Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Abstract

Polymodale ionenkanalen transduce meerdere stimuli van verschillende aard in allosteric wijzigingen; deze dynamische conformaties zijn uitdagend te bepalen en blijven grotendeels onbekend. Met recente vooruitgang in single-deeltje cryo-Elektron microscopie (cryo-EM) afwerpende licht op de structurele kenmerken van de agonist bandplaatsen en het mechanisme van de activering van verschillende ionenkanalen, is het podium ingesteld voor een dynamische analyse van hun gating mechanismen met behulp van spectroscopische benaderingen. Spectroscopische technieken zoals elektron paramagnetisch resonantie (EPR) en dubbele elektron-elektron resonantie (herten) zijn hoofdzakelijk beperkt tot de studie van prokaryote ionenkanalen dat gezuiverd kan worden in grote hoeveelheden. De eis van grote hoeveelheden van functionele en stabiele membraaneiwitten heeft belemmerd de studie van zoogdieren ionenkanalen met behulp van deze benaderingen. EPR en herten bieden vele voordelen, met inbegrip van bepaling van de structuur en dynamische veranderingen in de mobiele eiwit regio's, zij het op een lage resolutie, die moeilijk wellicht te verkrijgen door middel van röntgendiffractie of cryo-EM, en toezicht omkeerbare gating overgang (d.w.z., gesloten, open, gesensibiliseerde personen en ongevoelig). Wij bieden hier protocollen voor het verkrijgen van milligram van functionele wasmiddel-ontbindend voorbijgaande receptor potentieel catie kanaal onderfamilie V lid 1 (TRPV1) die kunnen worden gelabeld voor EPR en herten spectroscopie.

Introduction

Met recente vooruitgang in single-deeltje cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), zijn zoogdieren ion kanaal structuren verkregen in een buitengewone tempo. Met name hebben structurele studies van Polymodale ionenkanalen, zoals de voorbijgaande receptor potentiële vanilloid 1 (TRPV1), verstrekt verder begrip van de activering mechanismen1,2,3, 4 , 5. dynamische informatie over ionenkanalen ingebed in de omgeving van een membraan is echter vereist om te begrijpen hun Polymodale gating en drug-bindende mechanismen.

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) en dubbele elektron-elektron resonantie (herten) spectroscopies hebben verschaft enkele van de meest definitieve mechanistische modellen voor ion kanalen6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. deze benaderingen zijn voornamelijk beperkt tot het onderzoek van prokaryote en archeal ion kanalen die opbrengst van een grote hoeveelheid eiwitten wasmiddel-gezuiverd wanneer overexpressie bij bacteriën. Met de ontwikkeling van eukaryotische membraan eiwitten productie in insect en zoogdiercellen voor functionele en structurele karakterisatie14,15,16is het nu mogelijk om te verkrijgen biochemische hoeveelheid wasmiddel-gezuiverd eiwitten voor spectroscopische onderzoeken.

De EPR en herten signalen voortkomen uit een label paramagneticspin (SL) (dat wil zeggen, methanethiosulfonate) zijn gekoppeld aan een single-cysteine residu in het eiwit. De spin-labels verslag drie soorten structurele informatie: beweging, toegankelijkheidsopties en afstanden. Deze informatie kan bepalen of residuen zijn begraven in het eiwit of worden blootgesteld aan de membraan of het waterige milieu in het apo en ligand-gebonden staten13,17,18,19. In het kader van een hoge resolutie structuur (indien beschikbaar), geven de EPR en herten gegevens een verzameling van beperkingen voor het afleiden van dynamische modellen in hun oorspronkelijke omgeving observatie van omkeerbare gating overgang (d.w.z., gesloten, open, tijdens gesensibiliseerde personen en ongevoelig). Bovendien, flexibele regio's die moeilijk wellicht te bepalen door middel van röntgendiffractie of cryo-EM kon worden verkregen met behulp van deze milieu datasets toewijzen van secondaire structuren, alsmede de locatie in de eiwit-20. Cryo-EM structuren verkregen in lipide nanodiscs verstrekt waardevolle informatie over de gating van ion kanalen3,21,22,23,24, 25; spectroscopische benaderingen kunnen evenwel dynamische informatie van conformationele Staten (bijvoorbeeld, thermische wijzigingen) die moeilijk wellicht te bepalen met behulp van cryo-EM.

Veel moeilijkheden moeten worden overwonnen om uitvoering van EPR en herten, met inbegrip van gebrek aan eiwitfunctie bij het verwijderen van alle cysteïne residuen (bijzonder rijk aan zoogdieren kanalen), laag eiwitgehalte opbrengst, eiwit instabiliteit tijdens het zuiveringsproces ongehinderd en na het labelen van de spin , en aggregatie van eiwitten in schoonmaakmiddel of liposomen. Hier, hebben wij ontworpen protocollen bij deze kritische obstakels en herten en EPR spectra informatie voor een zoogdieren sensorische receptoren hebben verkregen. Het doel hier is om te beschrijven van methoden voor de expressie, zuivering, labelen en reconstructie van een functionele rat voor minimale cysteïne-minder TRPV1 (eTRPV1) voor spectroscopische analyses bouwen. Deze methode is geschikt voor deze membraaneiwitten die houden hun functie ondanks de verwijdering van residuen van cysteïne of die cysteïne vormen bisulfide-bindingen bevatten. Deze collectie van protocollen kan worden aangepast voor de spectroscopische analyse van andere zoogdieren ionenkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TRPV1 mutagenese

Opmerking: Een minimale TRPV1 constructie voor spectroscopische analyse26 werd gebouwd vanaf de full-length cysteïne-minder kanaal TRPV127 met behulp van de polymerase-kettingreactie (PCR) methode (Figuur 1). Deze cysteïne-minder minimale TRPV1 constructie (hierna aangeduid als eTRPV1 hierna) bestaat uit residuen 110-603 en 627-764. eTRPV1 werd gekloond in pMO (een pcDNA3.1 gebaseerde vector) voor functionele analyse en een recombinant donor vector28 met 8 x histidine-maltose-bindend-proteïne (MBP)-tabak etch virus (TEV) voor expressie en zuivering (figuur 2A). eTRPV1 single-cysteïne mutanten werden gegenereerd met behulp van plaats-geleide mutagenese. Vector- en kanaal sequenties zijn opgegeven de aanvullende bestand 1: aanvullende methoden.

  1. Mutagenese inleidingen met onlinetools29ontwerpen.
  2. Meng in een 0,2 mL-buis: 5 μl van 10 x reactie buffer, 1 μL van dNTP mix (100 mM), 1 μL van 10 μM voorwaartse en omgekeerde oligonucleotides, 1 μL van 100 ng/μL eTRPV1 sjabloon DNA26, 1.5 μL van DMSO, 1 μL van mutagenese enzym , en 38.5 μL van gedeïoniseerd water. Draai het mengsel vóór het plaatsen van de buizen in de thermocycler.
  3. Uitvoeren van PCR Mutagenese.
    1. Uitvoeren van (a) denaturatie bij 95 ° C gedurende 2 min, (b) denaturatie bij 95 ° C gedurende 20 s, (c) gloeien bij 60 ° C gedurende 10 s, en (d) rek bij 68 ° C gedurende 4 minuten (30 s per 1 kb). Herhaalt u stap b tot en met d voor 18 cycli, en vervolgens uitvoeren van rek bij 68 ° C gedurende 5 minuten, en onderhouden van de reactie bij 4 ° C tot verder gebruik.
  4. Voeg 2 μL van Dpnik enzym tot de reactie; Meng en vervolgens Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  5. Uitvoeren van de transformatie
    1. Ontdooi de bevoegde cellen E. coli op ijs.
    2. Om een vooraf gekoelde 14mL steriele buis, voeg 75 μL van bevoegde cellen en 10 μL van Dpnik behandelde PCR mengsel. Meng voorzichtig.
    3. Incubeer reactie op ijs voor 30 min. behouden de buis bij 42 ° C gedurende 45 s en vervolgens onmiddellijk op ijs voor 2 min. plaat het mengsel op Luria Bouillon (LB)-agarplaat met carbenicillin (0,2 mg/mL). Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C.
    4. Oogst van ten minste drie afzonderlijke kolonies van de plaat en elk in 4 mL LB met carbenicillin (0,2 mg/mL) met behulp van een steriele buis van 14 mL beënten. Incubeer culturen 's nachts bij 37 ° C staan en schud nu op 250 toeren per minuut.
    5. Spin down's nachts culturen bij 8.000 x g gedurende 10 minuten en haal DNA volgens de instructies van verkrijgbare mini voorbereiding kits.
    6. Controleer of de aanwezigheid van single-cysteïne mutanten door standaard geautomatiseerde DNA-sequentiebepaling (Zie Tabel van materialen).

2. functionele analyse van eTRPV1 en Single-cysteïne mutanten

  1. HEK293 cel lijn transfectie 30
    1. Cultuur HEK293 cellen in 6 - goed platen in hoge glucose medium (DMEM) 2 mL per putje (37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid). HEK293 cellen die 70 \u2012 80% heuvels voor te bereiden.
    2. De transfectie mengsel in twee aparte 1.5-mL micro-centrifuge buizen voor te bereiden.
      1. Voor reactie A, voeg toe 0,5 µg eTRPV1 of cysteïne mutant-bevattende pMO aan 250 µL van minimale essentiële medium (bijvoorbeeld Opti-MEM). Reactie B, voegt toe 3 µL van het transfectiereagens aan 250 µL van minimale essentiële medium. Incubeer elke reactie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      2. Meng reacties A en B met een pipet 1 mL. Incubeer het mengsel gedurende 45 minuten op RT.
    3. Verwijder 500 µL van voedingsbodems uit de heuvels van 70-80% goed en voeg 500 µL van het reactiemengsel. Opslaan platen 's nachts voor Ca2 + imaging (37 ° C, 5% CO2en luchtvochtigheid van 95%).
  2. CA2 + beeldvorming in de HEK293 cellen 30
    1. 12-mm diameter glas coverslips met ethanol en water schoon en plaats ze in een 24-well-plaat.
    2. Voeg 75 µL van poly-l-lysine in het midden van elke dekglaasje aan en sla de plaat voor 45 min (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%).
    3. Verwijder de overtollige poly-l-lysine en wassen coverslips drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te verwijderen van alle overgebleven.
    4. Zodra de coverslips klaar zijn, gaat u verder met het loskoppelen van de cellen van de 6-well-plaat.
    5. Verwijder het medium en voeg 500 µL van warme PBS (37 ° C) voor het wassen.
    6. Verwijderen van PBS, voeg 500 µL van trypsine en incubeer gedurende 1 minuut.
    7. Voeg 500 µL van warme voedingsbodems (37 ° C) te stoppen met de reactie van de spijsvertering en meng met de pipet; Vermijd vormen van bubbels. Wijzig indien nodig, de concentratie van de cel deze resuspensie met meer voedingsbodems verdunnen.
    8. 250 µL van transfected cellen van de HEK293 (70% heuvels) plus 250 µL van voedingsbodems (500 µL eindvolume per putje) op de vooraf behandelde coverslips zaad en laat ze settelen (voor bevestiging) voor 1-2 h in de incubator (37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
    9. In de tussentijd bereidt een oplossing laden door toevoeging van 0,02% pluronic zuur en 1 µM Fluo-4-AM aan een Ringer's buffer. Meng de oplossing goed.
    10. Verwijder de HEK293-cultuur-media uit de put en voeg 500 µL van het laden oplossing. Incubeer de cellen gedurende 1 uur (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 95%). Wassen van de cellen Fluo-4-loaded tweemaal met warme Ringer's buffer.
    11. Plaats een dekglaasje aan met geladen cellen in een petrischaal 10-mm in een stadium van de Microscoop (met behulp van een 10 X doelstelling; 494 nm excitatie en 506 nm emissie) voor het uitvoeren van intracellulaire Ca2 + metingen.
    12. Meten van veranderingen in de intensiteit van de fluorescentie na zoogdierlevercellen respectieve liganden (bijvoorbeeld, 10 μM capsaïcine) met behulp van commercieel verkrijgbare software (Zie Tabel van materialen).
  3. mRNA en Xenopus laevis eicellen voorbereiding 30
    1. Linearize eTRPV1 en single-cysteïne mutanten-bevattende pMO met Pmeik gedurende 1 uur bij 37 ° C. Schone DNA volgens de instructies van verkrijgbare reiniging kits.
    2. Gebruik gelineariseerde en gereinigd ANI's om te synthetiseren afgetopte RNAs met een commercieel beschikbare kit compatibel met T7 RNA-polymerase.
    3. Schone afgetopte RNAs volgens verkrijgbare reiniging kits. Het bedrag van RNA te kwantificeren door het meten van de extinctie bij 260 nm golflengte.
    4. Overdracht 5 \u2012 10 mL X. laevis eicellen (Los verkrijgbaar) in een conische buis van 50 mL met 20 mL van de oplossing van de ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2; pH 7.4) met 1 mg/mL collagenase en nutate voor 50 min op RT.
    5. Spoel de eicellen in de ND96 totdat de oplossing duidelijk is; toevoegen van verse collagenase en schud gedurende 30 minuten op RT. onderzocht de eicellen onder een stereo microscoop en de spijsvertering te stoppen wanneer de folliculaire buitenlaag (glanzende laag met rode bloedvaten) afwezig is in de meeste eicellen (90%). Spoel eicellen in ND96 totdat de oplossing duidelijk is.
    6. Overdracht eicellen tot een koker 50 mL polystyreen met ND96 plus 1 mM CaCl2 en schud gedurende 1 h. onder-verteerd eicellen zal vasthouden aan de polystyreen buis.
    7. Wassen van eicellen met ND96 plus 1 mM CaCl2 en supplement oplossing met 50 µg/mL gentamicine en 50 µg/mL tetracycline.
      Opmerking: Bescherm tetracycline-bevattende oplossingen tegen blootstelling aan licht.
    8. Selecteer grote eicellen zonder beschadigde membranen en het weergeven van een duidelijke scheiding tussen de dierlijke en plantaardige Polen. Laat eicellen herstellen voor 4 uur vóór microinjection bij 16 ° C.
    9. Gebruik glas pipetten (OD: 1.11 mm, I.D.: 0,5 en lengte 8,8 cm) te injecteren van 1-5 ng van mRNA van eTRPV1 en één-cysteïne mutanten in eicellen met behulp van een systeem van nanoliter-injector (46 nL/s) en een stereomicroscoop (2 X vergroting). Bewaren van eicellen bij 16 ° C in ND96 aangevuld met CaCl2 en antibiotica (gentamycine/tetracycline 1 x).
    10. Meten macroscopische stroom met behulp van een twee-electrode spanning-clamp (TEVC) acquisitie systeem31na 72 uur.
    11. Trekken van borosilicaatglas pipetten (0.3-MΩ) en vul ze met 3 M KCl.
    12. Plaats de oöcyt in de zaal van de opname met behulp van een precisiepipet overdracht en perfuse van de bad-oplossing (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA en 10 mM HEPES oplossing; pH 7.4) bij lage snelheid.
    13. Dompel beide elektroden in de oplossing van het bad te passen hun Pipetteer offsets. Duw voorzichtig de pipet elektroden (borosilicaatglas pipetten; Od: 1,5 mm, I.D.: 1.10 en lengte 10 cm) in de oöcyt totdat een kleine inspringing wordt waargenomen onder een stereomicroscoop (vergroting 2 X), evenals een verandering in de membraanpotentiaal.
    14. De versterker instellingen wijzigen voor het opnemen van mode en maatregel macroscopische stromingen terwijl houdende toepassing van een spanning-clamp helling van -80 tot + 80 mV voor 1 s. Load de perfusie-systeem met de oplossing die is gebruikt stap 2.3.12 met een pH van 7,4 (als een besturingselement) en met een pH van 5 eTRPV1 activiteit controleren.

3. het genereren van de recombinante Bacmid en Baculovirus voor eiwit expressie

  1. Bacmid
    1. Transformeren van 100 μl van het DH10Bac E. coli bevoegde cellen met 7.5 ng van de recombinante donor vector met eTRPV1 en/of single-cysteïne mutanten.
    2. Toevoegen van 900 μL van SOC media (20 mg/mL trypton, 5 mg/mL gist extract, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4en 20 mM glucose) en incubeer gedurende 6-7 uur bij 37 ° C en 225 rpm.
    3. Zaad van 100 µL rechtstreeks van het mengsel en van seriële verdunningen (1/10 en 1/100), in LB-agar platen met 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicine, 10 μg/mL tetracycline en 50 μg/mL kanamycine. Incubeer de platen gedurende ten minste 48 uur bij 37 ° C.
    4. Selecteer wit kolonies die 2 mm diameter, omdat blauw kolonies het invoegen van belang ontbreekt. Gebruik een stereomicroscoop om te controleren dat witte kolonies geen blauwe plekken bevatten.
    5. Oogst van ten minste drie afzonderlijke kolonies en ze vervolgens overbrengen naar een 14-mL steriele buis met 4 mL van LB-media aangevuld met 10 μg/mL tetracycline, 7 μg/mL gentamicine en kanamycine van 50 μg/mL. Incubeer de cellen 's nachts (~ 16 h) bij 37 ° C en 250 rpm.
    6. Neem 1,5 mL van de overnachting culturen en isoleren recombinante bacmid DNA (verwijzen naar de aanvullende bestand 1 voor gedetailleerde protocol). Bewaar de bacmid bij 4 ° C voor maximaal twee maanden.
      Opmerking: Bereiden de glycerol voorraden van DH10Bac E. coli met de bacmid van DNA. Neem 300 μL van cultuur en voeg 200 l glycerol op 50% (laatste glycerol concentratie van 20%). Het bewaren van het afgepipetteerde deel bij-80 ° C tot verder gebruik.
    7. Controleer of de aanwezigheid van eTRPV1 in de recombinante bacmid met behulp van PCR (verwijzen naar aanvullende bestand 1 voor gedetailleerde protocol).
  2. Baculovirus
    Opmerking: Voor deze procedure transfect Sf9 insect cellen in de indeling van een 6-well. Alle bedragen en volumes worden gegeven op basis van de per-well. Vermijd het gebruik van antibiotica.
    1. 1 x 106 Sf9 cellen in 2 mL zuiver insect cel media plaat. Toestaan dat cellen koppelen voor minstens 45 min.
    2. Verdunnen 1 μg van recombinante bacmid DNA in 100 μl van insecten cel media. Meng voorzichtig.
    3. Verdun 6 μL van transfectiereagens (TR) in 100 μl van insecten cel media. Meng voorzichtig.
    4. Combineren van het DNA en TR-oplossingen (van stappen 3.2.2 en 3.2.3, respectievelijk). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 min op RT.
    5. 0,8 milliliters insect cel media toevoegen aan het mengsel van de DNA/TR; Meng voorzichtig.
    6. Verwijder het medium van de insecten cel van de Sf9 cellen en een keer wassen met 1 mL verse voedingsbodem.
    7. Het wassen-medium verwijderen en toevoegen van DNA/TR mengsel (3.2.2 \u2012 3.2.5) aan de cellen. Incubeer de cellen bij 27 ° C gedurende 5 h (zonder agitatie).
    8. Verwijder de transfectie mengsel en vervang met 2 mL insect cel media met 0,5% foetale runderserum (FBS). Incubeer de cellen bij 27 ° C gedurende vijf dagen.
      Let op: Verdamping van de media van de cel door te vullen de lege putten met media en die betrekking hebben op de 6-well plaat met twee lagen paraffine film voorkomen.
    9. Breng de voedingsbodems cel in een centrifugebuis van 15 mL. De eerste passage (P1) van virale voorraad isoleren door het draaien van de buis bij 8.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Het supernatant overbrengen in een centrifugebuis schoon 15 mL en onmiddellijk opslaan bij 4 ° C.
      Opmerking: Beschermen het virus tegen blootstelling aan licht door die betrekking hebben op de buis met aluminiumfolie.
    10. Voor de tweede generatie (P2) van virale voorraad, zet een 25 mL schorsing cultuur van insecten cel media bij 1 x 106 Sf9 cellen/mL met 2% FBS in een maatkolf van 125 mL (platte bodem en ontlucht). 25 μL van de P1-virus aan de cultuur van 25 mL toevoegen.
    11. Incubeer de cultuur bij 27 ° C gedurende 72 uur.
    12. Verkrijgen van de virale voorraad van P2, overdracht van de cultuur tot een nieuwe 50-mL koker en Centrifugeer het bij 8.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
    13. Het supernatant overbrengen in een nieuwe 50 mL-buis en onmiddellijk opslaan bij 4 ° C.
      Opmerking: Beschermen het virus tegen blootstelling aan licht door die betrekking hebben op de buis met aluminiumfolie. Uitvoeren van een kleinschalige experiment om de verhouding tussen van P2, virus/Sf9 voor optimale TRPV1 expressie Titreer (verwijzen naar aanvullende bestand 1 voor een gedetailleerde protocol, sectie 4 met een adellijke titel "Kleinschalige experiment voor P2 virus.")
    14. Voor grootschalige eiwit expressie, vastgesteldop de cultuur van de cel schorsing voor een 1-L-Sf9 2 x 106 cellen/mL in insect cel media aangevuld met 0,5% FBS in een maatkolf van 2.8-L borosilicaat glas.
    15. Voeg 1 mL P2 virus voorraad met de 1-L-cultuur en Incubeer het bij 27 ° C gedurende 72 uur.
      Opmerking: Op de derde dag, celdichtheid dient bij ongeveer 1.5 tot 2.5 x 106 cellen/mL.

4. eTRPV1 en Single-cysteïne Mutant zuivering

  1. Membranen isolatie28
    1. Oogst de 1-L insect schorsing celcultuur door spinnen bij 4.500 x g, 4 ° C, voor 20 min. wegen de cel pellet (het naar verwachting ongeveer 6-9 g).
    2. Resuspendeer de pellet cel in 25 mL van de ijskoude Buffer A (sacharose 36.5 mM, 2 mM tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP), en 50 mM Tris; pH 7.4) in aanwezigheid van proteaseinhibitors (1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinin en 1 μg/mL pepstatin). Gedesag cel bosjes voor het verkrijgen van een homogene suspensie en draaien bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
    3. Breek de cellen met behulp van een handleiding (dounce weefsel grinder) of een hoge druk homogenizer. Verwijderen van het puin van de cel door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
      Opmerking: Houd de lysed cellen en buizen op ijs tijdens het hele proces.
    4. Verzamelen van de bovendrijvende substantie en centrifuge op 100.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet membraan in een totaal volume van 20 mL ijskoud Buffer B (150 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES; pH 7.4), aangevuld met proteaseinhibitors (zoals in stap 4.1.2).
    5. Aliquot 20 mL membraan suspensie in 50 mL tubes en flash-freeze in vloeibare stikstof. Bewaren monsters bij-80 ° C tot verder gebruik.
  2. Eiwit zuivering26,28
    1. Ontdooi de membraan aliquots op ijs en voeg 3 mL n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) per buis (200 mM stock). Draai de buis gedurende 2 uur bij 4 ° C.
    2. Centrifugeer het monster bij 100.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Verzamelen van het supernatant en voeg 1 mL van de schone natte amylose hars. Draai het mengsel gedurende 2 uur bij 4 ° C. Het mengsel van eiwit/amylose in zwaartekracht stroom Chromatografiekolommen laden.
      Let op: Laat het hars drogen tijdens wasbeurten niet.
    3. Wassen van de eiwit-gebonden amylose hars met 10 keer de kolomvolumina van ijskoude Buffer C (150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 0.5 mM DDM, 0.1 μg/mL asolectin, 0,5 mM TCEP van 10% glycerol, pH 7.4). Wassen met 10 kolomvolumina van ijskoude Buffer D (150 mM NaCl, 10% glycerol, 50 mM HEPES, 0.5 mM DDM, 0.1 μg/mL asolectin, pH 7.4).
      Opmerking: Voorafgaande bij wassen, ontgas Buffer D zonder schoonmaakmiddel of lipiden, verwijderen met stikstof. Voeg na Ontgassingen, DDM en asolectin.
    4. Elueer eTRPV1 eiwit met 0,5 mL breuken, tot 5 mL, ijskoude ontgast Buffer D, aangevuld met 20 mM maltose. Indien mogelijk, het uitvoeren van de wasbeurten en elutie bij 4 ° C.
    5. Het kwantificeren van het bedrag van de eiwitten door het meten van de extinctie bij 280 nm golflengte.
      Opmerking: Dit protocol levert 0.5 tot 1.0 mg eiwit per liter van cultuur. Eiwit opbrengst kan verschillen voor elke eTRPV1 single-cysteïne mutant. Voor EPR en herten experimenten, groeien 4 \u2012 6 L van cultuur.

5. eTRPV1 Single-cysteïne Mutant Site-Directed Spin Labeling

  1. Concentreren op de eTRPV1-bevattende fracties met behulp van een centrifugaal filter eenheid (cutoff = 100 kDa) maximaal 2 \u2012 2,5 mg/mL voor het labelen van (cycli van 7.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 ° C).
  2. Een 10-fold molaire overmaat (3 keer, elke 30 min) van (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) methyl methanethiosulfonate (MTSSL) rotatie label uit een 100-mM stamoplossing in DMSO toevoegen aan het geconcentreerde eiwit (eTRPV1 monomeer: MTSSL in 1:10 molaire verhouding) 17. houden van de reactie in het donker op RT voor 1 h 30 min, gevolgd door overnight incubatie bij 4 ° C.
    Opmerking: In deze stap MBP kan worden verwijderd door TEV protease tijdens de nachtelijke spin-labeling incubatie toe te voegen.
  3. Belasting spin-label eTRPV1 op een kolom grootte uitsluiting chromatografie geëquilibreerd in Buffer E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0.5 mM DDM; pH 7.4), bestuurd door een systeem van snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC). Breuken met eTRPV1 tetrameer verzamelen.
    Opmerking: Neem geen 10% glycerol in deze stap, aangezien het de reconstitutie-efficiëntie vermindert.
  4. Het kwantificeren van het bedrag van de eiwitten door het meten van de extinctie bij 280 nm golflengte.
  5. Evalueren de zuiverheid van het monster door het runnen van een SDS-pagina gel (vlek-vrije gel, 4 \u2012 20%). Het monster is nu klaar voor spectroscopische metingen in de oplossing en/of proteoliposomes.

6. eTRPV1 Spin-label één cysteïne Mutant reconstitutie

  1. Drogen van 10 mg asolectin met behulp van een rotatieverdamper onder vacuüm (≤100 mbar) voor 1 h bij 40 ° C. U kunt asolectin liposomen, voeg 1 mL Buffer F (200 mM NaCl, 5 mM MOPS; pH 7.4) en bewerk het mengsel gedurende 15 minuten of totdat het monster homogeen is ultrasone trillingen ten.
  2. De liposomen destabiliseren door DDM toe te voegen aan een definitieve concentratie van 2 mM en incubeer gedurende 30 min op RT.
  3. De gelabelde proteïne concentreren op 2 mg/mL en toevoegen aan de liposomen met behulp van een eiwit/lipide-verhouding 1:5 (massa: massa).
    Let op: Het is belangrijk dat de concentraties van de eerder genoemde eiwitten, omdat spin-labeling efficiëntie vermindert bij lage concentraties en bij hoge die het eiwit kan neerslaan.
  4. Voeg Buffer F aan te passen van het eiwit/liposoom mengsel bij de DDM critical micelle concentratie (CMC), en na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zachte agitatie.
  5. Dubbele het volume van het mengsel van eiwit/liposomen met Buffer F en verwijderen wasmiddel door achtereenvolgens drie aliquots van apolaire polystyreen adsorberende parels (30 mg, 50 mg en 80 mg) toevoegen om 1 uur met zachte agitatie op RT.
  6. Het laden van het mengsel op een kolom filter (zwaartekracht stroom chromatografie kolom) te verwijderen van de kralen en het proteoliposomes mengsel overbrengen in een buis van de ultracentrifuge. Centrifugeer de monsters bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 30 μL van Buffer F.
    Opmerking: Monsters zijn klaar voor analyse van de spectroscopische en injectie in Xenopus eicellen. Als de monsters kunnen niet worden gebruikt op dezelfde dag, flash-freeze ze in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus oöcyt electrofysiologie26,32
    1. Injecteren van 50 nL verschillende verdunningen van spin-label proteoliposomes in Xenopus eicellen zoals beschreven in paragraaf 2.2.
    2. TEVC metingen uitvoeren na 12u van injectie, zoals beschreven in sectie 2.3.10.
  8. Ga verder met het uitvoeren van spectroscopische metingen en analyse (hoofdstuk 7).

7. herten en EPR Spectroscopies

  1. Dubbele Electron-elektron (herten) resonantie spectroscopie.
    1. HERTEN metingen in een gepulseerde EPR spectrometer die met Q-band frequentie (34 GHz) en uitgerust met een 10-W versterker met de dode tijd gratis vier-pulse opeenvolging op 83° met behulp van fabrikant geleverde software33uitvoeren.
    2. Aanvulling 50 µM van wasmiddel-gezuiverd eTRPV1 spin-geëtiketteerden cysteïne mutanten in Buffer E (stap 5.5) met 30% (v/v) glycerol voor cryo-bescherming.
    3. Laad het monster in een verzegelde kwarts capillair en de spin naar de onderkant van de buis door korte lage snelheid centrifugeren (100 x g).
    4. Plaats het capillair in vloeibare stikstof te bevriezen van het monster. De monsters kunnen worden opgeslagen op dit punt bij-80 ° C voor later meting.
    5. Leg het monster met rechtstreeks in de magnetron resonator en laat het opnieuw equilibreer bij-83° voor 10 \u2012 20 min.
    6. Meten van het monster met behulp van een vier-pulse herten standaardprotocol, (π/2) mw1 – τ1 – (π) mw1 – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1 – τ2 – echo34. De lengtes van de pols voor mw1 (π/2) en (π) mw1 zijn respectievelijk 10 en 20 ns, en 40 ns voor mw2 (π). De frequentie-scheiding vastgesteldop 63 MHz.
      Opmerking: Primaire herten verval gegevens kunnen worden geanalyseerd met een huis-gebouwde software (bijvoorbeeld in Matlab) dat wordt uitgegaan van een bedrag van Gaussiaanse distributies te beschrijven de afstanden tussen de spin etiketten19,35.
  2. Continuous-Wave (CW) EPR spectroscopie
    1. CW EPR experimenten op RT uitvoeren op een spectrometer van de X-band (9.6 GHz) met behulp van de software van de fabrikant.
    2. Start het instrument door te draaien op de water-chiller, de console en de magneet voedingsspanning. De software sluit aan op het instrument, plaats het instrument in harmonie en wacht minstens 30 min voor het instrument om op te warmen.
    3. Laden van 20 µL van het monster uit stap 5.5 in een 25-µL glazen capillaire buis met behulp van capillaire actie en verzegel het uiteinde van de buis met afdichtmiddel.
    4. Laad het capillair in de holte van de magnetron en kritisch koppel de resonator handmatig of automatisch met behulp van de auto-tune functie van de software.
    5. De eerste afgeleide spectra standaard instrument omstandigheden verzamelen: 100 kHz magnetron modulatie, 1,6 G magnetisch veld modulatie en 10 mW magnetron macht.
    6. Voor gegevensanalyse en presentaties, corrigeer de spectra tegen de achtergrond en normaliseren van hen door de spectra te delen door de waarde van de piek-tot-piek van de dubbele integraal.
    7. De spin-label mobiliteit bepalen door het meten van de inverse van de lijnbreedte van de centrale van de eerste afgeleide Absorptiespectra (ΔHo-1)36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Functionele karakterisering van de minimale cysteïne-minder TRPV1 Construct (eTRPV1) en de Single-cysteïne mutanten

De eerste stap naar spectroscopische onderzoeken is ingenieur en karakteriseren van cysteïne-minder eiwit constructies (figuur 2A), die zijn functionele en biochemische hoeveelheid eiwitten opleveren. eTRPV1 is functioneel zoals bepaald door Ca2 + beeldvorming en TEVC (figuur 2B-C). Bovendien eTRPV1 voorziet in voldoende hoeveelheden eiwit wasmiddel-gezuiverd EPR en herten experimenten (0,5 - 1 mg per liter Sf9 cellen)26. Invoering van één cysteines in bepaalde eiwitten gebieden invloed kan zijn op hun functie. Figuur 2B ziet u enkele voorbeelden van single-cysteïne mutanten (E651C en A702C) op eTRPV1 die zich gedragen als een wild type (WT), omdat de intensiteit van de fluorescentie toeneemt wanneer TRPV1 agonist (b.v., capsaïcine) wordt toegevoegd aan eTRPV1-bevattende HEK293 cellen, zoals blijkt uit Ca2 + 26imaging. Aan de andere kant, is A680C het typische voorbeeld van een niet-functionele cysteïne mutant, als de fluorescentie niet te onderscheiden van de achtergrond is. De mutant A680C werd uitgesloten voor verdere analyse. Na Ca2 + imaging experimenten, is single-cysteïne mutanten functie getest met behulp van TEVC of patch klem te evalueren hun biofysische eigenschappen. Figuur 2C toont dat mutanten de uiterlijke rectificatie karakteristiek van TRPV1 recapituleren wanneer uitgedaagd met pH 5, zoals bepaald door TEVC26. Functionele analyse van single-cysteïne mutanten is het eerste controlepunt alvorens expressie en zuivering protocollen.

Biochemische karakterisering van de eTRPV1 en de Single-cysteïne mutanten

Het protocol van de reiniging hierboven beschreven levert wasmiddel-ontbindend eiwit dat via covalente modificatie van cysteïne (bijvoorbeeldfluorophores, spin-geëtiketteerden [SL] methyl-methanethiolsulfonate) kan worden gelabeld langs de opeenvolging van de TRPV1 voor spectroscopische analyse. Minimale TRPV1 kanaal-bevattende cysteïne residuen als stabiel en monodispers soorten migreren (~ 13.6 mL), zoals bepaald door de grootte-uitsluiting chromatografie (Figuur 3). eTRPV1 en single-cysteïne spin-geëtiketteerden mutanten (E651C-SL en A702C-SL) recapituleren de elutie profiel en stabiliteit gekenmerkt door de minimale TRPV1 construct (Figuur 3)26. Het profiel van de elutie kan verschillen onder verschillende mutanten, zoals één cysteines van invloed kunnen zijn op de eiwitstabiliteit. In sommige gevallen vormen mutanten aggregaten; en een fractie van het monster kan Elueer op het dode volume van de kolom (8-9.5 mL), vermindering van de hoeveelheid eiwit dat gemigreerd als een tetrameer (Figuur 3, onderste rode pijl). In dit geval kunnen cel cultuur volumes worden opgeschaald naar compenseren het verloren in de geaggregeerde breuk, of een eiwit kan deze mutant uitsluiten van verdere analyse en overgaan tot het testen van het naburige residu. Andere voorbeelden zijn een verbreding van de piek die correspondeert met de tetrameer. Belangrijkste bergtoppen breder dan 3 mL worden niet aanbevolen voor spectroscopische analyse, aangezien ze multi bevatten-soorten verspreiden. Biochemische karakterisering van spin-label single-cysteïne mutanten is het tweede controlepunt voor onderneming reconstitutie en spectroscopische analyse.

Functionele karakterisering van gereconstitueerd Spin-label eTRPV1 Single-cysteïne mutanten

Omdat de signalen van de EPR en herten, is afhankelijk van de bevestiging van een paramagnetisch spin-label aan een cysteine residu, is het belangrijk om te controleren of de locatie van de spin-label eiwitfunctie verandert. Er zijn verschillende manieren om te testen voor functie na wederopvoering van de spin-geëtiketteerden eiwitten, met inbegrip van vlakke lipide dubbelgelaagde experimenten, patch klem en TEVC. TEVC kunt de evaluatie van een groot aantal spin-geëtiketteerden kanalen tijdens het opnemen van macroscopische stromingen. Om te beoordelen van de functionaliteit van de spin-label single-cysteïne mutanten, zijn kanalen gereconstitueerd in pre-gevormde asolectin liposomen. Tijdens deze stap is het belangrijk om uit te sluiten van de 10% glycerol die aanwezig is in de gehele zuivering, aangezien glycerol verlaagt de efficiëntie van eiwit reconstitutie in liposomen. Figuur 4 toont een representatief resultaat van A702C-SL TRPV1 gereconstitueerd in asolectin liposomen en microinjected in Xenopus eicellen. Zoals verwacht, lokt pH 5 robuuste uiterlijk rectificatie stromingen37 die zijn geblokkeerd door co toepassingvan de TRPV1 antagonist capsazepine (CPZ, blauwe trace)26. Mutanten die functionaliteit niet na spin labeling en reconstitutie behouden van verdere analyse moeten worden uitgesloten. Functionele karakterisering van gereconstitueerde spin-label single-cysteïne mutanten is het derde checkpoint vóór onderneming spectroscopische analyse.

Structurele dynamiek van de Spin-label eTRPV1 mutanten gecontroleerd door CW-EPR en herten

Nitroxide spin etiketten zijn gevoelig voor de omgeving en de flexibiliteit van de ruggengraat van de eiwit waaraan de label is gekoppeld17. Vandaar, CW-EPR kunt bepalen van de dynamische regime van een bepaalde draai-geëtiketteerden cysteïne; namelijk, posities die zijn blootgesteld aan de waterige media of het membraan zijn dynamischer dan die beperkt tot eiwit-eiwit interacties17. Figuur 5A toont posities, Glu651, Ile679 en Ala702 in TRPV1 die zijn gekozen om te controleren parameters van de mobiliteit. Voor het berekenen van de mobiliteit-parameter van de sonde spin label, berekent een de inverse van de lijnbreedte van de centrale van de eerste afgeleide Absorptiespectra (figuur 5B, zwarte lijn ΔHo−1). Bijvoorbeeld, E651C-SL (figuur 5B) spectrale lijn vorm en mobiliteit geeft een waarde weer (0.24) algemeen aangetroffen op dynamische posities op het membraan interface26. Aan de andere kant, de I679C-SL en A702C-SL vertonen verbreding van de spectra (Zie stippellijnen) en een afname van de mobiliteit-waarden (0.16 en 0.18, respectievelijk; Figuur 5B) 26 die stroken met hun beperkte omgeving (eiwit-eiwit), volgens de cryo-EM structuur1.

Figuur 5C toont de spectra van spin-label TRPV1 mutanten na reconstitutie in asolectin liposomen. Zoals verwacht, veranderde de dynamische functies van de spectra voor E651C-SL en A702C-SL niet na reconstitutie, zoals hun vorm en mobiliteit waarden hetzelfde in oplossing in een membraan milieu26 zijn. Aan de andere kant, illustreert I679C-SL een lawaaierige spectrum; daarom de laagste (blauwe pijl) en hoger (rode pijl) veld onderdelen minder duidelijk geworden. Lawaaierige spectra zijn niet meestal gewenst, aangezien zij neigen te onderschatten van de mobiliteit van de spin-geëtiketteerden positie. Dit type spectrum zou het product van inefficiënt eiwitten reconstitutie in plaats van onder-labeling, aangezien het signaal van de I679C-SL in oplossing robuust is.

HERTEN gegevens zijn een som van oscillerende, sinusvormige signaal vervalt dat informatie bevat over de verdeling van de afstand van interagerende spin-etiketten38,39. De periode en de complexiteit van het verval weerspiegelt rechtstreeks de onderliggende afstand verdeling. De verdeling van de afstand bestaat uit het aantal structurele onderdelen aanwezig in het monster en hun stoornis. Vandaar het tijdsdomein signaal is afgeleid van de datieve koppeling tussen niet-vaste, verre spin labels in oplossing die meestal oorzaak van het verval van een exponentiële achtergrond, andrigidly combinatie draaiingen binnen de dezelfde eiwit19,40. HERTEN kunt in het bijzonder de bepaling van intra-eiwit lange-afstands afstanden (20-70 Å) tussen spin-geëtiketteerden residuen19. Figuur 6 toont het verval van het signaal en de bijbehorende verdeling van de afstand van de E651C-SL. De verdeling van de Glu651 toont drie pieken overeenkomt met 24, 36, en 58 Å26. De twee kortere afstanden stroken met de gesloten TRPV1-structuur (afstanden met 23 en 32 Å voor de Cβ-Cβ, respectievelijk)1, terwijl de derde 58 Å piek met de aggregatie van eiwitten overeen mogelijk.

Figure 1
Figuur 1. Experimentele overzicht. Diagram van de experimentele omtrek moet express, zuiveren en reconstrueren van eTRPV1 voor de EPR en herten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Functionele karakterisering van eTRPV1 en één-cysteïne mutanten. (A) Schematische weergave van de TRPV1-constructies gebruikt spectroscopische p.a. (eTRPV1: cysteïne-minder TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 cellen waarin WT-TRPV1, eTRPV1, en mutants (geladen met Ca2 +-gevoelige Fluo-4-AM) werden geanalyseerd voor capsaïcine (10 µM)-met behulp van fluorescentie Ca2 + imaging reacties opgeroepen. Kleurenbalk toont u relatieve wijzigingen in intensiteit van de fluorescentie, met blauw en rood ter aanduiding van de laagste en hoogste cytoplasmatische Ca2 +, respectievelijk. Witte balk vertegenwoordigt 100 µm. (C) links, een subeenheid (S5, porie helix, S6 en TRP domein) van TRPV1 tetrameer structuur single-cysteïne residuen (gele bollen) leidt langs de kanaal volgorde te markeren. Juiste, stroom-spanning-relaties worden bepaald door TEVC opnames van Xenopus eicellen uiten WT-TRPV1, eTRPV1 en één-cysteïne mutanten uitgedaagd met pH 5. Achtergrond stromingen (bkgrd). Aangepast ten opzichte van de oorspronkelijke figuur26. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Biochemische karakterisering van eTRPV1 en één-cysteïne mutanten.
Grootte-uitsluiting chromatografie Profiel van DDM-ontbindend eTRPV1 en single-cysteïne spin-geëtiketteerden mutanten na expressie en reiniging van Sf9 cellen. Inzet: SDS-pagina gel tonen de monomeer eTRPV1-MBP fusieproteïne (gewijzigd van de oorspronkelijke figuur26). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Functionele karakterisering van een spin-label eTRPV1 mutant.
Stroom-spanning relaties bepaald door TEVC van Xenopus eicellen microinjected met proteoliposomes die spin-label A702C uitgedaagd met pH 5 (rood) en geblokkeerd door capsazepine (CPZ, blauw: 40 µM). Achtergrond stromingen (bkgrd). Aangepast ten opzichte van de oorspronkelijke figuur26. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. Mobiliteiten van spin-label eTRPV1 mutanten bepaald door CW-EPR.
(A) twee subeenheden (S5, porie helix, S6 en TRP domein) van TRPV1 tetrameer structuur markeren het aminozuurresidu's (gele bollen) peilden door plaats-geleide draai-labeling spectroscopies. (B) eerste afgeleide van CW EPR spectra van spin-geëtiketteerden cysteïne mutanten in DDM-oplossing. (C) eerste afgeleide van CW EPR spectra van spin-geëtiketteerden cysteïne mutanten gereconstitueerd in asolectin liposomen. Spectra werden verkregen met een pH van 7,4 (gesloten staat). ΔHo−1 geeft de omvang van de mobiliteit-parameter. De zwarte gestippelde lijn wordt gemarkeerd de verbreding van de spectra. Blauwe en rode pijlen duiden de lage en hoge veld onderdelen van de spectra, respectievelijk. EPR spectra waren genormaliseerd naar het totale aantal spin etiketten. Aangepast ten opzichte van de oorspronkelijke figuur26. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. De verdeling van de afstand van een mutant eTRPV1 in wasmiddel.
HERTEN echo (A) en afstand verdeling (B) van de spin-geëtiketteerden mutant E651C; een som van Gaussians was gemonteerd op de herten-gegevens. P(r) duidt op afstand verdeling van de spin paren41. Spectra werden verkregen met een pH van 7,4 (gesloten staat). Aangepast ten opzichte van de oorspronkelijke figuur26. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Huidige technologieën voor expressie en zuivering van zoogdieren membraaneiwitten hebben het mogelijk gemaakt te verkrijgen van voldoende hoeveelheden eiwit voor spectroscopische onderzoeken14,15,16,42. Wij hebben hier, deze technologieën om express, zuiveren, reconstrueren en spectroscopische analyses uitvoeren in TRPV1 aangepast.

Onder de kritische stappen in het protocol, hieronder zijn degenen die we hebben daarvoor voor TRPV1 en die kunnen worden aangepast voor andere eiwitten. Wijzigen van de opeenvolging van DNA voor het genereren van een sjabloon dat de opbrengst van 0,5 - 1 mg/mL afwasmiddel-gezuiverd eiwit; sjablonen die opbrengst van minder dan 0,5 mg/mL eiwit zijn uitdagend, omdat steeds meer dan 6 liter insect cellen culturen per mutant moeten zouden. Eiwit moet worden geconcentreerd, niet minder dan 2 mg/mL, zonder TCEP spin-labeling efficiëntie te vergroten. Labeling in laag eiwitgehalte concentraties en/of in aanwezigheid van TCEP zal sporen genereren lawaaierige EPR spectra. Hoewel de eiwitten bewaard worden bij 4 ° C tijdens het zuiveringsproces ongehinderd, is het essentieel voor het uitvoeren van de spin labelen op RT om efficiëntie te verbeteren. Tijdens de zuivering en labeling, verbetert glycerol eiwitstabiliteit; echter moet het volledig worden verwijderd voordat reconstitutie, als het vermindert de hoeveelheid eiwit in liposomen en lawaaierige EPR spectra genereert. Verminderen van het wasmiddel concentratie lager dan de CMC is een gangbare praktijk tijdens reconstitutie; echter de TRPV1 neiging te precipiteren vóór de integratie in de liposomen. U kunt dit probleem oplossen, was TRPV1 's nachts geïncubeerd met pre-gevormde liposomen precies op de CMC te voorkomen eiwit neerslag en verhogen de hoeveelheid kanalen in de voorbereiding van de proteoliposome. TRPV1 is volledig functioneel in asolectin liposomen28; Vandaar, was het de voorkeur lipide-mengsel in dit protocol gebruikt. Het is echter essentieel om te bepalen van de samenstelling van lipide waarin een bepaald eiwit functionele (bijvoorbeeldcholesterol is) voordat u verdergaat met spectroscopische analyses.

Spectroscopische benaderingen zoals EPR en herten presenteren verschillende beperkingen, met inbegrip van: wijzigingen in eiwit sjabloon volgorde ter verbetering van de biochemische stabiliteit zou gevolgen kunnen hebben in functie26; introductie van uitheemse één cysteines, evenals het label van de spin, kan niet goed worden verdragen in bepaalde regio's van het eiwit; verkrijgen van grote hoeveelheden van gelabelde proteïnen; en in beperkte mate conformationele wijzigingen bij de bepaling van afstanden met herten in wasmiddel micellen. Echter kan de laatste beperking worden overwonnen door het verzamelen van de spectra, met Q-band frequentie, van TRPV1 mutanten gereconstitueerd in nanodiscs19,43. Het voordeel van deze benaderingen komt echter vooral uit het patroon van global dynamics, toegankelijkheidsopties en afstanden meer dan van de absolute waarde van een bepaalde positie.

Temperatuur gevoeligheid is een van de meest fascinerende en minder begrepen gating mechanismen; Vandaar, met behulp van spectroscopische benaderingen, zou het mogelijk zijn om te bepalen hoe membraaneiwitten thermische energie vertalen in eiwitten beweging in de omgeving van een membraan. Nog belangrijker is, zou het uitdagend om te bepalen van de structurele veranderingen tijdens de thermische gating met behulp van röntgendiffractie of cryo-EM, als deze technieken op vriestemperaturen worden uitgevoerd. Toekomstige experimenten zal worden gericht op het bepalen van dat TRPV1 conformationele verandert compatibel met thermische-afhankelijke gating via EPR, herten of fluorescentie. EPR spectroscopie heeft voorzien in gedetailleerde mechanistische modellen prokaryote ionenkanalen, dus we verwachten dat we met behulp van de bovenstaande protocollen, inzicht in de mechanismen van activering en drug-binding van zoogdieren ionenkanalen met behulp van krijgt spectroscopische benaderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn zeer dankbaar Dr H. Mchaourab voor het verstrekken van toegang tot de EPR en herten spectrometers en Dr. T. Rosenbaum voor het verstrekken van de full-length cysteïne-minder TRPV1 plasmide.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

Biochemie kwestie 137 voorbijgaande receptor potentiële vanilloid 1 TRPV1 zuivering reconstructie spin-labeling EPR spectroscopie herten spectroscopie
Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter