Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Denne artikel beskriver specifikke metoder til at opnå biokemiske mængder af vaskemiddel-solubilized TRPV1 for spektroskopisk analyse. De kombinerede protokoller giver biokemiske og biofysiske værktøjer, som kan tilpasses til at lette strukturelle og funktionelle studier til pattedyr Ionkanaler i en membran-kontrolleret miljø.

Abstract

Polymodal Ionkanaler transduce flere stimuli af forskellige naturer allosteriske ændringer; disse dynamiske konformationer udfordrende at bestemme og forbliver stort set ukendt. Med de seneste fremskridt i enkelt-partikel cryo-Elektron Mikroskopi (cryo-EM) kaste lys på de strukturelle egenskaber af agonist bindingssteder og aktivering mekanisme af flere Ionkanaler, er scenen sat for en dybtgående dynamisk analyse af deres gating mekanismer ved hjælp af spektroskopiske metoder. Spektroskopiske teknikker som elektron paramagnetisk resonans (EPR) og dobbelt elektron-elektron resonans (RÅDYR) er hovedsagelig begrænset til undersøgelse af prokaryote Ionkanaler, som kan renses i store mængder. Kravet om, at store mængder af funktionelle og stabil Membranproteiner har hæmmet studiet af pattedyr Ionkanaler ved hjælp af disse metoder. EPR og HJORTE tilbyder mange fordele, herunder bestemmelse af strukturen og dynamiske ændringer af mobile protein regioner, omend med lav opløsning, der kan være vanskeligt at opnå af røntgenkrystallografi eller cryo-EM, og overvågning af reversibel gating overgang (dvs., lukket, åben, lysfølsomme, og desensibiliserede). Her give vi protokoller for at opnå milligram af funktionelle vaskemiddel-solubilized forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1) der kan mærkes for EPR og HJORTE spektroskopi.

Introduction

Med de seneste fremskridt i enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), har pattedyr ion-kanal strukturer opnået med ekstraordinære hastighed. Især, har strukturelle studier af polymodal Ionkanaler, såsom forbigående receptor potentielle vanilloid 1 (TRPV1), givet yderligere forståelse af dens aktivering mekanismer1,2,3, 4 , 5. dynamisk information om Ionkanaler indlejret i en membran miljø er dog forpligtet til at forstå deres polymodal gating og stof-bindende mekanismer.

Elektron paramagnetisk resonans (EPR) og dobbelt elektron-elektron resonans (RÅDYR) spectroscopies har givet nogle af de mest definitive mekanistiske modeller for ion-kanaler6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. disse tilgange er hovedsagelig begrænset til en undersøgelse af prokaryote og archeal ion-kanaler, giver en stor mængde af vaskemiddel-renset proteiner når overexpressed i bakterier. Med udviklingen af eukaryote membran proteiner produktion i insekt og pattedyrsceller for funktionel og strukturel karakterisering14,15,16er det nu muligt at få biokemiske mængder af vaskemiddel-renset proteiner for spektroskopiske undersøgelser.

EPR og HJORTE signaler opstår fra en paramagneticspin etiket (SL) (dvs., methanethiosulfonate) knyttet til en enkelt-cystein rester i proteinet. Spin-etiketter rapport tre typer af strukturelle oplysninger: motion, tilgængelighed og afstande. Denne information giver mulighed for fastlæggelse af, om restkoncentrationer er begravet inde i proteinet eller udsættes for membran eller vandige miljø i apo og ligand-bundet stater13,17,18,19. I forbindelse med en høj opløsning struktur (når de er tilgængelige), giver EPR og HJORTE data en samling af begrænsninger for der følger dynamiske modeller i deres oprindelige miljø mens overvågningen reversible gating overgang (dvs., lukket, åben, lysfølsomme, og desensibiliserede). Desuden kunne fleksible regioner, der kan være vanskeligt at bestemme af røntgenkrystallografi eller cryo-EM opnås ved hjælp af disse miljømæssige datasæt til at tildele sekundære strukturer samt placering inden for protein20. Cryo-EM strukturer fremkommer i lipid nanodiscs givet værdifulde oplysninger om gating af ion-kanaler3,21,22,23,24, 25; dog kunne spektroskopiske metoder give dynamiske oplysninger fra konformationelle stater (fx, termisk ændringer), der kan være vanskeligt at bestemme ved hjælp af cryo-EM.

Mange vanskeligheder skal overvindes for at implementere EPR og HJORTE, herunder mangel på protein funktion, når du fjerner alle cystein restkoncentrationer (især rigelige i pattedyr kanaler), lavt proteinindhold udbytte, protein ustabilitet under rensning og efter spin mærkning , og protein sammenlægning i opvaskemiddel eller Liposomer. Her har vi designet protokoller til at overvinde disse kritiske hindringer og har fået DEER og EPR spectra oplysninger for et pattedyr sensoriske receptor. Formålet her er at beskrive metoder for udtryk, rensning, mærkning og rekonstituering af en funktionel minimal cystein-mindre rat TRPV1 (eTRPV1) konstruere spektroskopiske analyser. Denne metode er velegnet til disse Membranproteiner, der holder deres funktion trods fjernelse af cystein restkoncentrationer eller indeholder cystein danner disulfid obligationer. Denne samling af protokoller kunne tilpasses til spektroskopisk analyse af andre pattedyr Ionkanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TRPV1 mutagenese

Bemærk: En minimal TRPV1 konstruktion for spektroskopisk analyse26 blev bygget fra den fuld længde cystein-mindre kanal TRPV127 ved hjælp af metoden polymerase kædereaktion (PCR) (figur 1). Denne cystein-mindre minimal TRPV1 konstruktion (refereret til som eTRPV1 herefter) består af restkoncentrationer 110-603 og 627-764. eTRPV1 er klonet i pMO (en pcDNA3.1-baserede vektor) for funktionel analyse og en rekombinant donor vektor28 indeholdende 8 x histidin-maltose-bindende protein (MBPS)-tobak etch virus (TEV) for proteinekspression og -oprensning (figur 2A). eTRPV1 enkelt-cystein mutanter blev genereret ved hjælp af site-directed mutagenese. Vektor og kanal sekvenser er angivet i den supplerende fil 1: supplerende metoder.

  1. Design mutagenese primere med online værktøjer29.
  2. Bland i en 0,2 mL tube: 5 μl af 10 x reaktion buffer, 1 μL dNTP mix (100 mM), 1 μl af 10 μM frem og bak oligonukleotider, 1 μL 100 ng/μl eTRPV1 skabelon DNA26, 1,5 μL af DMSO, 1 μL mutagenese enzym , og 38,5 μL ionbyttet vand. Spin blandingen før markedsføring rør i thermocycler.
  3. Udføre PCR mutagenese.
    1. Udføre a denaturering ved 95 ° C i 2 min., b denaturering ved 95 ° C i 20 s, c udglødning ved 60 ° C i 10 s og d brudforlængelse på 68 ° C i 4 min (30 s pr 1 kb). Gentag trin b til d til 18 cykler, og derefter udføre brudforlængelse på 68 ° C i 5 min, og vedligeholde reaktion ved 4 ° C indtil videre anvendelse.
  4. Tilføj 2 μl af Dpnjeg enzym til reaktion; mix og derefter inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
  5. Udføre transformationen
    1. Tø E. coli kompetente celler på is.
    2. En pre afkølede 14mL sterilt tube, tilføje 75 μl af kompetente celler og 10 μl af Dpnjeg-behandlede PCR blanding. Bland forsigtigt.
    3. Inkuber reaktion på is i 30 min. vedligehold tube på 42 ° C til 45 s og derefter straks anbringes på is i 2 min. plade blanding på Luria bouillon (LB)-agar plade der indeholder carbenicillin (0,2 mg/mL). Inkuber plade natten over ved 37 ° C.
    4. Høste mindst tre enkelt kolonier fra pladen og podes hver 4 mL af LB indeholdende carbenicillin (0,2 mg/mL) ved hjælp af en 14-mL sterilt tube. Inkuber kulturer natten over ved 37 ° C og ryste ved 250 omdrejninger i minuttet.
    5. Spin ned natten kulturer på 8.000 x g i 10 min. og udtrække DNA ifølge vejledningen i kommercielt tilgængelige mini forberedelse kits.
    6. Kontrollere tilstedeværelsen af single-cystein mutanter af standard automatiseret DNA-sekventering (Se Tabel af materialer).

2. funktionel analyse af eTRPV1 og Single-cystein mutanter

  1. HEK293 celle linje Transfektion 30
    1. Kultur HEK293 celler i 6 - godt plader i 2 mL af høje glukose medium (DMEM) pr. brønd (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed). Forberede HEK293 celler, der er 70 \u2012 80% sammenflydende.
    2. Forberede Transfektion blandingen i to separate 1.5 mL micro-centrifugeglas.
      1. Reaktion A, tilføje 0,5 µg eTRPV1 eller cystein mutant-holdige pMO til 250 µL af minimal afgørende medium (f.eks Opti-MEM). For reaktion B, tilføje 3 µL Transfektion reagens til 250 µL af minimal afgørende medium. Inkuber hver reaktion i 5 min. ved stuetemperatur (RT).
      2. Bland reaktioner A og B med 1 mL pipette. Inkuber blanding for 45 min på RT.
    3. Fjern 500 µL af kultur medier fra 70-80% sammenflydende godt og tilsæt 500 µL af en reaktionsblanding. Gemme plader natten til Ca2 + imaging (37 ° C, 5% CO2og 95% fugtighed).
  2. Ca2 + imaging i HEK293 celler 30
    1. Ren 12-mm diameter glas coverslips med ethanol og vand og placere dem i en 24-godt plade.
    2. Tilføje 75 µL af poly-l-lysin i midten af hver coverslip og gemme pladen i 45 min (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed).
    3. Fjern den overskydende poly-l-Lysin og vask coverslips tre gange med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) at fjerne eventuelle rester.
    4. Når coverslips er klar, fortsætte med at frigøre celler fra 6-godt plade.
    5. Fjern mediet og tilsæt 500 µL af varm PBS (37 ° C) til vask.
    6. Fjerne PBS, tilsættes 500 µL af trypsin og inkuberes i 1 min.
    7. Tilsættes 500 µL af varm kultur medier (37 ° C) til fordøjelsen reaktionen standses og bland med pipette; undgå at danne bobler. Hvis det er nødvendigt, justere celle koncentrationen fortynde denne resuspension med flere medier.
    8. Seed 250 µL af transfekteret HEK293 celler (70% sammenflydende) plus 250 µL af kultur medier (500 µL endelige mængden pr. brønd) på forbehandlet coverslips og lad dem slå sig ned (for vedhæftet fil) for 1-2 h i inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed).
    9. I mellemtiden forbereder en loading løsning ved at tilføje 0,02% pluronic syre og 1 µM Fluo-4-AM til en ringelyden bufferen. Bland opløsningen godt.
    10. Fjern HEK293 Kulturmedier fra brønden og tilsæt 500 µL af opløsningen lastning. Inkuber celler for 1 h (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed). Fluo-4-loaded cellerne vaskes to gange med varmt ringelyden bufferen.
    11. Placere en coverslip med indlæst celler i en 10 mm petriskål i et mikroskop scene (ved hjælp af en 10 X mål; 494 nm excitations- og 506 nm) til at udføre intracellulær Ca2 + målinger.
    12. Måle ændringer i fluorescens intensitet efter perfusing respektive ligander (f.eks, 10 μM capsaicin) ved hjælp af kommercielt tilgængelige software (Se Tabel af materialer).
  3. mRNA og Xenopus laevis oocyter forberedelse 30
    1. Linearize eTRPV1 og single-cystein mutanter-holdige pMO med Pmejeg for 1 timer ved 37 ° C. Ren DNA ifølge vejledningen i kommercielt tilgængelige rensning kits.
    2. Brug lineariseret og renset DNAs for at syntetisere udjævnede RNA'er med et kommercielt tilgængeligt kit kompatibel med T7 RNA polymerase.
    3. Ren udjævnede RNA'er ifølge kommercielt tilgængelige rensning kits. Kvantificere RNA beløb ved måling af absorbans ved 260 nm bølgelængde.
    4. Overførsel 5 \u2012 10 mL af X. laevis oocyter (kommercielt tilgængelige) i en 50 mL konisk rør indeholdende 20 mL af ND96 løsning (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,4) med 1 mg/mL collagenase og nutate til 50 min. ved RT.
    5. Skyl oocyter i ND96 indtil løsningen er klar. Tilsæt frisk collagenase og omrystes i 30 min. ved RT. undersøge oocyter under et stereo mikroskop og stopper fordøjelsen, når det ydre follikulære lag (blanke lag med røde blodkar) er fraværende i de fleste oocyter (90%). Skyl oocyter i ND96, indtil løsningen er klar.
    6. Overførsel oocytter til en 50 mL polystyren tube med ND96 plus 1 mM CaCl2 og rystes 1 h. Under fordøjet oocyter vil holde polystyren røret.
    7. Vask oocyter med ND96 plus 1 mM CaCl2 og supplement løsning med 50 µg/mL af gentamicin og 50 µg/mL tetracyclin.
      Bemærk: Beskytte tetracyklin-holdige løsninger fra lys eksponering.
    8. Vælg store oocyter uden beskadigede membraner og viser en klar adskillelse mellem den animalsk og vegetabilsk polakker. Lad oocyter inddrive for 4 h før mikroinjektion ved 16 ° C.
    9. Bruge glas pipetter (OD: 1.11 mm, I.D.: 0,5 og længde 8,8 cm) at tilføre oocyter ved hjælp af en nanoliter-injektor systemet (46 nL/s) og et stereo mikroskop (2 X forstørrelse) 1-5 ng af mRNA fra eTRPV1 og single-cystein mutanter. Gemme oocyter ved 16 ° C i ND96 suppleret med CaCl2 og antibiotika (phosphatbufferet/tetracyklin 1 x).
    10. Efter 72 h, måle makroskopisk strøm ved hjælp af en to-elektrode spænding-klemme (TEVC) erhvervelse system31.
    11. Trække borsilikatglas pipetter (0,3 MΩ) og fylde dem med 3 M KCl.
    12. Placer oocyt i optagelse kammeret ved hjælp af en overførsel pipette og perfuse bad løsning (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA og 10 mM HEPES løsning, pH 7,4) på lav hastighed.
    13. Fordyb begge elektroder i Bad-løsningen til at justere deres pipette forskydninger. Skub forsigtigt pipette elektroder (borsilikatglas pipetter; OD: 1,5 mm I.D.: 1,10 og længde 10 cm) til oocyt indtil en lille fordybning er observeret under et stereo mikroskop (2 X forstørrelse), samt en ændring af membran potentiale.
    14. Ændre indstillingerne for forstærker til optagelse tilstand og foranstaltning makroskopisk strømninger mens anvendelse en spænding-clamp rampe fra-80 til +80 mV for 1 s. belastning perfusion system med løsningen anvendes i trin 2.3.12 ved pH 7,4 (som kontrol) og pH-værdi på 5 for at tjekke eTRPV1 aktivitet.

3. skabe rekombinante Bacmid og Baculovirus for Protein udtryk

  1. Bacmid
    1. Omdanne 100 μL af DH10Bac E. coli kompetente celler med 7,5 ng af rekombinant donor vektor indeholdende eTRPV1 og/eller single-cystein mutanter.
    2. Tilføje 900 μl af SOC medier (20 mg/mL trypton, 5 mg/mL gær extract, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4og 20 mM glukose) og Inkuber i 6-7 timer ved 37 ° C og 225 rpm.
    3. Seed 100 µL direkte fra blandingen og serielle fortyndinger (1/10 og 1/100), i LB-agar plader der indeholder 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyclin og 50 μg/mL kanamycin. Inkuber plader i mindst 48 timer ved 37 ° C.
    4. Vælg hvide kolonier, der er 2 mm i diameter, da blå kolonier mangler indsætte af interesse. Bruge et stereo mikroskop til at kontrollere, at hvide kolonier ikke indeholder nogen blå steder.
    5. Høste mindst tre enkelt kolonier og overføre dem til en 14-mL sterilt rør indeholdende 4 mL af LB media suppleret med 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyclin og 50 μg/mL kanamycin. Inkuber celler natten over (~ 16 h) ved 37 ° C og 250 rpm.
    6. Tage 1,5 mL af overnight kulturer og isoleres rekombinante bacmid DNA (der henvises til den supplerende fil 1 for detaljeret protokol). Gemme bacmid ved 4 ° C i op til to måneder.
      Bemærk: Forberede glycerol bestande af DH10Bac E. coli indeholdende bacmid DNA. Tage 300 μL af kultur og tilføje 200 μl af glycerol på 50% (endelige glycerol koncentration af 20%). Gemme alikvot ved-80 ° C indtil videre anvendelse.
    7. Kontrollere tilstedeværelsen af eTRPV1 i den rekombinante bacmid ved hjælp af PCR (der henvises til supplerende fil 1 for detaljeret protokol).
  2. Baculovirus
    Bemærk: Denne procedure, transfect Sf9 insekt celler i en 6-godt format. Alle beløb og mængder er givet på grundlag af pr. brønd. Undgå brug af antibiotika.
    1. Plade 1 x 106 Sf9 celler i 2 mL af insekt celle medier. Tillad celler til at knytte for mindst 45 min.
    2. Fortyndes 1 μg af rekombinante bacmid DNA i 100 μL af insekt celle medier. Bland forsigtigt.
    3. Fortynd 6 μL Transfektion reagens (TR) i 100 μL af insekt celle medier. Bland forsigtigt.
    4. Kombinere DNA og TR-løsninger (fra trin 3.2.2 og 3.2.3, henholdsvis). Bland forsigtigt og Inkuber i 30 min. ved RT.
    5. Tilføje 0,8 mL af insekt celle medier til DNA/TR blanding; Bland forsigtigt.
    6. Fjerne insekt celle medierne fra Sf9 cellerne og vaske en gang med 1 mL frisk medium.
    7. Fjerne vask medium og tilføje DNA/TR blanding (3.2.2 \u2012 3.2.5) til cellerne. Inkuber celler på 27 ° C i 5 h (uden agitation).
    8. Fjerne Transfektion blandingen og erstatte med 2 mL af insekt celle medier indeholdende 0,5% føtal bovint serum (FBS). Inkuber celler på 27 ° C i fem dage.
      Forsigtighed: Forhindre fordampning af celle medier ved at udfylde de tomme brønde med medier og dækker 6-godt plade med to lag af paraffin film.
    9. Overføre celle Kulturmedier i en 15 mL-centrifugerør. Isolere den første passage (P1) af viral lager ved at dreje røret på 8.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Overføre supernatanten til en ren 15 mL centrifugeglas og umiddelbart gemme det ved 4 ° C.
      Bemærk: Beskytte virus fra lys eksponering ved at dække tube med aluminiumsfolie.
    10. For den anden generation (P2) af viral stock, sætte en 25-mL suspension kultur af insekt cell media 1 x 106 Sf9 celler/mL indeholdende 2% ved FBS i en 125 mL kolbe (almindelig bunden og ventileret). Tilsættes 25 μL P1 virus til 25 mL kultur.
    11. Inkuber kultur på 27 ° C i 72 timer.
    12. For at høste P2 viral bestanden, overføre kulturen til en ny 50 mL tube og centrifugeres ved 8.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
    13. Overføre supernatanten til en ny 50 mL tube og umiddelbart gemme det ved 4 ° C.
      Bemærk: Beskytte virus fra lys eksponering ved at dække tube med aluminiumsfolie. Foretage et lille eksperiment for at titreres P2 virus/Sf9 ratio for optimal TRPV1 udtryk (henvises til supplerende fil 1 for en detaljeret protokol, afsnit 4 med titlen "Små eksperiment for P2 virus.")
    14. For store protein udtryk, sæt en 1-L Sf9 celle suspension kultur på 2 x 106 celler/mL i insekt celle media suppleret med 0,5% FBS i en 2,8-L borsilikatglas kolbe.
    15. Der tilsættes 1 mL af P2 virus materiel til 1-L kultur og inkuberes det på 27 ° C i 72 timer.
      Bemærk: På den tredje dag skal celle tæthed på ca 1,5-2,5 x 106 celler/mL.

4. eTRPV1 og Single-cystein Mutant rensning

  1. Membraner isolation28
    1. Høst 1-L insekt celle suspension kultur af spinning på 4.500 x g, 4 ° C i 20 min. vejer celle pellet (det forventes at være omkring 6-9 g).
    2. Resuspenderes celle i 25 mL iskold buffer A (36,5 mM saccharose, 2 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) og 50 mM Tris, pH 7,4) i nærværelse af proteasehæmmere (1 mM phenylmethyl sulfonyl fluor (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinin og 1 μg/mL pepstatin). Disaggregate celle klumper for at opnå en homogen suspension og rotere ved 4 ° C i 20 min.
    3. Bryde de celler ved hjælp af en manual (dounce væv grinder) eller en højtryks homogeniseringsapparat. Fjern celle debris ved centrifugering ved 8.000 x g i 20 min. ved 4 ° C.
      Bemærk: Hold mængden celler og rør på isen under hele processen.
    4. Indsamle supernatanten og centrifugeres ved 100.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. Kassér supernatanten og resuspenderes membran i en samlet maengde paa 20 mL iskold Buffer B (150 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES, pH 7,4), suppleret med proteasehæmmere (som i trin 4.1.2).
    5. Alikvot 20 mL af membran suspension i 50 mL rør og flash-freeze i flydende kvælstof. Gemme prøver på-80 ° C indtil videre anvendelse.
  2. Protein oprensning26,28
    1. Tø membran delprøver på is og tilsættes 3 mL n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (Bettinas) pr tube (200 mM bestand). Rotere rør i 2 timer ved 4 ° C.
    2. Centrifugeres prøve på 100.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. Indsamle supernatanten og tilsættes 1 mL ren våde amylose harpiks. Rotere blanding i 2 timer ved 4 ° C. Indlæse protein/amylose blandingen i tyngdekraften flow kromatografi kolonner.
      Forsigtighed: Tillad ikke harpiks tørre under vasker.
    3. Vask protein-bundet amylose harpiks med 10 gange bed mængderne af iskold Buffer C (150 mM NaCl, 10% glycerol, 50 mM HEPES, 0,5 mM Bettinas, 0,1 μg/mL asolectin, 0,5 mM TCEP, pH 7,4). Vask med 10 bed bind for iskold Buffer D (150 mM NaCl, 10% glycerol, 50 mM HEPES, 0,5 mM Bettinas, 0,1 μg/mL asolectin, pH 7,4).
      Bemærk: Før vask, degas Buffer D uden vaskemiddel eller lipider, udrensning med kvælstof. Efter afgasning, tilføje Bettinas og asolectin.
    4. Elueres eTRPV1 protein med 0,5 mL fraktioner, op til 5 mL, iskold afgasses Buffer D, suppleret med 20 mM maltose. Hvis det er muligt, udføre vasker og eluering ved 4 ° C.
    5. Kvantificere protein beløb ved måling af absorbans ved 280 nm bølgelængde.
      Bemærk: Denne protokol giver 0,5 til 1,0 mg protein pr. liter af kultur. Protein udbytte kan variere for hver eTRPV1 single-cystein mutant. For EPR og HJORTE eksperimenter, vokse 4 \u2012 6 L af kultur.

5. eTRPV1 Single-cystein Mutant Site-Directed Spin mærkning

  1. Koncentrere sig eTRPV1-holdige fraktioner ved hjælp af en centrifugal filterenhed (cutoff = 100 kDa) op til 2 \u2012 2,5 mg/mL for mærkning (cyklusser af 7.000 x g i 2 min. ved 4 ° C).
  2. Tilføje en 10-fold kindtand overskud (3 gange, hvert 30 min) af (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methyl methanethiosulfonate (MTSSL) spin etiket fra en 100-mM stamopløsning i DMSO til koncentreret protein (eTRPV1 monomer: MTSSL i 1:10 molære forhold) 17. holde reaktionen i mørke på RT i 1 h 30 min, efterfulgt af natten inkubation ved 4 ° C.
    Bemærk: I dette trin, MBP kunne fjernes ved at tilføje TEV protease under overnight spin-mærkning inkubation.
  3. Belastning spin-mærket eTRPV1 på en størrelse udstødelse kromatografi kolonne ekvilibreres i Buffer E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM Bettinas, pH 7,4), kontrolleres af en hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system. Indsamle fraktioner der indeholder eTRPV1 tetramer.
    Bemærk: Medtag ikke 10% glycerol i dette trin, da det reducerer rekonstitution effektivitet.
  4. Kvantificere protein beløb ved måling af absorbans ved 280 nm bølgelængde.
  5. Evaluere renheden af prøven ved at køre en SDS-PAGE gel (plet-fri gel, 4 \u2012 20%). Prøven er nu klar til spektroskopiske målinger i løsning og/eller proteoliposomes.

6. eTRPV1 Spin-mærket enkelt cystein Mutant rekonstitution

  1. Tørre 10 mg af asolectin ved hjælp af en rotationsfordamper under vakuum (≤100 mbar) i 1 time ved 40 ° C. For at gøre asolectin Liposomer, tilsættes 1 mL Buffer F (200 mM NaCl, 5 mM MOPS, pH 7,4) og sonikeres blanding i 15 min eller indtil prøven er homogen.
  2. Destabilisere Liposomer ved at tilføje Bettinas til en slutkoncentration på 2 mM og Inkuber i 30 min. ved RT.
  3. Koncentrere den mærket protein på 2 mg/mL og føje den til Liposomer ved hjælp af forholdet 1:5 protein/Lipid (mass: mass).
    Forsigtighed: Det er vigtigt at holde de førnævnte protein koncentrationer, da spin-mærkning effektivitet falder ved lave koncentrationer og høj protein kan udfældes.
  4. Tilføje Buffer F for at justere protein/Liposom blandingen til Bettinas kritiske micelle koncentration (CMC) og der inkuberes natten over ved 4 ° C med blid agitation.
  5. Dobbelte volumen af protein/Liposom blanding med Buffer F og fjern vaskemiddel ved at tilføje fortløbende tre delprøver af upolære polystyren adsorbent perler (30 mg, 50 mg og 80 mg) i 1-h intervaller med blid agitation på RT.
  6. Læg blandingen på et kolonnefilter (tyngdekraften flow kromatografi kolonne) at fjerne perlerne og overføre proteoliposomes blandingen til en ultracentrifuge tube. Centrifugeres prøver på 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Kassér supernatanten og resuspenderes i 30 μL af bufferen F.
    Bemærk: Prøver er klar til spektroskopisk analyse og injektion i Xenopus oocyter. Hvis prøverne ikke kan bruges samme dag, flash-fryse dem i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus oocyt Elektrofysiologi26,32
    1. Injicere 50 nL af forskellige fortyndinger af spin-mærket proteoliposomes i Xenopus oocyter som beskrevet i afsnit 2.2.
    2. Udføre TEVC målinger efter 12 h af injektion, som beskrevet i punkt 2.3.10.
  8. Gå videre til at udføre spektroskopiske målinger og analyse (afsnit 7).

7. RÅDYR og EPR Spectroscopies

  1. Dobbelt elektron-elektron resonans (RÅDYR) spektroskopi.
    1. Udføre HJORTE målinger i en pulserende EPR spektrometer opererer på Q-bånds frekvens (34 GHz) og er udstyret med en 10-W forstærker med den døde-time gratis fire-puls sekvens på 83° ved hjælp af producentens software33.
    2. Supplere 50 µM af vaskemiddel-renset eTRPV1 spin-mærket cystein mutanter i Buffer E (trin 5.5) med 30% (v/v) glycerol til cryo-beskyttelse.
    3. Læg prøven i et forseglet kvarts kapillarrør og spin i bunden af røret ved kort lav hastighed centrifugering (100 x g).
    4. Sted kapillarrør i flydende kvælstof til at fryse prøven. Prøverne kan opbevares ved dette punkt ved-80 ° C til senere målinger.
    5. Prøven anbringes direkte i mikrobølgeovn resonator og lad det igen reagensglasset ved-83° for 10 \u2012 20 min.
    6. Måle prøven ved hjælp af en fire-puls HJORTE standardprotokol, (π/2) mw1 – τ1 – (π) mw1 – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1 – τ2 – echo34. Puls længder (π/2) mw1 og (π) mw1 er 10 og 20 ns, henholdsvis, og 40 ns for (π) mw2. Angive hyppigheden adskillelse på 63 MHz.
      Bemærk: Primære HJORTE henfald data kan analyseres med en hjem-bygget software (f.eks. i Matlab) som antager en summen af Gaussisk distributioner til at beskrive Afstandene mellem spin etiketter19,35.
  2. Kontinuerte (CW) EPR spektroskopi
    1. Udføre CW EPR eksperimenter på RT på en X-band (9,6 GHz) spektrometer ved hjælp af fabrikanten software.
    2. Start instrumentet ved at dreje på vandet køler, konsollen og magnet strømforsyning. Softwaren er tilsluttet instrumentet, placere apparatet i tune og vente mindst 30 min. for det instrument til at varme op.
    3. Indlæse 20 µL af prøven fra trin 5.5 til en 25-µL glas kapillarrør ved hjælp af kapillaritet og forsegle enden af røret med fugemasse.
    4. Indlæse den kapillarrør i mikrobølgeovn hulrum og kritisk par resonator enten manuelt eller automatisk ved hjælp af funktionen auto-tune af softwaren.
    5. Indsamle de første afledte spectra standardinstrument betingelser: 100 kHz mikrobølgeovn graduering, 1,6 G magnetfelt graduering og 10 mW mikrobølgeovn magt.
    6. Dataanalyse og præsentation, rette spectra baggrund og normalisere dem ved at dividere spektrene af top til top værdi af det dobbelte integral.
    7. Bestemme spin-label mobilitet ved at måle inverse af den første afledte Absorptionsspektra (ΔHo-1)36centrale linjebredden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Funktionelle karakterisering af den minimale cystein-mindre TRPV1 konstruere (eTRPV1) og Single-cystein mutanter

Det første skridt mod spektroskopiske undersøgelser er ingeniør og karakterisere cystein-mindre protein konstruktioner (figur 2A) der er funktionelle og give biokemiske mængder af proteiner. eTRPV1 er funktionel, som bestemmes af Ca2 + imaging og TEVC (figur 2B-C). Desuden eTRPV1 leverer tilstrækkelige mængder af vaskemiddel-renset protein for EPR og HJORTE eksperimenter (0,5 - 1 mg pr. liter Sf9 celler)26. At indføre fælles cysteines i bestemt protein regioner kan påvirke deres funktion. Figur 2B viser nogle eksempler på single-cystein mutanter (E651C og A702C) på eTRPV1, der opfører sig som vilde type (WT), da deres fluorescens-intensiteten stiger, når TRPV1 agonist (f.eks., capsaicin) er tilføjet til eTRPV1-holdige HEK293 celler, som det fremgår af Ca2 + imaging26. På den anden side er A680C de typiske eksempel på en ikke-funktionel cystein mutant, som Fluorescens er umulig at skelne fra baggrunden. A680C mutant blev udelukket for yderligere analyse. Efter Ca2 + imaging eksperimenter, er single-cystein mutanter funktion testet ved hjælp af TEVC eller patch klemme til at evaluere deres biofysiske egenskaber. Figur 2 c viser, at mutanter sammenfatte den udadgående berigtigelse karakteristisk for TRPV1 når udfordret med pH 5, som bestemmes af TEVC26. Funktionel analyse af single-cystein mutanter er den første checkpoint før virksomheden proteinekspression og -oprensning protokoller.

Biokemiske karakterisering af eTRPV1 og Single-cystein mutanter

Rensning protokollen beskrevet ovenfor udbytter vaskemiddel-solubilized protein, som kan mærkes via cystein kovalente ændring (f.eks., fluorophores, spin-mærket [SL] methyl-methanethiolsulfonate) langs TRPV1 sekvens for spektroskopisk analyse. Minimal TRPV1 kanal, der indeholder cystein restkoncentrationer migrere som stabil og monodisperse arter (~ 13,6 mL), som bestemmes af størrelsen-udelukkelse kromatografi (figur 3). eTRPV1 og single-cystein spin-mærket mutanter (E651C-SL og A702C-SL) sammenfatte eluering profil og stabilitet kendetegnet af den minimale TRPV1 konstruktion (figur 3)26. Eluering profil kan variere mellem forskellige mutanter, som enkelt cysteines kan påvirke protein stabilitet. I nogle tilfælde formular mutanter aggregater; og en brøkdel af stikprøven kunne elueres på dødvolumen af kolonnen (8-9,5 mL), at reducere mængden af protein, der trækker som en tetramer (figur 3, nederste rød pil). I dette tilfælde, kan celle kultur diskenheder skaleres til at kompensere for protein tabt i den aggregerede fraktion, eller man kan udelukke denne mutant fra yderligere analyse og fortsætte med at teste den nærliggende rest. Andre eksempler er en udvidelse af den top, der svarer til tetramer. Vigtigste toppe bredere end 3 mL anbefales ikke til spektroskopisk analyse, da de indeholder multi-sprede arter. Biokemiske karakterisering af spin-mærket single-cystein mutanter er den anden checkpoint inden virksomhed rekonstitution og spektroskopisk analyse.

Funktionelle karakterisering af rekonstitueret Spin-mærket eTRPV1 Single-cystein mutanter

Fordi EPR og HJORTE signaler stole på udlæg i et Paramagnetiske spin-etiket til en cystein rester, er det vigtigt at kontrollere, om placeringen af spin-label ændrer protein funktion. Der er flere måder at teste for funktion efter erstatningsgodtgørelse spin-mærket protein, herunder planar lipid tolagede eksperimenter, patch klemme og TEVC. TEVC tillader evaluering af et stort antal spin-mærket kanaler samtidig optagelse makroskopisk strømninger. For at vurdere funktionaliteten af den spin-mærket single-cystein mutanter, er kanaler rekonstitueret i præformerede asolectin Liposomer. Under dette trin er det vigtigt at udelukke 10% glycerol, der er til stede i hele rensning, da glycerol formindsker effektiviteten af protein rekonstituering i Liposomer. Figur 4 viser en repræsentant resultat af A702C-SL TRPV1 rekonstitueres i asolectin Liposomer og microinjected i Xenopus oocyter. Som forventet, fremkalder pH 5 robust udadtil berigtigende strømninger37 , der blokeres af fælles anvendelse af TRPV1 antagonist capsazepine (CPZ, blå trace)26. Mutanter, der ikke bevarer funktionalitet efter spin mærkning og rekonstitution bør udelukkes fra yderligere analyse. Funktionelle karakterisering af rekonstitueret spin-mærket single-cystein mutanter er den tredje checkpoint inden virksomhed spektroskopisk analyse.

Strukturelle dynamik af Spin-mærket eTRPV1 mutanter overvåges af CW-EPR og HJORTE

Nitroxide spin etiketter er følsomme over for det omgivende miljø og fleksibilitet af protein rygraden som etiketten er vedhæftet17. Derfor, CW-EPR giver mulighed for bestemmelse af den dynamiske regime af en given spin-mærket cystein; nemlig, positioner udsat for den vandige medier eller membranen er mere dynamisk end dem, der er begrænset til protein-protein interaktioner17. Fig. 5A viser holdninger, Glu651, Ile679 og Ala702 i TRPV1 valgt at overvåge mobilitet parametre. For at beregne parameteren mobilitet af spin etiket sonde, beregner en inverse af central line bredde af de første afledte Absorptionsspektra (figur 5B, sort linje ΔHo−1). For eksempel, viser E651C-SL (figur 5B) en røde linje form og mobilitet værdi (0,24) almindeligt forekommende på dynamisk positioner på membran interface26. På den anden side I679C-SL og A702C-SL udstiller bredere spektre (Se punkterede linjer) og et fald i mobiliteten værdier (0,16 og 0,18, henholdsvis; Figur 5B) 26 der er i overensstemmelse med deres begrænsede omgivende miljø (protein-protein), ifølge cryo-EM struktur1.

Figur 5 c viser spektre af spin-mærket TRPV1 mutanter efter rekonstituering i asolectin Liposomer. Som forventet, har de dynamiske funktioner af spektre for E651C-SL og A702C-SL ikke ændret efter rekonstitution, som deres form og mobilitet værdier er den samme i løsning som en membran miljø26. På den anden side illustrerer I679C-SL en støjende spektrum; Derfor bliver lavere (blå pil) og højere (rød pil) felt komponenter mindre indlysende. Støjende spectra er ikke normalt ønsket, som de har tendens til at undervurdere mobilitet af positionen spin-mærket. Dette spektrum type kunne være produktet af ineffektive protein rekonstitution snarere end under-mærkning, da I679C-SL signal i løsning er robust.

HJORTE data er summen af oscillerende, sinusformet signal henfalder indeholdende oplysninger om afstand fordelingen af interagerende spin-etiketter38,39. Periode og kompleksitet henfald afspejler direkte den underliggende afstand distribution. Afstand distribution består af antallet af strukturelle komponenter til stede i prøven og deres lidelse. Derfor, den tid-domæne signal stammer fra den dipolære kobling mellem ikke-fast, Fjern spin etiketter i løsning, som normalt forårsager en eksponentiel baggrund henfald, andrigidly kombineret spins inden for den samme protein19,40. Specifikt, tillader HJORTE bestemmelse af intra-protein langtrækkende afstande (20-70 Å) mellem spin-mærket restkoncentrationer19. Figur 6 viser signal forfald og den tilsvarende afstand distribution af E651C-SL. Fordelingen af Glu651 viser tre toppe svarende til 24, 36 og 58 Å26. De to kortere afstande er i overensstemmelse med den lukkede TRPV1 struktur (23 og 32 Å for Cβ-Cβ afstande, henholdsvis)1, mens den tredje 58 Å peak måske svarer til protein sammenlægning.

Figure 1
Figur 1. Eksperimentelle disposition. Diagram af eksperimentelle dispositionen skal udtrykke, rense og rekonstruere eTRPV1 EPR og HJORTE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Funktionelle karakterisering af eTRPV1 og single-cystein mutanter. (A) skematisk repræsentation af TRPV1 konstruktioner bruges til spektroskopisk analyse (eTRPV1: cystein-mindre TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 celler udtrykker WT TRPV1, eTRPV1 og mutanter (lastet med Ca2 +-følsomme Fluo-4-AM) blev analyseret for capsaicin (10 µM)-fremkaldte svar ved hjælp af fluorescens Ca2 + billeddannelse. Farvelinjen indikerer relative ændringer i fluorescens intensitet, med blå og rød betegner de laveste og højeste cytoplasmatisk Ca2 +, henholdsvis. Hvide søjle repræsenterer 100 µm. (C) venstre, én subunit (S5, pore helix, S6 og TRP domæne) af TRPV1 tetramer struktur fremhæve single-cystein restkoncentrationer (gule kugler) indført langs kanalrækkefølgen. Højre, aktuel spænding relationer bestemt af TEVC optagelser fra Xenopus oocyter udtrykker WT TRPV1, eTRPV1 og single-cystein mutanter udfordret med pH 5. Baggrund strømme (bkgrd). Ændret fra den oprindelige figur26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Biokemiske karakterisering af eTRPV1 og single-cystein mutanter.
Størrelse-udelukkelse kromatografi profil af Bettinas-solubilized eTRPV1 og single-cystein spin-mærket mutanter efter proteinekspression og -oprensning fra Sf9 celler. Indsatser: SDS-PAGE gel viser de monomere eTRPV1-MBP fusion protein (ændret fra den oprindelige figur26). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Funktionelle karakterisering af en spin-mærket eTRPV1 mutant.
Aktuel spænding relationer bestemt af TEVC fra Xenopus oocyter microinjected med proteoliposomes indeholdende spin-mærket A702C udfordret med pH 5 (rød) og blokeret af capsazepine (CPZ, blå: 40 µM). Baggrund strømme (bkgrd). Ændret fra den oprindelige figur26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Mobiliteter af spin-mærket eTRPV1 mutanter bestemmes af CW-EPR.
(A) to underenheder (S5, pore helix, S6 og TRP domæne) af TRPV1 tetramer struktur fremhæve aminosyrerester (gule kugler) aftestede gennem site-directed spin-mærkning spectroscopies. (B) første afledede af CW EPR spektre af spin-mærket cystein mutanter i Bettinas-løsning. (C) første afledede af CW EPR spektre af spin-mærket cystein mutanter rekonstitueres i asolectin Liposomer. Spectra blev indhentet ved pH 7,4 (lukkede tilstand). ΔHo−1 angiver omfanget af parameteren mobilitet. Den sorte stiplede linje fremhæver udvidelse af spektre. Blå og røde pile betegne de lave og høje område komponenter af spektre, henholdsvis. EPR spectra var normaliseret til det samlede antal spin etiketter. Ændret fra den oprindelige figur26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Afstand distribution af en eTRPV1 mutant i vaskemiddel.
HJORTE echo (A) og afstand distribution (B) af spin-mærket mutant E651C; en sum af Gaussians var monteret til HJORTE data. P(r) betegner afstanden distribution af spin par41. Spectra blev indhentet ved pH 7,4 (lukkede tilstand). Ændret fra den oprindelige figur26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nuværende teknologier til proteinekspression og -oprensning af pattedyr Membranproteiner har gjort det muligt at opnå tilstrækkelige mængder af protein i spektroskopiske studier14,15,16,42. Her, har vi tilpasset disse teknologier for at udtrykke, rense, rekonstruere og udføre spektroskopiske analyser i TRPV1.

Blandt de afgørende trin i protokollen, nedenfor er dem, vi har foretaget fejlfinding for TRPV1 og der kan justeres for andre proteiner. Ændre DNA-sekvens for at generere en skabelon, der giver 0,5 - 1 mg/mL af vaskemiddel-renset protein; skabeloner, der giver mindre end 0,5 mg/mL af protein er udfordrende, da vokser mere end 6 liter i insekt celler kulturer ville være påkrævet per mutant. Protein skal koncentreres, ikke mindre end 2 mg/mL, uden TCEP at øge spin-mærkning effektivitet. Mærkning på lavt proteinindhold koncentrationer og/eller tilstedeværelse af TCEP vil spor generere støjende EPR spektre. Selv om proteinerne opbevares ved 4 ° C under rensningen, er det vigtigt at udføre spin mærkning på RT for at forbedre effektiviteten. Under rensning og mærkning, forbedrer glycerol protein stabilitet; men det skal være helt fjernet før rekonstitution, da det nedsætter mængden af protein i Liposomer og genererer støjende EPR spektre. Faldende vaskemiddel koncentrationen under CMC er en fælles praksis under rekonstitution; men TRPV1 har tendens til at udfælde før indarbejde i Liposomer. For at løse dette problem, blev TRPV1 inkuberet natten over med præformerede Liposomer præcis på CMC at undgå protein nedbør og øge mængden af kanaler i proteoliposome forberedelse. TRPV1 er fuldt funktionel i asolectin Liposomer28; Derfor, det var den foretrukne lipid blanding anvendes i denne protokol. Det er imidlertid vigtigt at bestemme lipid sammensætning, hvor et bestemt protein er funktionel (fxkolesterol), før du fortsætter med spektroskopiske analyser.

Spektroskopiske metoder såsom EPR og HJORTE præsentere flere begrænsninger, herunder: ændringer i protein skabelon sekvens, der forbedrer biokemiske stabilitet kan have konsekvenser i funktion26; indførelse af ikke-hjemmehørende enkelt cysteines samt etiketten spin kan ikke tolereres godt i visse områder af protein; at opnå store mængder af mærket proteiner; og begrænset konformationelle ændringer ved fastsættelsen af afstande med HJORTE i vaske-og rengøringsmidler micelles. Men den sidstnævnte begrænsning kan overvindes ved at indsamle spektre, Q-bånds frekvens af TRPV1 mutanter rekonstitueres i nanodiscs19,43. Ikke desto mindre kommer fordel af disse tilgange hovedsageligt fra mønster af global dynamik, tilgængelighed og afstande mere end fra den absolutte værdi af en given stilling.

Temperatur følsomhed er en af de mest fascinerende og mindre forstået gating mekanismer; Derfor ville bruger spektroskopiske metoder, det være muligt at afgøre, hvordan Membranproteiner oversætte termisk energi i protein bevægelse i et miljø med membran. Vigtigere er, ville det være udfordrende at bestemme strukturelle ændringer under termisk gating ved hjælp af røntgenkrystallografi eller cryo-EM, som disse teknikker er udført på frostgrader. Fremtidige eksperimenter vil være rettet mod bestemmelse TRPV1 konformationelle ændrer kompatibel med termisk-afhængige gating bruger EPR, HJORTE eller fluorescens. EPR spektroskopi har givet detaljerede mekanistiske modeller for prokaryote Ionkanaler, så vi forventer, at vi ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet ovenfor, vil få indblik i mekanismerne i den aktivisering og stof-binding af pattedyr Ionkanaler ved hjælp af spektroskopiske metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er meget taknemmelige for Dr. H. Mchaourab for at give adgang til de EPR og HJORTE spektrometre og Dr. T. Rosenbaum for at give den fuld længde cystein-mindre TRPV1 plasmid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

Biokemi sag 137 forbigående receptor potentielle vanilloid 1 TRPV1 rensning rekonstitution spin-mærkning EPR spektroskopi HJORTE spektroskopi
Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter