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Biochemistry

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.

Abstract

Canaux ioniques polymodal transduce multiples stimuli de différentes natures allostérique de l’évolution ; ces conformations dynamiques sont difficiles à déterminer et demeurent largement inconnus. Avec les progrès récents en lumière délestage de la particule cryo-electron microscopy (cryo-EM) sur les caractéristiques structurales des sites de fixation agoniste et le mécanisme d’activation de plusieurs canaux ioniques, le décor est planté pour une analyse approfondie et dynamique de leurs processus de blocage mécanismes utilisant des méthodes spectroscopiques. Techniques spectroscopiques comme la résonance paramagnétique électronique (RPE) et électron-électron double résonance (cerf) ont été principalement limités à l’étude des canaux ioniques procaryotes qui peut être purifié en grandes quantités. L’obligation pour les grandes quantités de protéines membranaires fonctionnelle et stable a entravé l’étude des canaux d’ion mammifères à l’aide de ces approches. EPR et DEER offre de nombreux avantages, y compris la détermination de la structure et des changements dynamiques des régions de la protéine mobile, mais à basse résolution, ce qui pourrait être difficile d’obtenir par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM, et suivi d’une ouverture de porte réversible transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). Ici, nous fournissons des protocoles pour l’obtention de milligrammes de récepteur transitoire fonctionnel solubilisée détergent potentiels cation V membre du subfamily canal 1 (TRPV1) qui peut être marqué pour la spectroscopie RPE et le cerf.

Introduction

Avec les progrès récents dans la particule cryo microscopie électronique (cryo-EM), structures de canal ionique mammifères ont été obtenus à un rythme extraordinaire. En particulier, des études structurales des canaux ioniques de polymodal, tels que le récepteur transitoire potentiels VANILLOÏDE 1 (TRPV1), ont fourni davantage comprendre son activation des mécanismes1,2,3, 4 , 5. Toutefois, des informations dynamiques sur les canaux ioniques intégrée dans un environnement membranaire sont nécessaires pour comprendre leurs mécanismes de blocage et drogue-liaison polymodal.

Résonance paramagnétique électronique (RPE) et la spectroscopie de résonance (cerf) double électron-électron ont fourni certains des modèles mécanistes plus définitifs pour ion canaux6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. ces approches ont été principalement limitées à l’examen des procaryotes et des canaux d’archeal ion qui produisent une grande quantité de protéines purifiées détergent lorsque surexprimée dans les bactéries. Avec le développement de la production de protéines eucaryotes membrane dans l’insecte et des cellules de mammifères pour la caractérisation structurale et fonctionnelle de15,14,16, il est maintenant possible d’obtenir biochimiques quantités de protéines purifiées détergent pour études spectroscopiques.

Les signaux RPE et DEER découlent d’une étiquette de paramagneticspin (SL) (p. ex., méthanethiosulfonate) fixée à un résidu cystéine-unique dans la protéine. Les marqueurs de spin rapport trois types d’informations structurelles : motion, accessibilités et distances. Ces informations permettent de déterminer si les résidus sont enterrés dans la protéine ou sont exposés à la membrane ou le milieu aqueux dans l’apo et le ligand lié aux États13,17,18,19. Dans le cadre d’une structure à haute résolution (si disponible), les données de l’EPR et le cerf fournissent une collection des contraintes qui fixeront les modèles dynamiques dans leur environnement natif tout en surveillant réversible gating transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). En outre, régions flexibles qui peuvent être difficiles de déterminer par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM pourraient être obtenues en utilisant ces ensembles de données environnementales pour attribuer les structures secondaires ainsi que l’emplacement au sein de la protéine20. Structures de Cryo-EM obtenues en lipides nanodiscs a fourni des informations précieuses sur le déclenchement de l’ion canaux3,21,22,23,24, 25; Cependant, méthodes spectroscopiques pourraient fournir des informations dynamiques des États conformationnels (p. ex., changements thermiques) qui peut être difficile de déterminer à l’aide de cryo-EM.

Nombreuses difficultés doivent être surmontées pour implémenter l’EPR et les cerfs, notamment le manque de fonction de protéine en enlevant tous les résidus de cystéine (particulièrement abondants dans les canaux de mammifères), rendement faible en protéines, l’instabilité de la protéine durant la purification et après marquage de spin et l’agrégation de la protéine de détergent ou de liposomes. Ici, nous avons conçu des protocoles à surmonter ces obstacles essentiels et ont obtenu des renseignements de spectres DEER et EPR pour un récepteur sensoriel chez les mammifères. Le but ici est de décrire les méthodologies pour la construisent de l’expression, purification, étiquetage et reconstitution d’un rat fonctionnelle de la cystéine-moins minime TRPV1 (eTRPV1) pour les analyses spectroscopiques. Cette méthode est appropriée pour les protéines de la membrane qui gardent leur fonction malgré l’élimination des résidus de cystéine ou qui contiennent des cystéine formant des ponts disulfures. Cette collection de protocoles pourrait être adaptée pour l’analyse spectroscopique d’autres canaux d’ion chez les mammifères.

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Protocol

1. TRPV1 mutagenèse

Remarque : Une construction TRPV1 minimale pour l’analyse spectroscopique26 fut construite entre le canal de cystéine-moins long TRPV127 à l’aide de la méthode de réaction en chaîne (PCR) polymérase (Figure 1). Cette construction de cystéine-moins TRPV1 minime (ci-après comme eTRPV1) est composé de résidus 110-603 et 627-764. eTRPV1 a été cloné en pMO (un pcDNA3.1 vectoriel) pour l’analyse fonctionnelle et un vecteur recombinant donneur28 qui contenant 8 x protéines histidine-liant le maltose (MBP)-tabac etch virus (TEV), expression et purification (Figure 2 a). cystéine de single–eTRPV1 mutants ont été générés à l’aide de mutagenèse dirigée. Séquences de vecteur et de canal sont spécifiées dans le supplémentaire 1 fichier : méthodes complémentaires.

  1. Concevoir des amorces de mutagenèse avec des outils en ligne29.
  2. Mélanger dans un tube à 0,2 mL : 5 μL de 10 x tampon de réaction, 1 μL de mélange dNTP (100 mM), 1 μL de 10 μM et inverses des oligonucléotides, 1 μL de modèle d’eTRPV1 100 ng/μL ADN26, 1,5 μL de DMSO, 1 μl d’enzyme de mutagenèse et 38,5 μL d’eau désionisée. Tourner le mélange avant de placer les tubes dans le thermocycleur.
  3. Effectuer la mutagénèse PCR.
    1. Effectuer une dénaturation à 95 ° C pendant 2 min, et (b) la dénaturation à 95 ° C pendant 20 s, (c) recuit à 60 ° C pendant 10 s et d allongement à 68 ° C pendant 4 min (30 s par 1 Ko). Répétez les étapes b à d de 18 cycles, puis effectuer l’allongement à 68 ° C pendant 5 min et maintenir la réaction à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  4. Ajouter 2 μL de Dpnj’ai enzymatique à la réaction ; mélanger et puis incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  5. Effectuer la transformation
    1. Décongelez les cellules compétentes d’Escherichia coli sur la glace.
    2. Dans un tube stérile un refroidissement préalable de 14mL, ajouter 75 μl de cellules compétentes et 10 μL de mélange PCR j’ai traités Dpn. Mélanger doucement.
    3. Incubez la réaction sur la glace pendant 30 min. maintenir le tube à 42 ° C pendant 45 s puis immédiatement Placez-le sur la glace pendant 2 min. plaque le mélange sur le bouillon Luria (LB)-Gélose contenant la carbénicilline (0,2 mg/mL). Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C.
    4. Récolter au moins trois colonies individuelles de la plaque et ensemencer chacun dans 4 mL de LB contenant la carbénicilline (0,2 mg/mL) à l’aide d’un tube stérile de 14 mL. Incuber les cultures pendant une nuit à 37 ° C et agiter à 250 tr/min.
    5. Tournez en bas des cultures durant la nuit à 8 000 x g pendant 10 min et extraire l’ADN suivant les instructions de trousses de préparation mini disponibles dans le commerce.
    6. Vérifier la présence de mutants de single-cystéine par séquençage automatisé standard (voir la Table des matières).

2. functional Analysis of Single-cystéine Mutants et d’eTRPV1

  1. Transfection de ligne HEK293 cellulaire 30
    1. La culture de cellules HEK293 dans 6 - plats dans 2 mL de milieu de l’hyperglycémie (DMEM) / puits (37 ° C, 5 % CO2, 95 % humidité). Préparer les cellules HEK293 qui sont 70 \u2012 80 % anastomosé.
    2. Préparer le mélange de transfection dans deux tubes distincts de micro-centrifugeuse 1,5 mL.
      1. Pour la réaction A, ajouter 0,5 µg eTRPV1 ou la cystéine contenant du mutant pMO à 250 µL de milieu minimal essentiel (p. ex. Opti-MEM). Pour la réaction B, ajouter 3 µL de réactif de transfection de 250 µL de milieu minimal essentiel. Incubez chaque réaction pendant 5 min à température ambiante (RT).
      2. Mélanger les réactions A et B avec une pipette 1 mL. Incuber le mélange pendant 45 min à température ambiante.
    3. Retirer 500 µL de milieux de culture depuis le confluent de 70-80 % bien et ajouter 500 µL du mélange réactionnel. Ranger les assiettes du jour au lendemain pour Ca2 + d’imagerie (37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité).
  2. Ca2 + imagerie dans les cellules HEK293 30
    1. Nettoyer les lamelles de verre 12 mm de diamètre avec l’éthanol et l’eau et les placer dans une plaque de 24 puits.
    2. Ajouter 75 µL de la poly-l-lysine dans le centre de chaque lamelle et stocker la plaque pendant 45 min (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité).
    3. Retirez l’excès lamelles poly-l-lysine et laver trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour enlever tout résidu.
    4. Une fois que les lamelles sont prêts, procéder pour détacher des cellules de la plaque 6 puits.
    5. Retirez le support et ajouter 500 µL de PBS tiède (37 ° C) pour le lavage.
    6. Supprimer les PBS, ajouter 500 µL de trypsine et incuber pendant 1 min.
    7. Ajouter 500 µL de milieux de culture chaude (37 ° C) pour arrêter la réaction de la digestion et mélanger avec la pipette. éviter la formation de bulles. Si nécessaire, ajuster la concentration en cellules Diluer cette resuspension avec plusieurs milieux de culture.
    8. 250 µL de cellules HEK293 transfectées (confluent de 70 %) des graines plus 250 µL de milieux de culture (500 volume final µL / puits) sur les lamelles pré-traitées et laissez-les s’installent (à joindre) pour 1-2 h dans l’incubateur (37 ° C, 5 % CO2, 95 % d’humidité).
    9. Pendant ce temps, préparer une solution de chargement en ajoutant l’acide Pluronique 0,02 % et 1 µM Fluo-4-AM au tampon d’une solution de Ringer. Bien mélanger la solution.
    10. Retirer les milieux de culture HEK293 du puits et ajouter 500 µL de la solution de chargement. Incuber les cellules pendant 1 h (37 ° C, 5 % de CO2, 95 % d’humidité). Laver les cellules Fluo-4-chargé deux fois avec un tampon de Ringer chaud.
    11. Placez un lamelle couvre-objet avec cellules chargées dans un plat de Pétri de 10 mm dans une platine du microscope (avec un 10 X objectif ; 494 nm excitation et 506 nm d’émission) pour effectuer des mesures intracellulaires de Ca2 + .
    12. Mesurer les changements dans l’intensité de fluorescence après perfusant les ligands respectifs (par exemple, 10 μM capsaïcine) à l’aide de logiciels disponibles sur le marché (voir Table des matières).
  3. ARNm et préparation des ovocytes de Xenopus laevis 30
    1. Linéariser eTRPV1 et single-cystéine contenant des mutants pMO avec Pmej’ai pendant 1 h à 37 ° C. ADN propre suivant les instructions de kits de purification disponible dans le commerce.
    2. Utilisation linéarisé et nettoyé l’ADN pour synthétiser RNAs plafonnés avec un kit commercialement disponible compatible avec l’ARN polymérase T7.
    3. Nettoyer le RNAs plafonnés selon des kits de purification disponible dans le commerce. Quantifier la quantité de RNA en mesurant l’absorbance à la longueur d’onde de 260 nm.
    4. \U2012 transfert 5 10 mL d’ovocytes X. laevis (disponibles dans le commerce) dans un tube conique de 50 mL contenant 20 mL de solution de ND96 (96 mM NaCl, KCl, 5 mM HEPES, 2 mM 1 mM MgCl2; pH 7,4) avec la collagénase de 1 mg/mL et nutate pendant 50 min à température ambiante.
    5. Rincez les ovocytes dans ND96 jusqu'à ce que la solution est claire ; Ajouter frais collagénase et agiter pendant 30 min à RT. Examinez les ovocytes sous un microscope stéréo et la digestion s’arrête lorsque la couche extérieure folliculaire (couche brillant avec les vaisseaux sanguins rouges) est absente dans la plupart des ovocytes (90 %). Rincez les ovocytes dans ND96 jusqu'à ce que la solution est claire.
    6. Transfert des ovocytes dans un tube de 50 mL en polystyrène avec ND96 plus 1 mM CaCl2 et secouer pour les ovocytes digérés sous 1 h. collera au tube en polystyrène.
    7. Laver les ovocytes avec ND96 plus 1 mM CaCl2 et supplément solution avec 50 µg/mL de gentamicine et de 50 µg/mL de tétracycline.
      Remarque : Protéger les solutions contenant tétracycline d’exposition à la lumière.
    8. Sélectionnez gros ovocytes sans membranes endommagées et en affichant une nette séparation entre l’animal et végétales pôles. Laisse les ovocytes à récupérer pendant 4 h avant microinjection à 16 ° C.
    9. Utiliser des pipettes en verre (O.D. : 1,11 mm, diamètre intérieur : 0,5 et longueur 8,8 cm) 1-5 ng d’ADN messagère de mutants eTRPV1 et single-cystéine d’injecter dans les ovocytes en utilisant un système d’injecteur nanolitre (46 nL/s) et un microscope stéréo (2 X grossissement). Stocker les ovocytes à 16 ° C en ND96 additionné de CaCl2 et antibiotiques (gentamicine/tétracycline 1 x).
    10. Après 72 h, mesurer le courant macroscopique à l’aide de deux électrodes de voltage clamp (TEVC) acquisition système31.
    11. Tirez sur les pipettes en verre borosilicaté (0,3 MΩ) et remplissez-les de 3M KCl.
    12. Placer l’ovocyte dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette de transfert et perfuse la solution bain (120 mM NaCl, KCl, 2 mM solution de MgCl2, EGTA 1 mM et 10 mM HEPES à 2 mM, pH 7,4) à faible vitesse.
    13. Plonger les deux électrodes dans la solution du bain pour ajuster leurs décalages de pipette. Poussez doucement les électrodes de la pipette (pipettes de verre borosilicaté ; O.D. : 1,5 mm, diamètre intérieur : 1.10 et longueur 10 cm) dans l’ovocyte jusqu'à ce qu’une minuscule échancrure est observée sous un microscope stéréo (2 X grossissement), ainsi qu’un changement dans le potentiel de membrane.
    14. Changer les réglages de l’amplificateur à la mode et la mesure des courants macroscopiques d’enregistrement tout en appliquant une rampe de voltage clamp de -80 à + 80 mV pour 1 s. charge le système de perfusion avec la solution utilisée dans l’étape 2.3.12 à pH 7,4 (sous forme de contrôle) et à pH 5 pour vérifier l’activité eTRPV1.

3. générer la recombinaison Bacmid et Baculovirus pour l’Expression de la protéine

  1. Bacmid
    1. Transformer 100 μL de DH10Bac e. coli cellules compétentes avec 7,5 ng du vecteur recombinant donneur contenant des mutants eTRPV1 et/ou single-cystéine.
    2. Ajouter 900 μL de médias SOC (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL extrait de levure, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4et 20 mM de glucose) et incuber pendant 6-7 heures à 37 ° C et 225 t/mn.
    3. 100 µL directement à partir du mélange et de dilutions en série des graines (1/10 et 1/100), en LB-géloses contenant 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicine, 10 tétracycline μg/mL et la kanamycine 50 μg/mL. Incuber les boîtes pendant au moins 48 h à 37 ° C.
    4. Sélectionner des colonies blanches qui sont de 2 mm de diamètre, car colonies bleues n’ont pas l’insertion d’intérêt. Utiliser un microscope stéréo pour vérifier que les colonies blanches ne contiennent pas toutes les taches bleues.
    5. Récolter au moins trois colonies individuelles et de les transférer dans un tube de 14 mL stérile contenant 4 mL de milieu LB avec 7 μg/mL gentamicine, 10 tétracycline μg/mL et 50 kanamycine μg/mL. Incuber les cellules pendant la nuit (~ 16 h) à 37 ° C et 250 tr/min.
    6. Prendre 1,5 mL des cultures pendant la nuit et isolat bacmid recombinant DNA (voir le fichier 1 supplémentaire pour le protocole détaillé). Stocker le bacmid à 4 ° C pendant deux mois.
      Remarque : Préparer les stocks de glycérol de DH10Bac de e. coli contenant l’ADN de bacmid. Prendre 300 μL de la culture et ajouter 200 μl de glycérol à 50 % (concentration finale de glycérol de 20 %). Conserver l’aliquote à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
    7. Vérifier la présence d’eTRPV1 dans la bacmid recombinant par PCR (voir 1 de fichier supplémentaire pour protocole détaillé).
  2. Baculovirus
    Remarque : Pour cette procédure, transfecter des cellules d’insecte Sf9 dans un format de 6 puits. Toutes les quantités et les volumes sont donnés sur une base par puits. Éviter l’utilisation d’antibiotiques.
    1. Plaque de 1 x 106 Sf9 cellules dans 2 mL de milieux cellulaires insectes. Permettre aux cellules d’attacher pendant au moins 45 min.
    2. Diluer 1 μg de bacmid recombinant DNA dans 100 μl de milieux cellulaires insectes. Mélanger doucement.
    3. Diluer 100 μl de milieux cellulaires insectes 6 μl de réactif de transfection (TR). Mélanger doucement.
    4. Combiner les solutions d’ADN et TR (des étapes 3.2.2 et 3.2.3, respectivement). Mélanger doucement et laisser incuber 30 min à température ambiante.
    5. Ajouter 0,8 mL de milieux cellulaires insectes au mélange ADN/TR ; mélanger doucement.
    6. Retirez le support de cellule insectes des cellules Sf9 et laver une fois avec 1 mL de milieu frais.
    7. Retirez le support de lavage et ajouter le mélange de l’ADN/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) aux cellules. Incuber les cellules à 27 ° C pendant 5 h (sans agitation).
    8. Retirez le mélange de transfection et remplacez par 2 mL de support de cellule insectes contenant 0,5 % sérum fœtal (SVF). Incuber les cellules à 27 ° C pendant cinq jours.
      Mise en garde : Éviter l’évaporation des médias cellulaire en remplissant les puits vides avec les médias et couvrir la plaque de 6 puits avec deux couches de film de paraffine.
    9. Transférer les milieux de culture de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Isoler le premier passage (P1) du parc de virale en faisant tourner le tube à 8 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger de 15 mL nettoyer et ranger immédiatement à 4 ° C.
      Remarque : Protéger le virus de l’exposition à la lumière en recouvrant le tube avec le papier d’aluminium.
    10. Pour la seconde génération (P2) du parc de virale, mettre une culture en suspension de 25 mL de milieux cellulaires insectes à 1 x 106 Sf9 cellules/mL contenant 2 % FBS dans un flacon de 125 mL (fond clair et aéré). Ajouter 25 μL du virus P1 à la culture de 25 mL.
    11. Incuber la culture à 27 ° C pendant 72 h.
    12. Pour récolter le stock viral P2, la culture de transfert dans un nouveau tube de 50 mL et il centrifuger à 8 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
    13. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 50 mL et rangez-le immédiatement à 4 ° C.
      Remarque : Protéger le virus de l’exposition à la lumière en recouvrant le tube avec le papier d’aluminium. Réaliser une expérience à petite échelle pour titrer le ratio de virus/Sf9 P2 pour une expression optimale TRPV1 (voir 1 de fichier supplémentaire pour un protocole détaillé, Section 4 intitulée « Expérience à petite échelle pour P2 virus. »)
    14. Pour l’expression de la protéine à grande échelle, définir une culture en suspension cellules Sf9 1 L à 2 x 106 cellules/mL dans les médias de cellule insectes additionnés de 0,5 % FBS dans une fiole de verre borosilicaté 2,8-L.
    15. Ajouter 1 mL de stock de virus de P2 à la culture de 1 L et il incuber à 27 ° C pendant 72 h.
      Remarque : Le troisième jour, la densité cellulaire doit être à environ 1,5 à 2,5 x 106 cellules/mL.

4. eTRPV1 et Purification de Mutant de Single-cystéine

  1. Membranes d’isolement28
    1. Récolte de la culture en suspension cellulaire insectes 1 L de la filature à x 4 500 g, 4 ° C, pendant 20 min. peser le culot cellulaire (il devrait être autour de 6-9 g).
    2. Resuspendre le culot dans 25 mL de tampons glacee A (saccharose de 36,5 mM, 2 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) et 50 mM Tris ; pH 7,4) en présence d’inhibiteurs de la protéase (fluorure de sulfonyle de benzyle 1 mM (PMSF), 3 μg/mL leupeptine, 3 μg/mL aprotinine et 1 pepstatine μg/mL). Désagréger les amas de cellules pour obtenir une suspension homogène et tournez à 4 ° C pendant 20 min.
    3. Briser les cellules à l’aide d’un manuel (meuleuse de tissu dounce) ou un homogénéisateur haute pression. Enlever les débris de cellules par centrifugation à 8 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
      Remarque : Conservez les cellules lysées et les tubes sur la glace pendant tout le processus.
    4. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger à 100 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot de membrane dans un volume total de 20 mL de glacee tampon B (NaCl 150 mM, 10 % de glycérol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES, pH 7,4), complété par des inhibiteurs de protéase (comme au point 4.1.2).
    5. Aliquote 20 mL de suspension de la membrane en tubes de 50 mL et flash-congélation dans l’azote liquide. Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  2. Purification de protéine26,28
    1. Décongeler les aliquotes de membrane sur la glace et ajouter 3 mL de n-dodécyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) par tube (stock de 200 mM). Tourner le tube pendant 2 h à 4 ° C.
    2. Centrifuger l’échantillon à 100 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant et ajouter 1 mL de résine d’amylose humide propre. Tourner le mélange pendant 2 h à 4 ° C. Charger le mélange de protéine/amylose dans les colonnes de chromatographie de flux gravité.
      Mise en garde : Ne laissez pas la résine sécher pendant les lavages.
    3. Laver la résine protéinique amylose et 10 fois les lit volumes de C glacé de tampon (NaCl 150 mM, 10 % de glycérol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectine, 0,5 mM TCEP, pH 7,4). Laver avec 10 volumes de lit de glacee tampon D (NaCl 150 mM, 10 % de glycérol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectine, pH 7,4).
      Remarque : Avant de laver, dégazer le tampon D sans détergent ni lipides, purge à l’azote. Après le dégazage, ajouter DDM et asolectine.
    4. Éluer les protéines d’eTRPV1 avec des fractions de 0,5 mL, jusqu'à 5 mL de glacee dégazé tampon D, additionné de maltose de 20 mM. Si possible, effectuer le lavage et élution à 4 ° C.
    5. Quantifier la quantité de protéines en mesurant l’absorbance à la longueur d’onde de 280 nm.
      Remarque : Ce protocole donne 0,5 à 1,0 mg de protéines par litre de culture. Rendement de protéine peut varier pour chaque mutant de single-cystéine eTRPV1. Pour des expériences EPR et cerfs, poussent 4 \u2012 6 L de la culture.

5. eTRPV1 Single-cystéine Mutant Site-Directed Spin Labeling

  1. Concentrer les fractions contenant des eTRPV1 à l’aide d’une unité de filtration centrifuge (coupure = 100 kDa) jusqu'à 2 \u2012 2,5 mg/mL pour l’étiquetage (cycles de 7 000 x g pendant 2 min à 4 ° C).
  2. Ajouter un excès molaire 10 fois (3 fois, toutes les 30 minutes) du marqueur de spin (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) méthyle méthanethiosulfonate (MTSSL) d’une solution mère de 100 mM dans le DMSO au concentré de protéine (monomère d’eTRPV1 : MTSSL à 01:10 rapport molaire) 17. maintenir la réaction dans l’obscurité à RT pendant 1 h 30 min, suivie d’une nuit d’incubation à 4 ° C.
    Remarque : Dans cette étape, MBP puisse être supprimée en ajoutant la protéase TEV pendant l’incubation de spin-étiquetage pendant la nuit.
  3. ETRPV1 de charge marqué sur une colonne de chromatographie d’exclusion dimensions équilibrées dans tampon E (NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DN 150 mM, pH 7,4), contrôlée par un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide. Recueillir des fractions contenant eTRPV1 tétramère.
    Remarque : N’incluent pas les 10 % de glycérol dans cette étape, car il réduit l’efficacité de la reconstitution.
  4. Quantifier la quantité de protéines en mesurant l’absorbance à la longueur d’onde de 280 nm.
  5. Évaluer la pureté de l’échantillon en exécutant un gel SDS-PAGE (gel sans tache, 4 \u2012 20 %). L’échantillon est maintenant prêt pour des mesures spectroscopiques en solution et/ou protéoliposomes.

6. eTRPV1 marqué seule cystéine la Reconstitution du Mutant

  1. Sécher 10 mg d’asolectine à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide (≤100 mbar) pendant 1 h à 40 ° C. Pour faire asolectine liposomes, ajouter 1 mL de tampon F (200 mM NaCl, vadrouilles de 5 mM, pH 7,4) et laisser agir le mélange pendant 15 min ou jusqu'à ce que l’échantillon est homogène.
  2. Déstabiliser les liposomes en ajoutant DDM à une concentration finale de 2 mM et laisser incuber 30 min à température ambiante.
  3. Concentrer les protéines marquées à 2 mg/mL et ajoutez-le aux liposomes en utilisant le ratio protéines/lipides 1:5 (masse : masse).
    Mise en garde : Il est important de maintenir les concentrations de protéine susmentionnés, étant donné que l’efficacité d’essorage-étiquetage diminue à de faibles concentrations et à la puissance maximum, que la protéine pourrait précipiter.
  4. Ajouter le tampon F pour régler le mélange de protéine/aux liposomes à la concentration micellaire critique DDM (CMC) et incuber une nuit à 4 ° C avec agitation douce.
  5. Double de la quantité du mélange protéine/Liposome avec tampon F et enlever un détergent en ajoutant successivement trois aliquotes de non-polaires billes de polystyrène adsorbants (30 mg, 50 mg et 80 mg) à intervalles de 1 h avec agitation douce à température ambiante.
  6. Charger le mélange sur un filtre de colonne (colonne de chromatographie de flux gravité) pour enlever les billes et transvaser le mélange de protéoliposomes dans un tube ultracentrifugeuse. Centrifuger les échantillons à 100 000 x g pendant 1 h à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 30 μL de tampon de F.
    Remarque : Les échantillons sont prêts pour l’analyse spectroscopique et injection dans des ovocytes de Xenopus . Si les échantillons ne peuvent être utilisés le jour même, flash gel eux dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
  7. Protéoliposomes -Xenopus ovocyte électrophysiologie26,32
    1. Injecter 50 nL des dilutions différentes de protéoliposomes marqué dans des ovocytes de Xenopus comme décrit à la section 2.2.
    2. Effectuer des mesures de TEVC après 12 h d’injection tel que décrit à l’article 2.3.10.
  8. Continuez à effectuer des mesures spectroscopiques et analyse (article 7).

7. les cerfs et les Spectroscopies RPE

  1. Spectroscopie de résonance (cerf) double électron-électron.
    1. Effectuer des mesures de cerfs dans un spectromètre de RPE pulsé fonctionnant à Q-bande de fréquence (34 GHz) et muni d’un amplificateur de 10 W avec la séquence de quatre-pulsation libre temps morts à 83° à l’aide de logiciels fournis par le fabricant,33.
    2. Supplément de 50 µM de mutants de cystéine marqué eTRPV1 purifié détergent en tampon E (étape 5.5) avec 30 % (v/v) de glycérol pour cryo-protection.
    3. Charger l’échantillon dans un tube capillaire de quartz scellé et un essorage jusqu’au fond du tube en bref centrifugation à basse vitesse (100 x g).
    4. Placer le tube capillaire dans l’azote liquide pour geler l’échantillon. Les échantillons peuvent être conservés en ce moment à-80 ° C pour mesurer ultérieurement.
    5. Placer l’échantillon directement dans la caisse de résonance micro-onde et laissez-le rééquilibrer-83 ° pour 10 \u2012 20 min.
    6. Mesurer l’échantillon à l’aide d’un protocole standard de DEER quatre impulsions, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – (π) mw1 – τ2 – écho34. La longueur de l’impulsion pour mw1 (π/2) et (π) mw1 est respectivement de 10 et 20 ns et 40 ns pour mw2 (π). Définir l’espacement des fréquences à 63 MHz.
      Remarque : Données décomposition primaire chevreuil peuvent être analysées avec un accueil logiciel intégré (par exemple en Matlab) qui suppose une somme de distributions gaussiennes pour décrire les distances entre spin étiquettes19,35.
  2. Onde continue spectroscopie RPE (CW)
    1. Réaliser des expériences de CW EPR à ta sur un spectromètre X-band (9,6 GHz) en utilisant le logiciel de fabricant.
    2. Démarrer l’instrument en tournant sur le refroidisseur d’eau, la console et l’alimentation aimant. Vous connecter au logiciel de l’appareil, placer l’appareil dans l’air et attendre au moins 30 min pour l’instrument pour se réchauffer.
    3. Charger 20 µL de l’échantillon de l’étape 5.5 dans un tube capillaire de verre de 25 µL à l’aide de l’action capillaire et sceller l’extrémité du tube avec mastic.
    4. Chargez le tube capillaire dans la cavité du four à micro-ondes et couple critique du résonateur manuellement ou automatiquement à l’aide de la fonction automatique du logiciel.
    5. Recueillir le premier spectre dérivé dans des conditions standard instrument : 100kHz à micro-ondes modulation, modulation de champ magnétique de 1,6 G et puissance micro-ondes de 10 mW.
    6. Pour l’analyse des données et la présentation, corriger les spectres sur le fond et normaliser en divisant les spectres de la valeur de crête à crête de l’intégrale double.
    7. Déterminer la mobilité du marqueur de spin en mesurant l’inverse de la largeur de la ligne centrale du premier dérivé des spectres d’absorption (ΔHo-1)36.

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Representative Results

Caractérisation fonctionnelle des minimes sans cystéine TRPV1 construire (eTRPV1) et Single-cystéine Mutants

La première étape vers des études spectroscopiques est d’ingénieur et de caractériser des constructions de cystéine-moins de protéine (Figure 2 a) qui sont fonctionnels et qui produisent des quantités biochimiques des protéines. eTRPV1 est fonctionnel, tel que déterminé par Ca2 + imagerie et TEVC (Figure 2 b-C). En outre, eTRPV1 fournit des quantités suffisantes de protéines purifiées détergent pour des expériences de l’EPR et le cerf (0,5 à 1 mg par litre de cellules Sf9)26. Introduisant des cystéines unique dans les régions de la protéine particulière pouvant affecter leur fonction. Figure 2 b montre quelques exemples de mutants de single-cystéine (E651C et A702C) sur eTRPV1 qui se comportent comme type sauvage (WT), car leur intensité de la fluorescence augmente lorsque TRPV1 agoniste (p. ex., la capsaïcine) est ajouté à HEK293 contenant du eTRPV1 cellules, comme illustré par le Ca2 + 26d’imagerie. En revanche, A680C est l’exemple typique d’un mutant de cystéine non fonctionnels, comme la fluorescence ne peut être distinguée de l’arrière-plan. Le mutant A680C a été exclu pour une analyse ultérieure. Après Ca2 + des expériences d’imagerie, fonction des single-cystéine mutants est testée à l’aide de TEVC ou patch clamp pour évaluer leurs propriétés biophysiques. La figure 2 montre que les mutants récapitulent la rectification extérieure caractéristique de TRPV1 quand défié avec pH 5, tel que déterminé par TEVC,26. Analyse fonctionnelle de mutants de single-cystéine est le premier point de contrôle avant d’entreprendre les protocoles expression et purification.

Caractérisation biochimique de l’eTRPV1 et le Single-cystéine Mutants

Le protocole de purification décrit ci-dessus donne la protéine solubilisée détergent qui peut être marqué par une modification covalente de cystéine (p. ex., fluorophores, marqué [SL] méthyl-methanethiolsulfonate) le long de la séquence de TRPV1 pour analyse par spectroscopie. TRPV1 minimes canal contenant des résidus de cystéine migrent comme espèce stable et monodispersés (~ 13,6 mL), telle que déterminée par chromatographie d’exclusion stérique (Figure 3). eTRPV1 et single-cystéine marqué des mutants (E651C-SL et A702C-SL) récapitulent le profil d’élution et la stabilité en vedette par les minimes TRPV1 construct (Figure 3)26. Le profil d’élution peut varier entre différents mutants, comme unique cystéines pouvant affecter la stabilité des protéines. Dans certains cas, des mutants forment des agrégats ; et une fraction de l’échantillon peut éluer au volume vide de la colonne (8-9,5 mL), réduisant la quantité de protéine qui migre comme un tétramère (Figure 3, flèche fond rouge). Dans ce cas, les volumes de culture cellulaire peuvent être transposés pour compenser pour la protéine perdue dans la fraction agrégée ou l’une peut exclure une analyse plus approfondie de ce mutant et continuer à tester le résidu voisin. D’autres exemples incluent un élargissement du pic correspondant au tétramère. Principaux sommets de plus de 3 mL ne sont pas recommandés pour l’analyse spectroscopique, car ils contiennent des multi-espèces de disperser. Caractérisation biochimique des mutants de single-cystéine marqué est le deuxième point de contrôle avant la reconstitution de l’entreprise et l’analyse spectroscopique.

Mutants de Single-cystéine eTRPV1 caractérisation de reconstitué Spin-étiqueté fonctionnelles

Parce que les signaux RPE et le cerf s’appuient sur l’attachement d’un marqueur de spin paramagnétique à un résidu de cystéine, il est important de vérifier si l’emplacement du label essorage altère la fonction de protéine. Il y a plusieurs façons de tester pour la fonction après reconstitution de la protéine marqué, y compris les expériences des bicouches lipidiques planes, patch clamp d’et TEVC. TEVC permet d’évaluer un grand nombre de canaux marqué lors de l’enregistrement des courants macroscopiques. Pour évaluer la fonctionnalité des mutants single-cystéine marqué, canaux est reconstituées dans les liposomes asolectine préformées. Au cours de cette étape, il est important d’exclure le 10 % de glycérol qui est présent tout au long de la purification, puisque glycérol diminue l’efficacité de la reconstitution de la protéine dans des liposomes. La figure 4 montre un représentant A702C-SL TRPV1 reconstitué dans les liposomes asolectine et micro dans des ovocytes de Xenopus . Comme prévu, pH 5 suscite robuste extérieurement rectification courants37 qui sont bloqués par demande conjointe du TRPV1 antagoniste la capsazépine (CPZ, trace bleue)26. Des mutants qui ne conservent pas de fonctionnalité après essorage étiquetage et reconstitution devraient être exclus de l’analyse. Caractérisation fonctionnelle de mutants de single-cystéine marqué reconstitués est le troisième point de contrôle avant d’entreprendre des analyses spectroscopiques.

Structurels marqués dynamique de Spin eTRPV1 Mutants contrôlés par CW-EPR et le cerf

Marqueurs de spin nitroxydes sont sensibles à l’environnement et la flexibilité de l’épine dorsale de protéine à laquelle l’étiquette est attachée à17. Par conséquent, CW-EPR permet de déterminer le régime dynamique d’une cystéine marqué donné ; notamment, les postes exposés pour les milieux aqueux ou la membrane sont plus dynamiques que ceux limités à des interactions de protéine-protéine17. Figure 5 a montre les positions Glu651, Ile679 et Ala702 en TRPV1 choisi pour analyser des paramètres de mobilité. Pour calculer le paramètre de la mobilité de la sonde d’étiquette de spin, on calcule l’inverse de la largeur de la ligne centrale des premiers dérivés spectres d’absorption (Figure 5 b, ligne noire ΔHo−1). Par exemple, E651C-SL (Figure 5 b) affiche une raie spectrale forme et mobilité valeur (0,24) trouve couramment sur les positions de dynamiques à la membrane interface26. En revanche, I679C-SL et A702C-SL pièce élargissant le spectre (voir les pointillés) et une diminution des valeurs de la mobilité (0,16 à 0,18, respectivement ; Figure 5 b) 26 qui sont en accord avec leur environnement contraint (protéines), selon la structure de cryo-EM1.

La figure 5 montre les spectres des mutants de TRPV1 marqué après reconstitution dans les liposomes asolectine. Comme prévu, les caractéristiques dynamiques des spectres pour E651C-SL et A702C-SL n’a pas changé après reconstitution, que leurs valeurs de forme et de la mobilité sont les mêmes en solution comme une membrane environnement26. En revanche, I679C-SL illustre un spectre bruyant ; par conséquent, le plus bas (flèche bleue) et les composantes du champ supérieurs (flèche rouge) deviennent moins évidentes. Spectres bruyants ne sont pas habituellement souhaitées, car ils ont tendance à sous-estimer la mobilité du poste marqué. Ce type de spectre pourrait être le produit de reconstitution de la protéine inefficace plutôt que de sous-étiquetage, étant donné le signal de I679C-SL en solution est robuste.

Données de cerfs sont une somme de désintégrations signal oscillant, sinusoïdale contenant des informations sur la répartition des distances de l’interaction spin-étiquettes38,39. La période et la complexité de la décroissance reflète directement la distribution sous-jacente de la distance. La répartition des distances se compose du nombre de composants structuraux présents dans l’échantillon et de leur trouble. Par conséquent, le signal du domaine temporel dérive de la dipolaire de couplage entre les marqueurs de spin non fixée, lointain en solution qui provoquent habituellement une décroissance exponentielle de fond, andrigidly couplé tours au sein de la même protéine19,40. Plus précisément, chevreuil permet de déterminer des distances à longue distance d’intra-protéines (20-70 Å) entre résidus marqué19. La figure 6 montre la décroissance du signal et la répartition des distances correspondantes du E651C-SL. La distribution des Glu651 montre trois pics correspondant à 24, 36 et 58 Å26. Les deux distances plus courtes sont compatibles avec la structure fermée de TRPV1 (23 et 32 Å pour la Cβ-Cβ distances, respectivement)1, tandis que le troisième 58 pic Å pourrait correspondre à l’agrégation des protéines.

Figure 1
Figure 1. Schéma expérimental. Diagramme du plan expérimental pour exprimer, purifier et reconstituer des eTRPV1 pour l’EPR et le cerf. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Caractérisation fonctionnelle des mutants eTRPV1 et single-cystéine. (A) Représentation schématique des constructions TRPV1 utilisés pour l’analyse spectroscopique (eTRPV1 : cystéine-moins TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 cellules exprimant WT TRPV1, eTRPV1 et les mutants (chargé avec Ca2 +-sensible Fluo-4-AM) ont été analysées pour la capsaïcine (10 µM)-évoquée par les réponses à l’aide de Ca2 + imagerie par fluorescence. Barre de couleur indique les changements relatifs dans l’intensité de la fluorescence, bleu et rouge indiquant le minimum ou maximum cytoplasmique Ca2 +, respectivement. Barre blanche représente 100 µm. (C) à gauche, une sous-unité (S5, hélice de pore, domaine S6 et TRP) de structure de tétramère TRPV1 soulignant single-cystéine résidus (sphères jaunes) introduits le long de la séquence des chaînes. Relations de droite, courant-tension déterminées par des enregistrements de TEVC partir des ovocytes de Xenopus exprimant WT TRPV1, eTRPV1 et single-cystéine mutants contestés avec pH 5. Courants de fond (bkgrd). Modification de l’original figure26. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
La figure 3. Caractérisation biochimique des mutants eTRPV1 et single-cystéine.
Profil de chromatographie liquide d’exclusion d’eTRPV1 DDM solubilisée et mutants de single-cystéine marqué après expression et purification de cellules Sf9. En médaillon : Gel de SDS-PAGE montrant la protéine de fusion eTRPV1-MBP monomère (modifiée d’après l’original figure26). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
La figure 4. Caractérisation fonctionnelle d’un mutant d’eTRPV1 marqué.
Relations courant-tension déterminée par TEVC à partir des ovocytes de Xenopus micro avec protéoliposomes contenant marqué A702C confrontés à pH 5 (rouge) et bloqué par la capsazépine (CPZ, bleu : 40 µM). Courants de fond (bkgrd). Modification de l’original figure26. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
La figure 5. Mobilités des mutants eTRPV1 marqué déterminés par CW-EPR.
(A) deux sous-unités (S5, hélice de pore, domaine S6 et TRP) de structure de tétramère TRPV1 mettant en valeur les résidus d’acides aminés (sphères jaunes) a sondé par spectroscopies de spin-étiquetage dirigée. (B) la dérivée première de spectres rpe de CW de mutants de cystéine marqué en DDM-solution. (C) la dérivée première de spectres rpe de CW de mutants de cystéine marqué reconstitués dans les liposomes asolectine. Les spectres ont été obtenus à un pH de 7,4 (état fermé). ΔHo−1 désigne l’ampleur du paramètre mobilité. La ligne pointillée noire met en évidence l’élargissement du spectre. Les flèches bleues et rouges indiquent les composantes de champ haute et basse des spectres, respectivement. Les spectres rpe ont été normalisées pour le nombre de marqueurs de spin. Modification de l’original figure26. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
La figure 6. Distribution des distances d’un mutant d’eTRPV1 dans un détergent.
DEER echo (A) et la distribution (B) de distance du mutant marqué E651C ; une somme de gaussiennes a été ajustée aux données chevreuil. P (r) désigne la répartition des distances du spin paires41. Les spectres ont été obtenus à un pH de 7,4 (état fermé). Modification de l’original figure26. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Expression et purification des protéines membranaires chez les mammifères, les technologies actuelles ont permis d’obtenir des quantités suffisantes de protéines pour des études spectroscopiques14,15,16,,42. Ici, nous avons adapté ces technologies pour exprimer, purifier, reconstituer et effectuez des analyses spectroscopiques en TRPV1.

Parmi les étapes cruciales dans le protocole, voici ceux que nous avons dépannez-effectué pour TRPV1 et qui pourrait être réglé d’autres protéines. Modifier la séquence d’ADN afin de générer un modèle qui cède 0,5 - 1 mg/mL de protéine purifiée de détergent ; modèles de rendement inférieur à 0,5 mg/mL de protéine sont difficiles, puisque plus de 6 litres de cultures de cellules d’insectes de plus en plus serait tenu par mutant. Protéine doit être concentré, pas moins de 2 mg/mL, sans PTCE d’augmenter l’efficacité d’essorage-étiquetage. Étiquetage à des concentrations de faible teneur en protéines ou en présence de PTCE traces générera des spectres rpe bruyants. Bien que les protéines sont conservés à 4 ° C durant la purification, il est essentiel d’effectuer spin labeling RT pour améliorer l’efficacité. Au cours de la purification et l’étiquetage, glycérol améliore la stabilité des protéines ; Toutefois, il doit être complètement retiré avant reconstitution, car il diminue la quantité de protéines dans les liposomes et génère des spectres rpe bruyants. Diminution de la concentration de détergent sous la CMC est une pratique courante au cours de la reconstitution ; Toutefois, le TRPV1 tend à précipiter avant d’incorporer dans les liposomes. Pour résoudre ce problème, TRPV1 est incubé pendant la nuit avec les liposomes préformés exactement au MCC pour éviter la précipitation de protéines et d’augmenter la quantité de canaux dans la préparation des protéoliposomes. TRPV1 est entièrement fonctionnel en asolectine liposomes28; par conséquent, c’est le mélange de lipides préféré utilisé dans le présent protocole. Toutefois, il est essentiel de déterminer la composition lipidique dans laquelle une protéine particulière est fonctionnelle (p. ex., cholestérol) avant de procéder à des analyses spectroscopiques.

Spectroscopique des approches telles que l’EPR et cerfs présentent plusieurs limites, y compris : modifications dans l’ordre de protéine modèle qui améliorent la stabilité biochimique pourraient avoir une incidence en fonction26; introduction des cystéines unique non indigènes, ainsi que le marqueur de spin, ne pourrait pas être bien tolérée dans certaines régions de la protéine ; obtention de grandes quantités de protéines marquées ; et des changements de conformation limitées lors de la détermination des distances avec les cerfs dans les micelles de détergent. Toutefois, la limitation de ce dernier pourrait être surmontée en recueillant les spectres, à Q-bande de fréquence, des mutants TRPV1 reconstituée en nanodiscs19,43. Néanmoins, l’avantage de ces approches provient principalement du modèle de la dynamique mondiale, accessibilités et distances plus que sur la valeur absolue d’un poste donné.

Sensibilité à la température est l’un des plus fascinants et comprend moins de mécanismes de blocage ; par conséquent, à l’aide de méthodes spectroscopiques, il serait possible de déterminer comment les protéines membranaires traduiront énergie thermique en mouvement de la protéine dans un environnement membranaire. Ce qui est important, il serait difficile de déterminer les changements structurels au cours de déclenchement thermique à l’aide de la diffraction des rayons x ou cryo-EM, que ces techniques sont effectuées à des températures glaciales. Expériences futures viseront à déterminer que TRPV1 conformational change compatible dont le thermique dépendant à l’aide des EPR, le chevreuil ou fluorescence. Spectroscopie RPE a fourni les modèles mécanistes détaillées pour canaux ioniques procaryote, donc nous attendons qu’en utilisant les protocoles décrits ci-dessus, nous allons gagner la perspicacité dans les mécanismes d’activation et de la drogue-liaison de canaux d’ion mammifères à l’aide méthodes spectroscopiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes très reconnaissants à m. H. Mchaourab pour accéder à des spectromètres EPR et cerfs et Dr T. Rosenbaum pour fournir le plasmide de TRPV1 cystéine-moins long.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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Biochimie numéro 137 Transient receptor potentiels VANILLOÏDE 1 TRPV1 purification reconstitution spin-étiquetage spectroscopie RPE spectroscopie de cerf
Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique
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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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