Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Denne artikkelen beskriver bestemte metoder for å få biokjemiske mengder vaskemiddel-solubilized TRPV1 for spectroscopic analyse. Kombinert protokollene gir biokjemiske og Biofysiske verktøy som kan tilpasses for å lette strukturelle og funksjonelle studier for pattedyr ionekanaler i en membran-kontrollert miljø.

Abstract

Polymodal ionekanaler transduce flere stimuli av forskjellige naturer allosteric endringer; disse dynamiske konformasjonen er utfordrende å finne og forblir hovedsakelig ukjent. Med nylige fremskritt innen enkelt-partikkel cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM) belyse strukturfunksjonene av Agonistiske bindende områder og aktivisering mekanisme flere ionekanaler, er scenen satt for en dynamisk dybdeanalyse av deres gating mekanismer bruke spektroskopiske tilnærminger. Spektroskopiske teknikker som elektron spinn resonans (EPR) og doble elektron-elektron resonans (DEER) har vært hovedsakelig begrenset til studiet av prokaryote ionekanaler som kan bli renset ved store mengder. Kravet for store mengder funksjonelle og stabil membran proteiner har hemmet studiet av pattedyr ion kanalene benytter disse tilnærmingene. EPR og HJORT tilby mange fordeler, inkludert fastsettelse av strukturen og dynamiske endringer av mobile protein regioner, om enn på lav oppløsning, som kan være vanskelig å få Røntgenkrystallografi eller cryo-EM, og overvåking reversibel gating Overgang (dvs., lukket, åpen, oppmerksomme og ufølsomme). Her gir vi protokoller for å få milligram funksjonelle vaskemiddel-solubilized forbigående reseptor potensielle kasjon kanal gruppe V medlem 1 (TRPV1) som kan merkes for EPR og HJORT spektroskopi.

Introduction

Med nylige fremskritt innen enkelt-partikkel cryo-elektronmikroskop (cryo-EM), er pattedyr ion kanal strukturer anskaffet på en ekstraordinær. Spesielt har strukturelle studier av polymodal ionekanaler, for eksempel forbigående reseptor potensielle vanilloid 1 (TRPV1), gitt videre forståelse dens aktivisering mekanismer1,2,3, 4 , 5. men dynamisk informasjon om ionekanaler i en membran miljø er nødvendig for å forstå deres polymodal gating og narkotika-bindende mekanismer.

Elektron spinn resonans (EPR) og doble elektron-elektron resonans (DEER) spectroscopies har gitt noen av de mest endelige mekanistisk modellene for ion kanaler6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse metodene har vært hovedsakelig begrenset til undersøkelse av prokaryote og archeal ion kanaler som gir mye vaskemiddel-renset proteiner når overexpressed i bakterier. Med utviklingen av eukaryote membran proteiner produksjon i insekt og pattedyrceller funksjonelle og strukturelle karakterisering14,15,16er det nå mulig å få biokjemiske mengder vaskemiddel-renset proteiner for spektroskopiske studier.

EPR og HJORT signaler oppstår fra en paramagneticspin etikett (SL) (dvs., methanethiosulfonate) knyttet til en enkelt-cystein rester i protein. Spin-etikettene rapportere tre typer strukturinformasjon: bevegelse, accessibilities og avstander. Denne informasjonen kan avgjøre om rester er gravlagt i protein eller utsettes for membran eller vandig miljø i apo og ligand binding stater13,17,18,19. I forbindelse med en kodebasert struktur (når tilgjengelig), gir EPR og HJORT dataene en samling av betingelser for deriving dynamiske modeller i sitt eget miljø mens overvåking reversibel gating overgang (dvs., lukket, åpen oppmerksomme og ufølsomme). Videre kan fleksibel områder som kan være vanskelig å fastslå Røntgenkrystallografi eller cryo-EM oppnås ved hjelp av disse miljømessige datasett tilordne sekundære strukturer samt plassering i protein20. Cryo-EM strukturer innhentet i lipid nanodiscs gitt verdifull informasjon om gating av ion kanaler3,21,22,23,24, 25; men kan spektroskopiske tilnærminger gi dynamisk informasjon fra conformational stater (f.eks, termisk endringer) som kan være vanskelig å fastslå bruker cryo-EM.

Mange vanskeligheter må overvinnes for å implementere EPR og HJORT, inkludert mangel på protein-funksjonen når du fjerner alle cystein rester (spesielt rikelig i pattedyr kanaler), lav protein avkastning, protein ustabilitet under rensing og etter spinn merking , protein kontonumre i vaskemiddel eller liposomer. Her har vi utviklet protokoller for å overvinne disse kritiske barrierer og har fått HJORT og EPR spectra informasjon for et pattedyr sensoriske reseptorene. Formålet her er å beskrive metoder for uttrykket, rensing, merking og rekonstituering av en funksjonell minimal cystein mindre rotte TRPV1 (eTRPV1) konstruere for spectroscopic analyser. Denne metoden er egnet for de membran proteinene som holder sin funksjon til tross for fjerning av cystein rester eller inneholder cystein danner disulfide obligasjoner. Denne samlingen av protokoller kan tilpasses for spectroscopic analyse av andre pattedyr ionekanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TRPV1 mutagenese

Merk: En minimal TRPV1 konstruksjon for spectroscopic analyse26 ble bygget fra full lengde cystein mindre kanal TRPV127 med metoden for polymerase kjedereaksjon (PCR) (figur 1). Denne cystein mindre minimal TRPV1 konstruksjonen (referert til som eTRPV1 heretter) består av rester 110-603 og 627-764. eTRPV1 ble klonet pMO (en pcDNA3.1-baserte vektor) for funksjonsanalyse og en rekombinant donor vektor28 som inneholder 8 x histidin maltose bindende protein (MBP)-tobakk etse virus (TEV) for uttrykk og rensing (figur 2A). eTRPV1 enkelt-cystein mutanter ble generert ved hjelp nettstedet-rettet mutagenese. Vektor og kanal sekvenser er angitt i den supplerende fil 1: utfyllende metoder.

  1. Utforme mutagenese primere med nettverktøy29.
  2. Bland i en 0,2-mL tube: 5 μL 10 x reaksjon buffer, 1 μL dNTP blanding (100 mM), 1 μL hver 10 μM revers oligonucleotides, 1 μL 100 ng/μL eTRPV1 mal DNA26, 1,5 μL DMSO 1 μL av mutagenese enzym , og 38,5 μL deionisert vann. Spinne blandingen før du plasserer rørene i thermocycler.
  3. Utføre PCR mutagenese.
    1. Utføre (a) rødsprit 95 ° c i 2 minutter, (b) rødsprit 95 ° c for 20 s, (c) annealing ved 60 ° C i 10 s, og (d) forlengelse på 68 ° C i 4 min (30 s per 1 kb). Gjenta trinn b til d for 18 sykluser, deretter utføre forlengelse på 68 ° C for 5 min og vedlikeholde reaksjonen på 4 ° C til fremme bruk.
  4. Tilsett 2 μL av Dpnjeg enzymet for reaksjonen; Bland og deretter ruge på 37 ° C i 30 min.
  5. Utføre transformeringen
    1. Tine E. coli kompetent celler på is.
    2. En pre-avkjølt 14-mL steril tube, legge 75 μL kompetent celler og 10 μL Dpnjeg behandlet PCR blanding. Bland forsiktig.
    3. Inkuber reaksjon på is 30 min. vedlikeholde røret på 42 ° C i 45 s og deretter umiddelbart plassere den på is 2 min. Plate blandingen på Luria kjøttkraft (LB)-agar plate inneholder carbenicillin (0,2 mg/mL). Inkuber platen overnatting på 37 ° C.
    4. Høste minst tre enkelt kolonier fra platen og vaksinere hver i 4 mL LB som inneholder carbenicillin (0,2 mg/mL) bruker en 14-mL steril rør. Inkuber kulturer overnatting på 37 ° C og riste på 250 rpm.
    5. Nedspinning overnatting kulturer 8000 x g i 10 min og ekstra DNA følge instruksjonene av kommersielt tilgjengelig mini forberedelse kits.
    6. Bekrefte tilstedeværelse av enkelt-cystein mutanter av standard automatisert DNA sekvensering (se Tabell for materiale).

2. funksjonell analyse av eTRPV1 og enkelt-cystein mutanter

  1. HEK293 celle linje transfection 30
    1. Kultur HEK293 celler i 6 - bra plater i 2 mL av høy glukose medium (DMEM) per brønn (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet). Forberede HEK293 celler som er 70 \u2012 80% confluent.
    2. Forberede transfection blandingen i to separate 1.5-mL mikro-sentrifuge rør.
      1. For reaksjonen A, Legg til 0,5 µg eTRPV1- eller cystein mutant inneholder pMO 250 µL av minimal viktig medium (f.eks Opti-MEM). For reaksjonen B, legge 3 µL av transfection reagensen til 250 µL av minimal viktig medium. Inkuber hver reaksjon i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
      2. Bland reaksjoner A og B med en 1-mL pipette. Inkuber blandingen for 45 min på RT.
    3. Fjern 500 µL av kultur medier fra 70-80% confluent godt og legge 500 µL reaksjonsblandingen. Lagre plater over natten for Ca2 + imaging (37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet).
  2. Ca2 + imaging i HEK293 celler 30
    1. Rengjør 12 mm diameter glass coverslips med etanol og vann og plassere dem i en 24-vel plate.
    2. Legg til 75 µL av poly-l-lysine i midten av hver dekkglassvæske og lagre platen i 45 min (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet).
    3. Fjern de overskytende poly-l-lysine og vask coverslips tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) å fjerne alle leftover.
    4. Når coverslips er klar, fortsette å koble celler fra 6-vel plate.
    5. Fjern media og legge 500 µL av varm PBS (37 ° C) for vask.
    6. Fjerne PBS, legge til 500 µL av trypsin og ruge for 1 min.
    7. Legge til 500 µL av varm kultur medier (37 ° C) å stoppe fordøyelsen reaksjonen og bland med Pipetter; unngå danner bobler. Eventuelt justere du celle konsentrasjonen fortynne denne rørets med mer kultur medier.
    8. Frø 250 µL transfekterte HEK293 celler (70% confluent) pluss 250 µL av kultur medier (500 µL siste volum per brønn) på den pre-behandlet coverslips og la dem conditions (for vedlegg) i 1-2 h i inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet).
    9. I mellomtiden forbereder en lasting løsning ved å legge 0.02% pluronic syre og 1 µM Fluo-4-er til en Ringer i bufferen. Blandingen løsningen.
    10. Fjern HEK293 kultur medier fra brønnen og legge 500 µL av lasting løsningen. Inkuber celler 1t (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet). Vask Fluo-4-loaded cellene to ganger med varm Ringer i bufferen.
    11. Plass en dekkglassvæske med lastet celler i en 10 mm Petriskål i et mikroskop Stadium (med en 10 X målet; 494 nm eksitasjon og 506 nm utslipp) for å utføre intracellulær Ca2 + målinger.
    12. Måler endringer i fluorescens intensiteten etter perfusing respektive ligander (f.eks, 10 μM capsaicin) bruke kommersielt tilgjengelig programvare (se Tabell for materiale).
  3. mRNA og Xenopus laevis oocytes forberedelser 30
    1. Linearize eTRPV1 og enkelt-cystein mutanter inneholder pMO med Pmejeg 1t på 37 ° C. Rengjør DNA følge instruksjonene av kommersielt tilgjengelig rensing kits.
    2. Bruk linearized og renset DNAs å syntetisere avkortet RNAs med et kommersielt tilgjengelig kit kompatibel med T7 RNA polymerase.
    3. Rengjør avkortet RNAs ifølge kommersielt tilgjengelig rensing kits. Kvantifisere hvor RNA ved å måle absorbansen på 260 nm bølgelengde.
    4. Overføre 5 \u2012 10 mL av X. laevis oocytes (kommersielt tilgjengelig) i et 50-mL konisk rør som inneholder 20 mL ND96 løsning (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7.4) med 1 mg/mL collagenase og nutate for 50 min på RT.
    5. Skyll oocytes i ND96 til løsningen er klare; legge fersk collagenase og riste i 30 min på RT. undersøke oocytes under stereo mikroskop og stoppe fordøyelsen når det ytterste follikulære laget (skinnende lag med røde blod fartøy) er fraværende i de fleste oocytes (90%). Skyll oocytes i ND96 til løsningen er klart.
    6. Overføre oocytes til en 50-mL polystyren rør med ND96 pluss 1 mM CaCl2 og riste for 1 h. Under-fordøyd oocytes vil holde seg til polystyren røret.
    7. Vask oocytes med ND96 pluss 1 mM CaCl2 og supplement løsning med 50 µg/mL av gentamicin og 50 µg/mL av tetracycline.
      Merk: Beskytte tetracycline inneholder løsninger fra lyseksponering.
    8. Velg stor oocytes uten skadet membraner og vise et klart skille mellom animalske og vegetabilske polakker. La oocytes gjenopprette 4 h før microinjection på 16 ° C.
    9. Bruke glass Pipetter (od: 1.11 mm, ID: 0,5 og lengden 8,8 cm) å injisere 1-5 ng av mRNA fra eTRPV1 og enkelt-cystein mutanter i oocytes med en nanoliter-injektor system (46 nL/s) og stereo mikroskop (2 X forstørrelse). Lagre oocytes på 16 ° C i ND96 med CaCl2 og antibiotika (gentamycin/tetracycline 1 x).
    10. Etter 72 h, måle makroskopisk gjeldende bruker en to-elektrode spenning-klemme (TEVC) Kjøp systemet31.
    11. Trekk Borosilikatglass Pipetter (0,3 MΩ) og fylle dem med 3 M KCl.
    12. Plasser oocyte i innspillingen kammeret ved hjelp av en overføring pipette og perfuse bad løsningen (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA og 10 mM HEPES løsning, pH 7.4) ved lav hastighet.
    13. Legg begge elektrodene i Bad løsningen å justere sine pipette forskyvninger. Skyv pipette elektrodene (Borosilikatglass Pipetter; Od: 1,5 mm, ID: 1,10 og lengden 10 cm) i oocyte til en liten innrykk er observert under stereo mikroskop (2 X forstørrelse), og en endring i membran potensial.
    14. Endre forsterker innstillingene til opptak modus og måle makroskopisk strøm mens du bruker en spenning-klemme rampe fra-80 til + 80 mV for 1 s. Last perfusjon systemet med løsningen i trinn 2.3.12 pH 7.4 (som en kontroll) og pH 5 å sjekke eTRPV1 aktivitet.

3. generere rekombinant Bacmid og Baculovirus for Protein uttrykk

  1. Bacmid
    1. Transformere 100 μL DH10Bac E. coli kompetent celler med 7.5 ng av rekombinant donor vektoren som inneholder eTRPV1 og/eller single-cystein mutanter.
    2. Legge til 900 μL SOC media (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL gjær ekstrakt, 2,5 KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4og 20 mM glukose) og Inkuber 6-7 h 37 ° C og 225 rpm.
    3. Frø 100 µL direkte fra blandingen og føljetong fortynninger (1/10 og 1/100), i LB-agar plater som inneholder 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracycline og 50 μg/mL kanamycin. Inkuber platene for minst 48 timer på 37 ° C.
    4. Velg hvit kolonier som 2 mm i diameter, siden blå kolonier mangler innsatsen av interesse. Bruke stereo mikroskop for å bekrefte at hvite koloniene ikke inneholder noen blå flekker.
    5. Høste minst tre enkelt kolonier og overføre dem til en 14-mL steril rør som inneholder 4 mL LB medier med 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracycline og 50 μg/mL kanamycin. Inkuber cellene natten (~ 16 h) på 37 ° C og 250 rpm.
    6. Ta 1,5 mL av natten kulturer og isolere rekombinant bacmid DNA (se utfyllende fil 1 for detaljert protokollen). Lagre bacmid på 4 ° C i opptil to måneder.
      Merk: Forberede glyserol bestandene av DH10Bac E. coli som inneholder bacmid DNA. Ta 300 μL kultur og tilsett 200 μL glyserol 50% (siste glyserol konsentrasjon på 20%). Lagre aliquot ved-80 ° C til fremme bruk.
    7. Bekrefte tilstedeværelse av eTRPV1 i den rekombinant bacmid bruker PCR (se utfyllende fil 1 for detaljert protokollen).
  2. Baculovirus
    Merk: Til dette transfect Sf9 insekt celler i et 6-vel format. Alle beløp og volumer er gitt på en per-vel basis. Unngå bruk av antibiotika.
    1. Plate 1 x 106 Sf9 celler i 2 mL insekt cellen media. Tillate at celler koble minst 45 min.
    2. Fortynne 1 μg av rekombinant bacmid DNA i 100 μL insekt cellen media. Bland forsiktig.
    3. Fortynne 6 μL transfection reagens (TR) i 100 μL insekt cellen media. Bland forsiktig.
    4. Kombinere DNA og TR løsninger (fra trinn 3.2.2 og 3.2.3, henholdsvis). Bland forsiktig og Inkuber i 30 min på RT.
    5. Legge 0,8 mL av insekt cellen media til DNA/St blanding; Bland forsiktig.
    6. Fjerne insekt cellen media fra Sf9 cellene og vaskes en gang med 1 mL av fersk medium.
    7. Fjerne vask mediet og Legg DNA/St blanding (3.2.2 \u2012 3.2.5) til cellene. Inkuber celler ved 27 ° C i 5 h (uten agitering).
    8. Fjerne transfection blandingen og erstatte med 2 mL insekt celle mediet som inneholder 0,5% fosterets bovin serum (FBS). Inkuber celler ved 27 ° C i fem dager.
      Forsiktig: Forhindre fordampning av cellen media ved å fylle tom brønnene med medier og dekker 6-vel plate med to lag med parafin film.
    9. Overføre celle kultur medier til et 15-mL sentrifuge rør. Isolere første passering (P1) av viral lager ved spinning røret 8000 x g i 15 min på 4 ° C. Overføre nedbryting slik rent 15 mL sentrifuge og umiddelbart lagre den på 4 ° C.
      Merk: Beskytte viruset fra lyseksponering ved å dekke røret med aluminiumsfolie.
    10. For andre generasjon (P2) av viral lager, sette en 25-mL suspensjon kultur av insekt cellen media på 1 x 106 Sf9 celler/mL som inneholder 2% FBS i en 125 mL kolbe (ren bunnen og ventilerte). Legg til 25 μL P1 viruset 25 mL kulturen.
    11. Inkuber kulturen ved 27 ° C i 72 h.
    12. For å høste P2 viral aksjen, overføre kulturen til en ny 50 mL tube og sentrifuge det 8000 x g i 15 min på 4 ° C.
    13. Overføre nedbryting til en ny 50 mL tube og umiddelbart lagre den på 4 ° C.
      Merk: Beskytte viruset fra lyseksponering ved å dekke røret med aluminiumsfolie. Utføre en småskala eksperiment for å sjarmere P2 virus/Sf9 forholdet for optimal TRPV1 uttrykk (se utfyllende fil 1 for en detaljert protokoll, del 4 med tittelen "Småskala eksperiment for P2 virus.")
    14. For storskala protein uttrykk, angi en 1-L Sf9 celle suspensjon kultur på 2 x 106 celler/mL i insekt cellen media med 0,5% FBS i en 2.8-L Borosilikatglass kolbe.
    15. Legger 1 mL av P2 virus lager til 1-L kultur og ruge det ved 27 ° C i 72 h.
      Merk: På den tredje dagen, celle tetthet bør være på ca 1.5-2.5 x 106 celler/mL.

4. eTRPV1 og enkelt-cystein Mutant rensing

  1. Membraner isolasjon28
    1. Innhøstingen 1-L insekt celle suspensjon kulturen av snurrende 4500 x g, 4 ° C, i 20 min. veie celle pellet (det er ventet å være rundt 6-9 g).
    2. Resuspend celle pellet i 25 mL iskald bufferen A (36,5 mM sukrose, 2 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), og 50 mM Tris; pH 7.4) i nærvær av proteasehemmere (1 mM phenylmethyl sulfonyl fluor (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinin og 1 μg/mL pepstatin). Disaggregate celle klumper å få en homogen suspensjon og rotere ved 4 ° C i 20 min.
    3. Bryte celler ved hjelp av en manuell (dounce vev jeksel) eller en høytrykks homogenizer. Fjerne celle rusk ved sentrifugering 8000 x g for 20 min på 4 ° C.
      Merk: Holde lysed celler og rør på is under hele prosessen.
    4. Samle nedbryting og sentrifuger 100.000 x g i 30 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend membran pellet i et totalvolum på 20 mL iskald Buffer B (150 mM NaCl, 10% glyserol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES, pH 7.4), supplert med proteasehemmere (som trinn 4.1.2).
    5. Aliquot 20 mL av membran suspensjon i 50-mL rør og flash-fryse i flytende nitrogen. Lagre prøver-80 ° c til fremme bruk.
  2. Protein rensing26,28
    1. Tine membran dele på is og legge 3 mL n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) per tube (200 mM stock). Rotere røret for 2t på 4 ° C.
    2. Sentrifuge prøven på 100.000 x g i 30 min på 4 ° C. Samle nedbryting og tilsett 1 mL av ren våt amylose harpiks. Rotere blandingen for 2 h på 4 ° C. Last protein/amylose blandingen i gravitasjon flow kromatografi kolonner.
      Forsiktig: Tillat ikke skal tørke under vasker.
    3. Vask protein-bundet amylose harpiksen med 10 ganger seng volumene iskald Buffer c (150 mM NaCl, 10% glyserol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0.1 μg/mL asolectin, 0,5 mM TCEP, pH 7.4). Vask med 10 seng mengder iskald Buffer D (150 mM NaCl, 10% glyserol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0.1 μg/mL asolectin, pH 7.4).
      Merk: Før vasking, degas Buffer D uten vaskemiddel eller lipider, tømmer med nitrogen. Etter degasification, Legg DDM og asolectin.
    4. Elute eTRPV1 protein med 0,5 mL fraksjoner, opptil 5 mL, av iskalde degassed Buffer D, supplert med 20 mM maltose. Hvis mulig, utføre vasker og elueringsrør på 4 ° C.
    5. Kvantifisere hvor protein ved å måle absorbansen på 280 nm bølgelengde.
      Merk: Denne protokollen gir 0.5 til 1.0 mg protein per liter kultur. Protein ytelsen kan variere for hver eTRPV1 single-cystein mutant. For EPR og HJORT eksperimenter, vokse 4 \u2012 6 L kultur.

5. eTRPV1 Single-cystein Mutant Site-Directed Spin merking

  1. Konsentrere eTRPV1 inneholder fraksjoner bruker en sentrifugal filter enhet (cutoff = 100 kDa) opptil 2 \u2012 2,5 mg/mL for merking (sykluser av 7000 x g i 2 minutter på 4 ° C).
  2. Legge til en 10 ganger molar overflødig (3 ganger, enhver 30 min) (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methyl methanethiosulfonate (MTSSL) spinn etiketten fra en 100 mM lagerløsning i DMSO konsentrert protein (eTRPV1 monomer: MTSSL i 1:10 molar forholdet) 17. holde reaksjonen i mørket på RT 1 h 30 min, etterfulgt av natten inkubasjon på 4 ° C.
    Merk: I dette trinnet MBP kan fjernes ved å legge TEV protease under overnatting spin-merking incubation.
  3. Last spin-merket eTRPV1 på en størrelse utelukkelse kromatografi kolonne equilibrated i Buffer E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DDM, pH 7.4), kontrollert av en rask protein flytende kromatografi (FPLC) system. Samle brøker som inneholder eTRPV1 tetramer.
    Merk: Inkluder ikke 10% glyserol i dette trinnet som reduserer rekonstituering effektiviteten.
  4. Kvantifisere hvor protein ved å måle absorbansen på 280 nm bølgelengde.
  5. Evaluere renheten av prøven ved å kjøre en SDS side gel (flekken-gratis gel, 4 \u2012 20%). Prøven er nå klar for spektroskopiske målinger i løsningen og/eller proteoliposomes.

6. eTRPV1 Spin-merket enkelt cystein Mutant rekonstituering

  1. Tørr 10 mg asolectin bruker en roterende fordamperen vakuum (≤100 mbar) 1t på 40 ° C. Asolectin liposomer, Legg 1 mL av Buffer F (200 mM NaCl, 5 mM MOPPER, pH 7.4) og sonicate blandingen i 15 minutter eller til prøven er homogen.
  2. Destabilisere liposomer ved å legge til DDM en siste konsentrasjon av 2 mM og Inkuber i 30 min på RT.
  3. Konsentrere merket protein på 2 mg/mL og legge den til i liposomer ved hjelp av en 1:5 protein/Lipid ratio (masse: masse).
    Forsiktig: Det er viktig å holde de nevnte protein konsentrasjonene, siden spin-merking effektivitet reduseres ved lave konsentrasjoner og høy protein kan fremskynde.
  4. Legge til Buffer F for å justere protein/Liposome blandingen til DDM kritiske micelle konsentrasjonen (CMC) og ruge over natten ved 4 ° C med mild agitasjon.
  5. Doble volumet av protein/Liposome blandingen med Buffer F og fjern vaskemiddel ved sekvensielt å legge tre dele upolart polystyren adsorbent perler (30 mg, 50 mg og 80 mg) på 1-h intervaller med mild agitasjon på RT.
  6. Legg blandingen på et kolonnefilter (gravitasjon flow kromatografi kolonne) å fjerne perler og overføre proteoliposomes blandingen til en ultracentrifuge tube. Sentrifuge prøvene 100.000 x g 1t på 4 ° C. Forkaste nedbryting og resuspend pellet i 30 μL Buffer F.
    Merk: Utvalg er klar for spectroscopic analyse og injeksjon i Xenopus oocytes. Hvis eksemplene ikke kan brukes på samme dag, flash-fryse dem i flytende nitrogen og store på-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus oocyte elektrofysiologi26,32
    1. Injisere 50 nL av ulike fortynninger av spin-merket proteoliposomes i Xenopus oocytes som beskrevet i delen 2.2.
    2. Utføre TEVC mål etter 12 timer med injeksjon som beskrevet i delen 2.3.10.
  8. Fortsette å utføre spektroskopiske mål og analyse (del 7).

7. HJORT og EPR Spectroscopies

  1. Dobbel Electron-elektron resonans (DEER) spektroskopi.
    1. Utføre HJORT målinger i en pulserende EPR spectrometer opererer på Q-bandet frekvens (34 GHz) og utstyrt med en 10-W forsterker med døde-tid gratis fire-puls rekkefølgen på 83° med leverandørleverte programvare33.
    2. Supplere 50 µM vaskemiddel-renset eTRPV1 spin-merket cystein mutanter i Buffer E (trinn 5.5) med 30% (v/v) glyserol for cryo-beskyttelse.
    3. Laste inn prøven i en forseglet kvarts kapillær rør og spin til bunnen av røret med kort lav hastighet sentrifugering (100 x g).
    4. Plass kapillarrør i flytende nitrogen å fryse prøven. Eksemplene kan lagres på dette punktet på-80 ° C for senere måling.
    5. Plasser prøven direkte i mikrobølgeovn resonator og la det nytt equilibrate på-83° for 10 \u2012 20 min.
    6. Måle prøven ved hjelp av en fire-puls HJORT standardprotokoll, (π/2) mw1-τ1-(π) mw1-τ1-(π) mw2-τ2-(π) mw1-τ2-ekko34. Puls lengder (π/2) mw1 og (π) mw1 er 10 og 20 ns, henholdsvis og 40 ns for (π) mw2. Angi frekvensen utskillelse 63 MHz.
      Merk: Primære HJORT forfall data kan analyseres med en hjemme-bygget programvare (f.eks i Matlab) som forutsetter en sum av Gaussian distribusjoner å beskrive avstandene mellom spinn etiketter19,35.
  2. Continuous-Wave (CW) EPR spektroskopi
    1. Utføre CW EPR eksperimenter på RT på en X-band (9,6 GHz) spectrometer programmvre produsenten.
    2. Start maskinen ved å slå på vann chiller, konsollen og strømforsyningen magnet. Koble programvare til apparatet, plasser apparatet i harmoni og vent minst 30 min instrumentet å varme opp.
    3. Laste 20 µL av utvalget fra trinn 5.5 i 25-µL kapillær røret kapillær handlingen og forsegle slutten av røret med fugemasse.
    4. Legg kapillarrør i mikrobølgeovn hulrom og kritisk par resonator manuelt eller automatisk ved hjelp av funksjonen auto-tune av programvaren.
    5. Samle de første avledede spectra under standard instrument forhold: 100 kHz mikrobølgeovn modulasjon, 1.6 G magnetfelt modulering og 10 mW mikrobølgeovn kraft.
    6. For analyse og presentasjon, rett til spectra på bakgrunn og normalisere dem ved til spectra med topp-til-topp verdien av Dobbeltintegral.
    7. Bestemme spin-label mobilitet ved å måle inverse av sentrale linjebredden for den første avledede absorpsjon spectra (ΔHo-1)-36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Funksjonell karakteristikk av Minimal cystein mindre TRPV1 konstruere (eTRPV1) og Single-cystein mutanter

Første skritt mot spektroskopiske studier er å ingeniør og karakterisere cystein mindre protein konstruksjoner (figur 2A) som er funksjonelle og gi biokjemiske mengder proteiner. eTRPV1 fungerer som bestemmes av Ca2 + bildebehandling og TEVC (figur 2B-C). Videre eTRPV1 gir tilstrekkelig mengder vaskemiddel-renset protein for EPR og HJORT eksperimenter (0,5 - 1 mg per liter Sf9 celler)26. Innføre enkelt cysteinene i spesielle proteinet områder kan påvirke deres funksjon. Figur 2B viser eksempler på single-cystein mutanter (E651C og A702C) på eTRPV1 som oppfører seg som vill type (WT), siden fluorescens intensitet øker når TRPV1 Agonistiske (f.eks, capsaicin) er lagt til eTRPV1 som inneholder HEK293 celler, som vist av Ca2 + imaging26. På den annen side, er A680C typisk eksempel på en ikke-fungerende cystein mutant, som fluorescensen er å skille fra bakgrunnen. A680C mutant ble utelukket for videre analyse. Etter Ca2 + imaging eksperimenter, er enkelt-cystein mutanter funksjonen testet med TEVC eller patch klemme evaluere Biofysiske egenskaper. Figur 2C viser at mutantene recapitulate den ytre retting karakteristisk for TRPV1 da utfordret med pH 5, som bestemmes av TEVC26. Funksjonell analyse av enkelt-cystein mutanter er første sjekkpunkt før foretaket uttrykk og rensing.

Biokjemiske karakterisering av eTRPV1 og enkelt-cystein mutanter

Rensing protokollen beskrevet ovenfor gir vaskemiddel-solubilized protein som kan merkes via cystein kovalente endring (f.eks, fluorophores, spin-merket [SL] metyl-methanethiolsulfonate) langs den TRPV1 sekvensen for spectroscopic analyse. Minimal TRPV1 kanal inneholder cystein rester overføre som stabil og monodisperse Art (~ 13.6 mL), som bestemmes av størrelsen-utestenging kromatografi (Figur 3). eTRPV1 og enkelt-cystein spin-merket mutanter (E651C-SL og A702C-SL) recapitulate elueringsrør profil og stabilitet av minimal TRPV1 konstruksjon (Figur 3)26. Elueringsrør profilen kan variere mellom forskjellige mutanter, som enkelt cysteinene kan påvirke protein stabilitet. I noen tilfeller danne mutanter aggregater; og en brøkdel av prøven kunne elute på ugyldige volumet av kolonnen (8-9.5 mL), redusere mengden av protein som overfører som en tetramer (Figur 3nederste røde pilen). I dette tilfellet kan celle kultur volumer skaleres for å kompensere for protein tapt i aggregert brøkdel, eller en kan utelate dette mutant fra videre analyse og fortsette å teste nærliggende rester. Andre eksempler er en utvidelse av fjellet som tilsvarer tetramer. Største toppene bredere enn 3 mL er ikke anbefalt for spectroscopic analyse, som de inneholder multi-spre arter. Biokjemiske karakterisering av spin-merket single-cystein mutanter er det andre sjekkpunktet før foretaket rekonstituering og spectroscopic analyse.

Funksjonell karakteristikk av rekonstituert Spin-merket eTRPV1 Single-cystein mutanter

Fordi EPR og HJORT signalene stole på feste en spinn spin-etikett til en cystein rest, er det viktig å kontrollere om plasseringen av spin-etiketten endrer protein-funksjonen. Det er flere måter å teste funksjonen etter gjenoppbygge spin-merket protein, inkludert Plane lipid bilayer eksperimenter, patch klemme og TEVC. TEVC tillater evaluering av et stort antall spinn-merket kanaler mens makroskopisk strømninger. For å vurdere funksjonaliteten til spin-merket single-cystein mutanter, er kanaler rekonstituert i pre-formet asolectin liposomer. I dette trinnet er det viktig å ekskludere 10% glycerol som finnes i hele rensing, siden glyserol reduserer effektiviteten av protein rekonstituering i liposomer. Figur 4 viser en representant resultatet av A702C-SL TRPV1 rekonstituert i asolectin liposomer og microinjected i Xenopus oocytes. Som forventet, utløser pH 5 robust utad rette opp strøm37 som blokkeres av co-anvendelse av TRPV1 antagonist capsazepine (CPZ, blå spor)26. Mutanter som ikke beholder funksjonalitet etter spinn merking og rekonstituering bør bli ekskludert fra videre analyse. Funksjonell karakteristikk av rekonstituert spin-merket single-cystein mutanter er det tredje sjekkpunktet før foretaket spectroscopic analyse.

Strukturelle Dynamics av Spin-merket eTRPV1 mutanter overvåket av CW-EPR og HJORT

Nitroxide snurr etiketter er følsomme for omgivelsene og fleksibiliteten av protein ryggraden som etiketten er knyttet17. Derfor tillater CW-EPR fastsetting av den dynamiske diett av en gitt spin-merket cystein; nemlig, utsatt for vandige media eller membranen er mer dynamisk enn de begrenset til protein-protein interaksjoner17. Figur 5A viser posisjoner Glu651, Ile679 og Ala702 i TRPV1 valgt å overvåke mobilitet parametere. For å beregne parameteren mobilitet av spin etiketten sonden, beregner en inverse av sentrale linjebredden for de første avledede absorpsjon spectra (figur 5B, svart linje ΔHo−1). For eksempel viser E651C-SL (figur 5B) en spectral form og mobilitet Linjeverdi (0.24) vanligvis grunnlegge opp på dynamisk posisjoner på membran grensesnitt26. På den annen side, I679C-SL og A702C-SL utstillingen utvidelse av spectra (se stiplede linjer) og en nedgang i mobilitet verdiene (0,16 og 0,18, henholdsvis; Figur 5B) 26 som stemmer overens med sin begrensede omgivelsene (protein-protein), i henhold til cryo-EM struktur1.

Figur 5C viser spektra av spin-merket TRPV1 mutanter etter rekonstituering i asolectin liposomer. Som forventet, endre de dynamiske funksjonene til spectra for E651C-SL og A702C-SL ikke etter rekonstituering, som form og mobilitet verdiene er de samme i løsningen som en membran miljø26. På den annen side, illustrerer I679C-SL en støyende spekteret; Derfor blir lavere (blå pil) og høyere (rød pil) feltet komponenter mindre opplagt. Støyende spectra er ikke vanligvis ønsket, som de pleier å undervurdere mobilitet av spin-merket plasseringen. Denne spekter type kan være produktet av ineffektiv protein rekonstituering i stedet for under-merking, siden I679C-SL signalet i løsningen er robust.

HJORT er en sum av oscillerende, sinusformet signal henfall som inneholder informasjon om avstanden fordelingen av samspill spin-etiketter38,39. Perioden og kompleksiteten i forfall reflekterer direkte den underliggende avstand fordelingen. Avstand distribusjon består av antallet strukturelle komponenter i utvalget og deres lidelse. Derfor gang-domene signalet kommer fra den dipolar kopling mellom ikke-fast, Fjern spinn etiketter i løsning som vanligvis forårsaker en eksponentiell bakgrunn forfall, andrigidly kombinert spinner innenfor samme protein19,40. Spesielt tillater HJORT fastsetting av intra-protein langtrekkende avstander (20-70 Å) mellom spin-merket rester19. Figur 6 viser signal forfallet og tilsvarende avstand distribusjon av E651C-SL. Distribusjon av Glu651 viser tre topper tilsvarer 24 og 36 58 Å26. De to kortere avstandene er konsekvent med lukkede TRPV1 struktur (23 og 32 Å for Cβ-Cβ avstander, henholdsvis)1, mens den tredje 58 Å toppen kan tilsvarer protein aggregering.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentell disposisjon. Diagram av eksperimentelle disposisjonen må uttrykke, rense og gjeninnføre eTRPV1 for EPR og HJORT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Funksjonell karakteristikk av eTRPV1 og enkelt-cystein mutanter. (A) skjematisk fremstilling av TRPV1 konstruksjoner brukes i spectroscopic analyser (eTRPV1: cystein mindre TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 celler uttrykke WT TRPV1, eTRPV1 og mutanter (lastet med Ca2 +-sensitive Fluo-4-AM) ble analysert for capsaicin (10 µM)-utløste svar med fluorescens Ca2 + imaging. Farge angir relativ endringer i fluorescens intensitet, blått og rødt angir de laveste og høyeste cytoplasmatiske Ca2 +, henholdsvis. Hvite linjalen representerer 100 µm. (C) venstre, én delenhet (S5, pore helix, S6 og TRP) i TRPV1 tetramer struktur utheving single-cystein rester (gul kuler) introdusert langs kanalen sekvensen. Høyre, strøm-spenning relasjoner bestemmes av TEVC opptak fra Xenopus oocytes uttrykke WT TRPV1, eTRPV1 og enkelt-cystein mutanter utfordret med pH 5. Bakgrunn strøm (bkgrd). Endret fra den opprinnelige figur26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Biokjemiske karakterisering av eTRPV1 og enkelt-cystein mutanter.
Størrelse-utestenging kromatografi profil DDM-solubilized eTRPV1 og enkelt-cystein spin-merket mutanter etter uttrykk og rensing fra Sf9 celler. Innfelt: SDS side gel viser monomerisk eTRPV1-MBP fusion protein (endret fra den opprinnelige figur26). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Funksjonell karakterisering av en mutant spin-merket eTRPV1.
Nåværende-spenning relasjoner bestemmes av TEVC fra Xenopus oocytes microinjected med proteoliposomes inneholder spin-merket A702C utfordret med pH 5 (rød) og blokkert av capsazepine (CPZ, blå: 40 µM). Bakgrunn strøm (bkgrd). Endret fra den opprinnelige figur26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Mobilities av spin-merket eTRPV1 mutanter bestemmes av CW-EPR.
(A) to underenheter (S5, pore helix, S6 og TRP) av TRPV1 tetramer struktur utheving aminosyre rester (gul kuler) undersøkt gjennom nettstedet-rettet spin-merking spectroscopies. (B) første deriverte av CW EPR spektra av spin-merket cystein mutanter i DDM-løsning. (C) første deriverte av CW EPR spektra av spin-merket cystein mutanter rekonstituert i asolectin liposomer. Spectra ble oppnådd ved pH 7.4 (lukket tilstand). ΔHo−1 angir omfanget av parameteren mobilitet. Den svarte stiplede linjen understreker utvidelse av til spectra. Blå og røde pilene betegne lav og høy komponentene i spektra, henholdsvis. EPR spectra var normalisert til antall spinn etiketter. Endret fra den opprinnelige figur26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Avstand distribusjon av en eTRPV1 mutert i vaskemiddel.
HJORT ekko (A) og avstand distribusjon (B) av spin-merket mutant E651C; en sum av bruk ble montert på HJORT dataene. P(r) angir avstanden distribusjon av spin par41. Spectra ble oppnådd ved pH 7.4 (lukket tilstand). Endret fra den opprinnelige figur26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dagens teknologi for uttrykk og rensing av pattedyr membran proteiner har gjort det mulig å skaffe tilstrekkelige mengder protein for spektroskopiske studier14,15,16,42. Her har vi tilpasset disse teknologiene for å uttrykke, rense, Rekonstituer og utføre spectroscopic analyser i TRPV1.

Blant de viktige trinnene i protokollen, nedenfor er de som vi har utført feilsøking for TRPV1 og som kan justeres for andre proteiner. Endre DNA sekvensen for å generere en mal som gir 0,5 - 1 mg/mL rengjøringsmiddel-renset protein; maler som gir mindre enn 0,5 mg/mL protein er utfordrende, siden mer enn 6 liter insekt celler kulturer være nødvendig per mutant. Protein må være konsentrert, ikke mindre enn 2 mg/mL, uten TCEP å øke spin-merking effektivitet. Merking på lav protein konsentrasjoner og/eller i nærvær av TCEP genererer spor støyende EPR spectra. Selv proteiner holdes i 4 ° C i rensing, er det nødvendig å utføre spinn merking RT å forbedre effektiviteten. Under rensing og merking, forbedrer glyserol protein stabilitet; men må det helt fjernes før rekonstituering, som reduserer mengden protein i liposomer og genererer støyende EPR spectra. Redusere vaskemiddel konsentrasjonen under CMC er en vanlig praksis under rekonstituering; Men, TRPV1 tendens til å føre før innlemmer i liposomer. For å løse dette problemet, ble TRPV1 inkubert natten med pre-formet liposomer nøyaktig CMC å unngå protein nedbør og øke antall kanaler i proteoliposome utarbeidelse. TRPV1 er fullt funksjonell i asolectin liposomer28; Derfor var det foretrukne lipid blandingen i denne protokollen. Imidlertid er det viktig å fastslå lipid sammensetningen der et bestemt protein er funksjonell (f.ekskolesterol) før du fortsetter med spectroscopic analyser.

Spektroskopiske tilnærminger som EPR og HJORT presentere flere begrensninger, inkludert: endringer i protein mal sekvens som forbedrer biokjemiske stabilitet kan ha betydning i funksjonen26; innføring av ikke-innfødte enkelt cysteinene, samt spinn etiketten, kan ikke være godt tolerert i enkelte områder av proteinet; å skaffe store mengder merket proteiner; og begrenset conformational endringer når avstander med DEER i vaskemiddel micelles. Men kan sistnevnte begrensningen overvinnes ved å samle spectra, på Q-bandet frekvens, TRPV1 mutanter rekonstituert i nanodiscs19,43. Likevel, fordelen av disse tilnærmingene hovedsakelig kommer fra mønster av global dynamics, accessibilities og avstander flere fra den absolutte verdien av en gitt posisjon.

Temperatur sensitivitet er en av de mest fascinerende og mindre forstått gating mekanismer; Derfor ville bruker spektroskopiske tilnærminger, det være mulig å fastslå hvordan membran proteiner oversette termisk energi i protein bevegelse i et miljø med membran. Viktigere, ville det være utfordrende å finne strukturelle endringer under termisk gating Røntgenkrystallografi eller cryo-EM, som disse teknikkene foretas minusgrader. Senere eksperimenter vil være rettet mot avgjøre TRPV1 conformational endrer kompatibel med termisk-avhengige gating bruker EPR, HJORT eller fluorescens. EPR spektroskopi har gitt detaljerte mekanistisk modeller for prokaryote ionekanaler, så vi forventer at du bruker protokollene som beskrevet ovenfor, vil vi få innsikt i mekanismer for aktivisering og narkotika-binding av pattedyr ion kanalene benytter spektroskopiske tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er svært takknemlig til Dr. H. Mchaourab for å gi tilgang til EPR og HJORT spektrometre og Dr. T. Rosenbaum for å gi den full lengde cystein mindre TRPV1 plasmider.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

Biokjemi problemet 137 forbigående reseptor potensielle vanilloid 1 TRPV1 rensing rekonstituering spin-merking EPR spektroskopi HJORT spektroskopi
Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter