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Biochemistry

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Abstract

Polymodal Ionenkanäle transduzieren mehrere Reize unterschiedlicher Art in allosterische Änderungen; Diese dynamische Konformationen sind schwierig zu bestimmen und nach wie vor weitgehend unbekannt. Mit den jüngsten Fortschritten in einzelne Partikel Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Licht auf die strukturellen Merkmale der Agonist Bindungsstellen und Aktivierungsmechanismus mehrere Ionenkanäle ist das Bühnenbild für dynamische Tiefenanalyse der ihre Anspritzung Mechanismen mit spektroskopischen Methoden. Spektroskopische Techniken wie Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron-Resonanz (Hirsch) wurden vor allem auf das Studium der prokaryotischen Ionenkanäle beschränkt, die in großen Mengen gereinigt werden können. Die Voraussetzung für große Mengen von funktionalen und stabilen Membranproteinen hat das Studium der Säugetier-Ionenkanäle, die durch diese Ansätze behindert. EPR und Hirsch bieten viele Vorteile, einschließlich der Bestimmung der Struktur und dynamischen Veränderungen der mobilen Protein Regionen, wenn auch mit geringer Auflösung, der durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM zu schwierig sein könnte, und Überwachung, reversible Anspritzung Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Hier bieten wir Protokolle für den Erhalt der Milligramm funktionale Waschmittel solubilisiert Transienten Rezeptor potenzielle kation Unterfamilie V Kanalmitglied 1 (TRPV1), die EPR und Hirsche Spektroskopie bezeichnet werden kann.

Introduction

Mit den jüngsten Fortschritten in der Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) wurden Säugetier-Ion Kanalstrukturen zu einem außergewöhnlichen Preis gewonnen. Insbesondere haben strukturelle Studien Polymodal Ionenkanäle, wie z. B. die Transienten Rezeptor potential Vanilloid 1 (TRPV1), weitere Verständnis für seine Aktivierung Mechanismen1,2,3, zur Verfügung gestellt 4 , 5. dynamischer Informationen über Ionenkanäle in einer Membran-Umgebung eingebettet ist jedoch erforderlich, ihre Polymodal gating und Medikament-Bindung Mechanismen zu verstehen.

Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron Resonanz (Hirsch) Spectroscopies haben einige der am meisten definitive mechanistische Modelle für Ionen-Kanäle6,7,8,9 , zur Verfügung gestellt , 10 , 11 , 12 , 13. diese Ansätze wurden hauptsächlich beschränkt sich auf die Prüfung der prokaryotischen und Archeal Ion Kanäle, liefern eine große Menge an Waschmittel-gereinigte Proteine als bei Bakterien überexprimiert. Mit der Entwicklung der Eukaryoten Membran Proteine Produktion in Insekt und Säugerzellen für funktionelle und strukturelle Charakterisierung14,15,16ist es jetzt möglich, biochemische zu erhalten Mengen von Waschmittel-gereinigte Proteine für spektroskopische Untersuchungen.

Die EPR und Hirsche Signale ergeben sich aus ein Paramagneticspin Etikett (SL) (d.h. Methanethiosulfonate), ein Single-Cystein Rückstand in das Protein. Die Spin-Etiketten Berichten drei Arten von Strukturinformationen: Bewegung, Erreichbarkeiten und Entfernungen. Diese Informationen ermöglichen es, festzustellen, ob Rückstände innerhalb des Proteins liegen oder der Membran oder wässrigen Umgebung in die Apo und Liganden-gebundenen Staaten13,17,18,19ausgesetzt sind. Im Rahmen einer hochauflösenden Struktur (wenn vorhanden) bieten die EPR und Hirsch-Daten eine Auflistung von Einschränkungen für die Ableitung von dynamischer Models in ihrer natürlichen Umgebung während der Überwachung reversible gating Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Darüber hinaus konnte flexibele Regionen, die möglicherweise schwierig zu bestimmen, durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM abgerufen werden, mithilfe dieser ökologischen Datensätze zum Sekundärstrukturen sowie Lage innerhalb der Protein-20zuweisen. Cryo-EM Strukturen erhalten in Lipid-Nanodiscs zur Verfügung gestellt, wertvolle Informationen über die Anspritzung von Ionen-Kanäle3,21,22,23,24, 25; Spektroskopische Methoden könnte jedoch dynamischen Informationen von Konformationsänderungen Staaten (z.B. thermische Veränderungen) bieten, die möglicherweise schwer zu bestimmen, mit Cryo-EM.

Viele Schwierigkeiten müssen überwunden werden, um die EPR und Hirsch, einschließlich Mangel an Proteinfunktion, wenn Sie alle Cystein Rückstände (besonders reichlich in Säugetieren Kanälen), eiweißarme Ausbeute, Protein Instabilität während der Reinigung und nach Spin labeling entfernen umzusetzen , und Proteinaggregation in Spülmittel oder Liposomen. Hier haben wir Protokolle dieser kritischen Barrieren zu überwinden und haben informierten sich Rehe und EPR Spektren für ein Säugetier sensorischer Rezeptor ausgelegt. Hierbei ist es, Methoden zu beschreiben, denn der Ausdruck, Reinigung, Kennzeichnung und Wiederherstellung einer funktionellen minimal Cystein-weniger Ratte TRPV1 (eTRPV1) für spektroskopische Analysen zu konstruieren. Diese Methode eignet sich für diese Membranproteine, die halten ihre Funktion trotz der Entfernung von Cystein Rückstände oder Cystein bildet Disulfid-Bindungen enthalten. Diese Sammlung von Protokollen könnte für die spektroskopische Analyse von anderen Säugetieren Ionenkanälen angepasst werden.

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Protocol

1. TRPV1 Mutagenese

Hinweis: Eine minimale TRPV1-Konstrukt für spektroskopische Analyse26 entstand aus dem Full-Length Cystein-weniger Kanal TRPV127 mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methode (Abbildung 1). Dieses Cystein-weniger minimalste TRPV1 Konstrukt (bezeichnet als eTRPV1 im folgenden) besteht aus Rückständen 110-603 und 627-764. eTRPV1 wurde geklont in pMO (ein pcDNA3.1-basierte Vektor) für Funktionsanalyse und in einem rekombinanten Spender Vektor28 mit 8 x-Histidin-Maltose-bindendes Protein (MBP)-Tabak Ätzen Virus (TEV) zum Ausdruck und Reinigung (Abbildung 2A). eTRPV1 Single–-Cystein, die durch Mutation entstehende Variationen mit Site-verwiesene Mutagenese erzeugt wurden. Vektor und Kanal-Sequenzen in angegeben sind die ergänzende Datei 1: Ergänzungsmethoden.

  1. Mutagenese-Primer mit online-Tools29zu entwerfen.
  2. Mischen Sie in einer 0,2-mL-Tube: 5 μl 10 x Reaktion Puffer, 1 μl dNTP-Mix (100 mM), 1 μl 10 μM vorwärts und rückwärts Oligonukleotide, 1 μL von 100 ng/μl eTRPV1 Schablone DNA26, 1,5 μL von DMSO, 1 μL der Mutagenese Enzym , und 38,5 μL deionisiertes Wasser. Drehen Sie die Mischung vor dem Einlegen der Rohre in den Thermocycler.
  3. Führen Sie PCR Mutagenese.
    1. Führen Sie (a) Denaturierung bei 95 ° C für 2 min, (b) Denaturierung bei 95 ° C für 20 s, (c) Glühen bei 60 ° C für 10 s und (d) Dehnung bei 68 ° C für 4 min (30 s pro 1 kb). Wiederholen Sie die Schritte b bis d für 18 Zyklen, dann Dehnung bei 68 ° C für 5 min durchführen, und die Reaktion bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu erhalten.
  4. Fügen Sie 2 μL der Dpnich Enzym Reaktion; mischen und dann bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
  5. Führen Sie die transformation
    1. E. Coli kompetente Zellen auf Eis Auftauen.
    2. Eine vorgekühlte 14mL steriles Röhrchen fügen Sie 75 μl kompetente Zellen und 10 μL der Dpn-behandelten PCR Mischung hinzu. Mischen Sie vorsichtig.
    3. Inkubieren Reaktion auf Eis für 30 min. pflegen das Rohr bei 42 ° C für 45 s und dann sofort auf Eis für 2 min. Platte die Mischung auf Luria Brühe (LB)-Agarplatte mit Carbenicillin (0,2 mg/mL). Die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    4. Mindestens drei einzelne Kolonien von der Platte zu ernten und jeweils in 4 mL LB mit Carbenicillin (0,2 mg/mL) mit einem 14-mL steriles Röhrchen zu impfen. Kulturen über Nacht bei 37 ° C inkubieren und bei 250 u/min schütteln.
    5. Spin-down über Nacht Kulturen bei 8.000 x g für 10 min und nach den Anweisungen der im Handel erhältlichen Mini-Vorbereitung Kits DNA extrahieren.
    6. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Single-Cystein Mutanten durch standard automatisierter DNA-Sequenzierung (siehe Tabelle der Materialien).

(2) funktionelle Analyse von eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten

  1. HEK293 Zellen Linie Transfektion 30
    1. Kultur HEK293 Zellen in 6 - well-Platten in 2 mL hohe Glukose Medium (DMEM) pro Bohrloch (37 ° C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit). Bereiten Sie HEK293 Zellen vor, die 70 \u2012 80 % Zusammenfluss.
    2. Bereiten Sie die Transfektion Mischung in zwei separate 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.
      1. Fügen Sie für Reaktion A 0,5 µg eTRPV1 oder Cystein Mutant-haltigen pMO zu 250 µL minimal wesentliche Medium (z. B. Opti-MEM hinzu). Fügen Sie für Reaktion B 3 µL Transfection Reagens zu 250 µL minimal wesentliche Medium hinzu. Jede Reaktion für 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
      2. Mischen Sie Reaktionen A und B mit einer 1-mL-Pipette. Die Mischung für 45 min bei RT inkubieren
    3. Entfernen Sie 500 µL Nährmedien aus dem Zusammenfluss von 70-80 % gut und fügen Sie 500 µL des Reaktionsgemisches hinzu. Platten über Nacht für Ca2 + imaging (37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit) zu speichern.
  2. Ca2 + imaging in HEK293 Zellen 30
    1. Reinigen Sie 12 mm Durchmesser Glasdeckgläser mit Ethanol und Wasser zu, und legen Sie sie in einer 24-Well-Platte.
    2. 75 µL Poly-l-Lysin in der Mitte der einzelnen Deckglas hinzuzufügen und die Platte für 45 min (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) zu speichern.
    3. Entfernen Sie die überschüssige Poly-l-Lysin und waschen Deckgläsern dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) gebliebene entfernen.
    4. Sobald die Deckgläsern fertig sind, fahren Sie mit Zellen aus dem 6-Well-Platte zu lösen.
    5. Entfernen Sie den Datenträger und fügen Sie 500 µL PBS warm (37 ° C) waschen.
    6. Entfernen Sie PBS zu, fügen Sie 500 µL von Trypsin und 1 min inkubieren.
    7. Hinzufügen von 500 µL warm Nährmedien (37 ° C) die Verdauung Reaktion zu stoppen und mit der Pipette mischen; vermeiden Sie Luftblasen. Passen Sie ggf. Die Zellkonzentration Verdünnung dieser Wiederfreisetzung mit mehr Kultur Medien.
    8. Seed 250 µL von transfizierten HEK293 Zellen (70 % Zusammenfluss) plus 250 µL Nährmedien (500 µL Endvolumen pro Well) auf die vorbehandelten Deckgläsern und lassen (zur Befestigung) niederzulassen für 1-2 h im Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit).
    9. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine Laden-Lösung durch Zugabe von 0,02 % Pluronic Säure und 1 µM Fluo-4-AM ein Ringer Puffer. Mischen Sie die Lösung gut.
    10. Entfernen Sie die HEK293-Kultur-Medien aus dem Brunnen und fügen Sie 500 µL der Laden-Lösung hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 1 h (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2). Waschen Sie die Fluo-4-geladenen Zellen zweimal mit warmen Ringer Puffer.
    11. Legen Sie ein Deckglas mit geladenen Zellen in einer Petrischale 10 mm in einen Mikroskoptisch (mit einem 10-fach Ziel; 494 nm Anregung und 506 nm Emission) um intrazelluläre Ca2 + Messungen durchzuführen.
    12. Messen von Veränderungen im Fluoreszenzintensität nach jeweiligen Liganden (z.B. 10 μM Capsaicin) Vorrichtung mit handelsüblicher Software (siehe Tabelle der Materialien).
  3. mRNA und Xenopus Laevis Eizellen Vorbereitung 30
    1. Linearisieren eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten-haltigen pMO mit Pmeich für 1 h bei 37 ° C. Reinigen Sie nach den Anweisungen der im Handel erhältlichen Reinigung Kits DNA.
    2. Linearisiert und DNA zu synthetisieren, angeschnittene Ärmel RNAs mit einem kommerziell erhältlichen Kit kompatibel mit T7-RNA-Polymerase gereinigt.
    3. Angeschnittene Ärmel RNAs nach handelsüblichen Reinigung Kits zu reinigen. Die RNA-Menge durch Messung der Absorption bei 260 nm Wellenlänge zu quantifizieren.
    4. Transfer 5 \u2012 10 mL laevis Eizellen (im Handel erhältlich) in ein 50 mL konische Röhrchen mit 20 mL ND96-Lösung (96 mM NaCl, KCl, 5 mM HEPES, 2 mM 1 mM MgCl2; pH 7.4) mit 1 mg/mL Kollagenase und Nutate für 50 min bei RT
    5. Spülen Sie die Eizellen in ND96, bis die Lösung klar ist; Fügen Sie frische Kollagenase und schütteln für 30 min bei RT untersuchen die Eizellen unter dem Stereo-Mikroskop und die Verdauung zu stoppen, wenn die follikuläre Außenschicht (glänzende Schicht mit roten Blutgefäße) fehlt in den meisten Eizellen (90 %). Spülen Sie Eizellen in ND96, bis die Lösung klar ist.
    6. Das Polystyrol Röhrchen bleiben Transfer Eizellen zu einem Polystyrol 50-mL-Schlauch mit ND96 plus 1 mM CaCl2 und schütteln für 1 h unter verdaut Eizellen.
    7. Waschen Sie Eizellen mit ND96 plus 1 mM CaCl2 und Ergänzung Lösung mit 50 µg/mL von Gentamicin und 50 µg/mL Tetracyclin.
      Hinweis: Schützen Sie Tetracyclin-haltigen Lösungen vor Lichteinwirkung.
    8. Wählen Sie große Eizellen ohne beschädigte Membranen und eine klare Trennung zwischen dem Tier und pflanzliche Polen anzeigen. Lassen Sie Eizellen erholen für 4 h vor der Mikroinjektion bei 16 ° C.
    9. Glaspipetten verwenden (O.D: 1,11 mm I.D.: 0,5 und Länge 8,8 cm), 1-5 ng der mRNA von eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten in Eizellen mit einem Nanoliter-Injektor-System (46 nL/s) und ein Stereo-Mikroskop (2 X Vergrößerung) zu injizieren. Speichern von Eizellen bei 16 ° C im ND96 ergänzt mit CaCl2 und Antibiotika (Gentamycin/Tetracyclin 1 X).
    10. Messen Sie nach 72 h makroskopischen Strom mit einem zwei-Elektroden-Voltage-Clamp (TEVC) Erwerb System31.
    11. Ziehen Sie Borosilikatglas Pipetten (0,3 MΩ) und füllen sie mit 3 M KCl.
    12. Legen Sie die Eizelle in der Aufnahme-Kammer mit einer transferpipette und Durchspülen der Bad-Lösung (120 mM NaCl, KCl, MgCl2, 1 mM EGTA und 10 mM HEPES Lösung 2 mM 2 mM; pH 7,4) bei niedriger Drehzahl.
    13. Tauchen Sie beide Elektroden in der Bad-Lösung ihre Pipette Offsets anpassen. Schieben Sie die Pipette Elektroden (Borosilikatglas Pipetten; O.D: 1,5 mm, I.D.: 1.10 und Länge 10 cm) in der Eizelle bis eine kleine Einbuchtung unter dem Stereo-Mikroskop (2 X Vergrößerung), sowie eine Änderung des Membranpotentials beobachtet wird.
    14. Die Verstärker Einstellungen ändern, um die Aufnahme-Modus und Maßnahme makroskopischer Strömungen während der Anwendung einer Spannung-Clamp-Rampe von-80 bis + 80 mV für 1 S. laden die Perfusion System mit der Lösung verwendet Schritt 2.3.12 bei pH 7.4 (als Kontrolle) und bei pH 5, eTRPV1 Aktivität zu überprüfen.

3. Erzeugung von rekombinanten Bacmid und Baculovirus für Protein-Expression

  1. Bacmid
    1. Transformieren von 100 μl kompetente Zellen DH10Bac E. Coli mit 7,5 ng des rekombinanten Spender Vektors mit eTRPV1 und/oder Einzel-Cystein Mutanten.
    2. Fügen Sie 900 μl SOC-Medien (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL Hefe-Extrakt, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4und 20 mM Glukose) und ca. 6-7 h bei 37 ° C und 225 u/min inkubieren.
    3. Samen 100 µL direkt aus der Mischung und von Verdünnungsreihen (1/10 und 1/100), in LB-Agar-Platten mit 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 50 μg/mL Kanamycin, Gentamicin μg/mL und 10 μg/mL Tetracyclin. Inkubieren Sie die Platten mindestens 48 h bei 37 ° c
    4. Wählen Sie weiße Kolonien, die 2 mm im Durchmesser, da Blaue Kolonien nicht über den Einsatz von Interesse. Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop, um sicherzustellen, dass weiße Kolonien blauen Flecken nicht enthalten.
    5. Mindestens drei einzelne Kolonien zu ernten und in einer 14-mL steriles Röhrchen mit 4 mL LB Medien ergänzt mit 7 μg/mL Gentamicin, 10 μg/mL Tetracyclin und 50 μg/mL Kanamycin überführen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht (~ 16 h) bei 37 ° C und 250 u/min.
    6. Nehmen Sie 1,5 mL der Nacht Kulturen und isolieren rekombinante Bacmid DNA (siehe die zusätzliche Datei 1 für ausführliches Protokoll ein). Speichern Sie die Bacmid bei 4 ° C für bis zu zwei Monate.
      Hinweis: Bereiten Sie die Glycerin-Bestände von DH10Bac E. Coli , Bacmid DNA enthält. Nehmen Sie 300 μL der Kultur und 200 μL des Glycerins mit 50 % (letzte Glycerin Konzentration von 20 %). Die aliquoten bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.
    7. Überprüfen Sie das Vorhandensein von eTRPV1 in der rekombinanten Bacmid mittels PCR (siehe ergänzende Datei 1 für ausführliches Protokoll).
  2. Baculovirus
    Hinweis: Bei diesem Vorgang transfizieren Sie Sf9 Insektenzellen in einem 6-Well-Format. Alle Beträge und Mengen werden auf einer Basis pro gut gegeben. Vermeiden Sie die Verwendung von Antibiotika.
    1. Platte 1 x 106 Sf9 Zellen in 2 mL Insekt Zelle Medien. Lassen Sie Zellen für mindestens 45 Minuten befestigen.
    2. Verdünnen Sie 1 μg rekombinantes Bacmid DNA in 100 μl Insekt Zelle Medien. Mischen Sie vorsichtig.
    3. Verdünnen Sie 6 μL Transfection Reagens (TR) in 100 μl Insekt Zelle Medien. Mischen Sie vorsichtig.
    4. Kombinieren Sie die DNA und TR-Lösungen (Schritte von 3.2.2 und 3.2.3, beziehungsweise). Vorsichtig mischen und 30 min bei RT inkubieren
    5. Die DNA/TR-Mischung 0,8 mL Insekt Zelle Medien hinzufügen; Mischen Sie vorsichtig.
    6. Entfernen Sie das Insekt Zelle Medium aus den Sf9 Zellen und einmal mit 1 mL frisches Medium waschen.
    7. Das Waschen-Medium zu entfernen und fügen Sie DNS/TR Mischung (3.2.2 \u2012 3.2.5) zu den Zellen. Inkubieren Sie Zellen bei 27 ° C für 5 h (ohne Agitation).
    8. Entfernen Sie die Transfektion Mischung zu und ersetzen Sie mit 2 mL Insekt Zelle Medien mit 0,5 % fetalen bovine Serum (FBS). Fünf Tage inkubieren Sie Zellen bei 27 ° C.
      Vorsicht: Verhindern Sie Verdunstung der Zelle Medien durch füllen die leeren Brunnen mit Medien und für die 6-Well-Platte mit zwei Schichten von Paraffin Film.
    9. Übertragen Sie den Zellkulturmedien in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen. Den ersten Durchgang (P1) von viralen Material zu isolieren, indem Sie dreht das Rohr auf 8.000 x g für 15 min bei 4 ° c Den überstand auf eine saubere 15 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und sofort bei 4 ° c Lagern
      Hinweis: Schützen Sie das Virus vor Belichtung durch das Rohr mit Alufolie abdecken.
    10. Für die zweite Generation (P2) des viralen bestand, legte einen 25-mL SUSPENSIONSKULTUR Insekt Zelle Medien 1 x 106 Sf9 Zellen/ml, enthält 2 % FBS in einem 125-mL-Flasche (PLANEM Boden und entlüftet). Die 25 mL Kultur 25 μL des P1-Virus hinzugefügt.
    11. Inkubieren Sie die Kultur bei 27 ° C für 72 h.
    12. Um den P2 virale bestand zu ernten, die Kultur auf eine neue 50-mL-Tube übertragen und bei 8.000 x g für 15 min bei 4 ° c zentrifugiert
    13. Den überstand auf eine neue 50-mL-Tube übertragen und sofort bei 4 ° c Lagern
      Hinweis: Schützen Sie das Virus vor Belichtung durch das Rohr mit Alufolie abdecken. Führen Sie eine kleine Experiment, um die P2-Virus/Sf9-Verhältnis für optimale TRPV1 Ausdruck titrieren (siehe ergänzende Datei 1 für ein detailliertes Protokoll, Abschnitt 4 mit dem Titel "Kleine Experiment für P2-Virus".)
    14. Für groß angelegte Proteinexpression setzen eine 1-L Sf9 Aussetzung Zellkultur bei 2 x 106 Zellen/mL in Insekten Zelle Medien ergänzt mit 0,5 % FBS in ein 2,8-L-Borosilikat-Glas-Flasche.
    15. Die 1-L-Kultur 1 mL der P2 Virus bestand hinzu und bei 27 ° C für 72 h inkubieren.
      Hinweis: Am dritten Tag sollte Zelldichte bei etwa 1,5 bis 2,5 x 106 Zellen/mL sein.

4. eTRPV1 und Single-Cystein Mutant Reinigung

  1. Membranen Isolierung28
    1. Ernte die 1-L Insekt Aussetzung Zellkultur von Spinnen bei 4.500 x g, 4 ° C für 20 min. die Zelle Pellet (es wird voraussichtlich ca. 6-9 g) wiegen.
    2. Aufschwemmen der Zelle Pellets in 25 mL eiskaltes Puffer A (36,5 mM Saccharose, 2 mM tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) und 50 mM Tris; pH 7,4) in Anwesenheit von Protease-Inhibitoren (1 mM Phenylmethyl Sulfonyl Fluorid (PMSF), 3 μg/mL Leupeptin, 3 μg/mL Aprotinin und 1 μg/mL Pepstatin). Disaggregieren Sie Zelle Klumpen um eine homogene Suspension zu erhalten und bei 4 ° C für 20 min drehen.
    3. Brechen Sie die Zellen mit einer manuellen (Dounce Gewebe Grinder) oder eine Hochdruck-Homogenisator. Entfernen Sie die zellenrückstand durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 20 min bei 4 ° C.
      Hinweis: Halten Sie die lysierten Zellen und Rohre auf dem Eis während des gesamten Prozesses.
    4. Sammeln Sie überstand und Zentrifuge bei 100.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Membran-Pellets in einem Gesamtvolumen von 20 mL eiskaltes Puffer B (150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 2 mM DÄMMUND, 50 mM HEPES; pH 7,4), ergänzt mit Protease-Inhibitoren (wie in Schritt 4.1.2).
    5. Aliquoten 20 mL Membran Aussetzung in 50-mL-Tuben und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff. Proben bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.
  2. Protein-Reinigung26,28
    1. Tauen Sie die Membran Aliquote auf Eis auf und 3 mL n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) pro Rohr (200 mM lieferbar). Drehen Sie das Rohr für 2 h bei 4 ° C.
    2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 100.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den überstand zu und 1 mL sauberen feuchten Amylose Harz. Drehen Sie die Mischung für 2 h bei 4 ° C. Die Protein/Amylose-Mischung in Schwerkraft fließen Chromatographiesäulen zu laden.
      Vorsicht: Lassen Sie sich nicht das Harz während der Wäsche zu trocknen.
    3. Waschen Sie das proteingebundene Amylose-Harz mit 10mal das bettvolumen eiskalte Puffer c (150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL Asolectin, 0,5 mM DÄMMUND; pH 7,4). Waschen Sie mit 10 bettvolumen eiskalte Puffer d (150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL Asolectin, pH 7.4).
      Hinweis: Vor dem Waschen, Entgasen Sie Puffer D ohne Spülmittel oder Lipide, Spülung mit Stickstoff. Fügen Sie nach der Entgasung DDM und Asolectin hinzu.
    4. ETRPV1 Protein mit 0,5 mL Fraktionen eluieren, bis zu 5 mL, eiskalte entgast Puffer D, ergänzt mit 20 mM Maltose. Führen Sie nach Möglichkeit die Waschungen und Elution bei 4 ° C.
    5. Quantifizieren Sie die Protein-Menge durch Messung der Absorption bei 280 nm Wellenlänge.
      Hinweis: Dieses Protokoll ergibt 0,5 bis 1,0 mg Eiweiß pro Liter Kultur. Proteinausbeute könnte für jedes eTRPV1 Single-Cystein Mutant variieren. Für die EPR und Hirsche Experimente, wachsen 4 \u2012 6 L Kultur.

5. eTRPV1 Single-Cystein Mutant Site-Directed Spin Labeling

  1. ETRPV1-haltige Fraktionen mit einer zentrifugalen Filteranlage zu konzentrieren (cutoff = 100 kDa) bis zu 2 \u2012 2,5 mg/mL für die Kennzeichnung (Zyklen von 7.000 x g für 2 min bei 4 ° C).
  2. Das konzentrierte Protein ein 10-divisibel molaren Überschuss (3 Mal, alle 30 min.) an (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) Methyl-Methanethiosulfonate (MTSSL)-Spin-Label aus einer 100-mM-Vorratslösung in DMSO hinzufügen (eTRPV1 Monomer: MTSSL in 01:10 Molverhältnis) 17. halten Sie die Reaktion im Dunkeln bei RT für 1 h 30 min, gefolgt von Übernachtung Inkubation bei 4 ° C.
    Hinweis: In diesem Schritt konnte MBP entfernt werden durch Zugabe von TEV Protease während der Nacht Spin labeling Inkubation.
  3. Last Spin-markierten eTRPV1 auf eine Größe Ausgrenzung Chromatographiesäule equilibriert im Puffer E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DDM; pH 7,4), gesteuert durch ein schnelles Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System. Brüche mit eTRPV1 Tetramer zu sammeln.
    Hinweis: Enthalten Sie keine 10 % Glycerin in diesem Schritt, da es die Rekonstitution Effizienz reduziert.
  4. Quantifizieren Sie die Protein-Menge durch Messung der Absorption bei 280 nm Wellenlänge.
  5. Bewerten Sie die Reinheit der Probe mit einem SDS-PAGE-Gel (Gel fleckenfreie, 4 \u2012 20 %). Die Probe ist nun bereit für Spektroskopische Messungen in Lösung und/oder Proteoliposomes.

6. eTRPV1 Spin-Label Single Cystein Mutant Rekonstitution

  1. Trocknen Sie 10 mg Asolectin mit einem drehverdampfer unter Vakuum (≤100 Mbar) für 1 h bei 40 ° C. Asolectin Liposomen, fügen Sie 1 mL Puffer F (200 mM NaCl, 5 mM MOPS; pH 7,4) und beschallen die Mischung für 15 Minuten oder bis die Probe homogen ist.
  2. Destabilisieren Sie die Liposomen zu, indem Sie eine Endkonzentration von 2 mM DDM hinzufügen und 30 min bei RT inkubieren
  3. Beschriftete Protein bei 2 mg/mL zu konzentrieren und die Liposomen mit ein Protein/Lipid-Verhältnis 1:5 (Masse: Masse) hinzufügen.
    Vorsicht: Es ist wichtig, dass die vorgenannten proteinkonzentrationen da Spin labeling Effizienz sinkt bei niedrigen Konzentrationen und bei hohen, die das Protein herbeiführen könnte.
  4. Fügen Sie Puffer F zum Anpassen der Protein/Liposomen-Mischung zur DDM critical Micelle Konzentration (CMC) und Inkubation über Nacht bei 4 ° C unter schonenden rühren hinzu.
  5. Doppelte Volumen der Protein/Liposomen Mischung mit Puffer F und Reinigungsmittel entfernen, indem nacheinander drei Aliquote von unpolaren Adsorbens styroporkügelchen (30 mg, 50 mg und 80 mg) auf 1-h-Intervallen mit sanften Agitation bei RT
  6. Laden Sie die Mischung auf ein Spaltenfilter (Schwerkraft fließen Chromatographiesäule) entfernen die Perlen und die Proteoliposomes Mischung auf einer Ultrazentrifuge Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 100.000 x g für 1 h bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in 30 μl Puffer F. Aufschwemmen
    Hinweis: Beispiele sind bereit für spektroskopische Analyse und Injektion in Xenopus Eizellen. Wenn die Proben am gleichen Tag verwendet werden können, Schockfrosten sie in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus Eizelle Elektrophysiologie26,32
    1. Injizieren 50 nL von verschiedenen Verdünnungen von Spin-Label Proteoliposomes in Xenopus Eizellen wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
    2. Durchführen Sie TEVC Messungen nach 12 h Injektion, wie im Abschnitt 2.3.10 beschrieben.
  8. Fahren Sie mit spektroskopischen Messungen und Analysen (Abschnitt 7).

(7) Hirsche und EPR-Spectroscopies

  1. Doppelte Elektron-Elektron (Hirsch)-Resonanz-Spektroskopie.
    1. Messungen Sie Hirsch-in einem gepulsten EPR-Spektrometer mit Q-Band Frequenz (34 GHz) arbeitet und ausgestattet mit einem 10-W-Verstärker mit der Totzeit kostenlos vier-Pulsfolge bei 83° mit vom Hersteller gelieferte Software33.
    2. 50 µM Reinigungsmittel gereinigt eTRPV1 Spin-Label Cystein Mutanten in Puffer E (Schritt 5.5) mit 30 % (V/V) Glycerin für Cryo-Schutz zu ergänzen.
    3. Laden Sie die Probe in einer versiegelten Quarz Kapillarrohr und Spin an der Unterseite des Rohres durch kurze Lowspeed Zentrifugation (100 X g).
    4. Legen Sie das Kapillarrohr in flüssigem Stickstoff zum Einfrieren der Probenmaterials. Die Proben können an dieser Stelle bei-80 ° C für späteren Messung gespeichert werden.
    5. Legen Sie die Probe direkt in der Mikrowelle Resonator und lassen Sie es neu bei-83 ° für 10 \u2012 equilibrate 20 min.
    6. Messen die Probe mit einem vier-Puls Hirsch Standardprotokoll, mw1 (π/2) – τ1 – (π) mw1 – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1 – τ2 – Echo34. Die Pulslängen für mw1 (π/2) und (π) mw1 sind 10 bis 20 ns, beziehungsweise, und 40 ns für mw2 (π). Der Frequenzabstand auf 63 MHz festgelegt.
      Hinweis: Primäre Hirsch Verfall Daten können mit einer selbstgebauten Software (z. B. in Matlab) analysiert werden, die eine Summe von Gaußsche Verteilungen zu beschreiben, die Abstände zwischen Spin Etiketten19,35annimmt.
  2. Dauerstrich-(CW) EPR-Spektroskopie
    1. Durchführen Sie CW EPR-Experimente bei RT auf ein X-Band (9,6 GHz)-Spektrometer mit der Herstellersoftware.
    2. Starten Sie das Instrument durch den Wasserkühler, die Konsole und die Magnet-Stromversorgung einschalten. Schließen Sie die Software an das Gerät an, stellen Sie das Gerät im Einklang und warten Sie mindestens 30 min für das Instrument zum Aufwärmen.
    3. 20 µL der Probe aus Schritt 5.5 in einer 25 µL Glas Kapillarrohr mit Kapillarwirkung laden und am Ende des Rohrs mit Dichtmasse abdichten.
    4. Laden Sie das Kapillarrohr in der Mikrowelle Hohlraum und kritisch paar den Resonator, entweder manuell oder automatisch mit der Auto-Tune-Funktion der Software.
    5. Sammeln Sie die ersten derivativen Spektren Standardinstrument Bedingungen: 100 kHz-Mikrowelle-Modulation, 1,6 G Magnetfeld Modulation und 10 mW Mikrowellenleistung.
    6. Korrigieren Sie für die Auswertung und Präsentation die Spektren vor dem Hintergrund und dividiert die Spektren durch den Spitze-Spitze-Wert der das doppelte Integral zu normalisieren.
    7. Bestimmen Sie die Spin-Label Mobilität durch die Messung der inversen der Zentrallinie Breite der ersten Derivative Absorptionsspektren (ΔHo-1)36.

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Representative Results

Funktionelle Charakterisierung des minimalen Cystein-weniger TRPV1 konstruieren (eTRPV1) und Single-Cystein Mutanten

Der erste Schritt zur spektroskopischen Untersuchungen ist Ingenieur und Cystein-weniger Protein Konstrukte (Abbildung 2A), die sind funktionell und biochemische Mengen an Proteinen zu charakterisieren. eTRPV1 ist funktional wie von Ca2 + Bildgebung und TEVC (Abb. 2 b-C) bestimmt. Darüber hinaus bietet eTRPV1 ausreichende Mengen an Protein Reinigungsmittel gereinigt für EPR und Hirsche Experimente (0,5 - 1 mg / l Sf9 Zellen)26. Einführung von einheitlichen Cysteine in bestimmten Proteins Regionen könnte ihre Funktion beeinträchtigen. Abbildung 2 b zeigt einige Beispiele von Single-Cystein Mutanten (E651C und A702C) auf eTRPV1, die sich Verhalten wie Wildtyp (WT), da ihre Fluoreszenzintensität zunimmt, wenn TRPV1-Agonisten (z.B. Capsaicin) hinzugefügt wird, eTRPV1-haltigen HEK293 Zellen, wie Ca2 + imaging26gezeigt. Auf der anderen Seite ist A680C typisches Beispiel für eine nicht-funktionale Cystein-Mutante, da die Fluoreszenz von Hintergrund zu unterscheiden ist. Die A680C mutierten wurde zur weiteren Analyse ausgeschlossen. Nach Ca2 + imaging Experimente ist Single-Cystein Mutanten Funktion getestet TEVC oder Patch-Clamp, um deren biophysikalischen Eigenschaften zu bewerten. Abbildung 2 zeigt, dass Mutanten die äußere Berichtigung charakteristisch für TRPV1 als mit pH 5, herausgefordert durch TEVC26rekapitulieren. Funktionelle Analyse von Einzel-Cystein Mutanten ist der erste Kontrollpunkt vor Ausdruck und Reinigung-Protokolle.

Biochemische Charakterisierung der eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten

Das oben beschriebene Reinigung-Protokoll liefert Reinigungsmittel solubilisiert Protein, das über Cystein kovalente Modifikation(z. B.Fluorophore, Spin-Label [SL] Methyl-Methanethiolsulfonate) beschriftet werden kann entlang der TRPV1-Sequenz für Spektroskopische Analyse. Minimale TRPV1 Kanal-haltigen Cystein Rückstände zu, als stabil und Monodisperse Spezies migrieren (~ 13,6 mL), nach Größe-Ausschluss-Chromatographie (Abbildung 3). eTRPV1 und Single-Cystein Spin-Label Mutanten (E651C-SL und A702C-SL) rekapitulieren die Elution Profil und Stabilität zeichnen sich durch minimale TRPV1 Konstrukt (Abbildung 3)26. Die Elution Profil konnte unter verschiedenen Mutanten, variieren, wie einzelne Cysteine proteinstabilität beeinflussen könnte. In einigen Fällen bilden durch Mutation entstehende Variationen Aggregate; und ein Teil der Probe konnte an das Hohlraumvolumen der Spalte (8-9,5 mL), Verringerung der Menge an Protein, das als ein Tetramer (Abbildung 3, unteren roten Pfeil) wandert eluieren. In diesem Fall können Zelle Kultur Bände skaliert um zu kompensieren das Protein verloren in der aggregierten Bruch oder in einer dieser Mutante von der weiteren Analyse ausgeschlossen und fahren Sie mit den benachbarten Rückstand testen kann. Andere Beispiele sind eine Erweiterung des Peaks, die das Tetramer entspricht. Hauptgipfel breiter als 3 mL sind nicht für spektroskopische Analyse empfohlen, da sie Multi enthalten-Spezies zu zerstreuen. Biochemische Charakterisierung der Spin-Label Single-Cystein Mutanten ist der zweite Checkpoint vor Unternehmen Rekonstitution und spektroskopische Analyse.

Funktionelle Charakterisierung von rekonstituiert Spin-markierten eTRPV1 Single-Cystein Mutanten

Da die EPR und Hirsch-Signale auf die Befestigung eines paramagnetischen Spin-Labels an Cystein Rückstände beruhen, ist es wichtig zu überprüfen, ob die Position des Spin-Label Proteinfunktion verändert. Es gibt mehrere Möglichkeiten, um Funktion zu testen, nach Neuaufbau der Spin-markierten Protein, darunter planar Lipid Bilayer Experimente, Patch-Clamp und TEVC. TEVC ermöglicht die Auswertung einer großen Anzahl von Spin-markierten Kanäle während der Aufnahme von makroskopischer strömen. Um die Funktionalität der Spin-Label Single-Cystein Mutanten zu beurteilen, sind Kanäle in vorgeformte Asolectin Liposomen rekonstituiert. Bei diesem Schritt ist es wichtig, die 10 % Glycerin ausschließen, das in der gesamten Reinigung, vorliegt, da Glycerin verringert die Effizienz der Protein Rekonstitution in Liposomen. Abbildung 4 zeigt einem Vertreter aus A702C-SL TRPV1 Asolectin Liposomen wieder hergestellt und in Xenopus Eizellen mikroinjiziert. Wie erwartet, entlockt pH 5 robuste äußerlich gleichrichtende Strömungen37 , die von Co-Anwendung der TRPV1 Antagonist Capsazepine (CPZ, blaue Spur)26blockiert werden. Mutanten, die nicht nach Spin labeling und Rekonstitution Funktionalität beibehalten sollte von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Funktionelle Charakterisierung der rekonstituierten Spin-Label Single-Cystein Mutanten ist die dritte Checkpoint vor Unternehmen spektroskopische Analyse.

Strukturelle Dynamik von Spin-markierten eTRPV1 Mutanten von CW-EPR und überwacht Hirsch

Nitroxid Spin Labels sind empfindlich auf die Umgebung und die Flexibilität der Protein-Rückgrat, das Label ist, befestigt17. CW-EPR dadurch Bestimmung der dynamischen Regime einen bestimmten Spin-Label Cystein; Positionen der wässrigen Medien oder die Membran ausgesetzt sind nämlich, dynamischer als diejenigen auf Proteinprotein Interaktionen17beschränkt. Abbildung 5A zeigt Positionen Glu651, Ile679 und Ala702 in TRPV1 Mobilität Parameter überwachen möchten. Um der Mobilität-Parameter des Prüfpunkts Spin-Label zu berechnen, berechnet man die Inverse der Zentrallinie Breite des ersten Derivative Absorptionsspektren (Abbildung 5 b, schwarze Linie ΔHo−1). E651C-SL (Abb. 5 b) zeigt etwa einen Spektrallinie Form und Mobilität (0,24) häufig gefundenen Wert auf dynamische Positionen bei der Membran Schnittstelle26. Auf der anderen Seite I679C-SL und A702C-SL ausstellen Verbreiterung der Spektren (siehe gestrichelte Linien) und eine Verringerung der Mobilität-Werte (0,16 und 0,18, beziehungsweise; Abbildung 5 b) 26 , die mit ihrer eingeschränkten Umgebung (Protein-Protein), gemäß der Cryo-EM Struktur1übereinstimmen.

Abbildung 5 zeigt die Spektren von Spin-Label TRPV1 Mutanten nach der Rekonstitution in Asolectin Liposomen. Wie erwartet, änderte die dynamischen Eigenschaften der Spektren für E651C-SL und A702C-SL nach Rekonstitution, sich nicht wie ihre Form und Mobilität Werte in Lösung wie eine Membran Umgebung26identisch sind. Auf der anderen Seite zeigt I679C-SL ein laut Spektrum; Infolgedessen werden die unteren (blauer Pfeil) und höher (roter Pfeil) Feldkomponenten weniger offensichtlich. Laute Spektren sind in der Regel nicht erwünscht, da sie dazu neigen, die Mobilität der Spin-markierten Position zu unterschätzen. Diese Spektraltyp könnte das Produkt von ineffizienten Protein Rekonstitution, anstatt Kennzeichnung, da das I679C-SL-Signal in Lösung stabil ist.

Hirsch-Daten sind eine Summe von oszillierenden, sinusförmige Signal zerfällt, enthält Informationen über die Entfernung Verteilung der wechselwirkenden Spin-Etiketten38,39. Der Zeitraum und der Komplexität des Zerfalls reflektiert direkt die zugrunde liegende Entfernung Verteilung. Die Entfernung Verteilung besteht aus der Anzahl von Bauteilen in der Stichprobe und ihrer Erkrankung. Daher die zeitbereichssignal leitet sich von der zweipoligen Kupplung zwischen den nicht fixierten, fernen Spin Etiketten in Lösung die in der Regel eine exponentielle Hintergrund Zerfall verursachen, Andrigidly Drehungen innerhalb der gleichen Protein19,40gekoppelt. Rehe kann insbesondere die Bestimmung des Intra-Protein Langstrecken Distanzen (20-70 Å) zwischen Spin-Label Rückstände19. Abbildung 6 zeigt den Signal-Zerfall und die entsprechende Verteilung der Abstand des E651C-SL. Die Verbreitung des Glu651 zeigt drei Zinnen, 24, 36 und 58 Å26entspricht. Die zwei kürzeren Strecken stehen im Einklang mit der geschlossenen TRPV1-Struktur (23 und 32 Å für Cβ-Cβ Abstände)1, während der dritte 58 Å Gipfel Proteinaggregation entsprechen könnte.

Figure 1
Abbildung 1: Experimentelle Umriss. Diagramm der experimentellen Gliederung erforderlich, um auszudrücken, reinigen und eTRPV1 für EPR und Hirsche rekonstruieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Funktionelle Charakterisierung von eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten. (A) schematische Darstellung der TRPV1 Konstrukte für die spektroskopische Analyse verwendet (eTRPV1: Cystein-weniger TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 Zellen mit dem Ausdruck ihrer WT TRPV1, eTRPV1 und Mutanten (beladen mit Ca2 +-sensible Fluo-4-AM) wurden analysiert für Capsaicin (10 µM)-evozierten Antworten mithilfe von Fluoreszenz Ca2 + Bildgebung. Farbbalken zeigt relative Änderungen in Fluoreszenzintensität, mit blau und rot für die niedrigsten und höchsten zytoplasmatischen Ca2 +, beziehungsweise. Weiße Balken repräsentiert 100 µm (C) nach links, eine Untereinheit (S5, Pore Helix, S6 und TRP Domain) der TRPV1 Tetramer Struktur Hervorhebung Single-Cystein Rückstände (gelbe Kugeln) entlang dem Kanal-Sequenz eingeführt. Recht, Strom-Spannungs-Beziehungen bestimmt durch TEVC Aufnahmen von Xenopus Eizellen mit dem Ausdruck WT TRPV1, eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten mit pH 5 in Frage gestellt. Hintergrund-Ströme (grunge). Von der ursprünglichen Abbildung26geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Biochemische Charakterisierung von eTRPV1 und Single-Cystein Mutanten.
Größe-Ausschluss Chromatographie Profil von DDM solubilisiert eTRPV1 und Single-Cystein Spin-Label Mutanten nach Ausdruck und Reinigung von Sf9 Zellen. Einschub: SDS-PAGE Gel zeigt die Monomere eTRPV1-MBP-Fusionsprotein (modifiziert von der ursprünglichen Abbildung26). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Funktionelle Charakterisierung einer Spin-markierten eTRPV1 mutierte.
Strom-Spannungs-Beziehungen von TEVC aus Xenopus Eizellen mikroinjiziert Spin-beschriftet mit Proteoliposomes ermittelt, A702C mit pH 5 (rot) in Frage gestellt und durch Capsazepine blockiert (CPZ, blau: 40 µM). Hintergrund-Ströme (grunge). Von der ursprünglichen Abbildung26geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Mobilitäten von Spin-markierten eTRPV1 Mutanten durch CW-EPR bestimmt.
(A) zwei Untereinheiten (S5, Pore Helix, S6 und TRP Domain) der TRPV1 Tetramer Struktur Hervorhebung der Aminosäurereste (gelbe Kugeln) durch Site-verwiesene Spin labeling Spectroscopies sondiert. (B) die erste Ableitung der CW EPR-Spektren von Spin-Label Cystein Mutanten im DDM-Lösung. (C) die erste Ableitung der CW EPR-Spektren von Spin-Label Cystein Mutanten in Asolectin Liposomen rekonstituiert. Spektren wurden bei pH 7.4 (geschlossener Zustand) erhalten. ΔHo−1 bezeichnet die Größe des Parameters Mobilität. Die schwarze gepunktete Linie zeigt die Verbreiterung der Spektren. Blaue und rote Pfeile bezeichnen die niedrigen und hohen Feldkomponenten von Spektren, beziehungsweise. EPR-Spektren wurden auf die Gesamtzahl der Spin Etiketten normalisiert. Von der ursprünglichen Abbildung26geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Entfernung Verteilung von eine eTRPV1 Mutante in Waschmittel.
DEER Echo (A) und Abstand Verteilung (B) der Spin-Label Mutant E651C; eine Summe der Mittelwerte wurde auf die Hirsch-Daten ausgestattet. P(r) bezeichnet Abstand Verteilung des Spin-Paare41. Spektren wurden bei pH 7.4 (geschlossener Zustand) erhalten. Von der ursprünglichen Abbildung26geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Aktuelle Technologien für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Membranproteine machten es möglich, ausreichende Mengen an Protein für spektroskopische Untersuchungen14,15,16,42zu erhalten. Hier haben wir diese Technologien, um auszudrücken, zu reinigen, rekonstruieren und spektroskopische Analysen in TRPV1 angepasst.

Unter den kritischen Schritten in das Protokoll unten sind die, die wir für TRPV1 Fehlersuche haben und, die möglicherweise für andere Proteine eingestellt werden. Ändern Sie die DNA-Sequenz um eine Vorlage zu generieren, die 0,5 - 1 mg/mL Spülmittel gereinigt Proteins ergibt; Vorlagen, die weniger als 0,5 mg/mL Protein liefern sind anspruchsvoll, da wachsen mehr als 6 Liter Insektenzellen Kulturen pro Mutant erforderlich wäre. Eiweiß muss konzentriert, nicht weniger als 2 mg/mL, ohne DÄMMUND, Spin-Kennzeichnung Effizienz zu steigern. Kennzeichnung bei geringen proteinkonzentrationen und/oder in Gegenwart von DÄMMUND erzeugt Spuren Laute EPR-Spektren. Obwohl die Proteine während der Reinigung bei 4 ° C gehalten werden, gilt es, Spin Kennzeichnung bei RT zur Effizienzsteigerung führen. Während der Reinigung und Kennzeichnung verbessert Glycerin proteinstabilität; jedoch muss vollständig vor Rekonstitution, entfernt werden, da es die Menge an Protein in Liposomen verringert und Laute EPR-Spektren erzeugt. Verringerung der Waschmittel Konzentration unterhalb der CMC ist eine gängige Praxis bei Rekonstitution; jedoch neigt TRPV1, vor Aufnahme in die Liposomen auszufällen. Um dieses Problem zu lösen, wurde TRPV1 über Nacht inkubiert, mit vorgeformten Liposomen genau bei der CMC zu vermeiden Proteinfällung und erhöhen Sie die Anzahl der Kanäle in der Proteoliposome Vorbereitung. TRPV1 ist voll funktionsfähig in Asolectin Liposomen28; Daher war es die bevorzugte Lipid-Mischung, die in diesem Protokoll verwendeten. Allerdings gilt es, die lipidzusammensetzung in dem ein bestimmtes Protein funktional (z.B.Cholesterin ist) bevor Sie mit spektroskopische Analysen zu bestimmen.

Spektroskopische Ansätze wie EPR und Hirsche mehrere Einschränkungen, unter anderem: Veränderungen in der Vorlage Proteinsequenz, Verbesserung der biochemischen Stabilität, Auswirkungen haben könnten, in Funktion26; Einführung von Gebietsfremden einzelne Cysteine sowie Spin-Label, möglicherweise nicht in bestimmten Regionen des Proteins vertragen; große Mengen an markierte Proteine zu erhalten; und begrenzte Konformationsänderungen Festlegung Abstände mit REHEN im Waschmittel Micellen. Jedoch konnte die letztere Beschränkung überwunden werden, durch das Sammeln der Spektren bei Q-Band Frequenz von TRPV1 Mutanten in Nanodiscs19,43rekonstituiert. Dennoch kommt der Vorteil dieser Ansätze hauptsächlich aus dem Muster der globalen Dynamik, Erreichbarkeiten und Entfernung mehr als der Absolute Wert einer angegebenen Position.

Temperaturempfindlichkeit ist eines der faszinierendsten und weniger verstanden gating Mechanismen; Daher wäre mit spektroskopischen Methoden, es möglich, festzustellen, wie Membranproteine Wärmeenergie in Protein-Bewegung in einer Membran Umgebung umsetzen. Wichtig ist, wäre es schwierig, strukturelle Veränderungen zu bestimmen, während der thermischen Anspritzung mittels Röntgenkristallographie oder Cryo-EM, da diese Techniken durchgeführt werden, bei Temperaturen unter dem Gefrierpunkt. Zukünftige Experimente werden auf die Bestimmung TRPV1 Konformationsänderungen kompatibel mit Thermal-abhängige Anspritzung mit EPR, Hirsche oder Fluoreszenz ändert gerichtet werden. EPR-Spektroskopie lieferte detaillierte mechanistische Modelle für prokaryotic Ionenkanäle, so dass wir erwarten, dass durch die Verwendung der oben beschriebenen Protokolle, gewinnen wir einen Einblick in die Mechanismen der Aktivierung und Medikament-Bindung von Säugetieren Ionenkanäle mit Spektroskopische Methoden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir sind sehr dankbar, Dr. H. Mchaourab für den Zugriff auf die EPR und Hirsche Spektrometer und Dr. T. Rosenbaum für die Bereitstellung der Full-Length Cystein-weniger TRPV1 Plasmid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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Biochemie Ausgabe 137 Transienten Rezeptor potential Vanilloid 1 TRPV1 Reinigung Rekonstitution Spin-Etikettierung EPR-Spektroskopie Hirsch-Spektroskopie
Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse
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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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