي الثوري يسمح تصميم نظام المعالجة الحيوية من سيستين المسمى تدور معين؛ مواقف يتعرضون لوسائل الإعلام مائي أو الغشاء أكثر دينامية من تلك التي تقتصر على تفاعلات البروتين البروتين17. ويبين الشكل 5A المواقف Glu651، و Ile679، و Ala702 في TRPV1 المختارة لرصد البارامترات التنقل. لحساب المعلمة تنقل المسبار التسمية تدور، أحد حساب معكوس عرض الخط الوسطى من أطياف امتصاص المشتقة الأولى (الشكل 5B، خط أسود ΔHس−1). على سبيل المثال، E651C-SL (الشكل 5B) يعرض خط طيفية الشكل وتنقل قيمة (0.24) توجد عادة في مناصب حيوية في واجهة غشاء26. من ناحية أخرى، I679C-SL و A702C SL معرض توسيع الأطياف (انظر الخطوط المنقطة) وانخفاضا في قيم التنقل (0.16 و 0.18، على التوالي؛ الشكل 5 (ب)) 26 التي تنسجم مع البيئة المحيطة بهم مقيدة (البروتين-بروتين)، وفقا لهيكل cryo-م1.
ويبين الشكل 5 أطياف طفرات TRPV1 المسمى تدور بعد إعادة تشكيل في الدهنية أسوليكتين. كما كان متوقعا، لم تتغير الميزات الديناميكية من أطياف E651C SL و A702C-SL بعد إعادة تشكيل، كما قيمها الشكل والتنقل هي نفسها في الحل كما هو الحال في بيئة غشاء26. من ناحية أخرى، يوضح I679C SL طائفة صاخبة؛ ونتيجة لذلك، تصبح أقل وضوحاً الدنيا (السهم الأزرق) وأعلى العناصر الميدانية (السهم الأحمر). أطياف صاخبة لا عادة المرغوب فيها، كما أنها تميل إلى التقليل من شأن تنقل موقف المسمى تدور. يمكن أن يكون هذا النوع من الطيف المنتج لإعادة تشكيل البروتين الكفاءة بدلاً من تحت العلامات، منذ إشارة I679C SL في حل قوي.
بيانات الغزلان مجموع يضمحل إشارة جيبية تتأرجح، والتي تحتوي على معلومات حول توزيع المسافة المتفاعلة تسميات تدور38،39. الفترة والتعقيد من الانحلال مباشرة يعكس توزيع المسافة الكامنة. توزيع المسافة تتألف من العدد المكونات الهيكلية الموجودة في العينة وعلى اضطراب. ومن ثم، إشارة الوقت نطاق مستمد من حلقية اقتران بين تسميات تدور غير ثابت، والبعيدة في الحل الذي عادة ما تسبب تسوس خلفية أسي، أندريجيدلي إلى جانب يدور داخل نفس البروتين19،40. على وجه التحديد، الغزلان يسمح تصميم البروتين داخل مسافات طويلة المدى (20-70 Å) بين بقايا المسمى تدور19. ويبين الشكل 6 تسوس إشارة وتوزيع المسافة المقابلة E651C-م. ويبين توزيع Glu651 ثلاث قمم الموافق 24 و 36 و 58 Å26. مسافات أقصر اثنين تتمشى مع هيكل TRPV1 مغلقة (23 و 32 Å Cβ-Cβ المسافات، على التوالي)1، بينما قد تتوافق مع ذروة Å 58 الثالث لتجميع البروتين.
رقم 1. مخطط تجريبي- الرسم التخطيطي لمخطط التجريبية اللازمة للتعبير عن وتنقية وإعادة تشكيل eTRPV1 للجيش الثوري الشعبي والغزلان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. توصيف وظيفي من طفرات eTRPV1 وواحد-سيستين. (أ) التمثيل التخطيطي من بنيات TRPV1 المستخدمة لتحليل سبيكتروسكوبيك (eTRPV1: سيستين-أقل TRPV1 110-603/627-764). خلايا HEK293 (ب) وإذ تعرب عن وزن TRPV1، eTRPV1، وطفرات (محملة Ca2 +-الحساسة فلوو-4-ص) حللت كبخاخات (10 ميكرون)-أثارت ردود استخدام fluorescence Ca2 + تصوير. يشير شريط اللون إلى التغيرات النسبية في كثافة الأسفار، مع الأزرق والأحمر تدل على أدنى وأعلى هيولى Ca2 +، على التوالي. يمثل الشريط الأبيض 100 ميكرومتر. (ج) اليسار، وحدة فرعية واحدة (S5، اللولب المسامية، المجال S6 والحزب) هيكل تيترامير TRPV1 تسليط الضوء على واحدة-سيستين المخلفات (مجالات الأصفر) أدخلت على طول التسلسل القناة. الحق، والجهد الحالي علاقات تحددها تسجيلات تيفك من بويضات النمو الإعراب عن وزن TRPV1، eTRPV1، وطفرات واحدة-سيستين وتحدي مع الأس الهيدروجيني 5. خلفية التيارات (بكجرد). تعديل من الرقم الأصلي26. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. وصف طفرات eTRPV1 وواحد-سيستين البيوكيميائية.
حجم الاستبعاد اللوني الشخصية eTRPV1 سولوبيليزيد DDM وطفرات المسمى تدور واحد-سيستين بعد التعبير وتنقيتها من الخلايا Sf9. داخلي: الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل عرض البروتين أحادي eTRPV1-MBP الانصهار (تعديل من الرقم الأصلي26). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. توصيف وظيفي متحولة eTRPV1 المسمى تدور.
الجهد الحالي علاقات تحددها تيفك من بويضات النمو ميكروينجيكتيد مع بروتيوليبوسوميس التي تحتوي على المسمى تدور A702C وتحدي مع الأس الهيدروجيني 5 (أحمر) وسدت كابسازيبيني (كبز، الأزرق: 40 ميكرومتر). خلفية التيارات (بكجرد). تعديل من الرقم الأصلي26. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5. موبيليتيس طفرات eTRPV1 المسمى تدور يحدده CW-الجيش الشعبي الثوري.
(أ) اثنين مفارز (S5، اللولب المسامية، المجال S6 والحزب) هيكل تيترامير TRPV1 إبراز مخلفات الأحماض الأمينية (مجالات الأصفر) سبر من خلال توجيه الموقع سبيكتروسكوبيس وسم تدور. (ب) أول مشتق من الأطياف الجيش الشعبي الثوري CW من طفرات سيستين المسمى تدور في حل DDM. (ج) أول مشتق من الأطياف الجيش الشعبي الثوري CW من طفرات سيستين المسمى تدور تشكيلها في الدهنية أسوليكتين. تم الحصول على الأطياف في درجة الحموضة 7.4 (مغلق). ΔHo−1 يشير حجم المعلمة التنقل. ويبرز خط منقط أسود توسيع الأطياف. أسهم زرقاء وحمراء تدل العناصر الميدانية المنخفضة والعالية من الأطياف، على التوالي. تم تطبيع الأطياف الجيش الشعبي الثوري إلى العدد الإجمالي لتسميات تدور. تعديل من الرقم الأصلي26. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. توزيع المسافة المسخ eTRPV1 في المنظفات.
صدى الغزلان (A) وتوزيع المسافة المسخ المسمى تدور E651C؛ (ب) كانت مزودة بمبلغ جوسينس للبيانات الغزلان. P(r) يشير إلى توزيع المسافة من أزواج تدور41. تم الحصول على الأطياف في درجة الحموضة 7.4 (مغلق). تعديل من الرقم الأصلي26. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التكنولوجيات الحالية للتعبير وتنقية البروتينات الغشاء الثدييات جعلت من الممكن الحصول على كميات كافية من البروتين للدراسات الطيفية14،15،،من1642. هنا، نحن قد تكيفت هذه التكنولوجيات التعبير عن تنقية وإعادة تشكيل، وإجراء تحليلات spectroscopic في TRPV1.
ومن بين الخطوات الهامة في البروتوكول، أدناه هي تلك التي كنا قد تروبليشوت ل TRPV1، والتي يمكن تعديلها للبروتينات الأخرى. تعديل تسلسل الحمض النووي لتوليد قالب غلة 0.5-1 ملغ/مل بروتين المنقي المنظفات؛ القوالب التي تنتج أقل من 0.5 ملغ/مل بروتين تشكل تحديا، نظراً لتزايد أكثر من 6 لتر من الثقافات خلايا الحشرات سيلزم كل المسخ. البروتين يجب أن تتركز، لا أقل من 2 مغ/مل، دون تسيب لزيادة كفاءة وسم تدور. وسم بتركيزات منخفضة البروتين و/أو حضور تسيب سيولد آثار صاخبة الجيش الشعبي الثوري الأطياف. على الرغم من أن يتم الاحتفاظ البروتينات في 4 درجات مئوية خلال تنقية، من الضروري أن تدور وضع العلامات على RT لتحسين كفاءة أداء. أثناء تنقية ووضع العلامات، يحسن والغليسيرول البروتين الاستقرار؛ ومع ذلك، يجب تماما إزالته قبل إعادة تشكيل، كما أنه يقلل من كمية البروتين في الدهنية ويولد صاخبة الجيش الشعبي الثوري الأطياف. تقليل تركيز المنظفات أدناه اللجنة العسكرية المركزية ممارسة شائعة أثناء إعادة تشكيل؛ ومع ذلك، TRPV1 يميل إلى يعجل قبل دمج الدهنية. لحل هذه المشكلة، وكان المحتضنة TRPV1 بين عشية وضحاها مع الدهنية قبل المشكلة بالضبط في اللجنة العسكرية المركزية تجنب ترسيب البروتين وزيادة كمية القنوات في إعداد بروتيوليبوسومي. TRPV1 تعمل بكامل طاقتها في أسوليكتين الدهنية28؛ ومن ثم، كان خليط الدهن المفضلة المستخدمة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، من الضروري تحديد تكوين الدهن الذي بروتين خاص وظيفية (مثلالكوليسترول) قبل الشروع في تحليل سبيكتروسكوبيك.
النهج الطيفية مثل الجيش الشعبي الثوري والغزلان حاليا العديد من القيود، بما في ذلك: التغييرات في تسلسل قالب البروتين التي تعمل على تحسين الاستقرار البيوكيميائية قد يكون لها تأثير في وظيفة26؛ مقدمة لغير الناطقين سيستينيس واحد، فضلا عن التسمية تدور، قد لا تكون جيد التحمل في مناطق معينة من البروتين؛ الحصول على كميات كبيرة من البروتينات المسماة؛ وتقتصر التغييرات conformational عند تحديد المسافات مع الغزلان في المذيلات المنظفات. ومع ذلك، يمكن التغلب على الحد الأخير بجمع الأطياف، تردد الموجات Q، طفرات TRPV1 تشكيلها في19،نانوديسكس43. ومع ذلك، الاستفادة من هذه النهج يأتي أساسا من نمط الديناميات العالمية، ووصول، ومسافات أكثر من القيمة المطلقة لموقف معين.
حساسية درجة الحرارة واحدة من الأكثر رائعة وأقل فهم آليات النابضة؛ ومن ثم، باستخدام النهج الطيفية، سيكون ممكناً لتحديد كيفية ترجمة البروتينات الغشاء الطاقة الحرارية إلى حركة البروتين في بيئة غشاء. الأهم من ذلك، أنه سيكون تحديا لتحديد التغيرات الهيكلية خلال الحرارية النابضة باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية أو البرد-م، كما يتم إجراء هذه التقنيات في انخفاض درجات الحرارة. التجارب المقبلة ستوجه نحو تحديد TRPV1 conformational تغييرات متوافقة مع النابضة الحرارية تعتمد على استخدام الجيش الشعبي الثوري، والغزلان، أو الأسفار. مطيافية الجيش الشعبي الثوري قد وفر نماذج ميكانيكية مفصلة لقنوات أيون بدائية، حيث أننا نتوقع أن باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، سوف نكتسب ثاقبة آليات التنشيط والمخدرات-ربط القنوات الثديية أيون باستخدام النهج الطيفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون جداً للدكتور مشورب H. لتوفير الوصول إلى مطيافات الجيش الشعبي الثوري والغزلان والدكتور ت. روزنباوم لتوفير بلازميد TRPV1 سيستين-أقل طول كامل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
| Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
| Amylose resin | NEB | E8021L | |
| Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
| Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
| Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | Olympus | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
| Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sealed capillary | VitroCom | special order | |
| SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
| Tryptone | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
| XL1 - Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
| pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
| Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
References
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
- Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
- Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
- Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
- Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
- Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
- Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
- Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
- Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
- Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
- Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
- McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
- Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
- Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
- Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
- Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
- Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
- Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
- McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
- Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
- Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
- Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
- Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
- Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
- Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
- Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
- Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
- Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
- Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
- Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
- Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
- Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
- Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
- Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
- Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
- He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
- Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).
