Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Bu makalede biyokimyasal miktarda deterjan çözündürüldükten TRPV1 spektroskopik analiz için elde için belirli yöntemleri açıklar. Kombine protokoller memeli iyon kanalları membran kontrollü bir ortamda yapısal ve fonksiyonel çalışmaları kolaylaştırmak için uyarlanmış Biyokimya ve biyofizik araçları sağlar.

Abstract

Polymodal iyon kanalları farklı doğada birden çok uyaranlara allosteric değişiklikler transduce; Bu dinamik biçimler belirlemek ve büyük ölçüde bilinmeyen kalmak için zorlu. Agonist bağlayıcı siteleri yapısal özellikleri ve birkaç iyon kanalları etkinleştirme mekanizması tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) dökülme ışık son gelişmeler ile sahne onların perdeleme derinlemesine bir dinamik analiz için hazır Spektroskopik yaklaşımları kullanarak mekanizmaları. Spektroskopik teknikleri elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) gibi esas olarak büyük miktarlarda saf prokaryotik iyon kanalları incelenmesi için sınırlı olmuştur. Fonksiyonel ve istikrarlı membran proteinlerinin büyük miktarda gereksinimini memeli iyon kanalları bu yaklaşımları kullanarak çalışma engel. EPR ve geyik birçok avantaj, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından elde etmek zor olabilir, düşük çözünürlükte olsa, yapısının belirlenmesi ve mobil protein bölgelerin dinamik değişiklikler dahil olmak üzere ve geri dönüşümlü geçişi izleme sunar geçiş (sensitize ve desensitizedyani, kapalı, açık,). Burada, biz iletişim kuralları için EPR ve GEYİĞE Spektroskopi etiketli deterjan çözündürüldükten fonksiyonel geçici reseptör potansiyel ba * kanal Alt familya V üye 1 (TRPV1) miligram almak için sağlar.

Introduction

Tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) son gelişmeler ile olağanüstü bir hızla memeli iyon kanal yapıları elde edilmiştir. Özellikle, polymodal iyon kanalları, geçici reseptör potansiyel vanilloid 1 (TRPV1), gibi yapısal çalışmaların daha fazla anlayış onun harekete geçirmek mekanizmaları1,2,3, sağladı 4 , 5. ancak, dinamik bir membran ortamında gömülü iyon kanalları vukuf onların polymodal perdeleme ve uyuşturucu bağlama düzenekleri anlamak için gereklidir.

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) ve çift elektron-elektron rezonans (geyik) spectroscopies iyon kanalları6,7,8,9 için en kesin mekanik modellerin bazıları hazırladık , 10 , 11 , 12 , 13. bu yaklaşımlar prokaryotik incelenmesi için esas olarak sınırlı olmuştur ve archeal iyon kanalları çok miktarda bakteri overexpressed zaman deterjan saf protein verim. Ökaryotik membran protein üretiminde böcek ve fonksiyonel ve yapısal karakterizasyon14,15,16memeli hücreleri gelişmesiyle birlikte, şimdi biyokimyasal elde etmek mümkündür miktarda deterjan saf protein spektroskopik çalışmalar için.

EPR ve geyik sinyalleri bir tek-sistein kalıntı proteini içerisinde bağlı bir paramagneticspin etiket (SL) (Örneğin, methanethiosulfonate) ortaya. Spin-Etiketler üç yapısal bilgi türlerinden rapor: hareket, eriþebilirlik ve mesafeler. Bu bilgiler tortular protein içinde gömülü veya membran veya apo ve ligand bağlı Birleşik13,17,18,19sulu ortamda maruz belirleme sağlar. Yüksek çözünürlüklü bir yapı (varsa) bağlamında, EPR ve geyik veri dinamik modeller kendi doğal ortamlarında tersinir gating geçiş (yani, kapalı, açık, süre izleme türetmek için kısıtlamalar topluluğu sağlar. duyarlı ve desensitized). Ayrıca, x-ışını kristalografisi veya cryo-EM tarafından belirlemek zor olabilir esnek bölgeleri ikincil yapılar yanı sıra protein20içinde yer atamak için bu çevresel veri kümeleri kullanarak elde edilebilir. Cryo-EM yapıları lipid nanodiscs elde edilen sağlanan iyon geçişi hakkında değerli bilgi kanalları3,21,22,23,24, 25; Ancak, spektroskopik yaklaşımlar cryo-EM kullanarak belirlemek zor olabilir konformasyon Birleşik (Örneğin, termal değişiklikler) üzerinden dinamik bilgi sağlayabilir.

EPR ve geyik tüm sistein kalıntıları (özellikle bol miktarda memeli kanalları), düşük protein verim, protein istikrarsızlık arıtma sırasında ve sonrasında spin etiketleme kaldırırken protein fonksiyon eksikliği de dahil olmak üzere, uygulamak için birçok zorlukların üstesinden gelmek ve deterjan veya lipozomlar protein toplama. Burada, bu kritik engellerin üstesinden gelmek ve bir memeli duyusal reseptör için geyik ve EPR spectra bilgilerini aldıysanız protokolleri tasarladık. Burada amaç ifade, arıtma, etiketleme ve sulandırma fonksiyonel en az sistein-az sıçan TRPV1 (eTRPV1) spektroskopik analizleri için oluşturmak için yöntemleri tarif etmektir. Bu metodoloji işlevlerine sistein kalıntıları kaldırılması rağmen tutmak veya disülfür bağları oluşturan sistein içeren bu membran proteinlerinin için uygundur. Bu koleksiyon iletişim kurallarının diğer memeli iyon kanalları spektroskopik analiz için adapte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TRPV1 Mutagenesis

Not: En az bir TRPV1 yapı spektroskopik Analizi26 tam uzunlukta sistein-az kanal TRPV127 polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi (resim 1) kullanılarak inşa edilmiştir. (ETRPV1 bundan sonra adlandırılır) bu sistein-az en az TRPV1 yapı kalıntıları 110-603 ve 627-764 oluşur. eTRPV1 klonlanmış pMO (pcDNA3.1 tabanlı vektör) fonksiyonel analiz için ve 8 x histidin maltoz bağlayıcı protein (MBP) içeren bir rekombinant donör vektör28 -tütün etch virüs (TEV) ifade ve arıtma (Şekil 2A). eTRPV1 tek-sistein mutantlar site yönettiği mutagenesis kullanarak oluşturulan. Vektör ve kanal dizileri içinde belirtilen ek dosya 1: ek yöntemler.

  1. Tasarım mutagenesis astar ile çevrimiçi araçlar29.
  2. Bir 0,2 mL tüp içinde karıştırın: 10 x reaksiyon arabellek, 1 μL dNTP Mix (100 mM), 1 μL her 10 mikron ileriye ve geriye doğru oligonucleotides, 100 ng/μL eTRPV1 şablonunun DNA261 μL, DMSO, mutagenesis enzim 1 μL 1,5 μL 5 μL ve deiyonize su 38,5 μL. Karışım tüpler içinde thermocycler yerleştirmeden önce spin.
  3. PCR mutagenesis gerçekleştirin.
    1. Gerçekleştirmek 2 min için 95 ° C'de denatürasyon (a), (b) denatürasyon 20 95 ° C'de s, (c) ve (d) uzaması için 4 dk. 68 ° C'de 10 s için 60 ° C'de tavlama (30 s 1 kb başına). 18 devredir d b adımları yineleyin sonra uzama 68 ° C'de 5 min için gerçekleştirmek ve 4 ° C'de tepki daha fazla kullanılmasını kadar korumak.
  4. Dpn2 μL ekleyin ben enzim reaksiyon; Mix ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  5. Dönüşümü gerçekleştirmek
    1. E. coli yetkili hücreler buz çözme.
    2. Önceden soğutulmuş 14-mL steril tüp için yetkili hücre 75 μL ve 10 μL Dpn-tedavi PCR karışımı ekleyin. Hafifçe karıştırın.
    3. Reaksiyon 30 dk. koru 45 için 42 ° C'de tüp buz üzerinde kuluçkaya s ve sonra hemen buz 2 dk. plaka üzerinde Luria suyu (LB) karışımı yerleştirin-carbenicillin (0.2 mg/mL) içeren agar plaka. Gecede 37 ° C'de plaka kuluçkaya
    4. Plaka üzerinden en az üç tek kolonileri hasat ve her bir 14-mL steril tüp kullanarak carbenicillin (0.2 mg/mL) içeren LB 4 ml aşılamak. Kültürler gecede 37 ° C'de kuluçkaya ve 250 devir / dakikada sallamak.
    5. Spin aşağı 8.000 x g 10 dk de gecede kültür ve piyasada bulunan mini hazırlık setleri talimatları DNA ayıklayın.
    6. Standart otomatik DNA sıralama tarafından tek-sistein mutantların varlığını denetlemek ( Tablo malzemelerigörmek).

2. eTRPV1 ve tek-sistein mutantlar fonksiyonel analiz

  1. HEK293 hücre satırı transfection 30
    1. İyi yüksek glikoz Orta (DMEM) 2 mL 6 - iyi levha hücrelerde HEK293 Kültür (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem). 70 \u2012% 80 birleşmesi HEK293 hücreleri hazırlayın.
    2. İki ayrı 1.5 mL mikro-santrifüj tüpleri transfection karışımı hazırlayın.
      1. A tepki için en az gerekli Orta (Örneğin Opti-MEM) 250 µL için 0,5 µg eTRPV1 veya sistein mutant içeren pMO ekleyin. B tepki için en az gerekli orta 250 µL için transfection reaktif 3 µL ekleyin. Her reaksiyon (RT) Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
      2. Reaksiyonları A ve B 1 mL pipet ile karıştırın. Karışım RT. adlı 45 dk için kuluçkaya
    3. Kültür ortamının 500 µL % 70-80 birleşmesi de kaldırın ve 500 µL tepki karışımı ekleyin. Plakalar için düşsel (37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem) gecede Ca2 + saklayın.
  2. CA2 + HEK293 hücrelerde görüntüleme 30
    1. 12 mm çapında cam coverslips etanol ve su ile temiz ve 24-şey plaka koyun.
    2. Poli-l-lizin, 75 µL her coverslip ortasına eklemek ve 45 dk (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) plaka saklayın.
    3. Üç kez ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) herhangi bir artık kaldırmak için aşırı poli-l-lizin ve yıkama coverslips kaldırın.
    4. Coverslips hazır olduğunda, 6-şey plaka hücrelerden ayırmak için devam edin.
    5. Medyayı çıkarın ve sıcak PBS (37 ° C) 500 µL yıkama için ekleyin.
    6. PBS kaldırmak, tripsin 500 µL ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya.
    7. Sıcak kültür sindirim reaksiyonu durdurmak ve pipet ile karıştırmak için medya (37 ° C) 500 µL ekleyin; kabarcıklar oluşturan kaçının. Gerekirse, bu resuspension daha fazla kültür medya ile sulandrarak hücre konsantrasyonu belirleyin.
    8. Önceden tedavi coverslips üzerinde (500 µL son hacim başına iyi) kültür ortamının 250 µL artı transfected HEK293 hücre (% 70 birleşmesi) 250 µL tohum ve onları (ek) sakin kuluçka (37 ° C, %5 CO2, % 95 nem) 1-2 h için izin.
    9. Bu arada, %0.02 pluronic asit ve 1 µM ekleyerek bir yükleme çözüm hazırlamak Fluo-4-AM için bir zil sesi'nın arabellek. Çözüm iyice karıştırın.
    10. HEK293 Kültür medya kuyudan kaldırın ve yükleme çözeltinin 500 µL ekleyin. Hücreler 1 h (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) için kuluçkaya. Fluo 4 yüklü hücreleri iki kez sıcak zil'ın arabellek ile yıkayın.
    11. Bir coverslip yüklü hücrelerle intrasellüler Ca2 + ölçümleri gerçekleştirmek için (10 X amaç; 494 nm uyarma ve 506 nm Emisyon kullanarak) bir mikroskop sahne 10 mm Petri kabına yerleştirin.
    12. Ölçü değişiklikleri floresan yoğunluğu ilgili ligandlar (Örneğin, 10 mikron kapsaisin) ventriküler sonra piyasada bulunan yazılım kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. mRNA ve Xenopus laevis yumurta hazırlık 30
    1. ETRPV1 ve tek-sistein mutantlar içeren pMO Pmeile linearize ben 37 ° C'de 1 h için Ticari olarak mevcut arıtma kitleri talimatları DNA temiz.
    2. Kullanım Doğrusallaştırılmış ve DNA'lar ile piyasada bulunan teçhizat T7 RNA polimeraz ile uyumlu çok Millî olan RNA'ların sentezlemek için temizledim.
    3. Ticari olarak mevcut arıtma kitleri göre çok Millî olan RNA'ların temiz. RNA miktarı 260 nm dalga boyunda absorbans ölçerek ölçmek.
    4. Transfer 5 \u2012 X. laevis (ticari olarak mevcut) yumurta içine 20 mL ND96 çözeltisi içeren bir 50 mL konik tüp 10 mL (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2; pH 7,4) 1 mg/mL collagenase ve nutate için 50 dk RT. az
    5. Çözüm temizlenene kadar yumurta ND96 içinde durulayın; taze collagenase ekleyin ve RT. inceleyin, 30 dk için stereo mikroskop altında yumurta sıkmak ve dış foliküler katman (kırmızı kan damarları ile parlak tabaka) eksik olduğunda sindirim durmak çoğu yumurta (% 90) içinde. Çözüm temizlenene kadar yumurta ND96 içinde yıkayın.
    6. Transfer yumurta 50 mL polistren Tube ND96 artı 1 mM CaCl2 ve 1 h. yumurta altında sindirmek için shake ile polistren tüp sopa olacaktır.
    7. Yumurta ND96 artı 1 mM 50 µg/mL gentamisin ve tetrasiklin 50 µg/mL ile CaCl2 ve ek bir çözüm ile yıkayın.
      Not: tetrasiklin içeren çözümler ışık pozlama korumak.
    8. Hasarlı membranlar ve hayvan ve sebze Polonyalılar arasında net bir ayrım görüntüleme olmadan büyük yumurta seçin. Yeniden elde etmek için 4 h 16 ° C'de mikroenjeksiyon önce yumurta izin
    9. Cam pipetler kullanın (OD: 1,11 mm, kimlik: 0.5 ve uzunluğu 8.8 cm) mRNA eTRPV1 ve tek-sistein mutantlar üzerinden 1-5 ng nanoliter-enjektör sistemi (46 nL/s) ve stereo mikroskop (2 X büyütme) kullanarak yumurta enjekte etmek. CaCl2 ve antibiyotik ile ND96 içinde yumurta 16 ° C'de depolamak (viomisin/tetrasiklin 1 x).
    10. 72 saat sonra makroskopik geçerli bir iki elektrot gerilimi-kelepçe (TEVC) satın alma sistemi31kullanarak ölçmek.
    11. Borosilikat Cam pipetler (0.3 MΩ) çekmek ve onları 3 M KCl ile doldurun.
    12. Transfer pipet kullanarak kayıt odası oosit yerleştirin ve düşük hızda banyo çözüm (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA ve 10 mM HEPES çözüm; pH 7,4) sıvı.
    13. Her iki elektrot onların pipet uzaklıklar ayarlamak için banyo çözümde bırakın. Yavaşça itin pipet elektrotlar (borosilikat cam pipetler; Doz: 1.5 mm, kimlik: 1,10 ve uzunluğu 10 cm) içine yumurta kadar küçük bir girinti stereo mikroskop altında (2 X büyütme), yanı sıra potansiyel zarda değişiklik görülmektedir.
    14. Bir gerilim tipi kelepçe rampa-80 + 80 için uygulanırken modu ve ölçü makroskopik akımları kaydı amplifikatör ayarları değiştirmek mV 1 s. yük kullanılan çözüm ile perfüzyon sistemi için adım 2.3.12 pH 7,4 (kontrol) olarak ve pH 5 eTRPV1 etkinliği kontrol edin.

3. rekombinant Bacmid ve Baculovirus için Protein ifade oluşturma

  1. Bacmid
    1. DH10Bac E. coli yetkili hücreleri 100 μL 7.5 ile dönüşümü eTRPV1 ve/veya tek-sistein mutantlar içeren rekombinant donör vektör ng.
    2. 900 μL SOC medya ekleyin (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL maya ekstresi, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4ve 20 mM glikoz) ve 6-7 h 37 ° C'de ve 225 rpm kuluçkaya.
    3. 100 µL doğrudan karışımı ve seri dilutions tohum (1/10 ve 1/100), 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, içeren içinde LB-ağar kaplamalar 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin ve 50 μg/mL sefaloridin. Plakalar için en az 48 saat 37 ° C'de kuluçkaya
    4. 2 mm çapında, mavi koloniler Ekle ilgi eksikliği bu yana olan beyaz kolonileri seçin. Stereo mikroskop beyaz kolonileri herhangi bir mavi lekeler içermeyen doğrulamak için kullanın.
    5. En az üç tek kolonileri hasat ve 4 mL 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin ve 50 μg/mL sefaloridin ile desteklenmiş LB medya içeren bir 14-mL steril tüp içine aktarabilirsiniz. Hücreleri gecede (~ 16 h) 37 ° C ve 250 devir/dakika, kuluçkaya.
    6. (Ek dosya 1 ayrıntılı iletişim kuralı için bakın) gecede kültür ve ayrı tutma rekombinant bacmid DNA 1,5 mL al. 4 ° C'de bacmid iki aya kadar saklayın.
      Not: DH10Bac E. coli bacmid DNA içeren gliserol stokları hazırlayın. Kültür 300 μL alın ve gliserol 200 μL %50 (son gliserol konsantrasyonu % 20) ekleyin. Aliquot-80 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
    7. PCR kullanarak rekombinant bacmid eTRPV1 varlığını denetlemek (için detaylı iletişim kuralı ek dosya 1 ' e bakınız).
  2. Baculovirus
    Not: Bu yordam için Sf9 böcek hücreleri bir 6-iyi biçimde transfect. Tüm tutarlar ve miktarlar bir şey başına olarak verilir. Antibiyotik kullanmaktan kaçının.
    1. Böcek hücre medya 2 mL 1 x 106 Sf9 hücrelerde plaka. Hücreleri en az 45 dk. takmak izin verir.
    2. Rekombinant bacmid DNA böcek hücre medya 100 μL 1 μg sulandırmak. Hafifçe karıştırın.
    3. Transfection reaktif (TR) 6 μL böcek hücre medya 100 μL içinde sulandırmak. Hafifçe karıştırın.
    4. DNA ve TR çözümleri birleştirmek (üzerinden 3.2.2 ve 3.2.3, sırasıyla adımlar). Karışımı yavaşça ve RT., 30 dk için kuluçkaya
    5. Böcek hücre medya 0.8 mL DNA/TR karışıma ekleyin; hafifçe karıştırın.
    6. Sf9 hücrelerden böcek hücre medyayı çıkarın ve bir kez taze orta 1 mL ile yıkayın.
    7. Yıkama orta kaldırmak ve DNA/TR karışımı ekleyin (3.2.2 \u2012 3.2.5) hücreleri. Hücreleri (olmadan ajitasyon) 5 h için 27 ° C'de kuluçkaya.
    8. Transfection karışımı kaldırın ve 2 mL % 0.5 fetal Sığır serum (FBS) içeren böcek hücre medya ile değiştirin. Hücreleri 27 ° C'de beş gün kuluçkaya.
      Uyarı: Boş wells medya ile doldurma ve parafin film iki kat 6-şey plakalı kapsayan hücre medya buharlaşma önlemek.
    9. Hücre kültür medya 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. İlk geçiş (P1) viral stokunun tüp 8.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de iplik izole Süpernatant temiz 15 mL santrifüj tüpü aktarın ve hemen 4 ° C'de depolayın
      Not: virüs tüp alüminyum folyo ile kaplayan ışık pozlama korumak.
    10. İkinci nesil viral stok için (P2), 1 x 106 Sf9 hücreler / % 2 içeren mL böcek hücre medya 25 mL süspansiyon kültürü koymak FBS 125 mL şişe içine (düz alt ve Bacalı). 25 μL P1 şunun için 25 mL kültür ekleyin.
    11. Kültür için 72 h 27 ° C'de kuluçkaya.
    12. P2 viral stok hasat için yeni bir 50 mL tüp kültür aktarmak ve 8.000 x g 4 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi
    13. Yeni bir 50 mL tüp süpernatant aktarın ve hemen 4 ° C'de depolayın
      Not: virüs tüp alüminyum folyo ile kaplayan ışık pozlama korumak. P2 virüs/Sf9 oranı en iyi TRPV1 ifade için titre için küçük ölçekli bir deney gerçekleştirmek (, Bölüm 4 "P2 virüs için küçük ölçekli deney." başlıklı için detaylı bir protokol ek dosya 1 ' e bakın)
    14. Büyük ölçekli protein ifade için bir 1-L Sf9 hücre süspansiyon kültürü 2 x 106 hücre/mL %0.5 ile desteklenmiş böcek hücre medya ayarlamak FBS 2.8 L borosilikat cam şişesi içine.
    15. P2 virüs stokunun 1 mL 1-L kültür ekleyin ve 72 h 27 ° C'de kuluçkaya.
      Not: üçüncü günde, yaklaşık 1.5-2.5 x 106 hücre/mL hücre yoğunluğu olmalıdır.

4. eTRPV1 ve tek-sistein Mutant arıtma

  1. Membran izolasyon28
    1. 1-L böcek hücre süspansiyon kültürü 4500 x g, 20 dk. 4 ° C de iplik tarafından tartmak (Bu yaklaşık 6-9 g olması bekleniyor) hücre Pelet hasat.
    2. Hücre Pelet 25-mL buz gibi soğuk arabellek A resuspend (36.5 mM sükroz, 2 mM tris(2-carboxyethyl) fosfamin (TCEP) ve 50 mM Tris; pH 7,4) proteaz inhibitörleri (1 mM phenylmethyl Sülfanil florür (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinin varlığında ve 1 μg/mL pepstatin). Homojen bir süspansiyon elde etmek ve 20 dk için 4 ° C'de döndürmek için hücre kümeleri disaggregate.
    3. Bir el kitabı (dounce doku değirmeni) veya bir yüksek basınç homogenizer kullanarak hücreleri kır. Santrifüjü 8.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de hücre artıkları çıkarın
      Not: tüm işlemi sırasında lysed hücreleri ve tüpler buz üzerinde tutmak.
    4. Toplamak süpernatant ve 4 ° C'de 30 dk için 100.000 x g, santrifüj Süpernatant atın ve membran Pelet proteaz inhibitörleri (aynı derecede içinde adım 4.1.2) ile takıma toplam hacmine buz gibi soğuk arabellek b (150 mM NaCl, % 10 gliserol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES; pH 7,4), 20 mL resuspend.
    5. Membran süspansiyon 50 mL tüpler ve flash-freeze sıvı azot aliquot 20 mL. Örnekleri-80 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
  2. Protein Saflaştırma26,28
    1. Membran aliquots buz çözme ve n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (demir) tüp (200 mM hisse senedi) başına 3 mL ekleyin. Tüp 4 ° C'de 2 h için döndürme
    2. 100.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnek santrifüj kapasitesi Süpernatant toplamak ve temiz ıslak Amiloz reçine 1 mL ekleyin. Karışımı 4 ° C'de 2 h için döndürme Yerçekimi akışı Kromatografi sütunları protein/Amiloz karışımı yerleştirin.
      Uyarı: Yıkama sırasında kuru reçine izin vermez.
    3. Protein bağlı Amiloz reçine 10 kat yatak hacimleri buz gibi soğuk arabellek C (150 mM NaCl, % 10 gliserol, 50 mM HEPES, 0,5 mM demir, 0,1 μg/mL asolectin, 0,5 mM TCEP; pH 7,4) ile yıkayın. Buz gibi soğuk arabellek D (150 mM NaCl, % 10 gliserol, 50 mM HEPES, 0,5 mM demir, 0,1 μg/mL asolectin, pH 7,4) 10 yatak birimleri ile yıkayın.
      Not: yıkama önce deterjan veya lipidler, azot ile tasfiye olmadan arabellek D degas. Degasification sonra demir ve asolectin ekleyin.
    4. ETRPV1 protein 0,5 mL fraksiyonları ile elute, en çok 5 mL, buz gibi soğuk arabellek D, 20 mM maltoz ile takıma degassed. Mümkünse, yıkama ve 4 ° C'de elüsyon gerçekleştirmek
    5. Protein miktarı 280 nm dalga boyunda absorbans ölçerek ölçmek.
      Not: Bu protokol 0.5-1.0 mg protein kültürünün litre başına verir. Protein verim her eTRPV1 tek-sistein mutant için değişebilir. 4 \u2012 6 L EPR, geyik deneyleri için büyümek kültür.

5. eTRPV1 tek-sistein Spin Mutant Site-Directed etiketleme

  1. Santrifüj filtre birimini kullanarak eTRPV1 içeren kesirleri konsantre (kesme = 100 kDa) 2 \u2012 (4 ° C'de 2 min için döngüleri 7000 x g) etiketleme için 2,5 mg/mL.
  2. Yoğun protein DMSO 100-mM hisse senedi çözümde bir 10 kat molar fazlalığı (3 kere, her 30 dk.) (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) metil methanethiosulfonate (MTSSL) spin etiket ekleyin (eTRPV1 monomer: 1:10 MTSSL molar oranı) 17. tepki için 1 saat 30 dk 4 ° C'de gecede kuluçka ardından, RT karanlıkta tut
    Not: Bu adımda MBP gecede spin-etiketleme kuluçka sırasında TEV proteaz ekleyerek kaldırılamaz olabilir.
  3. Arabellek hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi tarafından kontrol e (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DDM; pH 7,4), yük spin etiketli eTRPV1 bir boyut dışlama Kromatografi sütunda equilibrated. ETRPV1 tetramer içeren kesirleri toplamak.
    Not: sulandırma verimliliği indirgeyerek % 10 gliserol Bu adımda eklemeyin.
  4. Protein miktarı 280 nm dalga boyunda absorbans ölçerek ölçmek.
  5. Örnek saflığı SDS-sayfa jel (leke içermeyen jel, 4 \u2012 %20) çalıştırarak değerlendirin. Örnek şimdi çözüm ve/veya proteoliposomes spektroskopik ölçümler için hazırdır.

6. eTRPV1 tek sistein Mutant sulandırma Spin etiketli

  1. Rotary evaporatör 40 ° C'de 1 h için vakum altında (≤100 mbar) kullanarak asolectin 10 mg Kuru Asolectin lipozomlar yapmak için arabellek F (200 mM NaCl, 5 mM bezleri; pH 7,4) 1 mL ekleyin ve 15 dakika ya da örnek homojen olana kadar karışımı solüsyon içeren temizleyicide.
  2. 2 mM son bir konsantrasyon DDM ekleyerek lipozomlar istikrarsızlaştırmak ve RT., 30 dk için kuluçkaya
  3. Etiketli protein 2 mg/mL konsantre ve 1:5 protein/Lipid oranı (kütle: kitle) kullanarak lipozomlar ekleyin.
    Uyarı: Düşük konsantrasyonlarda ve protein çökelti yüksek spin-etiketleme verimliliği azalır bu yana söz konusu protein konsantrasyonu tutmak önemlidir.
  4. Arabellek DDM kritik micelle konsantrasyonu (CMC) protein/lipozom karışıma ayarlamak ve gecede nazik ajitasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya F ekleyin.
  5. İki katı protein/lipozom karışımı ile arabellek F ve Kaldır deterjan ekleyerek ardışık olarak nonpolar polistren adsorbent boncuk (30 mg, 50 mg ve 80 mg) üç aliquots RT, nazik ajitasyon ile 1-h aralıklarla hacmi
  6. Karışımı üzerine boncuk kaldırmak ve proteoliposomes karışımı bir ultracentrifuge tüp aktarmak için bir sütun filtresi (yerçekimi akışı Kromatografi sütun) yükleyin. 100.000 x g 4 ° C'de 1 h için de örnekler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak ve Pelet arabellek F. 30 μL içinde resuspend
    Not: Örnekleri spektroskopik Analizi ve Xenopus yumurta içine enjeksiyon için hazırsınız. Örnekleri aynı gün kullanılamıyorsa, birden parlamak-onları sıvı azot ve-80 ° C'de store donma
  7. Proteoliposomes -Xenopus oosit Elektrofizyoloji26,32
    1. 50 enjekte spin etiketli proteoliposomes farklı dilutions 2.2 bölümünde açıklandığı gibi Xenopus yumurta içine nL.
    2. TEVC ölçümler enjeksiyon 12 h sonra 2.3.10 bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  8. Spektroskopik ölçümler ve Analizi (Bölüm 7) gerçekleştirmek için devam edin.

7. geyik ve EPR Spectroscopies

  1. Çift elektron-elektron rezonans (geyik) spektroskopisi.
    1. GEYİK ölçümleri Q-band frekansı (34 GHz) ve ölü-zaman ücretsiz dört darbe dizisi 83 kullanarak yazılım üreticisi tarafından sağlanan33° ile 10-W amplifikatör ile donatılmış bir darbeli EPR Spektrometre gerçekleştirin.
    2. Deterjan saf eTRPV1 spin etiketli sistein mutantlarla %30 (v/v) gliserol cryo-koruma için arabellek e (adım 5.5), 50 µM ek.
    3. Örnek bir mühürlü kuvars kılcal tüp ve spin tüpün dibine düşük hızlı kısa aralıklarla (100 x g) tarafından yüklemek.
    4. Kılcal boru örnek dondurmak için sıvı azot yerleştirin. Örnekleri daha sonra ölçüm için-80 ° C'de bu noktada saklanır.
    5. Örnek doğrudan mikrodalga rezonatör yerleştirin ve izin vermek o yeniden-83 ° 10 \u2012 için de equilibrate 20 dk.
    6. Standart Dört-pulse geyik protokolü, (π/2) mw1 kullanarak örnek ölçmek – τ1 – (π) mw1 – τ1 – (π) mw2-τ2-(π) mw1 – τ2 – yankı34. (π/2) mw1 ve (π) mw1 için nabız yüksekliği 10 ve 20 ns, sırasıyla, vardır ve 40 ns (π) mw2 için. 63 MHz frekans ayırma ayarlayın.
      Not: Birincil geyik çürüme veri döndürme etiketleri19,35arasındaki mesafeleri açıklamak için Gauss dağıtımları toplamı varsayar bir ev inşa yazılım (Örneğin Matlab içinde) ile analiz edilebilir.
  2. Sürekli (CW) EPR spektroskopisi
    1. CW EPR deneyler RT, bir X-band (9,6 GHz) Spektrometre üretici yazılımını kullanarak gerçekleştirin.
    2. Araç su soğutucu, konsol ve mıknatıs güç kaynağı üzerinde açarak başlayın. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı alet için bağlanmak, enstrüman uyum içinde yerleştirin ve ısınmak araç için en az 30 dakika bekleyin.
    3. Örnek 20 µL kılcal eylemini kullanarak 25-µL cam kılcal tüp içine adım 5.5 yüklemek ve dolgu macunu ile tüp sonu mühür.
    4. Kılcal tüp mikrodalga boşluğuna yük ve eleştirel çift rezonatör el ile veya otomatik olarak yazılım auto-tune işlevini kullanarak.
    5. İlk türev spectra Standart araç koşullar altında toplamak: 100 kHz mikrodalga modülasyon, 1.6 G manyetik alan modülasyon ve 10 mW mikrodalga güç.
    6. Veri analizi ve sunum için arka planı spectra düzeltin ve onları Çift Kişilik integral tepe tepe değeri tarafından spectra bölerek normalize.
    7. Spin-etiket hareketlilik işlevinin ilk türev soğurma spektrumları (ΔHo-1)36Merkez çizgi genişliğini ölçerek belirlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En az sistein-az TRPV1 oluşturmak (eTRPV1) ve tek-sistein mutantlar fonksiyonel karakterizasyonu

Spektroskopik çalışmalar doğru ilk adım mühendisi ve fonksiyonel ve biyokimyasal proteinler miktarlarda verim sistein-az protein yapıları (Şekil 2A) karakterize olduğunu. eTRPV1 Ca2 + görüntüleme ve TEVC (Şekil 2B-C) tarafından belirlenen işlevseldir. Ayrıca, eTRPV1 EPR, geyik deneyleri (0.5 - 1 mg-litre Sf9 hücre) için yeterli miktarda deterjan saf protein sağlar26. Belirli protein bölgelerde tek katıldı tanıtımı onların işlevini etkileyebilir. Şekil 2B tek-sistein mutantlar (E651C ve A702C), bazı örnekler TRPV1 agonist (Örneğin, kapsaisin) eklendiğinde onların floresan yoğunluğu artar bu yana, vahşi türü (WT), gibi davranan eTRPV1 eTRPV1 içeren HEK293 gösterir hücreleri,26Imaging Ca2 + tarafından gösterildiği gibi. Öte yandan, A680C bir işlevsel olmayan sistein mutant tipik örneği gibidir floresan arka plandan ayırt edilemez. A680C mutant daha ayrıntılı bir çözümleme için dışarıda bırakıldı. Deneyler Imaging Ca2 + sonra tek-sistein mutantlar işlevi biyofiziksel özellikleri değerlendirmek için TEVC ya da yama kelepçe kullanılarak test edilmiştir. Şekil 2C mutantlar dışa doğru düzeltme istediğinde pH 5, TEVC26tarafından belirlenen TRPV1 karakteristik özetlemek gösterir. Fonksiyonel analiz tek-sistein mutantların ifade ve arıtma protokolleri girişmeden önce ilk denetim noktası var.

ETRPV1 ve tek-sistein mutantlar biyokimyasal karakterizasyonu

Yukarıda açıklanan arıtma protokolü için TRPV1 sırası boyunca sistein kovalent modifikasyon (Örneğin, fluorophores, spin etiketli [SL] metil methanethiolsulfonate) yolu ile etiketli deterjan çözündürüldükten protein verir Spektroskopik analizi. Kanal içeren sistein kalıntıları göç kararlı ve monodisperse tür olarak en az TRPV1 (~ 13,6 mL), boyutu-dışlama Kromatografi (Şekil 3) tarafından belirlenen. eTRPV1 ve tek-sistein spin etiketli mutantlar (E651C-SL ve A702C-SL) elüsyon profil ve en az TRPV1 yapı (Şekil 3)26tarafından özellikli istikrar özetlemek. Tek katıldı protein istikrar etkileyebilir gibi elüsyon profil farklı mutantlar arasında değişebilir. Bazı durumlarda, mutantlar toplamları oluşturur; ve örnek bir kısmını sütunun (8-9.5 mL), bir tetramer (Şekil 3, alt kırmızı ok) geçirir protein miktarını azaltarak geçersiz seste elute. Bu durumda, hücre kültür birimleri kayıp toplanan kesir, ya da bir protein bu mutant daha fazla çözümleme dışı bırakmak ve komşu kalıntı test etmek için devam etmek için telafi etmek için ölçeklenebilir. Diğer örnekler bir tetramer için karşılık gelen tepe genişletmektedir. Ana zirveleri 3 mL daha geniş spektroskopik analizi için onlar çok içeren tavsiye edilmez-tür dağıtmak. Biyokimyasal spin etiketli tek-sistein mutantlar girişim sulandırma ve spektroskopik analiz önce ikinci denetim noktası karakterizasyonudur.

Fonksiyonel karakterizasyonu yeniden Spin-etiketli eTRPV1 tek-sistein mutantlar

EPR ve geyik sinyalleri paramagnetic spin-etiket eki sistein kalıntıları için dayandığından, spin-etiket konumunu protein işlevi değiştirir olup olmadığını doğrulamak önemlidir. Düzlemsel lipid bilayer deneyler, yama kelepçe ve TEVC gibi spin etiketli protein başlamaktan sonra işlevi için sınamak için birkaç yolu vardır. TEVC makroskopik akımlarını kaydederken spin etiketli kanalları, çok sayıda değerlendirme sağlar. Spin etiketli tek-sistein mutantlar işlevselliğini değerlendirmek için kanalları önceden biçimlendirilmiş asolectin lipozomlar yeniden. Bu adım sırasında gliserol protein sulandırma lipozomlar içine verimliliğini azaltır bu yana, arıtma mevcut % 10 gliserol dışlamak önemlidir. Şekil 4 A702C-SL TRPV1 sonucu asolectin lipozomlar yeniden düzenlendi ve Xenopus yumurta microinjected bir temsilcisi gösterir. Beklendiği gibi pH 5 TRPV1 antagonisti capsazepine (CPZ, mavi iz)26ortak uygulama tarafından engellenen sağlam dıştan işletmeye akımları37 ortaya çıkarır. Spin etiketleme ve sulandırma sonra işlevselliği korumak değil mutantlar daha fazla analiz dışlanmaları gerekir. Fonksiyonel Sulandırılan spin etiketli tek-sistein mutantlar girişim spektroskopik analiz önce üçüncü denetim noktası karakterizasyonudur.

Yapısal, Dynamics Spin-etiketli eTRPV1 mutantlar izlenen CW-EPR ve geyik

Nitroxide döndürme etiketleri için çevreye duyarlıdır ve etiket olduğu protein omurga esnekliğini17bağlı. Bu nedenle, CW-EPR belirli bir spin etiketli sistein dinamik rejimi tayini sağlar; Yani, membran veya sulu ortamda maruz pozisyonları daha bu protein-protein etkileşimleri17' ye sınırlı daha dinamiktir. Şekil 5A pozisyonları Glu651, Ile679 ve Ala702 hareket parametrelerini izlemek için seçilen TRPV1 gösterir. Spin etiket sonda hareketlilik parametresini hesaplamak için bir ilk türev soğurma spektrumları (Şekil 5B, siyah çizgi ΔHEy−1) Merkez çizgi genişliğini tersini hesaplar. Örneğin, E651C-SL (Şekil 5B) yaygın membran arabirimi26dinamik pozisyonlarda bulunan bir tayf çizgi şekli ve hareketlilik değeri (0,24) görüntüler. Öte yandan, I679C-SL ve A702C-SL Sergi (bkz: noktalı çizgiler) spectra ve hareketlilik değerleri bir düşüş genişletilmesi (0.16 ve 0.18, sırasıyla; Şekil 5B) cryo-EM yapısı1göre kısıtlı çevre çevre (protein-protein), ile tutarlı olan 26 .

Şekil 5C asolectin lipozomlar rekonstitüsyon sonra spin etiketli TRPV1 mutantlar spectra gösterir. Şekil ve hareketlilik değerlerine çözüm bir membran çevre26olduğu gibi aynı olduğundan beklendiği gibi spectra E651C-SL ve A702C-SL için dinamik özellikler sulandırma sonra değişmedi. Öte yandan, I679C-SL gürültülü bir spektrum gösterir; Sonuç olarak, alt (mavi ok) ve daha yüksek (kırmızı ok) alanı bileşenleri daha az belirgin hale gelir. Spin satırının yere hareketliliğini hafife eğilimindedir gürültülü spectra genellikle, istenen değil. I679C-SL sinyal çözüm sağlam olduğundan bu tayf türü altında etiketleme, yerine yetersiz protein sulandırma ürün olabilir.

GEYİK veri salınan, sinüsoidal sinyal bozuluyor etkileşen spin-Etiketler38,39mesafe dağılımı hakkında bilgi içeren bir toplamıdır. Dönem ve çürüme karmaşıklığı doğrudan temel alınan mesafe dağıtım yansıtır. Mesafe dağıtım yapısal bileşenler örnek ve onların bozukluğu mevcut sayısı oluşur. Bu nedenle, saat alan sinyal dipolar türeyen genellikle bir üstel arka plan çürümesine neden sabit olmayan, mesafeli spin etiketleri arasında çözüm kaplin, andrigidly aynı protein19,40içinde spin birleştiğinde. Özellikle geyik spin etiketli artıkları19arasında içi-protein uzun menzilli mesafeleri (20-70 Å) tayini sağlar. Şekil 6 sinyal çürüme ve E651C-SL ilgili mesafe dağılımı gösterir. 24, 36 ve 58 Å26için karşılık gelen üç tepeler Glu651 dağılımını gösterir. İki kısa mesafeler kapalı TRPV1 yapısıyla tutarlı (23 ve 32 Å Cβ-Cβ için mesafelerde, sırasıyla)1, Oysa üçüncü 58 Å en yüksek protein toplamak için karşılık gelmeyebilir.

Figure 1
Şekil 1. Deneysel anahat. Hızlı, arındırmak ve EPR ve geyik için eTRPV1 yeniden oluşturmak için gereken deneysel anahat diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. ETRPV1 ve tek-sistein mutantlar fonksiyonel karakterizasyonu. TRPV1 yapıları spektroskopik çözümlemesi için kullanılan(a)şematik gösterimi (eTRPV1: sistein-az TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 hücreleri ifade WT TRPV1, eTRPV1 ve mutantlar (Ca2 +ile yüklü-hassas Fluo-4-AM) kapsaisin (10 µM) için analiz edildi-uyarılmış floresan Ca2 + Imaging'i kullanma yanıt. Renk çubuğunu floresan yoğunluğu, mavi ve kırmızı en düşük ve en yüksek ifade eden ile göreceli değişiklik gösterir sitoplazmik Ca2 +, anılan sıraya göre. Beyaz çubuk 100 µm. (C) sol, tek-sistein kalıntıları (sarı küreler) Kanal sıra tanıttı vurgulayarak TRPV1 tetramer yapısının bir alt birim (S5, gözenek helix, S6 ve TRP etki alanı) temsil eder. Doğru akım-gerilim ilişkileri WT TRPV1, eTRPV1 ve pH 5 ile meydan tek-sistein mutantlar ifade Xenopus yumurta TEVC kayıtları belirler. Arka plan akımları (bkgrd). Orijinal şekil26değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. ETRPV1 ve tek-sistein mutantlar biyokimyasal karakterizasyonu.
Boyut-dışlama Kromatografi profil demir çözündürüldükten eTRPV1 ve tek-sistein mutantlar ifade ve arıtma Sf9 hücrelerden sonra spin etiketli. İç metin: (--dan orijinal şekil26değiştirilmiş) monomeric eTRPV1-MBP füzyon protein gösterilen SDS-sayfa jel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Bir spin etiketli eTRPV1 mutant işlevsel alan nitelik özellikleri.
Akım-gerilim ilişkileri tespit TEVC tarafından Xenopus yumurta spin etiketli proteoliposomes içeren ile microinjected üzerinden A702C pH 5 (kırmızı) ile meydan ve capsazepine tarafından engellendi (CPZ, mavi: 40 µM). Arka plan akımları (bkgrd). Orijinal şekil26değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. CW-EPR tarafından belirlenen spin etiketli eTRPV1 mutant mobilities.
(A) iki alt birimleri (S5, gözenek helix, S6 ve TRP etki alanı) TRPV1 tetramer yapısı ile spin-etiketleme spectroscopies site yönettiği probed amino asit kalıntıları (sarı küreler) vurgulayarak. (B) CW EPR spectra spin etiketli sistein mutant DDM çözümünde ilk türevi. (C) CW EPR spectra spin etiketli sistein mutant asolectin lipozomlar yeniden ilk türevi. Spectra pH 7,4 (closed durumuna) elde edilmiştir. ΔHo−1 hareketlilik parametre büyüklüğünü gösterir. Siyah noktalı çizgi spectra genişletmektedir vurgulamaktadır. Mavi ve kırmızı oklar düşük ve yüksek alan spectra ürününün sırasıyla bileşenler. EPR spectra spin etiketleri toplam sayısı için normalleştirilmiş. Orijinal şekil26değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Bir eTRPV1 mutant deterjan içinde mesafe dağıtım.
GEYİK yankı(a)ve mesafe spin etiketli mutant E651C (B) dağılımı; Gaussians bir miktar geyik veri takıldı. P(r) mesafe dağıtım spin çiftleri41gösterir. Spectra pH 7,4 (closed durumuna) elde edilmiştir. Orijinal şekil26değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İfade ve memeli membran proteinlerinin arınma için güncel teknolojileri protein spektroskopik çalışmalar14,15,16,42için yeterli miktarda elde etmek mümkün kılmıştır. Burada, hızlı, arındırmak, yeniden oluşturma ve spektroskopik çözümlemesi TRPV1 içinde bu teknolojiler adapte olması.

Arasında protokol kritik adımlarda, aşağıda TRPV1 için troubleshot olanlar ve bu diğer proteinler için ayarlanmış. 0.5 - 1 mg/mL deterjan saf protein verimleri bir şablon oluşturmak için DNA sırasını değiştirmek; daha az 0,5 mg/mL protein verim şablonları zorlu, böcek hücreleri kültürleri daha--dan 6 litre büyüyen mutant gerekli olacaktır beri. Protein gerekir konsantre, en az 2 mg/mL, spin-etiketleme verimliliğini artırmak için TCEP olmadan. Düşük protein konsantrasyonları, ve/veya TCEP huzurunda etiketleme izlemeler gürültülü EPR spectra oluşturacaktır. Her ne kadar protein arıtma sırasında 4 ° C'de tutulur, RT verimliliği artırmak için etiketleme spin gerçekleştirmek için önemlidir. Arıtma ve etiketleme sırasında gliserol protein istikrar geliştirir; Ancak, Bu lipozomlar protein miktarını azaltır ve gürültülü EPR spectra oluşturur gibi sulandırma önce tamamen kaldırılmalıdır. CMC aşağıda deterjan konsantrasyon azalan yaygın bir uygulama sırasında sulandırma olduğunu; Ancak, TRPV1 lipozomlar birleşmeyle önce çökelti eğilimindedir. Bu sorunu çözmek için TRPV1 bir gecede tam olarak CMC protein yağış önlemek ve kanalları proteoliposome hazırlık miktarını artırmak için önceden biçimlendirilmiş lipozomlar ile inkübe. TRPV1 asolectin lipozomlar28yılında tümüyle işlevseldir; Bu nedenle, bu protokol için kullanılan tercih edilen lipid karışımı oldu. Ancak, spektroskopik analizleri ile devam etmeden önce hangi işlevsel (Örneğin, kolesterol) belirli bir proteindir lipid kompozisyonu belirlemek için önemlidir.

Spektroskopik yaklaşımlar EPR ve geyik bazı sınırlamaları da dahil olmak üzere, mevcut gibi:, biyokimyasal kararlılığı artıran değişiklikler protein şablon sırayla işlev26; bir etkiye sahip Yerel olmayan tek katıldı yanı sıra spin etiket giriş de protein belirli bölgelerde tolere değil; etiketli proteinler büyük miktarlarda elde etmek; ve deterjan micelles geyik ile mesafeler belirlerken sınırlı konformasyon değişiklikler. Ancak, ikinci sınırlama TRPV1 mutant nanodiscs19,43yılında yeniden Q-band frekans spectra toplayarak üstesinden gelebilir. Yine de, bu yaklaşımların avantajı esas olarak global Dinamik'in, eriþebilirlik ve belirli bir pozisyon mutlak değeri daha fazla mesafeler gelir.

Sıcaklık hassasiyeti en büyüleyici biridir ve daha az gating mekanizmaları anladım; Bu nedenle, spektroskopik yaklaşımları kullanarak, bu nasıl membran proteinlerinin membran ortamında protein hareket halinde termal enerji tercüme belirlemek mümkün olurdu. Önemlisi, bu tekniklerin sıcaklık donma gerçekleştirilen gibi termal x-ışını kristalografisi veya cryo-EM, kullanarak geçişi sırasında yapısal değişiklikleri belirlemek için zor olurdu. Gelecekteki deneyler-ecek var olmak matuf TRPV1 konformasyon EPR, geyik veya floresan kullanarak termal bağımlı geçişi ile uyumlu değişiklikleri belirleme doğru. Yani biz yukarıda açıklanan iletişim kuralları kullanılarak, biz harekete geçirmek mekanizmaları ve uyuşturucu-bağlama kullanarak memeli iyon kanallarının kazanacaktır EPR spektroskopisi prokaryotik iyon kanalları için ayrıntılı mekanik modeller sağlamıştır Spektroskopik yaklaşımlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Dr. H. EPR ve geyik Spektrometreler erişim sağlamak için Mchaourab ve Dr. T. Rosenbaum tam uzunlukta sistein-az TRPV1 plazmid sağlamak için minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

Biyokimya sayı: 137 geçici reseptör potansiyel vanilloid 1 TRPV1 arıtma sulandırma spin-etiketleme EPR spektroskopisi GEYİĞE Spektroskopi
Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter