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Biochemistry

स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए TRPV1 का शुद्धिकरण और पुनर्गठन

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

यह लेख स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए डिटर्जेंट-solubilized TRPV1 की जैव रासायनिक मात्रा प्राप्त करने के लिए विशिष्ट विधियों का वर्णन करता है । संयुक्त प्रोटोकॉल जैव रासायनिक और भौतिक उपकरण है कि एक झिल्ली नियंत्रित वातावरण में स्तनधारी आयन चैनलों के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन की सुविधा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है प्रदान करते हैं ।

Abstract

Polymodal आयन चैनल allosteric परिवर्तन में विभिन्न प्रकृति के कई उत्तेजनाओं transduce; इन गतिशील संरचनाओं निर्धारित करने के लिए और मोटे तौर पर अज्ञात रहने के लिए चुनौती दे रहे हैं । एकल कण क्रायो में हाल ही में अग्रिम के साथ-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) एगोनिस्ट बाध्यकारी साइटों की संरचनात्मक सुविधाओं पर प्रकाश बहा और कई आयन चैनलों के सक्रियकरण तंत्र, मंच के लिए सेट है एक में अपने गेटिंग की गहराई से गतिशील विश्लेषण स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग कर तंत्र । स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक जैसे इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) और दोहरे इलेक्ट्रॉन-इलेक्ट्रॉन अनुनाद (हिरण) को मुख्य रूप से prokaryotic आयन चैनलों के अध्ययन के लिए प्रतिबंधित किया गया है जो बड़ी मात्रा में शुद्ध किया जा सकता है. कार्यात्मक और स्थिर झिल्ली प्रोटीन की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता स्तनधारी आयन इन तरीकों का उपयोग कर चैनलों के अध्ययन में बाधा है । EPR और हिरण मोबाइल प्रोटीन क्षेत्रों की संरचना और गतिशील परिवर्तन का निर्धारण सहित कई फायदे, प्रस्ताव हालांकि कम संकल्प पर, कि एक्स द्वारा प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है-रे क्रि या क्रायो-EM, और प्रतिवर्ती गेटिंग की निगरानी संक्रमण (यानी, बंद, खुला, संवेदनशील, और संवेदनशील) । यहां, हम कार्यात्मक डिटर्जेंट-solubilized क्षणिक रिसेप्टर संभावित कटियन चैनल उपपरिवार वी सदस्य 1 (TRPV1) कि EPR और हिरण स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए लेबल किया जा सकता है की मिलीग्राम प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

Introduction

एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM), स्तनधारी आयन चैनल संरचनाओं में हाल ही में अग्रिमों के साथ एक असाधारण दर से प्राप्त किया गया है । विशेष रूप से, ऐसे क्षणिक रिसेप्टर संभावित vanilloid 1 (TRPV1) के रूप में polymodal आयन चैनलों के संरचनात्मक अध्ययन, अपने सक्रियण तंत्र के आगे की समझ प्रदान की है1,2,3, 4 , 5. हालांकि, एक झिल्ली वातावरण में एंबेडेड आयन चैनलों के बारे में गतिशील जानकारी उनके polymodal गेटिंग और दवा बाध्यकारी तंत्र को समझने की आवश्यकता है ।

इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद (EPR) और दोहरे इलेक्ट्रॉन-इलेक्ट्रॉन अनुनाद (हिरण) spectroscopies आयन चैनलों के लिए सबसे निश्चित यंत्रवत मॉडल के कुछ प्रदान की है6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. इन तरीकों को मुख्य रूप से prokaryotic और archeal आयन चैनलों की परीक्षा है कि डिटर्जेंट-शुद्ध प्रोटीन की एक बड़ी राशि उपज जब बैक्टीरिया में व्यक्त करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है । कार्यात्मक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन14,15,16के लिए कीट और स्तनधारी कोशिकाओं में eukaryotic झिल्ली प्रोटीन उत्पादन के विकास के साथ, यह अब जैव रासायनिक प्राप्त करने के लिए संभव है स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन के लिए डिटर्जेंट-शुद्धि प्रोटीन की मात्रा ।

EPR और हिरण संकेत एक paramagneticspin लेबल से उत्पंन (SL) (यानी, methanethiosulfonate) प्रोटीन में एक एकल cysteine अवशेषों से जुड़ी । स्पिन-लेबल रिपोर्ट संरचनात्मक जानकारी के तीन प्रकार: प्रस्ताव, accessibilities, और दूरी । यह जानकारी निर्धारित करता है कि क्या अवशेषों प्रोटीन के भीतर दफन कर रहे है या झिल्ली या ligand में जलीय वातावरण को उजागर कर रहे है अनुमति देता है राज्यों13,17,18,19। एक उच्च संकल्प संरचना के संदर्भ में (जब उपलब्ध है), EPR और हिरण डेटा अपने पैतृक वातावरण में गतिशील मॉडल प्राप्त करने के लिए बाधाओं का संग्रह प्रदान करते हुए प्रतिवर्ती गेटिंग संक्रमण की निगरानी (यानी, बंद, खुला, संवेदनशील, और संवेदनशील) । इसके अलावा, लचीला क्षेत्रों है कि एक्स द्वारा निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है रे क्रि या क्रायो-उंहें इन पर्यावरणीय डेटा का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है माध्यमिक संरचनाओं के रूप में अच्छी तरह से20प्रोटीन के भीतर स्थान प्रदान करते हैं । क्रायो उंहें लिपिड nanodiscs में प्राप्त संरचनाओं आयन चैनलों के गेटिंग के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान की3,21,22,23,24, 25; हालांकि, स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण के गठन के राज्यों से गतिशील जानकारी प्रदान (जैसे, थर्मल परिवर्तन) सकता है कि क्रायो-EM का उपयोग कर निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है ।

कई कठिनाइयों EPR और हिरण को लागू करने के लिए दूर किया जाना चाहिए, प्रोटीन समारोह की कमी सहित जब सभी cysteine अवशेषों को हटाने (विशेष रूप से स्तनधारी चैनलों में प्रचुर मात्रा में), कम प्रोटीन यील्ड, शुद्धि के दौरान प्रोटीन अस्थिरता और स्पिन लेबलिंग के बाद , और डिटर्जेंट या liposomes में प्रोटीन एकत्रीकरण । यहाँ, हम इन महत्वपूर्ण बाधाओं को दूर करने के लिए प्रोटोकॉल तैयार किया है और एक स्तनधारी संवेदी रिसेप्टर के लिए हिरण और EPR स्पेक्ट्रा जानकारी प्राप्त की है. यहां उद्देश्य के लिए अभिव्यक्ति, शुद्धि, लेबल, और एक कार्यात्मक ंयूनतम cysteine कम चूहे TRPV1 (eTRPV1) के पुनर्गठन के लिए तरीके का वर्णन है स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए निर्माण । इस पद्धति उन झिल्ली प्रोटीन है कि cysteine अवशेषों को हटाने के बावजूद अपने कार्य रखने के लिए उपयुक्त है या कि cysteine बनाने डाइसल्फ़ाइड-बांड शामिल । प्रोटोकॉल का यह संग्रह अंय स्तनधारी आयन चैनलों के स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

1. TRPV1 Mutagenesis

नोट: स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए एक ंयूनतम TRPV1 निर्माण26 पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विधि (चित्रा 1) का उपयोग कर पूर्ण लंबाई cysteine-कम चैनल TRPV127 से बनाया गया था । यह cysteine-कम ंयूनतम TRPV1 निर्माण (के रूप में eTRPV1 के बाद से संदर्भित) अवशेषों के होते है ११०-६०३ और ६२७-७६४ । eTRPV1 में क्लोन किया गया था पीएमओ (एक pcdna 3.1-आधारित वेक्टर) कार्यात्मक विश्लेषण के लिए और एक रिकॉमबिनेंट दाता सदिश28 में x histidine-माल्टोज़-बाइंडिंग प्रोटीन (MBP)-तंबाकू खोदना वायरस (टेव) अभिव्यक्ति और शुद्धि (चित्रा 2a) के लिए । eTRPV1 एकल-cysteine म्यूटेंट साइट-निर्देशित mutagenesis का उपयोग कर जनरेट किया गया । वेक्टर और चैनल अनुक्रम अनुपूरक फ़ाइल 1: अनुपूरक तरीकों में निर्दिष्ट कर रहे हैं ।

  1. डिजाइन ऑनलाइन उपकरण के साथ mutagenesis प्राइमरों29।
  2. मिश्रण में एक ०.२-एमएल ट्यूब: 5 μL के 10x प्रतिक्रिया बफर, 1 μL के dNTP मिश्रण (१०० मिमी), 1 μL प्रत्येक के 10 माइक्रोन फॉरवर्ड और रिवर्स oligonucleotides, 1 μL के १०० एनजी/μL eTRPV1 टेम्पलेट डीएनए26, १.५ μL की DMSO, 1 μL की mutagenesis एंजाइम , और ३८.५ μL जल की । thermocycler में ट्यूबों रखने से पहले मिश्रण स्पिन ।
  3. पीसीआर mutagenesis करते हैं ।
    1. प्रदर्शन (a) 2 मिनट के लिए ९५ ° c पर विकार, (b) विकार के लिए ९५ ° c पर 20 s, (C) एनीलिंग के लिए ६० ° c पर 10 s, और (d) 4 मिनट के लिए ६८ ° c पर बढ़ाव (30 s प्रति 1 kb). दोहराएँ कदम बी करने के लिए डी के लिए 18 चक्र, तो 5 मिनट के लिए ६८ ° c पर बढ़ाव प्रदर्शन, और आगे उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया बनाए रखने.
  4. Dpnमैं प्रतिक्रिया के लिए एंजाइम के 2 μL जोड़ें; मिश्रण और फिर 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  5. परिवर्तन करने
    1. गल ई. बर्फ पर कोलाई सक्षम कोशिकाओं ।
    2. एक प्री-कूल्ड 14 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब करने के लिए, सक्षम कोशिकाओं के ७५ μL जोड़ें और Dpnमैं इलाज पीसीआर मिश्रण के 10 μL । मिश्रण धीरे ।
    3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर रिएक्शन की मशीन ४५ एस के लिए ४२ ° c पर ट्यूब बनाए रखने और फिर तुरंत यह 2 मिनट के लिए बर्फ पर जगह. Luria शोरबा (पौंड) पर मिश्रण प्लेट-carbenicillin युक्त प्लेट आगर (०.२ मिलीग्राम/एमएल) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली मशीन ।
    4. प्लेट और inoculate में से प्रत्येक 4 मिलीलीटर carbenicillin (०.२ मिलीग्राम/एमएल) एक 14 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब का उपयोग करते हुए में से प्रत्येक में कम से कम तीन एकल कालोनियों फसल । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृतियों और २५० rpm पर हिला ।
    5. 10 मिनट के लिए ८,००० x g पर रातोंरात संस्कृतियों नीचे स्पिन और निकालने डीएनए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिनी तैयारी किट के निर्देशों का पालन ।
    6. मानक स्वचालित डीएनए अनुक्रमण द्वारा एकल-cysteine म्यूटेंट की उपस्थिति की जाँच करें ( सामग्री की तालिकादेखें).

2. eTRPV1 और सिंगल-cysteine म्यूटेंट का कार्यात्मक विश्लेषण

  1. HEK293 सेल लाइन अभिकर्मक 30
    1. संस्कृति HEK293 कोशिकाओं में 6-अच्छी तरह से प्लेटें उच्च ग्लूकोज मध्यम (DMEM) के 2 मिलीलीटर में अच्छी तरह से (३७ ° c, 5% सह2, ९५% आर्द्रता). तैयार HEK293 कोशिकाओं है कि ७० \u2012 ८०% धाराप्रवाह हैं ।
    2. दो अलग १.५-मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों में अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें ।
      1. रिएक्शन A के लिए, ०.५ µ g eTRPV1 या cysteine उत्परिवर्ती-युक्त पीएमओ को ंयूनतम आवश्यक माध्यम (उदा. Opti-मेम) के २५० µ l में जोड़ें । रिएक्शन बी के लिए, अभिकर्मक रिएजेंट के 3 µ l को न्यूनतम आवश्यक माध्यम के २५० µ l में जोड़ें । कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया की मशीन ।
      2. एक 1-एमएल पिपेट के साथ एक और बी प्रतिक्रियाओं मिश्रण । आरटी पर ४५ मिनट के लिए मिश्रण की मशीन ।
    3. ७०-८०% से संस्कृति मीडिया के ५०० µ एल निकालें और अच्छी तरह से धाराप्रवाह प्रतिक्रिया मिश्रण के ५०० µ एल जोड़ें । Ca2 + इमेजिंग (३७ ° c, 5% CO2, और ९५% आर्द्रता) के लिए रात भर प्लेट्स स्टोर ।
  2. Ca2 + HEK293 कक्षों में इमेजिंग 30
    1. साफ 12 मिमी व्यास गिलास इथेनॉल और पानी के साथ coverslips और उंहें एक 24 अच्छी तरह से थाली में जगह है ।
    2. प्रत्येक coverslip के केंद्र में पाली-एल-lysine के ७५ µ एल जोड़ें और ४५ मिनट (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, ९५% आर्द्रता) के लिए थाली की दुकान ।
    3. अतिरिक्त पाली-एल-lysine निकालें और coverslips तीन बार फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ किसी भी बचे हुए को दूर हटाने के लिए ।
    4. एक बार coverslips तैयार हैं, 6-अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं को अलग करने के लिए आगे बढ़ें ।
    5. मीडिया निकालें और धोने के लिए गर्म पंजाबियों (३७ डिग्री सेल्सियस) के ५०० µ एल जोड़ें ।
    6. पंजाबियों निकालें, trypsin के ५०० µ एल जोड़ने के लिए, और 1 मिनट के लिए मशीन ।
    7. गर्म संस्कृति मीडिया के ५०० µ एल जोड़ें (३७ डिग्री सेल्सियस) पाचन प्रतिक्रिया को रोकने और पिपेट के साथ मिश्रण करने के लिए; बुलबुले बनाने से बचें । यदि आवश्यक हो, तो अधिक संस्कृति मीडिया के साथ इस resuspension कमजोर कक्ष एकाग्रता समायोजित करें ।
    8. बीज २५० µ एल के transfected HEK293 कोशिकाओं (७०% धाराप्रवाह) से अधिक २५० µ एल के संस्कृति मीडिया (५०० µ एल अंतिम मात्रा प्रति अच्छी तरह से) पूर्व पर इलाज coverslips और उंहें नीचे बसने (लगाव के लिए) के लिए 1-2 एच मशीन में (३७ ° c, 5% CO2, ९५% आर्द्रता) ।
    9. इस बीच में, ०.०२% pluronic एसिड और 1 µ m Fluo जोड़कर एक लोडिंग समाधान तैयार-4-हूं एक घंटी बफर के लिए । घोल को अच्छी तरह मिला लें ।
    10. HEK293 संस्कृति मीडिया अच्छी तरह से निकालें और लोड हो रहा है समाधान के ५०० µ l जोड़ें । 1 घंटे (३७ ° c, 5% CO2, ९५% आर्द्रता) के लिए कोशिकाओं की मशीन । गर्म घंटी के बफर के साथ Fluo-4-लोड कोशिकाओं को दो बार धोएं ।
    11. एक खुर्दबीन स्टेज में एक 10 मिमी पेट्री डिश में लोड कोशिकाओं के साथ एक coverslip प्लेस (एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर; ४९४ एनएम उत्तेजना और ५०६ एनएम उत्सर्जन) intracellular Ca2 + माप प्रदर्शन करने के लिए ।
    12. perfusing संबंधित लाइगैंडों (जैसे, 10 माइक्रोन capsaicin) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन को मापने ।
  3. mRNA र Xenopus laevis अंडाणुओं तयारी 30
    1. ३७ ° c पर 1 ज के लिए PmeI के साथ Linearize eTRPV1 और सिंगल-cysteine म्यूटेंट-युक्त पीएमओ स्वच्छ डीएनए वाणिज्यिक उपलब्ध शुद्धीकरण किट के निर्देशों का पालन ।
    2. T7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ संगत एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ ढकी RNAs को संश्लेषित करने के लिए रैखिक और साफ DNAs का प्रयोग करें ।
    3. वाणिज्यिक उपलब्ध शुद्धीकरण किटों के अनुसार स्वच्छ छाया RNAs. २६० एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषक को मापने के द्वारा आरएनए राशि को बढ़ाता है ।
    4. स्थानांतरण 5 \u2012 10 मिलीलीटर X । laevis अंडाणुओं (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) में एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब ND96 समाधान (९६ मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 5 मिमी HEPES, 1 मिमी MgCl2के साथ 20 मिलीलीटर, पीएच ७.४) 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase और nutate के साथ ५० मिनट के लिए RT पर ।
    5. ND96 में अंडाणुओं कुल्ला जब तक समाधान स्पष्ट नहीं है; RT पर 30 मिनट के लिए ताजा collagenase और शेक जोड़ें. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत अंडाणुओं की जांच करें और पाचन बंद करो जब बाहरी तोंसिल्लितिस परत (लाल रक्त वाहिकाओं के साथ चमकदार परत) सबसे अंडाणुओं में अनुपस्थित है (९०%) । समाधान साफ होने तक ND96 में कुल्ला अंडाणुओं ।
    6. ND96 प्लस 1 मिमी CaCl2 के साथ एक ५०-एमएल polystyrene ट्यूब के लिए अंडाणुओं स्थानांतरण और 1 के लिए शेक ज. के तहत पच अंडाणुओं polystyrene ट्यूब से चिपक जाएगा.
    7. वॉश अंडाणुओं विथ ND96 प्लस 1 एमएम CaCl2 और सप्लीमेंट सॉल्यूशन विथ ५० µ g/एमएल ऑफ़ gentamicin एंड ५० µ g/एमएल ऑफ़ टेट्रासाइक्लिन.
      नोट: प्रकाश जोखिम से टेट्रासाइक्लिन युक्त समाधान की रक्षा ।
    8. क्षतिग्रस्त झिल्ली के बिना बड़े अंडाणुओं का चयन करें और पशु और वनस्पति डंडे के बीच एक स्पष्ट जुदाई प्रदर्शित । अंडाणुओं 16 डिग्री सेल्सियस पर microinjection से पहले 4 ज के लिए ठीक हो जाते हैं ।
    9. ग्लास पिपेट (ओडी: १.११ mm, आईडी: ०.५, और लंबाई ८.८ सेमी) का प्रयोग करें cysteine में eTRPV1 और एकल म्यूटेंट अंडाणुओं से mRNA के एनजी इंजेक्षन करने के लिए एक nanoliter-इंजेक्टर प्रणाली (४६ nL/एस) और एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (2x इज़ाफ़ा) का उपयोग कर । CaCl2 और एंटीबायोटिक दवाओं (गेन्तमयसीं/टेट्रासाइक्लिन 1x) के साथ पूरक ND96 में 16 डिग्री सेल्सियस पर अंडाणुओं स्टोर ।
    10. ७२ एच के बाद, macroscopic एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज-क्लैंप (TEVC) अधिग्रहण प्रणाली31का उपयोग कर वर्तमान को मापने.
    11. खींचो borosilicate ग्लास पिपेट (०.३ MΩ) और उंहें 3 एम KCl के साथ भरें ।
    12. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर रिकॉर्डिंग चैंबर में oocyte प्लेस और स्नान समाधान perfuse (१२० मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 2 मिमी MgCl2, 1 मिमी EGTA, और 10 मिमी HEPES समाधान; पीएच ७.४) कम गति से.
    13. उनके पिपेट ऑफसेट समायोजित करने के लिए स्नान समाधान में दोनों इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया । धीरे पिपेट इलेक्ट्रोड धक्का (borosilicate ग्लास पिपेट; ओडी: १.५ मिमी, आईडी: १.१०, और लंबाई 10 सेमी) oocyte में जब तक एक छोटे से इंडेंट एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप (2x इज़ाफ़ा), साथ ही झिल्ली की क्षमता में परिवर्तन के तहत मनाया जाता है ।
    14. रिकॉर्डिंग मोड और macroscopic धाराओं को मापने के लिए एम्पलीफायर सेटिंग्स बदलें-८० से + ८० एमवी के लिए 1 एस के लिए एक वोल्टेज दबाना रैंप आवेदन जबकि छिड़काव प्रणाली लोड पीएच ७.४ पर कदम 2.3.12 में इस्तेमाल समाधान के साथ (एक नियंत्रण के रूप में) और eTRPV1 गतिविधि की जांच करने के लिए पीएच 5 पर.

3. प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए रिकॉमबिनेंट Bacmid और Baculovirus का उत्पादन

  1. Bacmid
    1. DH10Bac ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं के रिकॉमबिनेंट दाता eTRPV1 और/या एकल cysteine म्यूटेंट युक्त सदिश के ७.५ एनजी के साथ १०० μL रूपांतरण ।
    2. समाज मीडिया के ९०० μL जोड़ें (20 मिलीग्राम/एमएल Tryptone, 5 मिलीग्राम/एमएल खमीर निकालने, २.५ मिमी KCl, 10 मिमी MgCl2, 10 मिमी MgSO4, और 20 मिमी ग्लूकोज) और ३७ डिग्री सेल्सियस और २२५ rpm पर 6-7 एच के लिए मशीन ।
    3. बीज १०० µ एल सीधे मिश्रण से, और सीरियल कमजोर पड़ने से (1/10 और 1/100), पौंड-आगर युक्त प्लेटों में १०० μg/एमएल एक्स-gal, ४० μg/एमएल IPTG, 7 μg/एमएल gentamicin, 10 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन और ५० μg/एमएल कनमीसिन । ३७ डिग्री सेल्सियस से कम ४८ ज के लिए प्लेटों की मशीन ।
    4. सफेद कालोनियों है कि व्यास में 2 मिमी का चयन करें, क्योंकि नीली कालोनियों ब्याज की डालने की कमी है । सफेद कालोनियों किसी भी नीले धब्बे शामिल नहीं है कि यह सत्यापित करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें ।
    5. एक 14 मिलीलीटर में फसल और उंहें 7 μg/एमएल gentamicin, 10 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन, और ५० μg/एमएल कनमीसिन के साथ पूरक मीडिया पौंड के 4 मिलीलीटर युक्त बाँझ ट्यूब में हस्तांतरण । रात भर कोशिकाओं (~ 16 एच) ३७ डिग्री सेल्सियस और २५० rpm पर गर्मी ।
    6. रात भर संस्कृतियों के १.५ मिलीलीटर ले लो और रिकॉमबिनेंट bacmid डीएनए को अलग (विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1 को देखें) । 4 डिग्री सेल्सियस पर bacmid को दो महीने तक स्टोर करें ।
      नोट: bacmid डीएनए युक्त DH10Bac ई. कोलाई के ग्लिसरॉल स्टॉक्स तैयार करें । संस्कृति के ३०० μL ले लो और ५०% (20% की अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता) में ग्लिसरॉल के २०० μL जोड़ें । aliquot पर स्टोर-८० ° c आगे का उपयोग जब तक ।
    7. पीसीआर का उपयोग bacmid रिकॉमबिनेंट में eTRPV1 की उपस्थिति की पुष्टि (विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए अनुपूरक फाइल 1 को देखें) ।
  2. Baculovirus
    नोट: इस कार्यविधि के लिए, एक 6-well स्वरूप में Sf9 कीट कोशिकाओं transfect । सभी राशियों और मात्रा के आधार पर एक प्रति अच्छी तरह से दिया जाता है । एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग से बचें ।
    1. प्लेट 1 x 106 कीट सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर में Sf9 कोशिकाओं । कक्षों को कम से ४५ ंयूनतम के लिए अनुलग्न करने की अनुमति दें ।
    2. कीट सेल मीडिया के १०० μL में रिकॉमबिनेंट bacmid डीएनए के 1 μg को पतला करना । मिश्रण धीरे ।
    3. कीट कोशिका मीडिया के १०० μL में अभिकर्मक रिएजेंट (एन) के 6 μL को पतला करना । मिश्रण धीरे ।
    4. डीएनए और TR समाधान का मिश्रण (कदम से 3.2.2 और 3.2.3, क्रमशः) । धीरे से मिश्रण और आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    5. डीएनए/TR मिश्रण करने के लिए कीट सेल मीडिया के ०.८ मिलीलीटर जोड़ें; मिश्रण धीरे ।
    6. Sf9 कोशिकाओं से कीट सेल मीडिया निकालें और ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें ।
    7. धो मध्यम निकालें और कोशिकाओं को डीएनए/TR मिश्रण (3.2.2 \u2012 3.2.5) जोड़ें । (आंदोलन के बिना) 5 घंटे के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
    8. अभिकर्मक मिश्रण निकालें और कीट सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित ०.५% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त । पांच दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
      सावधानी: मीडिया के साथ खाली कुओं को भरने और तेल फिल्म की दो परतों के साथ 6 अच्छी तरह से थाली को कवर करके सेल मीडिया के वाष्पीकरण रोकें ।
    9. एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में सेल संस्कृति मीडिया स्थानांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ८,००० x g पर ट्यूब कताई द्वारा वायरल स्टॉक के पहले पारित होने (P1) को अलग । एक साफ 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
      नोट: एल्यूमीनियम पंनी के साथ ट्यूब को कवर करके प्रकाश जोखिम से वायरस की रक्षा ।
    10. वायरल स्टॉक की दूसरी पीढ़ी (P2) के लिए, एक १२५ मिलीलीटर कुप्पी (सादा नीचे और वेंट) में 1 x 106 Sf9 कोशिकाओं पर कीट सेल मीडिया के एक 25-मिलीलीटर निलंबन संस्कृति (2% FBS युक्त) डाल दिया । 25 मिलीलीटर संस्कृति के लिए P1 वायरस के 25 μL जोड़ें ।
    11. ७२ एच के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति की मशीन ।
    12. P2 वायरल स्टॉक फसल के लिए, एक नया ५०-एमएल ट्यूब के लिए संस्कृति हस्तांतरण और यह ८,००० x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
    13. supernatant एक नया ५०-एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
      नोट: एल्यूमीनियम पंनी के साथ ट्यूब को कवर करके प्रकाश जोखिम से वायरस की रक्षा । एक छोटे पैमाने पर प्रयोग करने के लिए अनुमापन p2 वायरस/Sf9 अनुपात इष्टतम TRPV1 अभिव्यक्ति के लिए ( पूरक फ़ाइल 1 के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए देखें, खंड 4 शीर्षक "P2 वायरस के लिए छोटे पैमाने पर प्रयोग.")
    14. बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, एक २.८-l borosilicate ग्लास कुप्पी में ०.५% FBS के साथ पूरक कीट सेल मीडिया में 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल में एक 1-l Sf9 सेल निलंबन संस्कृति सेट ।
    15. 1-L संस्कृति के लिए P2 वायरस स्टॉक की 1 मिलीलीटर जोड़ें और ७२ एच के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन ।
      नोट: तीसरे दिन, सेल घनत्व पर लगभग १.५ से २.५ x 106 कोशिकाओं/

4. eTRPV1 और एकल-cysteine उत्परिवर्ती शुद्धिकरण

  1. झिल्ली अलगाव28
    1. 1-एल कीट कोशिका निलंबन संस्कृति ४,५०० x g, 4 ° c, 20 मिनट के लिए में कताई द्वारा फसल (यह 6-9 ग्राम के आसपास होने की उंमीद है) वजन के लिए सेल गोली ।
    2. 25-बर्फ ठंड बफर एक (३६.५ mM सुक्रोज की मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड, 2 मिमी tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), और ५० मिमी tris; पीएच ७.४) की उपस्थिति में छेड़ने वाले अवरोधकों (1 मिमी phenylmethyl sulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 3 μg/एमएल leupeptin, 3 μg/एमएल aprotinin , और 1 μg/एमएल pepstatin) । एक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाने के लिए समग्र सेल झुरमुट ।
    3. एक मैनुअल (dounce ऊतक चक्की) या एक उच्च दबाव homogenizer का उपयोग कर कोशिकाओं को तोड़ने । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेल मलबे निकालें ।
      नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर लीजड ड कोशिकाओं और ट्यूबों रखें ।
    4. supernatant लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १००,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और बर्फ के 20 मिलीलीटर-शीत बफर बी (१५० mm NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 2 मिमी TCEP, ५० mm HEPES, पीएच ७.४), को छेड़ने वाले अवरोधकों के साथ पूरक की कुल मात्रा में झिल्ली गोली reसस्पैंड (के रूप में कदम 4.1.2 में) ।
    5. Aliquot 20 मिलीलीटर में झिल्ली निलंबन ५०-एमएल ट्यूब और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज । -८० डिग्री सेल्सियस से अधिक उपयोग तक नमूनों की दुकान ।
  2. प्रोटीन शुद्धिकरण26,28
    1. झिल्ली aliquots बर्फ पर गल और n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (डीडीएम) प्रति ट्यूब (२०० mM स्टॉक) की 3 मिलीलीटर जोड़ें । 4 ° c पर 2 ज के लिए ट्यूब घुमाएँ ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १००,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । supernatant लीजिए और साफ गीला amylose राल के 1 मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिश्रण घुमाएँ । गुरुत्वाकर्षण प्रवाह क्रोमैटोग्राफी कॉलम में प्रोटीन/amylose मिश्रण लोड ।
      सावधानी: राल धोने के दौरान शुष्क करने की अनुमति नहीं है ।
    3. 10 बार आइस-कोल्ड बफर सी (१५० mm NaCl, 10% ग्लिसरॉल, ५० mm HEPES, ०.५ mm डीडीएम, ०.१ μg/एमएल asolectin, ०.५ mm TCEP, pH ७.४) के बेड वॉल्यूम के साथ प्रोटीन से बंधे amylose राल को धो लें । बर्फ ठंडा बफर डी (१५० mm NaCl, 10% ग्लिसरॉल, ५० mm HEPES, ०.५ mm डीडीएम, ०.१ μg/एमएल asolectin, पीएच ७.४) के 10 बिस्तर संस्करणों के साथ धो लें ।
      नोट: धोने से पहले, डिटर्जेंट या लिपिड के बिना degas बफर डी, नाइट्रोजन के साथ मिटाना । गैस निष्कासन के बाद, डीडीएम और asolectin जोड़ें ।
    4. ०.५ एमएल अंशों के साथ Elute eTRPV1 प्रोटीन, 5 मिलीलीटर तक, आइस-कोल्ड degassed बफर डी, 20 एमएम माल्टोज़ के साथ पूरक । यदि संभव हो तो, 4 ° c पर बहाकर और रेफरेंस का प्रदर्शन करें ।
    5. २८० एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापने के द्वारा प्रोटीन राशि को बढ़ाता है ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल पैदावार ०.५ के लिए १.० मिलीग्राम प्रति लीटर प्रोटीन की संस्कृति । प्रोटीन उपज प्रत्येक eTRPV1 एकल-cysteine उत्परिवर्ती के लिए भिंन हो सकते हैं । EPR और हिरण प्रयोगों के लिए, संस्कृति के 4 \u2012 6 एल बढे ।

5. eTRPV1 एकल-cysteine उत्परिवर्ती साइट-निर्देशित स्पिन लेबलिंग

  1. eTRPV1-एक केंद्रापसारक फिल्टर इकाई (cutoff = १०० केडीए) अप करने के लिए 2 \u2012 २.५ मिलीग्राम/एमएल (७,००० एक्स जी के चक्र के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 मिनट के लिए) का उपयोग कर भागों ध्यान केंद्रित ।
  2. एक 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त जोड़ें (3 बार, की हर 30 मिन) (1-oxyl-2, 2, 5, 5-टेट्रा-methylpyrrolidin-3-yl) मिथाइल methanethiosulfonate (MTSSL) के स्पिन लेबल से १००-mM स्टॉक सॉल्यूशन DMSO में केंद्रित प्रोटीन (eTRPV1 मोनोमर: MTSSL में 1:10 दाढ़ अनुपात) 17. 1 एच 30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन के बाद के लिए आरटी पर अंधेरे में प्रतिक्रिया रखें ।
    नोट: इस कदम में, MBP रातोंरात स्पिन लेबलिंग मशीन के दौरान टेव को जोड़ने के द्वारा हटाया जा सकता है ।
  3. लोड स्पिन-लेबल eTRPV1 पर एक आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी स्तंभ equilibrated में बफ़र E (१५० mm NaCl, 20 mm HEPES, ०.५ mm डीडीएम; pH ७.४), द्वारा नियंत्रित एक फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली । eTRPV1 tetramer युक्त अंशों को एकत्र करें ।
    नोट: इस चरण में 10% ग्लिसरॉल शामिल न करें, क्योंकि यह पुनर्गठन दक्षता को कम करता है ।
  4. २८० एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापने के द्वारा प्रोटीन राशि को बढ़ाता है ।
  5. एक एसडीएस-पृष्ठ जेल (दाग-मुक्त जेल, 4 \u2012 20%) चलाकर नमूने की शुद्धता का मूल्यांकन करें । नमूना अब समाधान और/या proteoliposomes में स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए तैयार है ।

६. eTRPV1 स्पिन-त्यसपछि एकल Cysteine उत्परिवर्ती पुनर्संविधान

  1. सूखी 10 asolectin के मिलीग्राम निर्वात (≤ १०० mbar) के तहत एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग ४० डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए । asolectin liposomes बनाने के लिए, बफ़र F (२०० mm NaCl, 5 mm MOPS; pH ७.४) के 1 मिलीलीटर जोड़ें और sonicate मिश्रण 15 मिनट के लिए या जब तक नमूना सजातीय है ।
  2. आरटी में 30 मिनट के लिए 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता और मशीन के लिए डीडीएम जोड़कर liposomes को अस्थिर
  3. 2 मिलीग्राम/एमएल पर लेबल प्रोटीन ध्यान लगाओ और यह एक 1:5 प्रोटीन/लिपिड अनुपात (मास: मास) का उपयोग कर liposomes में जोड़ें ।
    सावधानी: यह aforementioned प्रोटीन सांद्रता रखने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से स्पिन लेबलिंग दक्षता कम सांद्रता पर और उच्च प्रोटीन हाला हो सकता है पर कम हो जाती है ।
  4. प्रोटीन/Liposome मिश्रण के लिए डीडीएम क्रिटिकल micelle एकाग्रता (सीएमसी) को समायोजित करने के लिए और कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी बफर एफ जोड़ें ।
  5. डबल बफर एफ के साथ प्रोटीन/Liposome मिश्रण की मात्रा और क्रमिक रूप से (30 मिलीग्राम, ५० मिलीग्राम, और ८० मिलीग्राम) 1-पर कोमल आंदोलन के साथ आरटी में तीन aliquots जोड़ने के द्वारा डिटर्जेंट हटाने ।
  6. एक कॉलम फिल्टर पर मिश्रण लोड (गुरुत्वाकर्षण प्रवाह क्रोमैटोग्राफी कॉलम) मोतियों को हटाने और एक ultracentrifuge ट्यूब के लिए proteoliposomes मिश्रण हस्तांतरण करने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए १००,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और 30 बफर एफ के μL में गोली reसस्पेंड ।
    नोट: नमूने स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण और Xenopus अंडाणुओं में इंजेक्शन के लिए तैयार हैं । यदि नमूने एक ही दिन इस्तेमाल नहीं किया जा सकता, फ्लैश-तरल नाइट्रोजन में उंहें फ्रीज और-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  7. Proteoliposomes-Xenopus oocyte इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी26,३२
    1. Xenopus अंडाणुओं में स्पिन के विभिंन कमजोर पड़ने के ५० nL सुई-लेबल proteoliposomes के रूप में २.२ धारा में वर्णित है ।
    2. खंड 2.3.10 में वर्णित के रूप में इंजेक्शन के 12 ज के बाद TEVC माप निष्पादित करें ।
  8. स्पेक्ट्रोस्कोपी माप और विश्लेषण (धारा 7) प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें ।

7. हिरण और EPR Spectroscopies

  1. डबल इलेक्ट्रॉन-इलेक्ट्रॉन अनुनाद (हिरण) स्पेक्ट्रोस्कोपी ।
    1. Q-बैंड आवृत्ति (३४ GHz) में एक स्पंदित EPR स्पेक्ट्रोमीटर ऑपरेटिंग में हिरण माप प्रदर्शन और ८३ ° निर्माता-आपूर्ति सॉफ्टवेयर३३का उपयोग कर में मृत समय मुक्त चार पल्स अनुक्रम के साथ एक 10-W एम्पलीफायर के साथ सुसज्जित ।
    2. अनुपूरक ५० डिटर्जेंट-शुद्ध eTRPV1 स्पिन के µ मीटर-लेबल cysteine म्यूटेंट में बफर ई (चरण ५.५) के साथ 30% (v/v) ग्लिसरॉल के लिए-संरक्षण ।
    3. एक सील क्वार्ट्ज केशिका ट्यूब में नमूना लोड और संक्षिप्त कम गति केंद्रापसारक (१०० x g) द्वारा ट्यूब के नीचे करने के लिए स्पिन ।
    4. नमूना फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन में केशिका ट्यूब रखें । नमूनों को बाद में माप के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर इस बिंदु पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    5. नमूना माइक्रोवेव प्रतिध्वनित में सीधे प्लेस और इसे फिर से-equilibrate पर-८३ ° 10 \u2012 20 मिनट के लिए ।
    6. एक मानक चार पल्स हिरण प्रोटोकॉल का उपयोग कर नमूना उपाय, (π/mw1 – τ1 – (π) mw1 – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1 – τ2 – इको३४. (π/2) mw1 और (π) mw1 के लिए पल्स लंबाई 10 और 20 एनएस, क्रमशः कर रहे हैं, और (π) mw2 के लिए ४० एनएस । ६३ मेगाहर्ट्ज पर आवृत्ति जुदाई सेट.
      नोट: प्राथमिक हिरण क्षय डेटा एक घर निर्मित सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया जा सकता (Matlab मेंउदा ) जो स्पिन लेबल19,३५के बीच दूरी का वर्णन करने के लिए गाऊसी वितरण का एक योग मान लिया गया है ।
  2. सतत-तरंग (स.) EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. CW EPR प्रयोगों पर RT पर एक X-band (९.६ GHz) निर्माता सॉफ़्टवेयर का उपयोग स्पेक्ट्रोमीटर करें ।
    2. पानी मिर्च, सांत्वना, और चुंबक बिजली की आपूर्ति पर मोड़ से साधन शुरू करो । साधन करने के लिए सॉफ्टवेयर कनेक्ट, धुन में साधन जगह और गर्म करने के लिए साधन के लिए न्यूनतम 30 मिनट प्रतीक्षा करें ।
    3. ५.५ कदम से नमूना के 20 µ एल लोड एक 25-µ एल ग्लास केशिका ट्यूब केशिका कार्रवाई का उपयोग और सीलेंट के साथ ट्यूब के अंत सील ।
    4. माइक्रोवेव गुहा में केशिका ट्यूब लोड और गंभीर रूप से जोड़ी या तो स्वयं या स्वतः सॉफ्टवेयर के स्वत: धुन समारोह का उपयोग कर प्रतिध्वनित ।
    5. १०० kHz माइक्रोवेव मॉडुलन, १.६ ग्राम चुंबकीय क्षेत्र मॉडुलन, और 10 मेगावाट माइक्रोवेव पावर: पहले व्युत्पंन स्पेक्ट्रा मानक साधन शर्तों के तहत ले लीजिए ।
    6. डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति के लिए, स्पेक्ट्रा को पृष्ठभूमि के आधार पर सही करें और उंहें स्पेक्ट्रा को डबल-टू-पीक मान से विभाजित करके सामांय बनाएं ।
    7. पहले व्युत्पंन अवशोषण स्पेक्ट्रा (ΔHo-1)३६की केंद्रीय रेखा चौड़ाई के व्युत्क्रम को मापने के द्वारा स्पिन लेबल गतिशीलता का निर्धारण ।

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Representative Results

न्यूनतम Cysteine-कम TRPV1 का निर्माण (eTRPV1) और एकल-Cysteine म्यूटेंट के कार्यात्मक लक्षण वर्णन

स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन की ओर पहला कदम है इंजीनियर और cysteine कम प्रोटीन का निर्माण (चित्रा 2a) कि कार्यात्मक है और प्रोटीन की उपज जैव रासायनिक मात्रा की विशेषता है । eTRPV1 द्वारा निर्धारित के रूप में कार्यात्मक है Ca2 + इमेजिंग और TEVC (आंकड़ा 2 बी-सी) । इसके अलावा, eTRPV1 EPR और हिरण प्रयोगों के लिए डिटर्जेंट-शुद्ध प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्रदान करता है (०.५-1 Sf9 कोशिकाओं के प्रति लीटर मिलीग्राम)26. विशेष रूप से प्रोटीन क्षेत्रों में एकल cysteines का परिचय उनके समारोह को प्रभावित कर सकता है । चित्रा बी -cysteine म्यूटेंट (E651C और A702C) पर eTRPV1 है कि जंगली प्रकार (WT) की तरह व्यवहार के कुछ उदाहरण से पता चलता है, क्योंकि उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है जब TRPV1 एगोनिस्ट (जैसे, capsaicin) eTRPV1-युक्त HEK293 में जोड़ा जाता है कक्ष, Ca2 + इमेजिंग26द्वारा दर्शाए अनुसार । दूसरी ओर, A680C एक गैर कार्यात्मक cysteine उत्परिवर्ती का विशिष्ट उदाहरण है, के रूप में प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि से अलग है । A680C उत्परिवर्ती आगे के विश्लेषण के लिए बाहर रखा गया था । Ca2 + इमेजिंग प्रयोगों के बाद, एकल-cysteine म्यूटेंट ' समारोह TEVC या पैच क्लैंप का उपयोग कर अपने भौतिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किया है । चित्र 2c से पता चलता है कि म्यूटेंट दोहराऊंगा के जावक सुधार विशेषता TRPV1 जब पीएच 5 के साथ चुनौती दी, के रूप में TEVC द्वारा निर्धारित26। एकल cysteine म्यूटेंट के कार्यात्मक विश्लेषण अभिव्यक्ति और शोधन प्रोटोकॉल उपक्रम से पहले पहली चौकी है ।

eTRPV1 और एकल-cysteine म्यूटेंट के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन

शुद्धि प्रोटोकॉल के ऊपर वर्णित पैदावार डिटर्जेंट-solubilized प्रोटीन है कि cysteine आबंध संशोधन के माध्यम से लेबल किया जा सकता है (जैसे, fluorophores, स्पिन-लेबल [SL] मिथाइल-methanethiolsulfonate) के लिए TRPV1 अनुक्रम के साथ स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण. न्यूनतम TRPV1 चैनल युक्त cysteine अवशेषों स्थिर और monodisperse प्रजातियों (~ १३.६ एमएल) के रूप में विस्थापित, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 3) द्वारा निर्धारित के रूप में । eTRPV1 और एकल-cysteine स्पिन-लेबल म्यूटेंट (E651C-sl और A702C-sl) दोहराऊंगा रेफरेंस प्रोफाइल और स्थिरता न्यूनतम TRPV1 निर्माण (चित्रा 3)26द्वारा चित्रित किया । इस रेफरेंस प्रोफ़ाइल अलग म्यूटेंट के बीच भिंन हो सकता है, के रूप में एकल cysteines प्रोटीन स्थिरता को प्रभावित कर सकता है । कुछ उदाहरणों में, म्यूटेंट प्रपत्र समुच्चय; और नमूने का एक अंश स्तंभ (8-९.५ एमएल) के शून्य मात्रा पर elute सकता है, प्रोटीन की मात्रा को कम करने कि एक tetramer के रूप में स्थानांतरित करता है (चित्रा 3, नीचे लाल तीर). इस मामले में, कोशिका संस्कृति मात्रा को बढ़ाया जा सकता है प्रोटीन के लिए क्षतिपूर्ति के लिए एकत्रित अंश में खो दिया है, या एक और विश्लेषण से इस उत्परिवर्ती बाहर निकल सकते है और पड़ोसी अवशेषों का परीक्षण करने के लिए आगे बढ़ना । अंय उदाहरणों में शामिल है एक चोटी का विस्तार है कि tetramer से मेल खाती है । वे बहु-फैलाने प्रजातियों होते हैं के रूप में मुख्य चोटियों से व्यापक 3 मिलीलीटर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए अनुशंसित नहीं हैं । स्पिन के जैव रासायनिक लक्षण-लेबल एकल-cysteine म्यूटेंट पुनर्गठन और स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के उपक्रम से पहले दूसरी चौकी है ।

पुनर्गठन के कार्यात्मक लक्षण विनिर्मित स्पिन-लेबल eTRPV1 एकल-cysteine म्यूटेंट

क्योंकि EPR और हिरण संकेतों एक paramagnetic स्पिन के लगाव पर भरोसा-लेबल एक cysteine अवशेषों के लिए, यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्पिन के स्थान-लेबल प्रोटीन समारोह बदल । planar लिपिड bilayer प्रयोगों, पैच दबाना, और TEVC सहित स्पिन-लेबल प्रोटीन, पुनर्गठन के बाद समारोह के लिए परीक्षण करने के लिए कई तरीके हैं । TEVC स्पिन की एक बड़ी संख्या के मूल्यांकन की अनुमति देता है-चैनलों लेबल जबकि macroscopic धाराओं रिकॉर्डिंग । स्पिन-लेबल एकल-cysteine म्यूटेंट की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए, चैनलों पूर्व-गठित asolectin liposomes में पुनर्गठन किया जाता है । इस कदम के दौरान, यह 10% ग्लिसरॉल कि शुद्धिकरण के दौरान मौजूद है बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि ग्लिसरॉल liposomes में प्रोटीन पुनर्गठन की क्षमता कम हो जाती है । चित्रा 4 microinjected Xenopus में asolectin liposomes और अंडाणुओं में पुनर्गठन A702C-SL TRPV1 के एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है । के रूप में की उंमीद है, पीएच 5 मजबूत बाहर की ओर धाराओं३७ कि सह द्वारा अवरुद्ध कर रहे है सुधार TRPV1 विरोधी capsazepine (CPZ, ब्लू ट्रेस)26के आवेदन । म्यूटेंट है कि स्पिन लेबलिंग और पुनर्गठन के बाद कार्यशीलता को बनाए रखने नहीं है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए । गठित स्पिन के कार्यात्मक लक्षण-लेबल एकल-cysteine म्यूटेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण उपक्रम से पहले तीसरी चौकी है ।

स्पिन के संरचनात्मक गतिशीलता-लेबल eTRPV1 CW-EPR और हिरण द्वारा मॉनिटर म्यूटेंट

Nitroxide स्पिन लेबल आसपास के वातावरण के प्रति संवेदनशील होते हैं और प्रोटीन रीढ़ की हड्डी का लचीलापन जो लेबल17से जुड़ा होता है । इसलिए, CW-EPR एक दिया स्पिन के गतिशील आहार के निर्धारण की अनुमति देता है-लेबल cysteine; अर्थात्, जलीय मीडिया या झिल्ली को उजागर पदों के लिए प्रोटीन से प्रतिबंधित उन लोगों की तुलना में अधिक गतिशील है-प्रोटीन बातचीत17। चित्रा 5 गतिशीलता मापदंडों की निगरानी के लिए चुना TRPV1 में Glu651, Ile679, और Ala702 पदों से पता चलता है. स्पिन लेबल जांच के गतिशीलता पैरामीटर की गणना करने के लिए, एक पहले व्युत्पंन अवशोषण स्पेक्ट्रा (चित्रा 5B, ब्लैक लाइन ΔHओ−1) की केंद्रीय रेखा चौड़ाई के व्युत्क्रम की गणना करता है । उदाहरण के लिए, E651C-SL (चित्रा 5B) एक वर्णक्रमीय लाइन आकार और गतिशीलता मान (०.२४) आमतौर पर झिल्ली इंटरफ़ेस26पर गतिशील पदों पर पाया प्रदर्शित करता है । दूसरी ओर, I679C-sl और A702C-sl प्रदर्शन स्पेक्ट्रा का विस्तार (बिंदीदार रेखाएं देखें) और गतिशीलता मूल्यों में कमी (०.१६ और ०.१८, क्रमशः; चित्रा 5B) 26 कि उनके विवश आसपास के वातावरण (प्रोटीन प्रोटीन) के साथ संगत कर रहे हैं, क्रायो-EM संरचना1के अनुसार ।

चित्रा 5C asolectin liposomes में पुनर्गठन के बाद स्पिन-लेबल TRPV1 म्यूटेंट के स्पेक्ट्रा से पता चलता है. जैसा कि अपेक्षित, E651C-sl और A702C-sl के लिए स्पेक्ट्रा के गतिशील सुविधाओं पुनर्गठन के बाद बदल नहीं किया, के रूप में उनके आकार और गतिशीलता मूल्यों समाधान में एक झिल्ली वातावरण के रूप में एक ही है26। दूसरी ओर, I679C-SL एक शोर स्पेक्ट्रम दिखाता है; फलस्वरूप, निंन (नीला तीर) और उच्च (लाल तीर) फ़ील्ड घटक कम स्पष्ट हो जाते हैं । शोर स्पेक्ट्रा आमतौर पर वांछित नहीं हैं, के रूप में वे स्पिन के गतिशीलता-लेबल स्थिति को नजरअंदाज करते हैं । इस स्पेक्ट्रम प्रकार अक्षम प्रोटीन पुनर्गठन के बजाय के तहत लेबल के उत्पाद हो सकता है, के बाद से समाधान में I679C-SL संकेत मजबूत है ।

हिरण डेटा दोलन, sinusoidal संकेत क्षय का योग कर रहे हैं आदान-प्रदान की दूरी वितरण के बारे में जानकारी युक्त स्पिन-लेबल३८,३९. क्षय की अवधि और जटिलता सीधे अंतर्निहित दूरी वितरण को प्रतिबिंबित करता है । दूरी के वितरण के नमूने और उनके विकार में मौजूद संरचनात्मक घटकों की संख्या शामिल है । इसलिए, समय डोमेन संकेत गैर के बीच युग्मन dipolar से निकला-तय, समाधान में दूर स्पिन लेबल जो आम तौर पर एक घातीय पृष्ठभूमि क्षय कारण, andrigidly युग्मित एक ही प्रोटीन के भीतर spins19,४०। विशेष रूप से, हिरण अंतर-प्रोटीन लंबी दूरी की दूरी (20-70 Å) स्पिन-लेबल अवशेषों के बीच19के निर्धारण की अनुमति देता है । चित्रा 6 संकेत क्षय और E651C-SL के इसी दूरी वितरण से पता चलता है. Glu651 के वितरण 24, ३६, और ५८ Å26के लिए इसी तीन चोटियों से पता चलता है । दो छोटी दूरी बंद TRPV1 संरचना के साथ संगत कर रहे हैं (23 और ३२ å Cβ-Cβ दूरी के लिए, क्रमशः)1, जबकि तीसरे ५८ å पीक प्रोटीन एकत्रीकरण के अनुरूप हो सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. प्रायोगिक रूपरेखा । EPR और हिरण के लिए eTRPV1 को व्यक्त करने, शुद्ध करने, और पुनर्गठन के लिए आवश्यक प्रायोगिक रूपरेखा का आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. eTRPV1 और एकल cysteine म्यूटेंट के कार्यात्मक लक्षण वर्णन । (क) TRPV1 स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण (eTRPV1: cysteine-कम TRPV1 110-603/627-764) के लिए इस्तेमाल किया निर्माण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ख) HEK293 WT TRPV1, eTRPV1, और म्यूटेंट (ca के साथ लोड2 +-संवेदनशील Fluo-4-AM) व्यक्त कोशिकाओं capsaicin के लिए विश्लेषण किया गया (10 µ m)-प्रतिदीप्ति Ca2 + इमेजिंग का उपयोग कर प्रतिक्रिया पैदा की । रंग पट्टी प्रतिदीप्ति तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तन इंगित करता है, नीले और लाल के साथ सबसे कम और उच्चतम cytoplasmic Ca2 +, क्रमशः टिप्पण । सफेद पट्टी का प्रतिनिधित्व करता है १०० µm. (ग) छोड़ दिया, एक उपइकाई (S5, एक इंच ताकना, S6 और टीआरपी डोमेन) TRPV1 tetramer संरचना के एकल cysteine अवशेषों पर प्रकाश डाला (पीले क्षेत्रों) चैनल अनुक्रम के साथ शुरू की । सही, वर्तमान वोल्टेज रिश्तों Xenopus अंडाणुओं व्यक्त WT TRPV1, eTRPV1, और एकल cysteine म्यूटेंट से TEVC रिकॉर्डिंग द्वारा निर्धारित पीएच 5 के साथ चुनौती दी । पृष्ठभूमि धाराओं (bkgrd) । मूल चित्र26से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. eTRPV1 और एकल-cysteine म्यूटेंट के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन ।
डीडीएम-solubilized eTRPV1 और एकल-cysteine स्पिन के आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी प्रोफाइल-म्यूटेंट कोशिकाओं से अभिव्यक्ति और शुद्धि के बाद लेबल Sf9 । इनसेट: एसडीएस-पेज जेल दिखा monomeric eTRPV1-MBP फ्यूजन प्रोटीन (मूल आंकड़ा26से संशोधित) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एक स्पिन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन-eTRPV1 उत्परिवर्ती लेबल ।
वर्तमान वोल्टेज रिश्तों Xenopus अंडाणुओं microinjected से TEVC द्वारा निर्धारित स्पिन युक्त proteoliposomes के साथ-लेबल A702C पीएच 5 (लाल) के साथ चुनौती दी और capsazepine द्वारा अवरुद्ध (CPZ, नीला: ४० µ m). पृष्ठभूमि धाराओं (bkgrd) । मूल चित्र26से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. की मोबिल्स स्पिन-त्यसपछि eTRPV1 म्यूटेंट द्वारा निर्धारित स.-EPR.
(एक) दो उपयूनिटों (S5, एक और वक्रता कुण्डली, S6 और टीआरपी डोमेन) TRPV1 tetramer एमिनो एसिड अवशेषों (पीले क्षेत्रों) पर प्रकाश डाला संरचना के साइट के माध्यम से जांच-स्पिन लेबलिंग spectroscopies निर्देशित । (ख) प्रथम व्युत्पन्न की स. EPR स्पेक्ट्रा ऑफ स्पिन-त्यसपछि cysteine म्यूटेंट में डीडीएम-समाधान. (ग) प्रथम व्युत्पंन की स. EPR स्पेक्ट्रा ऑफ स्पिन-त्यसपछि cysteine म्यूटेंट पुनर्गठन गरिएको asolectin liposomes । स्पेक्ट्रा पीएच ७.४ (बंद राज्य) में प्राप्त किया गया । ΔHo−1 गतिशीलता पैरामीटर की भयावहता को ध्यान में रखें । काले बिंदीदार रेखा स्पेक्ट्रा के विस्तार पर प्रकाश डाला गया । नीला और लाल तीर स्पेक्ट्रा के निम्न और उच्च फ़ील्ड घटकों को क्रमशः निरूपित करते हैं. EPR स्पेक्ट्रा स्पिन लेबल की कुल संख्या को सामान्यीकृत किया गया । मूल चित्र26से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. डिटर्जेंट में एक eTRPV1 उत्परिवर्ती की दूरी वितरण ।
हिरण इको (ए) और दूरी वितरण (ख) के स्पिन-लेबल उत्परिवर्ती E651C; Gaussians का एक योग हिरण के डेटा के लिए फिट किया गया था । पी (आर) ४१स्पिन जोड़े की दूरी वितरण का अर्थ है । स्पेक्ट्रा पीएच ७.४ (बंद राज्य) में प्राप्त किया गया । मूल चित्र26से संशोधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

अभिव्यक्ति और स्तनधारी झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि के लिए वर्तमान प्रौद्योगिकियों यह स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन14,15,16,४२के लिए प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए संभव बना दिया है । यहां, हम इन प्रौद्योगिकियों को व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया है, शुद्ध, पुनर्गठन, और TRPV1 में स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण प्रदर्शन ।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के अलावा, नीचे वाले है कि हम TRPV1 के लिए troubleshot है और कि अंय प्रोटीन के लिए समायोजित किया जा सकता है । संशोधित डीएनए अनुक्रम एक टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए कि पैदावार ०.५-1 मिलीग्राम/मिलीलीटर डिटर्जेंट-शुद्ध प्रोटीन; टेंपलेट्स कि उपज से भी कम ०.५ मिलीग्राम/प्रोटीन की मिलीलीटर चुनौतीपूर्ण हैं, के बाद से अधिक 6 कीट कोशिकाओं संस्कृतियों के लीटर बढ़ उत्परिवर्ती प्रति आवश्यक होगा । प्रोटीन ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए, नहीं से कम 2 मिलीग्राम/एमएल, TCEP के बिना स्पिन-लेबलिंग दक्षता बढ़ाने के लिए । कम प्रोटीन सांद्रता और/या TCEP निशान की उपस्थिति में लेबल शोर EPR स्पेक्ट्रा उत्पंन होगा । हालांकि शुद्धीकरण के दौरान प्रोटीन 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, यह दक्षता में सुधार करने के लिए आर टी पर स्पिन लेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । शुद्धिकरण और लेबलिंग के दौरान, ग्लिसरॉल प्रोटीन स्थिरता में सुधार करता है; हालांकि, यह पूरी तरह से पुनर्गठन से पहले हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि यह liposomes में प्रोटीन की मात्रा कम हो जाती है और शोर EPR स्पेक्ट्रा उत्पंन करता है । सीएमसी के नीचे डिटर्जेंट एकाग्रता कम पुनर्गठन के दौरान एक आम प्रथा है; हालांकि, TRPV1 liposomes में शामिल करने से पहले हाला करने के लिए जाता है । इस समस्या को हल करने के लिए, TRPV1 रात भर पूर्व के साथ तैयार किया गया था liposomes बिल्कुल सीएमसी में प्रोटीन वर्षा से बचने के लिए और proteoliposome तैयारी में चैनलों की मात्रा में वृद्धि. TRPV1 asolectin liposomes28में पूरी तरह कार्यात्मक है; इसलिए, यह इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया पसंदीदा लिपिड मिश्रण था । हालांकि, यह लिपिड संरचना जिसमें एक विशेष प्रोटीन कार्यात्मक है निर्धारित करने के लिए आवश्यक है (जैसे, कोलेस्ट्रॉल) स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले ।

ऐसे EPR और हिरण के रूप में स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण कई सीमाएं, वर्तमान सहित: प्रोटीन टेंपलेट अनुक्रम में परिवर्तन है कि जैव रासायनिक स्थिरता में सुधार समारोह में एक प्रभाव हो सकता है26; गैर देशी एकल cysteines का परिचय, साथ ही स्पिन लेबल, प्रोटीन के कुछ क्षेत्रों में अच्छी तरह से सहन नहीं किया जा सकता है; लेबल किए गए प्रोटीन की बड़ी मात्रा प्राप्त करना; और सीमित गठन जब डिटर्जेंट micelles में हिरण के साथ दूरी निर्धारित परिवर्तन । हालांकि, बाद की सीमा स्पेक्ट्रा इकट्ठा करके दूर किया जा सकता है, Q-बैंड आवृत्ति, TRPV1 म्यूटेंट nanodiscs19,४३में पुनर्गठन की । बहरहाल, इन तरीकों का लाभ मुख्य रूप से वैश्विक गतिशीलता, accessibilities के पैटर्न से आता है, और एक दिया स्थिति के निरपेक्ष मूल्य से अधिक दूरी ।

तापमान संवेदनशीलता सबसे आकर्षक और कम समझ गेटिंग तंत्र में से एक है; इसलिए, स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग कर, यह कैसे झिल्ली प्रोटीन एक झिल्ली वातावरण में प्रोटीन गति में थर्मल ऊर्जा का अनुवाद करने के लिए संभव हो जाएगा । महत्वपूर्ण बात, यह थर्मल गेटिंग के दौरान संरचनात्मक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए चुनौतीपूर्ण होगा एक्स-रे क्रि या क्रायो-EM, के रूप में इन तकनीकों ठंड तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं । भविष्य के प्रयोगों EPR, हिरण, या प्रतिदीप्ति का उपयोग कर थर्मल-निर्भर गेटिंग के साथ संगत TRPV1 गठन परिवर्तन का निर्धारण करने की दिशा में निर्देशित किया जाएगा । EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी prokaryotic आयन चैनलों के लिए विस्तृत यंत्रवत मॉडल प्रदान की है, तो हम उम्मीद करते हैं कि ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम सक्रियण और दवा के तंत्र में अंतर्दृष्टि हासिल करेंगे स्तनधारी आयन का उपयोग कर चैनलों की बाइंडिंग स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

पूर्ण लंबाई की cysteine-विहीन TRPV1 प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए EPR और हिरण स्पेक्ट्रोमीटर तथा डॉ. टी. Rosenbaum तक पहुँच प्रदान करने के लिए हम डॉ॰ एच. Mchaourab के बहुत आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

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जैव रसायन १३७ अंक क्षणिक रिसेप्टर संभावित vanilloid 1 TRPV1 शुद्धि पुनर्गठन स्पिन-लेबलिंग EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी हिरण स्पेक्ट्रोस्कोपी
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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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