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Biochemistry

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

この記事では、分光分析用洗剤可溶化 TRPV1 の生化学的な量を取得する具体的な方法について説明します。結合されたプロトコルは、膜制御環境で哺乳類のイオン チャネルの構造と機能の研究を容易にするために合わせることが生化学的な生物物理学的ツールを提供します。

Abstract

ポリモーダル イオン チャネルは、アロステリック変更に異なる性質の複数の刺激を変換します。これらの動的分子構造を決定し、主不明のまま挑戦しています。アゴニスト結合部位の構造的特徴といくつかのイオン チャネルの活性化機構の単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) 放出光の最近の進歩、ステージは、ゲートの動的分析の設定します。分光学的手法を用いたメカニズム。電子常磁性共鳴 (EPR) や電子二重共鳴 (鹿) などの分光学的手法は、大量に精製することができます原イオン チャネルの研究に主に制限されています。機能的で安定した膜タンパク質の大量のための要件は、これらのアプローチを使用して哺乳類のイオン チャネルの研究を妨げています。EPR と鹿は、x 線結晶構造解析または Cryoem によって入手が困難なこと、低解像度でとはいえ構造の決定とモバイル蛋白質領域の動的変更を含むとリバーシブルのゲートの監視、多くの利点を提供します。移行 (すなわち、クローズド、オープン、増感と鈍感)。ここでは、ミリグラムの機能洗剤可溶化過渡受容体潜在的な陽イオン チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) EPR と鹿分光のラベルすることができますを取得するためプロトコルを提供します。

Introduction

単一粒子の低温電子顕微鏡 (Cryoem) の最近の進歩と哺乳類のイオン チャネルの構造は異常な率で得られています。特に、一過性受容体電位バニロイド 1 (TRPV1) などのポリモーダル イオン チャネルの構造研究を提供しているさらにその活性化機構1,2,3,の理解4,5します。 ただし、膜環境に埋め込まれたイオン チャネルに関する動的な情報はポリモーダル ゲーティングおよび薬剤結合メカニズムを理解する必要です。

電子常磁性共鳴 (EPR) と電子二重共鳴 (鹿) 分光、イオン チャンネル6,7,8,9の最も決定的な機構モデルのいくつかを提供しています。,10,11,12,13。 これらのアプローチは、原核生物の試験に主に制限されていると 3p293光イオン チャネルを細菌の高い洗剤浄化された蛋白質の多量を得られます。昆虫および哺乳類細胞の構造と機能14,15,16の真核生物の膜蛋白質の生産の発展に伴い、それは生化学的を得ることは今分光学的研究のための洗剤浄化された蛋白質の量。

EPR と鹿の信号は、タンパク質の単一システイン残基に付属する paramagneticspin ラベル (SL) (すなわちmethanethiosulfonate) から発生します。スピン ラベル 3 種類の構造情報をレポート: モーション、アクセシビリティ、および距離。この情報は、残基蛋白質の内で埋められるまたは膜または apo と配位子束縛状態13,17,18,19内の水環境にさらされているかどうかを判断できます。(すなわち、クローズド、オープン、リバーシブルのゲート遷移を監視しながら各自のネイティブ環境での動的モデルの導出のための制約のコレクションを提供する EPR と鹿のデータ (ある場合) の高分解能構造の中で、増感と鈍感)。さらに、x 線の結晶学または Cryoem で決定することは困難かもしれない柔軟な地域は、タンパク質20内の場所と同様、二次構造を割り当てるにはこれらの環境のデータ セットを使用して取得でした。脂質 nanodiscs の低温電子顕微鏡構造提供イオンのゲートに関する貴重な情報チャンネル3,21,22,23,24, 25;ただし、分光学的アプローチは、低温電子顕微鏡を使用して確認することは困難かもしれない構造の州 (例えば、温度変化) から動的な情報を提供できます。

EPR と浄化中とスピン標識後システイン残基 (特に哺乳動物チャンネルの豊富な), 低蛋白質収量タンパク質の不安定性を削除するとき、タンパク質の機能の欠如を含む鹿を実装する多くの困難を克服しなければなりません。、と洗剤やリポソームの蛋白質の集合。ここでは、これらの重要な障壁を克服し、哺乳類の感覚受容器の鹿と EPR スペクトル情報を取得するためのプロトコルを設計しています。ここでの目的は分光学的解析の式、浄化、ラベル付け、および機能最小限システイン レス ラット TRPV1 の再構成 (eTRPV1) を構築するための方法論を記述します。この方法は、それらの膜タンパク質のシステイン残基の除去にもかかわらず彼らの機能を維持することまたはシステイン二硫化物結束の形成を含む適切なです。このプロトコルのコレクションは、他の哺乳類のイオン チャンネルの分光分析の合わせることができます。

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Protocol

1. TRPV1 の突然変異誘発

注: 分光分析26最小限 TRPV1 コンストラクトは、フルレングス システイン少ないチャネル TRPV127ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 法 (図 1) を使用してから構築されました。このシステイン レス最小限 TRPV1 コンストラクト (以下 eTRPV1) は残基 110 603 と 627-764 から成っています。eTRPV1 pMO (pcDNA3.1 ベースのベクトル) の機能解析と遺伝子組換えドナー ベクトル28 x ヒスチジン マルトース結合タンパク質 (MBP) 8 を含むクローン作成-タバコ etch ウイルス (TEV) の発現と精製 (図 2 a)。eTRPV1 単一-システインの変異体は、サイト指示された突然変異誘発を使用して生成されました。ベクトルおよびチャネル シーケンスで指定されて、補足ファイル 1: 補助メソッド。

  1. オンライン ツール29と突然変異誘発プライマーを設計します。
  2. 0.2 mL チューブ ミックス: 反応バッファー、dNTP ミックス (100 mM) 1 μ、10 μ M の前方および逆のオリゴヌクレオチド、100 ng/μ L eTRPV1 テンプレート DNA26の 1 μ L、DMSO、変異酵素の 1 μ L の 1.5 μ L 各 1 μ x 10 の 5 μ L、と 38.5 μ L の脱イオン水。たちにチューブを配置する前に混合物をスピンします。
  3. 突然変異誘発 PCR を実行します。
    1. 2 分 95 ° C で変性 (a)、(b) 20 95 ° C で変性を実行 s、10 s、および (d) 4 分 68 ° C で伸長の 60 ° c (c) アニール (30 秒・ 1 kb)。18 サイクル d 手順 b を繰り返しますし、5 分 68 ° C で伸長を実行し、さらに使用するまで 4 ° C で反応を維持します。
  4. Dpnの 2 μ L を追加私に反応する酵素混合し、37 ° C、30 分インキュベートします。
  5. 変換を実行します。
    1. 氷の上のエシェリヒア属大腸菌の有能なセルを解凍します。
    2. 予冷 14 mL の生殖不能の管に有能なセルの 75 μ L とDpnI 処理した pcr の 10 μ L を追加します。優しく混ぜます。
    3. 氷上で 30 分維持管 45 42 ° C で反応を孵化させなさい s、その後すぐに 2 分板の氷の上ルリア スープ (LB) の混合物-carbenicillin (0.2 mg/mL) の入った寒天です。37 ° C で一晩プレートを孵化させなさい
    4. プレートから、少なくとも 3 つのシングル コロニーを収穫し、それぞれ 14 mL 滅菌チューブを用いた carbenicillin (0.2 mg/mL) を含む LB の 4 mL に接種します。37 ° C で一晩文化をインキュベートし、250 rpm で振る。
    5. 8,000 × g 10 分間で一晩文化スピンダウンし、市販のミニ準備キットの指示に従って DNA を抽出します。
    6. 標準的な自動化された DNA の配列によって単一システインの変異体の存在を確認 (材料の表を参照してください)。

2. eTRPV1 と単一システインの変異体の解析

  1. HEK293 細胞ライン トランスフェクション 30
    1. よく当たり高グルコース培地 (DMEM) 2 mL 中 6 - ウェル プレートで HEK293 細胞の培養 (37 ° C、5% CO295% 湿度)。70 \u2012 80% 合流は、HEK293 細胞を準備します。
    2. 2 つの独立した 1.5 mL マイクロ遠心チューブにトランスフェクション混合物を準備します。
      1. 反応が、0.5 μ g eTRPV1 またはシステイン変異体を含む pMO を最小限必要な媒体 (例えばオプティ MEM) の 250 μ L に追加します。反応 B、最小必須培地の 250 μ L に 3 μ L のトランスフェクション試薬を追加します。各反応室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。
      2. 1 mL ピペットで反応 A と B を混ぜます。右の 45 分の混合物を孵化させなさい
    3. よく 70-80% の合流から 500 μ L の培地を削除し、500 μ L の反応混合物を追加します。Ca2 +イメージング (37 ° C、5% CO2、および湿度 95%) のために夜通しプレートを格納します。
  2. HEK293 細胞内 Ca2 +イメージング30
    1. 直径 12 mm ガラス coverslips にエタノールと水をきれいおよび 24 ウェル プレートにそれらを置きます。
    2. 各 coverslip のセンターでポリ l リジンの 75 μ L を追加し、45 分 (37 ° C、5% CO2、湿度 95%) のプレートを格納します。
    3. 3 回でリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、残りを削除する余分なポリ-l-リジンと洗って coverslips を削除します。
    4. いったん、coverslips は準備ができて、6 ウェル プレートから細胞をデタッチに進みます。
    5. メディアを取り出し、洗浄用の暖かい PBS (37 ° C) 500 μ L を追加します。
    6. PBS を取り外して、トリプシンを 500 μ l 添加 1 分間インキュベートします。
    7. 消化反応を停止し、ピペット; とミックスする暖かい文化メディア (37 ° C) 500 μ L を追加します。気泡を形成しないでください。必要な場合は、希釈より文化メディアでこの再懸濁細胞濃度を調整します。
    8. 培地 (500/ウェル μ L 最終巻) の前処理 coverslips の 250 μ L 加えて transfected HEK293 細胞 (70% 合流) の 250 μ L をシード、インキュベーター (37 ° C、5 %co2、湿度 95%) で 1-2 時間 (取付用) 落ち着いてみましょう。
    9. 一方で、0.02% プルロニック酸と 1 μ M を追加して読み込みソリューションを準備蛍光 4時リンガーのバッファーにします。ソリューションをよく混ぜます。
    10. 井戸から HEK293 文化メディアを取り出し、ローディング ソリューションを 500 μ l 添加します。1 h (37 ° C、5% CO2、湿度 95%) のための細胞を孵化させなさい。暖かいリンゲル液バッファーで 2 回蛍光 4 ロード セルを洗います。
    11. 細胞内 Ca2 +測定を実行する 10 mm のペトリ皿に (使用目的; 494 nm 励起と 506 nm 発光 X 10) 顕微鏡ステージに読み込むセルの coverslip を配置します。
    12. (例えば、10 μ M カプサイシン) それぞれの配位子を灌後蛍光強度の変化を測定市販ソフトウェアを使用して (材料の表を参照してください)。
  3. mRNA とアフリカツメガエル卵母細胞の準備30
    1. ETRPV1 とPmeと単一システインの変異体を含む pMO をリニア化私は 37 ° C で 1 時間のきれいな DNA 市販精製キットの指示に従います。
    2. 使用する線形し、T7 RNA ポリメラーゼと互換性のある市販のキットで頂いた Rna を合成する Dna を洗浄します。
    3. 市販の精製キットによるとキャップ Rna をクリーンアップします。260 nm の波長で吸光度を測定することにより RNA 量を定量化します。
    4. 転送 5 \u2012 含む ND96 溶液 20 mL、50 mL の円錐管にX. laevis卵 (市販) 10 mL (96 mM NaCl、KCl、5 mM HEPES、2 mM 1 mM MgCl2; pH 7.4) 1 mg/mL コラゲナーゼと室温 50 分 nutate
    5. 解決策が明らかになるまで、ND96 の卵母細胞を洗浄します。新鮮なコラゲナーゼを追加した確認で 30 分のステレオ顕微鏡下で卵子を振るし、外側の濾胞層 (赤い血管の光沢のある層) が存在しない場合、消化を停止ほとんど卵母細胞 (90%)。ソリューションがクリアされるまで ND96 で卵母細胞をすすいでください。
    6. ND96 プラス 1 mM CaCl2 1 h. 消化の下で卵を振るとポリスチレン 50 mL チューブに転送卵子ポリスチレン管に固執します。
    7. ND96 プラス 1 mM ゲンタマイシンの 50 μ g/mL と 50 μ g/mL のテトラサイクリンの CaCl2と補足ソリューションと卵を洗います。
      注: は、露光からテトラサイクリンを含むソリューションを保護します。
    8. 破損した膜と動物と植物極の間の明確な分離を表示せず大きな卵を選択します。卵母細胞 16 ° C でのマイクロインジェクションの前に 4 h の回復をさせる
    9. ガラス ピペットを使用 (外径: 1.11 mm、内径: 0.5、および長さ 8.8 cm) ナノリットル インジェクター システム (46 nL/秒) とステレオ顕微鏡 (2 倍) を使用して卵母細胞に eTRPV1 と単一システインの変異体からの mRNA の 1-5 ng を注入します。CaCl2と抗生物質を添加した ND96 の 16 ° C で卵母細胞を保存 (ゲンタマイシン/テトラサイクリン 1 x)。
    10. 72 時間後 2 電極電圧クランプ (TEVC) 取得システム31を用いた巨視的電流を測定します。
    11. ホウケイ酸ガラス ピペット (0.3 MΩ) を引いて、3 M の KCl でそれらを埋めます。
    12. 転送ピペットを使用して録音室で卵母細胞を置き、低速で風呂ソリューション (120 mM の NaCl、KCl、2 mM MgCl2、グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM と 10 mM HEPES ソリューション 2 mM; pH 7.4) を灌流します。
    13. そのピペット オフセットを調整するバス ソリューションの両方の電極を浸します。ゆっくりピペット電極 (ホウケイ酸ガラス ピペット。内径外径: 1.5 mm: 1.10 と長さ 10 cm) に卵母細胞膜電位の変化だけでなく、小さなインデント (2 倍)、ステレオ顕微鏡観察まで。
    14. -80 から +80 に電圧クランプ ランプを適用中モードとメジャーの巨視的電流を記録するアンプの設定を変更 1 s. 負荷で使用されるソリューションと灌流システムの mV ステップ 2.3.12 pH 7.4 (コントロール) として、pH 5 eTRPV1 動作をチェックします。

3. 蛋白質の表現の組換えバクミドとバキュロ ウイルスの生成

  1. バクミド
    1. 7.5 DH10Bacエシェリヒア属大腸菌の有能なセルの 100 μ L を変換 eTRPV1 および/または単一システインの変異体を含む組換えドナー ベクトルの ng。
    2. 900 μ L の SOC のメディアを追加 (20 mg/mL トリプトン 5 mg/mL 酵母エキス、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、および 20 mM グルコース)、6-7 h 37 ° C で、225 rpm インキュベートします。
    3. 100 μ L の混合物、およびシリアルの希薄をシード (1/10、1/100) の LB 寒天培地プレート 100 μ g/mL、40 μ g/mL、IPTG X gal を含む 7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 G/ml テトラサイクリンと 50 μ g/mL カナマイシン。37 ° C で少なくとも 48 h 用の版を孵化させなさい
    4. 青いコロニーがない関心の挿入から、直径 2 mm は、白人の植民地を選択します。ステレオの顕微鏡を使用して、白人の植民地に青い斑点があるすべてが含まれていないことを確認します。
    5. 少なくとも 3 つのシングル コロニーを収穫し、4 mL LB 培地 7 μ g/mL ゲンタマイシン、10 μ g/mL テトラサイクリン、50 μ g/mL カナマイシンを含む 14 mL 滅菌チューブにそれらを転送します。セル一晩 (~ 16 h) 37 ° C および 250 rpm で孵化させなさい。
    6. (詳細なプロトコルの補助のファイル 1 を参照してください) 一晩文化および分離組換えバクミド DNA の 1.5 mL を取る。2 ヶ月間の 4 ° C でバクミドを格納します。
      注: DH10Bacエシェリヒア属大腸菌DNA バクミドを含んでいるグリセロールを準備します。文化の 300 μ L を取るし、50% (20% の最終的なグリセロール濃度) グリセロールの 200 μ L を追加します。さらに使用するまで-80 ° c 因数を格納します。
    7. PCR を用いた遺伝子組換えバクミドの eTRPV1 の存在を確認 (詳細なプロトコルの補助ファイル 1を参照してください)。
  2. バキュロ ウイルス
    注: この手順の 6 ウェル形式で Sf9 昆虫細胞を transfect します。すべての量とボリュームがよく当たりに基づいて与えられます。抗生物質の使用を避けてください。
    1. 昆虫細胞培地 2 mL に 1 x 106 Sf9 細胞をプレートします。少なくとも 45 分を添付します。
    2. 1 μ g の組換えバクミド DNA 昆虫細胞媒体の 100 μ l を希釈します。優しく混ぜます。
    3. 昆虫細胞媒体の 100 μ l のトランスフェクション試薬 (TR) の 6 μ L を希釈します。優しく混ぜます。
    4. DNA と TR のソリューションを組み合わせて (からのステップ 3.2.2 および 3.2.3、それぞれ)。穏やかに混合し、室温 30 分間インキュベート
    5. DNA/TR 混合物; に昆虫の細胞メディアの 0.8 mL を追加します。優しく混ぜます。
    6. Sf9 細胞から昆虫の細胞のメディアを取り出し、新鮮な培地 1 mL で 1 回洗浄します。
    7. 洗浄媒体を削除し、DNA/TR の混合物を追加 (3.2.2 \u2012 3.2.5) セルに。27 ° C (攪拌) なし 5 h でセルを孵化させなさい。
    8. トランスフェクション混合物を削除し、2 mL の 0.5% ウシ胎児血清 (FBS) を含む昆虫の細胞培に置き換えます。5 日間で 27 ° C の細胞を孵化させなさい。
      注意:メディアで空井戸を充填し、パラフィン膜の 2 つの層を持つ 6 ウェル プレートをカバーによって携帯メディアの蒸発を防ぐ。
    9. 15 mL 遠心チューブに細胞培養媒体を転送します。4 ° C で 15 分間 8,000 の x g でチューブを回すことによってウイルス ストックの最初の一節 (P1) を分離します。きれいな 15 mL 遠心チューブに上清を転送し、すぐに 4 ° C で保存
      注: は、アルミ箔の管を覆うことによって露光からウイルスを保護します。
    10. 1 x 106 Sf9 細胞/ml 2% を含む昆虫細胞培地の培養で 25 mL を入れてウイルス ストックの第 2 世代 (P2)、125 mL のフラスコに FBS (平底と出された)。25 mL 文化に P1 ウイルスの 25 μ L を追加します。
    11. 72 h の 27 ° C で文化を孵化させなさい。
    12. P2 のウイルス株を収穫するには、新しい 50 mL チューブに文化を転送し、4 ° C で 15 分間 8,000 × g で遠心分離
    13. 新しい 50 mL チューブに上清を転送し、すぐに 4 ° C で保存
      注: は、アルミ箔の管を覆うことによって露光からウイルスを保護します。最適な TRPV1 式 P2 ウイルス/sf9 に対する比を滴定する小規模な実験を行う (詳細なプロトコルの補助のファイル 1を参照してください、セクション 4 タイトル「P2 ウイルスの小規模実験」)。
    14. 大規模な蛋白質の表現、設定 1 L Sf9 細胞懸濁培養昆虫細胞培地 0.5% で 2 x 106セル/ml で 2.8 L ホウケイ酸ガラス フラスコに FBS。
    15. 1 L 文化に P2 ウイルス ストックの 1 mL を追加し、72 h 27 ° C でインキュベートします。
      注: 3 日目、細胞密度は約 1.5 2.5 x 106セル/ml にする必要があります。

4. eTRPV1 と単一システインの変異体の浄化

  1. 膜分離28
    1. 収穫 4,500 × g、4 ° C、20 分で回転で 1 L 昆虫の細胞培養 (6-9 g 程度を見込み) 細胞ペレットの重量を量る。
    2. 25 mL の氷冷バッファー A で細胞ペレットを再懸濁します (36.5 mM ショ糖、2 mM tris(2-carboxyethyl) ホスフィン (TCEP) と 50 mM; トリス pH 7.4) (1 mM フェニルメチル フッ素 (PMSF), 3 μ g/mL leupeptin, 3 μ g/mL アプロチニン プロテアーゼ阻害剤の存在下で、1 μ g/mL ペプスタチンと)。均一な懸濁液を入手して 4 ° C、20 分で回転する細胞塊の分解および。
    3. マニュアル (dounce 組織グラインダー) または高圧ホモジナイザーを使用してセルを分割します。4 ° C で 20 分間 8,000 × g で遠心分離によって細胞の残骸を削除します。
      注: は、全体の過程で分離細胞および氷のチューブを維持します。
    4. 清と 4 ° C で 30 分間 100,000 × g で遠心分離を収集します。上澄みを廃棄し、冷えたバッファー B (150 mM NaCl, 2 mM TCEP、50 mM HEPES 10% グリセロール; pH 7.4), 20 mL の総量 (4.1.2 の手順) とプロテアーゼ阻害剤を添加した膜ペレットを再懸濁します。
    5. 50 mL チューブの膜を懸濁液と液体窒素で急速凍結の分注 20 mL。さらに使用するまで-80 ° c のサンプルを格納します。
  2. タンパク質精製26,28
    1. 氷の膜の因数を解凍し、n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) チューブ (200 mM 在庫) あたりの 3 mL を加えます。4 ° C で 2 h のチューブを回転させてください。
    2. 4 ° C で 30 分間 100,000 × g のサンプルを遠心分離します。上清を収集し、きれいなウェット アミロース樹脂の 1 つの mL を追加します。4 ° C で 2 h の混合物を回転させる重力流クロマトグラフィ用カラムでタンパク ・ アミロース混合物をロードします。
      注意:樹脂洗浄中に乾燥するようにしてください。
    3. 10 回冷たいバッファー C (150 mM NaCl、10% グリセロール、50 mM HEPES、0.5 mM 0.1 μ g/mL asolectin、0.5 mM TCEP DDM; pH 7.4) のベッドのボリュームと蛋白結合アミロース樹脂を洗浄します。冷たいバッファー D (150 mM NaCl、10% グリセロール、50 mM HEPES、DDM 0.5 mM、0.1 μ g/mL asolectin, pH 7.4) の 10 ベッド ボリュームで洗ってください。
      注: 洗濯前に洗剤や脂質、窒素パージせずにバッファー D をドガします。脱ガス後、DDM と asolectin を追加します。
    4. 0.5 mL の一部分が付いている eTRPV1 蛋白質の溶出、冷たいの 5 mL まで脱バッファー D、20 mM マルトースと補われます。可能であれば、洗浄および 4 ° C で溶出を実行します。
    5. 280 nm の波長で吸光度を測定することによりタンパク質の量を定量化します。
      注: このプロトコルには、文化のリットル当たり 0.5 〜 1.0 mg が得られます。各 eTRPV1 単一システインの変異体の蛋白質収量が変わる可能性があります。EPR と鹿の実験用 4 \u2012 6 L を育てる文化。

5. eTRPV1 単一システイン Mutant Site-Directed スピン標識

  1. 遠心ろ過ユニットを使用して eTRPV1 を含む分数を集中 (カットオフ = 100 kDa) まで 2 \u2012 2.5 mg/mL (4 ° C で 2 分間 7,000 x g のサイクル) の分類のため。
  2. 高濃度のタンパク質を DMSO で 100 mM の原液からメチル (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methanethiosulfonate (MTSSL) スピン ラベルの 10 倍モル過剰 (3 回、各 30 分) を追加 (eTRPV1 モノマー: MTSSL 1:10 のモル比)17. 1 時間 30 分、4 ° C で一晩インキュベート後の RT で暗闇の中で反応を維持
    注: この手順では MBP は一晩スピンラベル孵卵中における TEV プロテアーゼを追加することによって削除でした。
  3. サイズ排除クロマトグラフィー コラムに負荷スピン標識 eTRPV1 平衡バッファー e (150 mM の NaCl、20 mM HEPES、0.5 mM DDM; pH 7.4) タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムによって制御されます。ETRPV1 テトラマーを含有する画分を収集します。
    メモ: 再構成効率を低下させるので、この手順で 10% グリセロールを含めないでください。
  4. 280 nm の波長で吸光度を測定することによりタンパク質の量を定量化します。
  5. SDS ページのゲル (ゲルの染色無料、4 \u2012 20%) を実行して、サンプルの純度を評価します。サンプルは、分光測定ソリューションまたはプロテオリポソームの準備が整いました。

6. eTRPV1 スピン標識単一システインの変異体の再構成

  1. 40 ° C で 1 時間減圧 (100 mbar) ロータリーエバポレーターを使用して asolectin の 10 mg の乾燥します。Asolectin リポソーム バッファー F (200 mM の NaCl、5 mM モップ; pH 7.4) の 1 つの mL を追加し、15 分間またはサンプルが均一になるまで混合物を超音波照射します。
  2. 2 mM の最終的な集中に DDM を追加することにより、リポソームを不安定にし、室温 30 分間インキュベート
  3. 2 mg/mL に分類された蛋白質を集中し、それを 1:5 タンパク質/脂質比 (質量:) を用いたリポソームに追加します。
    注意:スピン標識効率低下低濃度、高蛋白質を沈殿させるかもしれないので前述のタンパク質濃度を維持することが重要です。
  4. DDM 臨界ミセル濃度 (CMC) 蛋白質/リポソーム混合比を調整し、穏やかな攪拌と 4 ° C で一晩インキュベート バッファー F を追加します。
  5. ダブル バッファー F と順番に室温穏やかな攪拌と 1 h 間隔で非極性吸着剤ポリスチレン (30 mg、50 mg、80 mg) の 3 つの因数を追加して削除洗剤タンパク質/リポソーム混合物のボリューム
  6. ビーズを削除し、プロテオリポソーム混合物を遠心管に転送する列フィルター (重力流クロマトグラフィー コラム) の上に混合物をロードします。遠心分離機の 4 ° C で 1 時間 100,000 × g でサンプル上澄みを廃棄し、バッファー f. の 30 μ L でペレットを再懸濁します
    注: サンプル分光分析とアフリカツメガエル卵母細胞への注入のため準備ができています。サンプルは、同じ日に使用できない場合、フラッシュ - それら液体窒素及び凍結-80 ° C でストア
  7. プロテオリポソーム -アフリカツメガエル卵母細胞電気生理学26,32
    1. 50 を注入アフリカツメガエル卵母細胞セクション 2.2 で説明されているようにスピン標識プロテオリポソームの異なる希釈率の nL。
    2. セクション 2.3.10 で前述の注射 12 時間後 TEVC 測定を実行します。
  8. 分光学的測定と分析 (セクション 7) に進んでください。

7. 鹿や EPR 分光法

  1. ダブル電子 (鹿) の共鳴。
    1. Q バンドの周波数 (34 GHz) で動作し、33メーカー提供のソフトウェアを使用して 83 ° デッド ・ タイム無料 4 パルス シーケンスで 10 W アンプ搭載パルス EPR 分光器で鹿測定を実行します。
    2. 低温保護のため 30% (v/v) グリセロールとバッファー E (ステップ 5.5) で洗剤精製 eTRPV1 スピン標識システインの変異体の 50 μ M を補足します。
    3. 簡単な低速遠心分離 (100 x g) によって密閉された石英キャピラリー チューブとチューブの底にスピンにサンプルをロードします。
    4. サンプルを凍結する液体窒素にキャピラリー チューブを配置します。サンプルは、後測定-80 ° C でこの時点で保存できます。
    5. マイクロ波共振器に直接サンプルを置き、-83 ° 10 \u2012 の再平衡せて 20 分。
    6. 標準的な 4 パルス鹿プロトコル、(π/2) mw1 を使用してサンプルを測定-τ 1-(π) mw1-τ 1-(π) mw2-τ 2-(π) mw1-τ 2-エコー34。(Π/2) mw1 と (π) mw1 のパルスの長さは、それぞれ 10 および 20 ns と 40 (π) mw2 の ns。63 mhz 周波数分離を設定します。
      注: 自作ソフトウェア (例えばMatlab で) スピン ラベル19,35間の距離を記述するためのガウス分布の合計を想定すると一次鹿減衰データを分析できます。
  2. 連続波 (CW) EPR 分光法
    1. 製造元のソフトウェアを使用して X バンド (9.6 GHz) の分光器の RT で CW EPR 実験を実行します。
    2. 水チラー、コンソール、および電磁石電源 on にして計測器を起動します。ソフトウェアを計測器に接続、楽器調整、ウォーム アップする楽器のために少なくとも 30 分を待ちます。
    3. ステップ 5.5 に毛細管を使用して 25 μ L ガラス製毛管から 20 μ L のサンプルを読み込むし、シールとチューブの端を密封します。
    4. マイクロ波共振器にキャピラリー チューブをロードし、手動でまたは自動的にソフトウェアの自動調整機能を使用して共振器を批判的にカップルします。
    5. 標準器の条件の下で最初の微分スペクトルを収集: 100 kHz マイクロ波変調、1.6 G 磁界変調、10 mw に電子レンジ。
    6. データ解析とプレゼンテーションは、背景に対してスペクトルを修正、スペクトルを二重積分のピーク-ピーク値で割ることによって正規化します。
    7. 最初の誘導体の吸収スペクトル (ΔHo-1)36中央線幅の逆を測定によるスピン ラベル移動を決定します。

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Representative Results

最小限のシステイン レス TRPV1 の構築 (eTRPV1) と単一システインの変異体の機能解析

分光学的研究への第一歩は、エンジニア リングおよび機能、蛋白質の生化学的な量をもたらすシステイン少ないタンパク質構造 (図 2 a) を特徴付けます。eTRPV1 は、Ca2 +イメージングおよび TEVC (図 2 b・ C) が定める機能します。また、eTRPV1 は、EPR と鹿の実験 (0.5 - Sf9 細胞の 1 リットル当たり 1 mg) の洗剤精製タンパク質の十分な量を提供します26。特定のタンパク質の地域で 1 つのシステインを導入の機能は影響しません。図 2 b eTRPV1 含む HEK293 に野生型 (WT) 同様にその蛍光強度は増加する TRPV1 のアゴニスト (例えばカプサイシン) が追加されるので eTRPV1 に単一システインの変異株 (E651C と A702C) のいくつかの例を示しています。Ca2 +イメージング26に示すように、セルです。その一方で、A680C は、蛍光は背景から見分けがつかない非機能的なシステインの変異体の典型的な例です。A680C 変異体は、さらに分析のため除外されました。Ca2 +イメージング実験後は、生物物理物性を評価する TEVC またはパッチ クランプを使用して単一システインの変異体の機能をテストします。図 2は、TRPV1 TEVC26によって決定される ph 5、挑戦時の特徴的な外へ向かう整流を突然変異体に要約を示しています。単一システインの変異体の機能解析は式および浄化のプロトコルを着手する前に最初のチェックポイントです。

ETRPV1 と単一システインの変異体の生化学的解析

上記の浄化のプロトコルの TRPV1 シーケンスに沿ってシステインの共有結合修飾 (例えばフルオロ、スピン標識 [SL] メチル methanethiolsulfonate) 経由でラベル付けできますが洗剤可溶化タンパク質が得られます分光分析。最小限の TRPV1 チャネルを含むシステイン残基を安定で単分散の種として移行 (〜 13.6 mL)、サイズ排除クロマトグラフィー (図 3) によって決定されます。eTRPV1 と単一システイン スピン標識変異体 (E651C SL と A702C SL) 溶出プロファイルと最小限の TRPV1 構成 (図 3)26おすすめ安定性を要約するでしょう。単一システイン蛋白質の安定性に影響を与える可能性がありますとして溶出プロファイルが異なる変異体の間で異なります。いくつかのインスタンスで変異体形成総計;サンプルのほんの一部が四量体 (図 3、一番下の赤矢印) として移行タンパク質の量を減らす (8 9.5 mL)、列のボイドで溶出します。この場合、集計の一部またはいずれかで失われたタンパク質はこの突然変異体をさらに分析から除外でき、近隣の残渣をテストに進みますを賠償するセル文化ボリュームを拡張できます。など、四量体に対応するピークの広がりがあります。3 mL よりも広い、メインのピークは分光分析では推奨されません彼らは複数を含んでいる-種を分散させます。スピン標識単一システインの変異体の生化学的解析は、事業再構築と分光分析の前に 2 番目のチェックポイントです。

機能特性の再構成スピン標識 eTRPV1 単一システイン変異体

EPR と鹿の信号はシステイン残基に常磁性スピン ラベルの添付ファイルに依存しているためスピン ラベルの位置がタンパク質の機能を変更するかどうかを確認することが重要です。平面脂質二分子膜実験、パッチク ランプ、TEVC など、スピン標識タンパク質の再構成後の関数をテストするいくつかの方法があります。TEVC では、巨視的電流を記録しながら多数のスピン標識チャンネルの評価をことができます。単一システインのスピン標識変異体の機能を評価するためにチャネルは前もって形成された asolectin リポソームに再構成されました。この手順では、全体が浄化、グリセロール タンパク質リポソームに再構成の効率が下がるので 10% グリセロールを除外することが重要です。A702C SL TRPV1 の結果 asolectin リポソームに再構成し、アフリカツメガエル卵母細胞に microinjected の代表を図 4に示します。予想通り、pH 5 引き出す堅牢な外へ向か整流電流37 TRPV1 拮抗薬 capsazepine (CPZ、ブルー トレース)26の共同アプリケーションでブロックされているの。スピン標識と再構成後の機能を保持していない突然変異体は、さらに分析から除外すべき。再構成されたスピン標識単一システインの変異体の機能解析は、事業分光解析の前に第 3 チェックポイントです。

構造力学のスピン標識 eTRPV1 変異体によって監視されている CW EPR と鹿

ニトロキシド スピン ラベルが周囲の環境に敏感であるし、ラベルがある蛋白質のバックボーンの柔軟性に17が接続されています。したがって、CW EPR により特定のスピン標識したシステインの動的療法の決定すなわち、水性メディアまたは膜にさらされる位置がそれらの蛋白質蛋白質の相互作用17に制限よりもダイナミック。図 5 aは、TRPV1 移動パラメーターを監視することを選択の位置 Glu651、Ile679、および Ala702 を示しています。スピン ラベル プローブ モビリティ パラメーターを計算するには、1 つは最初の誘導体の吸収スペクトル (図 5 b、黒ライン ΔHo−1) の中央線幅の逆関数を計算します。例えば、E651C SL (図 5 b) 値を表示スペクトル線の形状とモビリティ (0.24) 膜インターフェイス26動的位置でよく見られます。その一方で、I679C SL と A702C SL の展示 (点線を参照) スペクトルの移動度の低下を広げる (0.16 と 0.18、それぞれ;図 5 b)26低温電子顕微鏡構造1によると制約された周辺環境 (タンパク質) と一致しています。

図 5は、asolectin リポソームに再構成した後スピン標識 TRPV1 の突然変異体のスペクトルを示しています。予想通り、E651C SL と A702C SL のスペクトルの動的特徴変えなかった再構成後は、その形状と移動度の値が膜環境26のようにソリューションで同じ。I679C SL が雑音のスペクトルを示しています一方でしたがって、下 (青い矢印) と高い (赤矢印) フィールド コンポーネントは、わかりにくくなります。ノイズのスペクトルはスピン標識位置の移動性を過小評価する傾向にある、通常必要なないです。このスペクトル型ソリューションで I679C SL 信号は堅牢なので下でラベリングするのではなく、非効率的なタンパク質溶解の製品かもしれない。

鹿データは、相互作用のスピン ラベル38,39の距離分布に関する情報を含む振動、正弦波の信号減衰の合計です。期間と崩壊の複雑さ直接基になる距離分布を反映します。距離の分布は、構造コンポーネント、サンプル、およびその障害で現在の数で構成されます。時間領域信号が、双極子から派生するため、通常背景の指数関数的減衰の原因とソリューションの非固定、遠いスピン ラベル間の結合、andrigidly 結合同じタンパク質19,40の回転。具体的には、鹿はスピン標識残19間の蛋白質間長距離距離 (20-70 Å) を判断できます。図 6は、信号の減衰と E651C SL の対応する距離分布を示します。Glu651 の分布は、24、36、および 58 Å26に対応する 3 つのピークを示しています。2 つの短い距離は閉じた TRPV1 の構造と一致している (23 と 32 Å Cβ Cβ の距離それぞれ)1, 3 58 Å のピークは蛋白質の集合に対応するのに対し。

Figure 1
図 1。実験概要。エクスプレス、浄化、EPR と鹿の eTRPV1 の再構成のために必要な実験の概要の図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2。ETRPV1 と単一システインの変異体の機能解析します。分光分析用 TRPV1 の構造の模式図 (A) (eTRPV1: システイン レス TRPV1 110-603/627-764)。(B) HEK293 細胞 WT TRPV1 を表現する、eTRPV1、および変異体 (Ca2 +を搭載-敏感な蛍光-4時) カプサイシン (10 μ M) の行った-蛍光 Ca2 +イメージングを使用して応答を誘発。カラー バーは最低と最高を示す赤と青の蛍光強度の相対的変化を表します細胞質 Ca2 +、それぞれ。白いバーは、100 μ m (C) 左、TRPV1 四量体構造単一システイン残基 (黄色球) チャネルの順序に沿って導入を強調表示のサブユニット (S5、細孔のヘリックス、S6 および TRP ドメイン) の 1 つを表します。右、電流-電圧関係は単一システインの変異体 pH 5 に挑戦、eTRPV1、WT TRPV1 を表現するアフリカツメガエル卵母細胞からの TEVC 録音によって決まります。バック グラウンド電流 (bkgrd)。元図26から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3。ETRPV1 と単一システインの変異体の生化学的解析。
ETRPV1 の DDM 可溶化と発現と Sf9 細胞から精製した単一システイン スピン標識変異体のサイズ排除クロマトグラフィー プロファイル。Inset: SDS-PAGE のゲル (元図26から変更) 単量体 eTRPV1 MBP 融合蛋白質を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4。スピン標識 eTRPV1 変異体の機能解析。
A702C は ph 5 (レッド) に挑戦し、capsazepine によってブロックに、電流-電圧特性プロテオリポソーム含有スピン標識 microinjectedアフリカツメガエル卵母細胞から TEVC によって決定されます (CPZ、青: 40 μ M)。バック グラウンド電流 (bkgrd)。元図26から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5。CW EPR によって決定されますスピン標識 eTRPV1 変異体の移動度。
(A) 2 サブユニット (S5、細孔のヘリックス、S6 および TRP ドメイン) TRPV1 四量体構造アミノ酸残基 (黄色球) スピンラベル分光のサイト監督を介してプローブを強調します。(B) DDM ソリューションのスピン標識システインの変異体の CW EPR スペクトルの最初の誘導体。(C) asolectin リポソームに再構成したスピン標識システインの変異体の CW EPR スペクトルの最初の誘導体。PH 7.4 (閉じた状態) でスペクトルが得られました。ΔHo−1は、移動パラメーターの大きさを示します。黒の点線は、スペクトルの広がりを強調表示します。青と赤の矢印は、それぞれスペクトルの低と高のフィールド コンポーネントを示します。EPR スペクトルはスピン ラベルの合計数を正規化されました。元図26から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6。洗剤の eTRPV1 の突然変異体の距離分布。
鹿エコー (A) および突然変異体のスピン標識 E651C; の距離分布 (B)ガウス分布の和は、鹿データに装着しました。P(r)は、スピンのペア41の距離分布を示します。PH 7.4 (閉じた状態) でスペクトルが得られました。元図26から変更。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

哺乳類膜蛋白質の表現そして浄化のための現在の技術は分光学的研究14,15,16,42のための蛋白質の十分な量を取得する可能にしました。ここでは、エクスプレス、浄化、再構成、および TRPV1 の分光学的解析を実行するこれらの技術を適応しています。

プロトコルの重要なステップの間で以下の我々 に TRPV1 のトラブルシューティングを持っているものがあります、他の蛋白質を調整可能性があります。0.5 - 1 mg/mL 洗剤精製タンパク質を生成するテンプレートを生成する DNA シーケンスを変更します。昆虫の細胞培養の 6 リットル以上の成長変異体ごとに必要になるので、タンパク質の 0.5 mg/mL 未満を生成するテンプレートは挑戦しています。蛋白質必要があります集中する、スピン標識効率を高める TCEP なし 2 mg/mL 未満。TCEP 存在および/または低蛋白濃度をラベリング トレース ノイズの EPR スペクトルが生成されます。タンパク質は、精製時に 4 ° C で維持されますが、分類の効率を改善する RT でスピンを実行する不可欠です。浄化とラベルの間にグリセロール蛋白質の安定性を向上します。しかし、それ取除かれなければならない完全に再構成する前とリポソーム中のタンパク質の量を減少させるノイズの EPR スペクトルを生成します。再構成; 中に一般的な方法は、CMC 以下洗剤濃度を減少ただし、TRPV1 はリポソームに組み込む前に沈殿する傾向があります。この問題を解決するために TRPV1 は、蛋白質の沈殿物を避けるために、プロテオリポソーム調製でチャンネルの量を増加するように CMC を正確に前もって形成されたリポソームと夜通し孵化だった。TRPV1 が完全に機能 asolectin リポソーム28;したがって、このプロトコルで使われる最寄りの脂質混合物だった。ただし、分光学的解析を行う前に、特定のタンパク質が機能 (例えばコレステロール) 脂質組成を決定することが不可欠です。

分光学的アプローチでは、EPR、鹿など、いくつかの制限を提示: 生化学的な安定性を向上させるタンパク質テンプレート配列の変化影響を与えるかもしれない関数26;タンパク質の特定の地域でスピン ラベルと同様に、ネイティブでない単一システインの導入可能性がありますも許容できません。大量の分類された蛋白質; を入手限られた変化洗剤ミセル中で鹿との距離を決定するとき。ただし、後者の制限は、Q バンドの周波数帯 nanodiscs19,43で再構成した TRPV1 変異体ので、スペクトルを集めることによって克服できます。それにもかかわらず、これらのアプローチの利点は、大域的ダイナミクス、アクセシビリティ、および指定された位置の絶対値から以上の距離のパターンから主に来る。

温度感度が最も魅力的なの 1 つと少ない理解ゲーティング機構;したがって、分光学的アプローチを使用して、あろう膜環境でタンパク質の動きに、膜タンパク質が熱エネルギーを変換する方法を決定することが可能。重要なは、熱ゲーティング x 線結晶構造解析や低温電子顕微鏡を使用してこれらの技術は凍結温度で実行される時に構造変化を判断するは困難ででしょう。今後の実験計画は、TRPV1 コンフォメーション変化熱依存性ゲート EPR、鹿、または蛍光を使用して互換性を決定するのに向けられるでしょう。EPR 分光ので上記プロトコルを使用して、我々 は活性化機序と薬剤を使用して哺乳類のイオン チャネルの結合に洞察力を得るが期待、原核生物のイオン チャネルの詳細な機構モデルを提供しています。分光学的アプローチ。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

EPR と鹿のスペクトロ メーターへのアクセスを提供するため博士 h. Mchaourab と博士 t. ローゼンバウム フルレングスのシステイン レス TRPV1 プラスミドを提供するために非常に感謝しております。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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References

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生化学、問題 137、一過性受容体電位バニロイド 1、TRPV1 を浄化、再構成、スピン標識、EPR 分光法、鹿の分光学
精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成
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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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