Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.

Abstract

תעלות יונים Polymodal מגלי גירויים מרובים מפלאי שונים לתוך השינויים allosteric; אלה הייצורים החיים דינמיים הם מאתגרים לקבוע ולהישאר אינו מודע לקיומם. עם ההתקדמות האחרונה יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM) שפיכת האור על המאפיינים המבניים של אתרי קישור אגוניסט, מנגנון הפעלה של מספר תעלות יונים, הבמה מוכנה לניתוח מעמיק דינמי של gating שלהם מנגנונים שימוש בגישות ספקטרוסקופיות. שיטות ספקטרוסקופיות אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה (EPR) ו אלקטרון כפול-אלקטרון תהודה (צבי) היה מוגבל בעיקר במחקר של תעלות יונים prokaryotic זה יכול להיטהר בכמויות גדולות. הדרישה עבור כמויות גדולות של חלבונים פונקציונליים ויציב ממברנה יש הקשו המחקר של תעלות יונים יונקים באמצעות הגישות האלה. EPR וצבאים מציעים יתרונות רבים, לרבות קביעת המבנה ושינויים דינמי של חלבון ניידים אזורים, אמנם ברזולוציה נמוכה, שעשויה להיות קשה להשיג על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-EM, וניטור gating הפיך מעבר (קרי, סגור, פתוח, רגיש, רגישות). כאן, אנו מספקים פרוטוקולים להשגת מיליגרם של קולטן ארעי solubilized דטרגנט פונקציונלי פוטנציאליים הקטיון ערוץ תת V חבר 1 (TRPV1) יכול להיקרא על ספקטרוסקופיה EPR וצבאים.

Introduction

עם ההתקדמות יחיד-חלקיקים הקפאה-מיקרוסקופ (הקפאה-EM), יון בתרבית של ערוץ מבנים הושגו בקצב יוצא דופן. במיוחד, מחקרים מבנית של תעלות יונים polymodal, כגון vanilloid פוטנציאלי קולטן ארעי 1 (TRPV1), סיפקו יותר הבנה של הפעלת מנגנונים1,2,3, 4 , 5. עם זאת, נדרש מידע דינמי על יון ערוצי מוטבע בסביבת ממברנה כדי להבין את מנגנוני חסימה ואיגוד התרופות שלהם polymodal.

אלקטרון פאראמגנטיים תהודה (EPR) ואת אלקטרון כפול-אלקטרון תהודה (צבי) spectroscopies סיפקו כמה דגמים מכניסטית סופית ביותר עבור יון ערוצי6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. גישות אלה היה מוגבל בעיקר הבחינה של prokaryotic ו archeal יון ערוצי זה להניב כמות גדולה של חלבונים מטוהרים דטרגנט כאשר overexpressed בחיידקים. עם התפתחות ממברנות האיקריוטים ייצור חלבונים חרק, בתרבית של תאים עבור אפיון פונקציונלי ומבניים14,15,16, עכשיו זה אפשרי להשיג הביוכימי כמויות של חלבונים מטוהרים דטרגנט ללימודי ספקטרוסקופיות.

האותות EPR וצבאים נובעים תווית paramagneticspin (SL) (קרי, methanethiosulfonate) קשורה משקע יחיד-ציסטאין בחלבון. הספין-התוויות דווח על שלושה סוגים של נתוני מבנה: תנועה, accessibilities, מרחקים. מידע זה מאפשר לקבוע אם שאריות קבורים בתוך החלבון או חשופים ממברנה או סביבה מימית אפו ואת הברית ליגנד מכורך13,17,18,19. בהקשר של מבנה ברזולוציה גבוהה (אם זמין), הנתונים EPR וצבאים לספק אוסף של אילוצים שיניעו מודלים דינאמיים בסביבה הטבעית שלהם תוך מעקב אחר המעבר חסימה הפיכה (קרי, סגור, פתוח, רגיש, רגישות). יתר על כן, האזורים גמישה שעשויה להיות קשה לקבוע על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-EM יכולה להיות מושגת באמצעות ערכות נתונים סביבתיים אלה כדי להקצות מבנים משניים, כמו גם מיקום בתוך חלבון20. הקפאה-EM מבנים בשנת השומנים nanodiscs סיפק מידע חיוני על דרך השער של יון ערוצי3,21,22,23,24, 25; עם זאת, גישות ספקטרוסקופיות יכול לספק מידע דינאמי ממדינות הסתגלותי (למשל, שינויים תרמיים) זה יכול להיות קשה לקבוע באמצעות הקפאה-EM.

קשיים רבים להכריעו ליישם EPR וצבאים, כולל חוסר וחלבון לתפקד בעת הסרת כל שאריות ציסטאין (במיוחד בשפע ערוצי יונקים), התשואה חלבון נמוך, חלבון יציבות במהלך טיהור ואחרי ספין תיוג , ואת החלבון צבירת חומרי ניקוי או ליפוזומים. . הנה, עיצבנו פרוטוקולים כדי להתגבר על מחסומים אלה קריטיות והשגת צבי ומידע ספקטרה EPR עבור יונקים קולטן חישה. המטרה כאן היא לתאר את מתודולוגיות כי הביטוי טיהור, תיוג, שיחזור של חולדה ציסטאין-פחות מינימלי ופונקציונלי TRPV1 (eTRPV1) לבנות עבור ניתוחים spectroscopic. מתודולוגיה זו מתאימה עבור אלה חלבונים קרום זה לשמור על תפקידם למרות הסרת שאריות ציסטאין או שמכילות ציסטאין ויוצרים דיסולפידי-חוב. זה אוסף של פרוטוקולים יכול להתאים לניתוח spectroscopic של תעלות יונים יונקים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TRPV1 מוטגנזה מכוונת

הערה: מבנה TRPV1 מינימלי עבור ניתוח spectroscopic26 נבנה מערוץ ציסטאין-פחות באורך מלא TRPV127 באמצעות השיטה תגובת שרשרת (PCR) פולימראז (איור 1). המבנה הזה, ציסטאין-פחות מינימלית TRPV1 (המכונה eTRPV1 להלן) מורכב שאריות 110-603 ו- 627-764. eTRPV1 היה לשכפל ב- pMO (pcDNA3.1 מבוססי וקטור) עבור אנליזה פונקציונלית וב -של וקטור recombinant התורם28 המכיל 8 x היסטידין-מלטוז-מחייב חלבון (MBP)-טבק לחרוט וירוס (אס) עבור ביטוי וטיהור (איור 2 א). מוטציות נוצרו באמצעות מוטגנזה ציסטאין יחיד–eTRPV1. רצפים וקטור וערוץ צוינו 1 הקבצים המשלימים: שיטות משלים.

  1. עיצוב מוטגנזה מכוונת תחל עם כלים מקוונים29.
  2. לערבב פנימה צינור 0.2-mL: 5 μL של 10 x תגובת מאגר, μL 1 של dNTP מיקס (100 מ מ), 1 μL כל 10 μM ואחורה oligonucleotides, μL 1 ng/μL 100 eTRPV1 תבנית ה-DNA26, μL 1.5 של דימתיל סולפוקסיד, μL 1 של האנזים מוטגנזה מכוונת , ואת μL 38.5 מים יונים. לסובב את התערובת לפני הנחת הצינורות thermocycler.
  3. לבצע PCR מוטגנזה מכוונת.
    1. מבצעים דנטורציה (א) ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (ב) דנטורציה ב 95 ° C עבור 20 s, (ג) חישול ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 s, ו- (ד) התארכות ב 68 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות (30 לשנייה בכל 1 kb). חזור על השלבים b ל- d עבור 18 מחזורים, ולאחר מכן לבצע התארכות ב 68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולתחזק את התגובה ב 4 ° C עד שימוש נוסף.
  4. להוסיף 2 μL של Dpnאני אנזים התגובה; לערבב, ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. מבצעים את השינוי
    1. הפשרת e. coli בתאי המוסמכת על קרח.
    2. כדי צינור טרום מקורר סטרילי 14-mL, להוסיף μL 75 של תאים המוסמכת ו 10 μL תערובת PCR Dpn-התייחסתי. מערבבים בעדינות.
    3. דגירה התגובה על קרח דק 30. שמור על הצינור ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 s והכנס אותו ואז מיד על קרח עבור 2 דק צלחת את התערובת על מרק לוריא (LB)-צלחת אגר המכילים carbenicillin (0.2 מ"ג/מ"ל). דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 º C.
    4. הקציר לפחות שלוש מושבות יחיד מהצלחת, לחסן את כל אחד מ 4 ל LB המכילים carbenicillin (0.2 מ"ג/מ"ל) באמצעות צינור סטרילי 14-mL. דגירה תרבויות בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ומנערים ב 250 סל"ד.
    5. ספין למטה תרבויות לילה ב g 8,000 x 10 דקות ולחלץ DNA ועקוב אחר ההוראות של ערכות הכנה מיני זמינים מסחרית.
    6. לוודא הנוכחות של יחיד-ציסטאין מוטציות על-ידי רצפי DNA אוטומטית סטנדרטית (ראה טבלה של חומרים).

2. אנליזה פונקציונלית של eTRPV1, יחיד-ציסטאין מוטציות

  1. HEK293 תא קו תרביות תאים 30
    1. התרבות התאים HEK293 הצלחות טוב 6 - 2 מ של גלוקוז גבוה בינוני (DMEM) לכל טוב (37 מעלות צלזיוס, CO 5%2, 95% לחות). להכין תאים HEK293 70 \u2012 80% confluent.
    2. להכין לתערובת תרביות תאים שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים של 1.5-mL.
      1. עבור תגובה א, להוסיף eTRPV1 או ציסטאין pMO 0.5 µg המכילים מוטציה µL 250 מינימלי הכרחי בינוני (למשל Opti-מ). עבור תגובה B, להוסיף 3 µL של תרביות תאים ריאגנט µL 250 בינוני חיוני מינימלי. דגירה כל תגובה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      2. מערבבים תגובות A ו- B עם פיפטה 1-mL. דגירה את התערובת למשך 45 דקות ב- RT.
    3. להסיר µL 500 של תרבות התקשורת confluent 70-80% היטב ולהוסיף 500 µL של תערובת התגובה. חנות צלחות ללילה עבור Ca2 + הדמיה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות).
  2. Ca2 + הדמיה בתאים HEK293 30
    1. 12-מ מ קוטר coverslips זכוכית דקה עם אתנול וביו -מים ונקי למקם אותם לתוך צלחת 24-. טוב.
    2. להוסיף µL 75 של פולי-l-ליזין במרכז של כל coverslip ולאחסן את הצלחת למשך 45 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות).
    3. להסיר את עודף coverslips פולי-l-ליזין, תשטוף שלוש פעמים עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי להסיר את כל שארית.
    4. ברגע coverslips מוכנות, להמשיך ניתוק התאים מהצלחת 6-. טוב.
    5. מסיר את המדיה ולהוסיף µL 500 ל- PBS חמים (37 מעלות צלזיוס) לרחצה.
    6. הסר PBS, להוסיף 500 µL של טריפסין, ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות.
    7. להוסיף 500 µL של מדיה תרבות חמים (37 מעלות צלזיוס) לעצור את התגובה עיכול ומערבבים עם פיפטה; הימנע ויוצרים בועות. במידת הצורך, התאם את הריכוז תא דילול זה resuspension עם מדיה תרבות נוספת.
    8. זרע µL 250 transfected תאים HEK293 (70% confluent) פלוס 250 µL של תרבות התקשורת (500 µL הסופי נפח לכל טוב) על coverslips שטופלו מראש ולתת להם להתיישב (עבור מצורף) עבור 1-2 h בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות).
    9. בינתיים, להכין פתרון טעינה על-ידי הוספת חומצה pluronic 0.02% 1 מיקרומטר Fluo-4-אם למאגר של מתחזה. מערבבים היטב את הפתרון.
    10. מסיר את המדיה תרבות HEK293 מן הבאר ולהוסיף 500 µL של הפתרון טעינה. דגירה תאים עבור h 1 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות). לשטוף את התאים Fluo-4-טעון פעמיים עם מאגר חם רינגר.
    11. מקום של coverslip עם תאים נטען לתוך צלחת פטרי 10 מ מ שלב מיקרוסקופ (באמצעות 10 X אובייקטיבית; 494 עירור ננומטר, 506 פליטה ננומטר) להופיע Ca תאיים2 + מדידות.
    12. למדוד שינויים בעוצמת פלורסצנטיות לאחר פרפוזיה ליגנדים המתאימים (למשל, 10 קפסאיצין μM) באמצעות תוכנה זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
  3. mRNA והכנות oocytes צפרדע רפואית זריזה 30
    1. Linearize eTRPV1 ו- pMO המכילות מוטציות יחיד-ציסטאין עם Pmeאני עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. ה-DNA נקי ועקוב אחר ההוראות של ערכות טיהור זמינים מסחרית.
    2. שימוש לליניארית וניקה DNAs לסנתז RNAs רצ'ט עם ערכת זמינים מסחרית תואם T7 RNA פולימראז.
    3. RNAs רצ'ט נקי על פי ערכות טיהור זמינים מסחרית. לכמת את כמות ה-RNA על ידי מדידת את ספיגת-260 גל nm.
    4. \U2012 העברת 5 מ"ל של oocytes X. laevis (זמינים מסחרית) לתוך צינור חרוטי 50-mL המכיל 20 מ של פתרון ND96 (96 מ מ NaCl, 2 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ. HEPES, מ מ 1 MgCl2; pH 7.4) עם collagenase 1 מ"ג/מ"ל, nutate למשך 50 דקות ב- RT.
    5. לשטוף את oocytes ב ND96 עד הפתרון ברור; להוסיף collagenase טריים, ללחוץ למשך 30 דקות ב- RT. לבחון את oocytes תחת מיקרוסקופ סטריאו ולהפסיק את העיכול כאשר השכבה החיצונית הזקיקים (מבריק שכבה עם כלי דם אדום) נעדר ב oocytes רוב (90%). לשטוף oocytes ב ND96 עד הפתרון ברור.
    6. העברת oocytes לרכבת התחתית פוליסטירן 50-mL עם ND96 פלוס 1 מ"מ CaCl2 ו- shake עבור ה 1 מתעכל תחת oocytes ידבק הצינור פוליסטירן.
    7. לשטוף oocytes עם ND96 בתוספת 1 מ2 CaCl פתרון תוספת עם 50 µg/mL של גנטמיצין ו- µg/mL 50 של טטרציקלין.
      הערה: להגן על פתרונות המכילה טטרציקלין לאור החשיפה.
    8. בחר oocytes גדולים ללא ממברנות פגום והצגה של הפרדה ברורה בין החיה לבין הפולנים ירקות. . תן oocytes להתאושש במשך 4 שעות לפני microinjection ב-16 ° c
    9. השתמש פיפטות זכוכית (יתר: mm 1.11, תעודת זהות: 0.5, אורך ס מ 8.8) להחדיר נג 1-5 של mRNA של מוטציות eTRPV1, יחיד-ציסטאין לתוך oocytes באמצעות מערכת nanoliter-מזרק (nL 46/s), מיקרוסקופ סטריאו (2 X הגדלה). אחסן oocytes ב 16 ° C ND96 בתוספת CaCl2 ואנטיביוטיקה (gentamycin/טטרציקלין 1 x).
    10. לאחר 72 h, למדוד זרם מאקרוסקופית באמצעות מערכת של רכישת שני-אלקטרודה מתח-קלאמפ (TEVC)31.
    11. משוך פיפטות זכוכית בורוסיליקט (0.3 MΩ), למלא אותם עם 3 מ' אשלגן כלורי.
    12. למקם את oocyte בבית הבליעה הקלטה באמצעות פיפטה העברה, perfuse הפתרון אמבט (120 מ"מ NaCl, 2 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ MgCl2, 1 מ"מ EGTA ו 10 מ מ HEPES פתרון; pH 7.4) במהירות נמוכה.
    13. לטבול שתי אלקטרודות בפתרון אמבט להתאמת קיזוז פיפטה שלהם. דחף בעדינות את האלקטרודות פיפטה (פיפטות זכוכית בורוסיליקט; יתר: 1.5 מ מ, תעודת זהות: 1.10, באורך 10 ס מ) לתוך oocyte עד כניסה קטן נצפית במיקרוסקופ סטריאו (2 X הגדלה), כמו גם שינוי פוטנציאל ממברנה.
    14. לשנות את הגדרות מגבר כדי להקליט זרמים מאקרוסקופית מצב ולמדוד בעת החלת רמפה מתח-קלאמפ מ-80 +80 mV לטעון ס' 1 מערכת זלוף עם הפתרון בשימוש צעד 2.3.12 ב- pH 7.4 (כמו פקד), ב- pH 5 כדי לבדוק את פעילות eTRPV1.

3. יצירת רקומביננטי Bacmid ו- Baculovirus עבור ביטוי חלבון

  1. Bacmid
    1. שינוי צורה μL 100 DH10Bac e. coli המוסמכת תאים עם 7.5 ng של וקטור recombinant התורם המכיל מוטציות eTRPV1 ו/או יחיד-ציסטאין.
    2. להוסיף μL 900 של מדיה SOC (20 מ"ג/מ"ל טריפטון, 5 מ"ג/מ"ל שמרים תמצית, 2.5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, MgSO 10 מ מ4וגלוקוז 20 מ מ), תקופת דגירה של 6-7 h ב 37 ° C ו- 225 סל ד.
    3. זרע µL 100 ישירות מן התערובת, ומן דילולים טורי (1/10 ו- 1/100), בתוך LB-אגר צלחות המכיל 100 μg/mL X-גל, 40 μg/mL IPTG, 7 גנטמיצין μg/mL, טטרציקלין μg/mL 10 ל kanamycin 50 μg/mL. דגירה הלוחות לפחות 48 שעות ב 37 º C.
    4. בחר מושבות לבן כי הם 2 מ מ קוטר, מאז מושבות כחול חסרים את תותב עניין. להשתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא כי מושבות לבן אינם מכילים כל נקודות כחולות.
    5. הקציר לפחות שלוש מושבות יחיד, להעביר אותם לתוך צינור סטרילי 14-mL המכיל 4 מ"ל של מדיה ליברות עם גנטמיצין μg/mL 7, 10 טטרציקלין μg/mL ו- 50 kanamycin μg/mL. דגירה תאים בין לילה (~ 16 h) על 37 ° C ו 250 סל"ד.
    6. קח 1.5 מ של תרבויות בין לילה, דנ א רקומביננטי ולבודד bacmid (עיין 1 קובץ משלים עבור פרוטוקול מפורט). אחסן את bacmid ב 4 ° C עד חודשיים.
      הערה: להכין את המניות גליצרול של DH10Bac e. coli המכיל את bacmid ה-DNA. לקחת 300 μL של תרבות ולהוסיף 200 μL של גליצרול ב-50% (ריכוז גליצרול הסופי של 20%). לאחסן את aliquot ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.
    7. לוודא הנוכחות של eTRPV1, bacmid רקומביננטי באמצעות PCR (עיין 1 קובץ משלים עבור פרוטוקול מפורט).
  2. Baculovirus
    הערה: עבור הליך זה, transfect Sf9 בתאי חרקים בתבנית 6-. טוב. כל הסכומים ואמצעי אחסון ניתנות על בסיס לכל טוב. יש להימנע משימוש באנטיביוטיקה.
    1. צלחת עונה 1 פרק 10 תאים6 Sf9 2 מ"ל של מדיה תא חרקים. מאפשרים לתאים לצרף לפחות 45 דקות.
    2. לדלל μg 1 של recombinant bacmid DNA ב 100 μL של חרקים תא מדיה. מערבבים בעדינות.
    3. לדלל 6 μL של תרביות תאים ריאגנט (TR) ב- 100 μL של חרקים תא מדיה. מערבבים בעדינות.
    4. לשלב את הפתרונות DNA ו ת ר (מן השלבים 3.2.2 ו 3.2.3, בהתאמה). לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
    5. להוסיף 0.8 מ של חרקים תא מדיה לתערובת דנ א/יח; מערבבים בעדינות.
    6. מסיר את המדיה חרקים התא מהתאים Sf9, לשטוף פעם עם 1 מ"ל בינוני טריים.
    7. להסיר את המדיום של השטיפה ולהוסיף תערובת דנ א/יח (3.2.2 \u2012 3.2.5) לתאים. דגירה תאים ב 27 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות (ללא עצבנות).
    8. הסר את התערובת תרביות תאים והחלף 2 מ של חרקים תא המדיה המכילה 0.5% סרום שור עוברית (FBS). דגירה תאים ב 27 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים.
      התראה: למנוע אידוי של התקשורת תא על-ידי מילוי הבארות ריק עם מדיה וכיסוי לצלחת 6-ובכן עם שתי שכבות של הסרט פרפין.
    9. העברת התקשורת התרבות התא לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL. לבודד את המעבר הראשון (P1) ויראלי מניות על ידי מסובב את הצינור ב 8000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי 15-mL ואחסן אותו מיד ב 4 º C.
      הערה: להגן על הנגיף מפני חשיפה קלה על ידי כיסוי ברכבת התחתית עם רדיד אלומיניום.
    10. הדור השני (P2) של מניות ויראלי, שים את תרבות 25-mL השעיה של חרקים תא מדיה-עונה 1 פרק 106 Sf9 תאים למ"ל המכיל 2% FBS לתוך בקבוקון 125 מ"ל (תחתון רגיל, פרקו). להוסיף 25 μL של הנגיף P1 התרבות 25 מ.
    11. דגירה התרבות ב 27 מעלות צלזיוס במשך 72 h.
    12. הקציר המניה ויראלי P2, להעביר את התרבות שפופרת 50-mL החדש, centrifuge זה ב 8000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
    13. להעביר את תגובת שיקוע צינור 50-mL ואחסן אותו מיד ב 4 º C.
      הערה: להגן על הנגיף מפני חשיפה קלה על ידי כיסוי ברכבת התחתית עם רדיד אלומיניום. לבצע ניסוי בקנה מידה קטן כדי titrate היחס וירוס/Sf9 P2 של האופטימלית ביטוי TRPV1 (עיין 1 קובץ משלים עבור פרוטוקול מפורט, סעיף 4 שכותרתו "ניסוי בקנה מידה קטן לוירוס P2.")
    14. ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול, להגדיר תרבות התליה תא Sf9 1-L-2 x 106 תאים למ"ל בתקשורת תא חרקים בתוספת 0.5% FBS לתוך בקבוקון זכוכית בורוסיליקט 2.8-L.
    15. להוסיף 1 מ"ל של P2 וירוס מניות לתרבות 1-L, דגירה זה ב 27 מעלות צלזיוס במשך 72 h.
      הערה: ביום השלישי, צפיפות התא צריך להיות כ 1.5-2.5 x 106 תאים למ"ל.

4. eTRPV1 וטיהור מוטציה בודדת-ציסטאין

  1. ממברנות בידוד28
    1. קציר התרבות ההשעיה 1-L תא חרקים על ידי ספינינג ב g x 4500, 4 מעלות צלזיוס, במשך 20 דקות שוקל בגדר תא (צפוי להיות בסביבות 6-9 גרם).
    2. Resuspend בגדר תא ב- 25-mL המאגר הקר A (36.5 מ מ סוכרוז, 2 מ מ tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP), ו-50 מ"מ. טריס; pH 7.4) בנוכחות מעכבי פרוטאז (1 מ מ phenylmethyl sulfonyl פלואוריד (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 aprotinin μg/mL ו- 1 pepstatin μg/mL). Disaggregate תא גושים לקבל השעיה הומוגנית ולהסתובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    3. לשבור את התאים באמצעות ידנית (דאונס רקמות grinder) או של מהמגן בלחץ גבוה. להסיר את שאריות תאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 g x עבור 20 דקות ב 4 º C.
      הערה: להשאיר את התאים lysed ואת צינורות על קרח במהלך כל התהליך.
    4. לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה ב 100,000 x g במשך 30 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ממברנה ב הנפח הכולל של 20 מ של B מאגר כקרח (150 מ מ NaCl, 10% גליצרול, 2 מ מ. TCEP, 50 מ מ HEPES; pH 7.4), בתוספת מעכבי פרוטאז (כמו שלב 4.1.2).
    5. Aliquot 20 מ של הבולם ממברנה צינורות 50-mL, הקפאה של חנקן נוזלי. לאחסן דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש נוסף.
  2. חלבון טיהור26,28
    1. להפשיר את aliquots קרום על קרח ולהוסיף 3 מ"ל של n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) למחזור (מניות 200 מ"מ). לסובב את הצינור עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס.
    2. Centrifuge הדגימה ב g x 100,000 במשך 30 דקות ב 4 º C. לאסוף את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של שרף עמילוז רטוב נקי. לסובב את התערובת על 2 h-4 מעלות צלזיוס. לטעון את תערובת חלבונים/עמילוז בעמודות כרומטוגרפיה זרימת הכבידה.
      התראה: אל תאפשר שרף להתייבש במהלך שוטף.
    3. רחץ שרף עמילוז חלבון מכורך עם 10 פעמים את המיטה נפחי C המאגר הקר (150 מ מ NaCl, 10% גליצרול, 50 מ מ HEPES, 0.5 מ מ DDM, 0.1 μg/mL asolectin, 0.5 מ מ TCEP; pH 7.4). לשטוף עם המיטה 10, נפחי D המאגר הקר (150 מ מ NaCl גליצרול 10%, 50 מ מ HEPES, 0.5 מ מ DDM, 0.1 μg/mL asolectin, pH 7.4).
      הערה: לפני כביסה, דגה מאגר D ללא סבון או שומנים, מנקה עם חנקן. לאחר degasification, להוסיף DDM ו asolectin.
    4. Elute eTRPV1 חלבון עם שברים 0.5 mL, עד 5 מ ל, של קרח degassed מאגר D, בתוספת 20 מ מ מלטוז. במידת האפשר, לבצע את מנקי • תנאי ב 4 º C.
    5. לכמת את כמות החלבון על ידי מדידת את ספיגת-גל 280 ננומטר.
      הערה: פרוטוקול זה מניב 0.5 עד 1.0 מ ג חלבון לליטר של תרבות. התשואה חלבון יכול להשתנות עבור כל מוטציה בודדת-ציסטאין eTRPV1. לניסויים EPR וצבאים, לגדול 4 \u2012 6 L של תרבות.

5. eTRPV1 יחיד-ציסטאין Mutant Site-Directed ספין תיוג

  1. להתרכז שברים המכילות eTRPV1 באמצעות יחידת צנטריפוגלי מסנן (הקיצוץ = 100 kDa) \u2012 עד 2 2.5 מ"ג/מ"ל של תיוג (מחזורים של 7,000 x g למשך 2 דקות ב 4 ° C).
  2. להוסיף 10-fold שן טוחנת עודף (3 פעמים, כל 30 דקות) של מתיל (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methanethiosulfonate (MTSSL) ספין תווית פתרון מניות 100-מ מ בדימתיל סולפוקסיד אל החלבון מרוכז (מונומר eTRPV1: MTSSL ב- 1:10 יחס טוחנת) 17. לשמור את התגובה בחושך ב RT במשך ארבע וחצי שעות, ואחריו הדגירה לילה ב 4 º C.
    הערה: בשלב זה, MBP היתה אפשרות להסיר על-ידי הוספת פרוטאז אס בתקופת הדגירה תיוג-ספין לילה.
  3. ETRPV1 התווית על-ידי סחרור עומס על עמודה כרומטוגרפיה של אי-הכללה של גודל equilibrated במי המאגר (150 מ מ NaCl, 20 מ מ. HEPES, 0.5 מ מ DDM; pH 7.4), נשלט על-ידי מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) חלבון מהיר. לאסוף את השברים המכיל eTRPV1 tetramer.
    הערה: אין לכלול גליצרול 10% בשלב זה, שכן הן מפחיתות את יעילות הכינון.
  4. לכמת את כמות החלבון על ידי מדידת את ספיגת-גל 280 ננומטר.
  5. להעריך את הטוהר של המדגם על-ידי הפעלת ג'ל מרחביות-דף (ג'ל העיניינים, 4 \u2012 20%). המדגם עכשיו הוא מוכן למדידות ספקטרוסקופיות פתרון ו/או proteoliposomes.

6. eTRPV1 התווית על-ידי סחרור שיחזור מוטציה ציסטאין יחיד

  1. יבש 10 מ ג של asolectin באמצעות המאדה תחת ואקום (≤100 mbar) עבור h 1-40 ° C. כדי להפוך את asolectin ליפוזומים, להוסיף 1 מ"ל של מאגר F (200 מ"מ NaCl, 5 מ מ מגבים; pH 7.4), sonicate את התערובת למשך 15 דקות, או עד המדגם הוא הומוגני.
  2. יציבות ליפוזומים על-ידי הוספת DDM ריכוז סופי של 2 מ מ, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
  3. להתרכז החלבון שכותרתו-2 מ"ג/מ"ל ולהוסיף אותו ליפוזומים באמצעות יחס חלבון/השומנים של 1:5 (מסה: מסה).
    התראה: חשוב לשמור על ריכוז החלבון הנ ל, מאז תיוג-ספין היעילות פוחתת בריכוזים נמוכים, בתיכון שהחלבון עשוי לזרז.
  4. להוסיף מאגר F כדי להתאים את תערובת חלבונים/ליפוזום לריכוז מיצלה קריטי DDM (CMC) וכן דגירה בין לילה ב 4 ° C עם עצבנות עדין.
  5. להכפיל את עוצמת הקול של תערובת חלבונים/ליפוזום עם מאגר F וחומרי ניקוי להסיר על-ידי הוספת ברצף 3 aliquots של פולרי חרוזים adsorbent פוליסטירן (30 מ"ג, 50 מ"ג ו 80 מ ג) במרווחים 1-h עם עצבנות עדין-RT.
  6. לטעון את התערובת על מסנן עמודה (כוח המשיכה לזרום כרומטוגרפיה עמודה) כדי להסיר את החרוזים ולהעביר את התערובת proteoliposomes צינור ultracentrifuge. Centrifuge את הדגימות-g x 100,000 עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב μL 30 מאגר פ
    הערה: דגימות מוכנים עבור ניתוח spectroscopic, הזרקה לתוך צפרדע רפואית oocytes. אם הדגימות לא ניתן להשתמש באותו היום, הקפאה אותן בחנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  7. Proteoliposomes -צפרדע רפואית oocyte אלקטרופיזיולוגיה26,32
    1. להזריק 50 nL של דילולים שונים של התווית על-ידי סחרור proteoliposomes לתוך oocytes צפרדע רפואית כמתואר בסעיף 2.2.
    2. לבצע מדידות TEVC לאחר 12 שעות של הזרקת כמתואר בסעיף 2.3.10.
  8. המשך לבצע מדידות ספקטרוסקופיות וניתוח (סעיף 7).

7. צבי ו- EPR Spectroscopies

  1. זוגי אלקטרון-תהודה (צבי) ספקטרוסקופיית.
    1. ביצוע מדידות צבי ספקטרומטר EPR פעמו Q-הלהקה תדר (34 GHz) ומצוידים עם מגבר 10 וואט עם הרצף ארבע-דופק חינם זמן-מת ב 83° באמצעות תוכנה שסופק על-ידי יצרן33.
    2. תוספת 50 מיקרומטר של מוטציות התווית על-ידי סחרור ציסטאין eTRPV1 מטוהרים דטרגנט במי המאגר (שלב 5.5) עם 30% (v/v) גליצרול להגנה-הקפאה.
    3. לטעון את הדגימה לתוך צינור קפילרי קוורץ אטום ספין לתחתית הצינור על ידי במהירות נמוכה קצר צנטריפוגה (100 x g).
    4. למקם את צינור קפילרי בחנקן נוזלי להקפיא את הדגימה. ניתן לאחסן את הדגימות בשלב זה ב-80 מעלות צלזיוס למדידה מאוחר יותר.
    5. מקם את הדגימה ישירות לתוך מיקרוגל מהוד ולתת לו equilibrate מחדש ב-83 מעלות עבור 10 \u2012 20 דקות.
    6. למדוד את הדגימה באמצעות פרוטוקול תקני של צבי 4-דופק, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – mw1 – τ2 – הד (π)34. המרחק הדופק (π/2) mw1 ו mw1 (π) הם 10 ל- 20 ns, בהתאמה, ל-40 ns על mw2 (π). לקבוע את ההפרדה בתדירות 63 MHz.
      הערה: ניתן לנתח נתונים דעיכה צבי ראשי עם בנה בית תוכנה (למשל ב- Matlab) ההנחה היא סכום של הפצות גאוסיאנית לתיאור של המרחקים בין הספין תוויות19,35.
  2. ספקטרוסקופיה EPR (CW) מכ
    1. מבצע ניסויים CW EPR-RT ספקטרומטר X-band (9.6 GHz) באמצעות תוכנת היצרן.
    2. להפעיל את המכשיר על-ידי הפעלת chiller מים את המסוף, את אספקת החשמל מגנט. להתחבר את תוכנת המכשיר, למקם את המכשיר בהרמוניה והמתן לפחות 30 דקות עבור כלי להתחמם.
    3. לטעון µL 20 של הדוגמה מהצעד 5.5 לתוך צינור קפילרי זכוכית 25-µL באמצעות נימיות, לאטום את קצה הצינורית עם חומר איטום.
    4. לטעון את צינור קפילרי לתוך חלל המיקרוגל, אנושות זוג מהוד באופן ידני או באופן אוטומטי באמצעות הפונקציה כיוון אוטומטי של התוכנה.
    5. לאסוף את ספקטרום נגזרת ראשונה בתנאים כלי סטנדרטי: 100 קילו-הרץ מיקרוגל אפנון אפנון שדה מגנטי 1.6 גרם, 10 mW הספק מיקרוגל.
    6. עבור ניתוח נתונים ומצגת, לתקן את ספקטרום רקע, לנרמל אותם על-ידי חלוקת הספקטרום לפי הערך שיא אל שיא של אינטגרל כפול.
    7. לקבוע את הניידות ספין-תווית על ידי מדידת ההופכי של רוחב הקו המרכזי של ספיגת נגזרות ספקטרה (oΔH-1) הראשון36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון פונקציונלי של מינימלי ציסטאין-פחות TRPV1 לבנות (eTRPV1), יחיד-ציסטאין מוטציות

הצעד הראשון לקראת לימודי ספקטרוסקופיות הוא מהנדס ולאפיין מבנים ציסטאין-פחות חלבון (איור 2 א) מתפקדים, תשואות כמויות ביוכימיה של חלבונים. eTRPV1 מתפקד כפי שנקבע על ידי Ca2 + הדמיה ו- TEVC (איור 2B-C). יתר על כן, eTRPV1 מספק כמויות מספיקות של חלבון מטוהרים דטרגנט בשביל ניסויי EPR וצבאים (0.5 - 1 מ ג לליטר של תאים Sf9)26. הצגת יחיד cysteines באזורים חלבון מסוים עשוי להשפיע על תפקוד שלהם. איור 2B מציגה מספר דוגמאות של מוטציות יחיד-ציסטאין (E651C ו- A702C) על eTRPV1 המתנהגים כמו פראי סוג (WT), כיוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית שלהם גדל כאשר מוסיפים אגוניסט TRPV1 (למשל, קפסאיצין) כדי HEK293 המכילים eTRPV1 תאים, כפי שמוצג על ידי Ca2 + הדמיה26. מצד שני, A680C הוא דוגמה אופיינית מוטנט ציסטאין פונקציונלי, כמו הוא להבחין מגניחותיה ברקע. המוטציה A680C הוצאה מהכלל לצורך ניתוח נוסף. לאחר Ca2 + הדמיה ניסויים, פונקציה חד-ציסטאין למוטציות נבדק באמצעות מלחציים TEVC או תיקון כדי להעריך את תכונותיהם ביופיזיקלי. איור 2C מראה כי מוטציות מסכם את הדברים האופייניים TRPV1 כאשר הם אתגר pH 5, כפי שנקבע על ידי TEVC26ה"תיקון כלפי חוץ. אנליזה פונקציונלית של מוטציות יחיד-ציסטאין הוא למחסום הראשון בעבר התחייבות פרוטוקולים ביטוי וטיהור.

איפיון ביוכימי של eTRPV1, יחיד-ציסטאין מוטציות

פרוטוקול טיהור שתוארו לעיל התשואות solubilized-אבקת חלבון זה יכול להיקרא באמצעות שינוי קוולנטיות ציסטאין (למשל, fluorophores, התווית על-ידי ספין [SL] מתיל-methanethiolsulfonate) לאורך הרצף TRPV1 עבור ניתוח spectroscopic. TRPV1 מינימלי ערוץ המכילים שאריות ציסטאין נודדים כמו מינים יציבים monodisperse (~ 13.6 mL), כפי שנקבע על ידי גודל-הדרה כרומטוגרפיה (איור 3). eTRPV1, יחיד-ציסטאין התווית על-ידי סחרור מוטציות (E651C-SL ו- A702C-SL) מסכם את הדברים את פרופיל • תנאי ויציבות מוצעים על-ידי מינימלית TRPV1 לבנות (איור 3)26. הפרופיל • תנאי יכול להשתנות בין מוטציות שונות, כפי cysteines יחיד עשוי להשפיע על יציבות החלבון. במקרים מסוימים, ליצור מוטציות אגרגטים; שבריר של המדגם יכול elute-נפח חלל של העמודה (8-9.5 מ ל), הפחתת כמות חלבון זה נודד כמו tetramer (איור 3, חץ למטה אדום). במקרה זה, וניתן לשנותם תא תרבות כרכים כדי לפצות על החלבון לאיבוד בתוך השבר צבור, או אחד יכול שלא לכלול את המוטציה הזה ניתוח נוסף ולהמשיך לבחון את שאריות שכנות. דוגמאות אחרות כוללות התרחבות של הפסגה התואם tetramer. רחב יותר מ 3 ל הראשי פסגות לא מומלצים לניתוח spectroscopic, כי הן מכילות מולטי-לפזר מינים. איפיון ביוכימי של התווית על-ידי סחרור מוטציות יחיד-ציסטאין הוא נקודת הביקורת השנייה לפני שיחתמו שיחזור וניתוח spectroscopic.

אפיון של מחדש ספין התווית על-ידי מוטציות יחיד-ציסטאין של eTRPV1 תפקודית

כי האותות EPR וצבאים מסתמכים על הקובץ המצורף של ספין-תווית פאראמגנטיים משקע ציסטאין, חשוב לוודא המיקום של הספין-התווית הפיצולים וחלבון לתפקד. ישנן מספר דרכים כדי לבדוק תפקוד לאחר לשחזר את התווית על-ידי סחרור חלבון, כולל ניסויים bilayer השומנים מישורי, מלחציים תיקון TEVC. TEVC מאפשר הערכת מספר רב של ערוצי התווית על-ידי סחרור בעת הקלטת הזרמים מאקרוסקופית. כדי להעריך את הפונקציונליות של המוטציות יחיד-ציסטאין התווית על-ידי סחרור, ערוצים הם מחדש asolectin הקבועים מראש ליפוזומים. במהלך שלב זה, חשוב לכלול את גליצרול 10% זה מוצמד טיהור, מאז גליצרול מפחית את היעילות של חלבון שיחזור לתוך ליפוזומים. איור 4 מראה נציג תוצאה של TRPV1 A702C-SL מחדש ליפוזומים asolectin microinjected לתוך צפרדע רפואית oocytes. כצפוי, pH 5 מעורר חזקה כלפי חוץ מתקנתנ זרמי37 שנחסמים על-ידי יישום שיתוף של TRPV1 אנטגוניסט capsazepine (CPZ, מעקב כחול)26. לא להיות כלולים מוטציות אשר אינם שומרים על פונקציונליות לאחר ספין תיוג, שיחזור ניתוח נוסף. אפיון פונקציונלי של מוטציות יחיד-ציסטאין התווית על-ידי סחרור משוקם הוא המחסום השלישי לפני ניתוח spectroscopic התחייבות.

מבניים דינמיקה של ספין-הנקרא eTRPV1 מוטציות המנוטרת על-ידי CW-EPR וצבאים

Nitroxide ספין תוויות רגישים לסביבה ומצורפת הגמישות של עמוד השדרה חלבון שאליה התווית היא17. לפיכך, CW-EPR מאפשרת קביעה של משטר דינמי של ציסטאין התווית על-ידי סחרור נתון; כלומר, תפקידים נחשפים בתקשורת מימית או הקרום הן דינמיות יותר מאשר אלה מוגבלת אינטראקציות חלבון-חלבון17. איור 5A מציג עמדות Glu651, Ile679 ו Ala702 TRPV1 שבחרת לעקוב אחר פרמטרים ניידות. כדי לחשב את הפרמטר ניידות של המכשיר תווית ספין, אחד מחשבת ההופכי של רוחב הקו המרכזי הראשון נגזרות הקליטה הספקטרום (איור 5B, קו שחור ΔHo−1). למשל, E651C-SL (איור 5B) הצגת ספקטרליות צורה וניידות ערך (0.24) נפוץ למצוא על עמדות דינמי-ממשק ממברנה26. מצד שני, I679C-SL ו- A702C-SL נספח הרחבה של הספקטרום (ראה קווים מנוקדים) לבין ירידה בערכי ניידות (0.16 ו- 0.18, בהתאמה; איור 5B) 26 שאינם עקביים עם סביבתם שמסביב מוגבלת (חלבון), על-פי מבנה הקפאה-EM1.

איור 5C מראה את הספקטרום של התווית על-ידי הספין TRPV1 המוטנטים לאחר שיחזור ב asolectin ליפוזומים. כצפוי, התכונות דינמי של הספקטרום עבור E651C-SL ו- A702C-SL לא השתנה לאחר שיחזור, כפי ערכיהם צורה וניידות זהים פתרון כמו קרום הסביבה26. מצד שני, I679C-SL מדגים קשת רועש; כתוצאה מכך, התחתון (חץ כחול) ואת רכיבי שדה (חץ אדום) גבוה יותר להיות פחות ברורה. ספקטרה רועש הם לא בדרך כלל הרצויה, כפי שהם נוטים להמעיט את הניידות של העמדה התווית על-ידי סחרור. סוג ספקטרום זה יכול להיות התוצר של הכינון חלבון לא יעיל יותר מאשר תחת-תיוג, מאז האות I679C-SL בפתרון הוא עמיד.

צבי נתונים הם סכום נרקב אות נדנוד, sinusoidal המכיל מידע על התפלגות מרחק של ספין-תוויות שמעצבת38,39. התקופה ואת המורכבות של הריקבון ישירות משקף את התפלגות מרחק המשמשת כבסיס. התפלגות המרחק מורכב של מספר רכיבים מבניים נוכח המדגם והפרעה שלהם. לפיכך, האות בתחום הזמן נובע dipolar צימוד בין תוויות שאינו קבוע, מרוחק ספין בפתרון אשר בדרך כלל לגרום של קרינת הרקע מעריכית, andrigidly בשילוב ספינים בתוך ה19,אותו חלבון40. באופן ספציפי, צבי מאפשר קביעת אינטרה-חלבון ארוכי טווח המרחקים (20-70 Å) בין שאריות התווית על-ידי סחרור19. איור 6 מראה את העששת אות והפצה המרחק המתאים של E651C-SL. חלוקת Glu651 מציג שלוש פסגות המתאים 24, 36, ו- 58 Å26. מרחקים קצרים שני עקביים עם המבנה TRPV1 סגור (23 ו- 32 Å עבור Cβ-Cβ מרחקים, בהתאמה)1, ואילו הפסגה Å 58 השלישית עשויה להתאים צבירת חלבון.

Figure 1
איור 1. חלוקה לרמות ניסיוני. דיאגרמה של החלוקה לרמות ניסיוני הנדרש כדי לבטא, לטהר, לשקם eTRPV1 עבור EPR וצבאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. אפיון פונקציונלי של מוטציות eTRPV1, יחיד-ציסטאין. (א) ייצוג סכמטי של המבנה TRPV1 המשמש לניתוח spectroscopic (eTRPV1: ציסטאין-פחות TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 תאים TRPV1 WT לביטוי, eTRPV1, מוטציות (נטען עם Ca2 +-רגיש Fluo-4-AM) נותחו עבור קפסאיצין (10 מיקרומטר)-עורר תגובות באמצעות קרינה פלואורסצנטית Ca2 + הדמיה. סרגל הצבע מציינת שינויים היחסית בעוצמת פלורסצנטיות, עם כחול ואדום המציין את הגבוהים והנמוכים cytoplasmic Ca2 +, בהתאמה. בר לבן מייצג 100 מיקרומטר. (ג) שמאלה, אחת יחידה משנית (S5, סליל נקבובית, S6 ותחום TRP) של מבנה tetramer TRPV1 סימון שאריות יחיד-ציסטאין (כדורים צהובים) הציג לאורך הרצף ערוץ. נכון, זרם-מתח מערכות יחסים נקבע על ידי הקלטות TEVC oocytes צפרדע רפואית לבטא WT TRPV1, eTRPV1 ויחיד-ציסטאין מוטציות עם pH 5. רקע זרמי (bkgrd). ששינה הדמות המקורית26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. איפיון ביוכימי של מוטציות eTRPV1, יחיד-ציסטאין.
גודל-הדרה כרומטוגרפיה פרופיל של DDM-solubilized eTRPV1, יחיד-ציסטאין התווית על-ידי סחרור מוטציות לאחר ביטוי וטיהור מתאי Sf9. שיבוץ: ג'ל מרחביות-דף מציג את חלבון כימרי eTRPV1 monomeric-MBP (שונה איור מקורי26). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. אפיון פונקציונלי של מוטציה eTRPV1 התווית על-ידי סחרור.
זרם-מתח מערכות יחסים נקבעים על-ידי TEVC של צפרדע רפואית oocytes microinjected עם proteoliposomes המכיל התווית על-ידי סחרור A702C תיגר עם pH 5 (אדום), תיחסם על-ידי capsazepine (CPZ, כחול: 40 µM). רקע זרמי (bkgrd). ששינה הדמות המקורית26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. Mobilities של מוטציות eTRPV1 התווית על-ידי סיבוב נקבעים על-ידי CW-EPR.
(א) 2 subunits (S5, סליל נקבובית, S6 ותחום TRP) של TRPV1 tetramer מבנה המדגיש את שאריות חומצה אמינית (כדורים צהובים) נחקר דרך האתר מכוון spectroscopies ספין-תיוג. (B) נגזרת ראשונה של CW EPR ספקטרום של ציסטאין התווית על-ידי סחרור מוטציות ב- DDM-פתרון. (ג) נגזרת ראשונה של CW EPR ספקטרום של מוטציות ציסטאין התווית על-ידי סחרור מחדש asolectin ליפוזומים. ספקטרה התקבלו ב- pH 7.4 (מצב סגור). ΔHo−1 מציין את סדר הגודל של הפרמטר ניידות. קו מנוקד שחור מדגיש את הרחבת הספקטרום. החצים כחול ואדום מציינות את רכיבי שדה נמוך וגבוה הספקטרום, בהתאמה. ספקטרה EPR היו מנורמל למספר הכולל של תוויות ספין. ששינה הדמות המקורית26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. התפלגות מרחק מוטציה eTRPV1 ותחטא.
אקו צבי (A), מרחק והפצה (B) של התווית על-ידי סחרור מוטציה E651C; סכום של Gaussians היה מצויד בנתונים צבי. P(r) מציין התפלגות מרחק של זוגות ספין41. ספקטרה התקבלו ב- pH 7.4 (מצב סגור). ששינה הדמות המקורית26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכנולוגיות הנוכחי עבור ביטוי וטיהור של חלבוני ממברנה יונקים הפכו אותה ניתן לקבל כמויות מספיקות של חלבון עבור מחקרים ספקטרוסקופיות14,15,16,42. כאן, אנחנו הסתגלו טכנולוגיות אלה כדי לבטא, לטהר, לשקם, לבצע ניתוח spectroscopic ב TRPV1.

בין הצעדים הקריטיים בפרוטוקול, להלן אלה אנו יש troubleshot על TRPV1, זה עשוי להיות מותאם חלבונים אחרים. לשנות את רצף ה-DNA כדי ליצור תבנית המניבה 0.5 - 1 מ"ג/מ"ל של טהור אבקת חלבון; תבניות תשואות פחות מ 0.5 מ"ג/מ"ל של חלבון מאתגרת, מאז גדל יותר מ 6 ליטר של תרביות תאים חרקים יהיה צורך לכל מוטציה. חלבון חייב להיות מרוכז, לא פחות מ 2 מ"ג/מ"ל, מבלי TCEP כדי להגביר את היעילות תיוג-ספין. תיוג בריכוזים חלבון נמוכה ו/או בנוכחות TCEP עקבות יפיק ספקטרה EPR רועש. למרות החלבונים נשמרים ב 4 ° C במהלך טיהור, זה חיוני לבצע ספין תיוג-RT כדי לשפר את היעילות. במהלך טיהור תיוג, גליצרול, משפרת את יציבות חלבון; עם זאת, זה לגמרי להסירו לפני שיחזור, כמו זה מקטין את כמות החלבונים בתוך ליפוזומים ומייצר ספקטרה EPR רועש. הקטנת ריכוז דטרגנט מתחת CMC הוא מנהג נפוץ במהלך שיחזור; עם זאת, TRPV1 נוטה לזרז לפני שילוב ליפוזומים. כדי לפתור בעיה זו, TRPV1 נדגרה בין לילה עם ליפוזומים הקבועים מראש בדיוק ב- CMC להימנע חלבון משקעים ולהגדיל את כמות הערוצים בהכנת proteoliposome. TRPV1 מתפקד באופן מלא asolectin ליפוזומים28; לפיכך, היה זה התערובת השומנים המועדפת בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חיוני כדי לקבוע את הרכב השומנים שבו הוא חלבון מסוים פונקציונלי (למשל, כולסטרול) לפני שתמשיך עם ניתוחים spectroscopic.

גישות ספקטרוסקופיות כגון EPR וצבאים להציג מספר מגבלות, לרבות: שינויים ברצף תבנית חלבון המשפרים את יציבות הביוכימי עשויה להיות לו השפעה פונקציה26; מבוא cysteines יחיד שאינו יליד הארץ, כמו גם את התווית ספין, עלול לא להיות נסבל היטב באזורים מסוימים של החלבון; רכישת כמויות גדולות של חלבונים שכותרתו; שינויים הסתגלותי מוגבלים בעת קביעת מרחקים עם צבי הקזאין דטרגנט. עם זאת, המגבלה השנייה יכול להתגבר על ידי איסוף הספקטרום, בתדר Q-band, של מוטציות TRPV1 מחדש nanodiscs19,43. למרות זאת, היתרון של גישות אלה מגיע בעיקר מהתבנית של גלובל דיינמיקס, accessibilities מרחקים יותר מן הערך המוחלט במצב נתון.

רגישות טמפרטורה הוא אחד המרתקים ביותר ומובן פחות מנגנוני חסימה; לפיכך, שימוש בגישות ספקטרוסקופיות, אפשר היה לקבוע איך קרום חלבונים לתרגם אנרגיה תרמית חלבון תנועה בסביבה קרום. חשוב, זה יהיה מאתגר כדי לקבוע שינויים מבניים במהלך תרמי gating בעזרת קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-EM, כמו טכניקות אלה מתקיימים בטמפרטורות נמוכות. ניסויים עתידיים יופנו כלפי קביעת ש-trpv1 הסתגלותי משנה תואם תלויי-תרמי gating באמצעות EPR, צבי או קרינה פלואורסצנטית. ספקטרוסקופיה EPR סיפקה מפורט מודלים מכניסטית עבור ערוצי יון prokaryotic, אנו צופים כי באמצעות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, אנו נשיג תובנה על מנגנוני הפעלה וסמים-איגוד של תעלות יונים בתרבית של שימוש גישות ספקטרוסקופיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים מאוד ד ר Mchaourab ה על מתן גישה ספקטרומטרים EPR וצבאים, ד ר רוזנבאום ט עבור מספקים את פלסמיד TRPV1 ציסטאין-פחות באורך מלא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

ביוכימיה גיליון 137 vanilloid פוטנציאלי קולטן ארעי 1 TRPV1 טיהור שיחזור תיוג-ספין ספקטרוסקופיה EPR צבי ספקטרוסקופיה
טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter