Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

تجهيز دفعة من الخميرة 2-الهجين شاشات تسمح بالمقارنة المباشرة لملامح متعددة الطعم البروتينات التفاعل مع مجموعة معقدة جداً من البروتينات الانصهار فريسة. هنا، يمكننا وصف الأساليب المكررة، الكواشف الجديدة، وكيفية تطبيق استخدامها لهذه الشاشات.

Abstract

الفحص لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام مقايسة 2-الهجين الخميرة منذ فترة طويلة أداة فعالة، ولكن إلى حد كبير استخدام محدود لاكتشاف التمثيلات النسب العالية التي يتم التخصيب في مكتبة المرشحين المتفاعلة. في تنسيق تقليدية، يمكن أن تسفر عن التحليل 2-الهجين الخميرة مستعمرات كثيرة جداً لتحليل عندما أجرت في صرامة منخفضة حيث يمكن العثور على التمثيلات تقارب منخفضة. وعلاوة على ذلك، دون استجواب شاملة وكاملة من المكتبة نفسها ضد والبلازميدات الطعم مختلفة، لا يمكن تحقيق إجراء تحليل مقارن. على الرغم من أن بعض هذه المشاكل يمكن معالجتها استخدام مكتبات صفت فريسة، التكلفة والبنية التحتية اللازمة لتشغيل هذه الشاشات يمكن أن تكون باهظة. كبديل لذلك، ونحن قد تكيفت المقايسة 2-الهجين الخميرة في الوقت نفسه كشف العشرات من عابرة وتفاعلات البروتين ثابتة داخل شاشة واحدة استخدام استراتيجية وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين)، التي ويتضمن تسلسل الحمض النووي الفائق وحساب متابعة تطور عدد سكانها والبلازميدات ترميز الشركاء متفاعلة فيما بينها. وهنا يصف لنا الكواشف مخصصة والبروتوكولات التي تسمح شاشة ديبن ليتم تنفيذها بسهولة وفعالية من حيث التكلفة.

Introduction

فهم كامل للعمليات البيولوجية الخلية يعتمد على إيجاد شبكات التفاعل البروتين التي تكمن وراء تلك الآليات الجزيئية. يتمثل أحد النهج لتحديد تفاعلات البروتين المقايسة الخميرة 2-هجين (Y2H)، الذي يعمل عن طريق تجميع عامل نسخ تشيميريك تعمل بمجرد ربط بين البروتين المجالات ذات الاهتمام ببعضها1. شاشة Y2H نموذجية يتم عن طريق إنشاء عدد أن خميرة التي يضم كل مكتبة من البلازميدات ترميز البروتينات المتفاعلة التي تنصهر فيها منشط النسخي (مثلاً.، 'فريسة' البروتين الانصهار) وبلازميد معين 'طعم' تتألف من البروتين من مصلحة تنصهر إلى مجال ربط الحمض النووي (مثلاً، Gal4 الحمض النووي ملزم المجال الذي يربط إلى تسلسل تفعيل Gal4 المنبع). واحدة من المزايا الرئيسية للنهج الذي Y2H هو أن من السهل نسبيا وغير مكلفة لقواعد السلوك في مختبر نموذجية مجهزة للعمل الروتيني البيولوجية الجزيئية2. ومع ذلك، عندما تؤدي تقليديا، عينات مستخدم المستعمرات الفردية التي تنشأ عند التحديد لتفاعل إيجابي Y2H. وهذا يحد بشدة من عدد النسخ 'فريسة' المكتبة التي يمكن أن تجري دراسة استقصائية. وتتفاقم هذه المشكلة عند وفرة فريسة متفاعلة خاصة مرتفع جداً بالنسبة للآخرين، تتضاءل فرصة للكشف عن التفاعل من وفرة منخفضة فريسة والبلازميدات.

هو حل واحد لاستخدام مبدأ Y2H في تغطية شاملة للبروتين استخدام نهج المهيأة باستخدام مصفوفة حيث يمكن استجوابهم صفيف يحتوي على البلازميدات فريسة الفردية المعروفة رقمياً. ومع ذلك، يتطلب هذا نهج البنية أساسية التي لا يسهل موجوداً أو فعالة من حيث التكلفة للمحققين الأفراد الذين يرغبون في تحديد إينتيراكتومي لعدد قليل من البروتينات أو المجالات3. وباﻹضافة إلى ذلك، ستوسع المكتبات فريسة المعقدة جداً التي قد ترميز أجزاء متعددة من البروتينات المتفاعلة حجم هذه المصفوفات مصفوفة لأحجام غير عملي. وبديل هو إجراء فحوصات مع مكتبات المعقدة على دفعات وتقييم وجود المتفاعلة الحيوانات المستنسخة باستخدام التسلسل الفائق المتوازية الضخمة4. وهذا يمكن تطبيقه على الاعتداء وجود والبلازميدات الجارحة التي تنشأ في مستعمرات متعددة باستخدام نموذجي Y2H نهج يسمح لتنمو على5،لوحة6خلايا الإسكان على زوج متفاعلة من البروتينات الانصهار في الخميرة التي تمت تهيئتها. يمكن أن تتفاقم هذه الفكرة العامة لزيادة الاستعلام من كلا الطعم متعددة وفريسة المكونات في نفس الوقت7،8.

لا يزال العديد من التحقيقات تتطلب أسهل بعد أكثر تركيزاً الجهد على عدد قليل من البروتين 'الطعم' ويمكن أن تستفيد أكثر من استعلام حصرية وشبه كمي لمكتبة واحدة فريسة المعقدة. لدينا نمواً والتحقق من صحة نهج لإجراء دراسات التفاعل البروتين على نطاق واسع باستخدام مبدأ Y2H في دفعة الشكل4. هذا يستخدم معدل التوسع بلازميد فريسة معينة كوكيل للقوة النسبية ل التفاعل Y2H9. التسلسل العميق لجميع البلازميدات داخل مجموعة من سكان يتعرضون للنمو الطبيعي أو ظروف النمو الانتقائي وتنتج خريطة كاملة للحيوانات المستنسخة التي تسفر عن التفاعلات Y2H القوية والضعيفة. ويمكن الحصول على المرجع للتمثيلات ومقارنة مباشرة عبر متعددة الطعم والبلازميدات. وبالتالي يمكن استخدام سير العمل الناتجة عن وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين) لتحديد إينتيراكتوميس التفاضلية من نفس مكتبات فريسة لتحديد البروتينات، مما يتيح المقارنة بين بروتين واحد مقابل آخر.

وهنا نبدي ديبن وإدخال التحسينات في أساليب المختبرات التي يسهل استخدامها، الذي يرد في الشكل 1. تتضمن التحسينات الهامة:

جيل سكان فريسة الخميرة. أحد المتطلبات الرئيسية ديبن يولد سكان خميرة مع البلازميدات الطعم المختلفة التي لها نفس التوزيع للمكتبات فريسة بلازميد. السكان يعادل خط الأساس للمكتبة بلازميد فريسة ضرورية لإجراء مقارنات دقيقة بين إينتيراكتوميس الطعوم المختلفة. وهذا يتحقق على أفضل وجه عندما يقع بلازميد مكتبة الفعل في عدد سكان فرداني خميرة وتتحرك بلازميد طعم معطى إلى أن السكان يتحقق عن طريق التزاوج لإنتاج من مثنوية. وهنا، نحن نقدم دليل واضح في كيفية جعل هؤلاء السكان باستخدام المكتبات التجارية في الخميرة فرداني. على الرغم من أن نجد أساليب توليد عدد كبير من ديبلويدس، وكفاءة التزاوج عموما من هذه السلالات التجارية الخميرة التي تحتوي على مكتبة كان منخفضا. ولذلك، نحن شيدت سلالة جديدة التي يمكن البيت فريسة المكتبات التي تعطي ديبلويدس أكثر بكثير من كل رد فعل التزاوج.

مجموعة جديدة من الطعم والبلازميدات. العديد من البلازميدات الحالية التي تعبر عن 'الطعم' الانصهار البروتينات تتألف من البروتين الفائدة ومجال الحمض النووي ملزم تقوم على أساس 2µ، السماح لهم بتضخيم عدد النسخ. يمكن هذا الرقم نسخة متغير تماما في عدد السكان ويؤدي إلى تباين في استجابة النسخي Y2H. وهذا بدوره يمكن أن تحرف القدرة على قياس قوة تفاعل بروتين معين استناداً إلى استجابة نمو الخلايا ضمن التحديد. يمكن أن يكون هذا جزئيا إلى عنوان باستخدام بلازميد نسخة منخفضة، البعض منها قد وصفت سابقا مثل pDEST32 المتاحة تجارياً10. نحن شيدت بلازميد طعم جديد (بتيف-اختطارها) التي تنتج Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الانصهار البروتينات داخل بلازميد نسخة منخفضة على أساس السنترومير TRP1 تحمل الجينات المقاومة كانر أن يسمح أيضا باستنساخ الأجزاء الطعم المنبع و المتلقين للمعلومات في المجال Gal4 الحمض النووي ملزم.

مكتبة بلغة جديدة الكثافة Y2H. شيدت بلازميد جديد إلى البيت Y2H فريسة المكتبات، وأنها تستخدم لبناء مكتبة Y2H معقدة للغاية مصنوع من شظايا المنفصمة عشوائياً من الحمض النووي من Saccharomyces cerevisiae. أظهر تحليل تسلسل أن مكتبة هذه العناصر المختلفة ما يزيد على 1 مليون، الآن أكثر تعقيداً من الخميرة هو موضح سابقا المجينية Y2H بلازميد المكتبات11. مع هذه المكتبة الجديدة، كنا قادرين على إظهار أن يكون سير العمل ديبن قوية بما يكفي لاستيعاب مكتبات معقدة مع العديد من البلازميدات مختلفة على نحو يعول عليه وقابل لإعادة الإنتاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد وسائل الإعلام ولوحات

ملاحظة: جميع لوحات تحتاج إلى بذل الحد الأدنى 2 أيام قبل البدء بالبروتوكول. ويمكن إجراء وسائل الإعلام عند أي نقطة. ومع ذلك، استخراج الخميرة مخزنة ببتون الدكستروز الأدنين (بيبدا) يحتاج إلى بذل في اليوم الذي سيتم استخدامه. بعض وسائل الإعلام باستخدام مزيج ملحق التي تحتوي على مستوى الأدنين أكبر من ما يستخدم بشكل عام. تحديد معظم وسائل الإعلام الحد الأدنى ملاحق الأدنين 10 مغ/لتر. المكملات المسماة '+ 40Ade' تحديد مجموع الأدنين 40 مغ/لتر.

  1. إعداد "الحل الجلوكوز" (50% w/v). 1 للأم، حل 500 غ د-(+)-الجلوكوز في 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. ضبط حجم الصوت لمل 1,000 لاستخدام اسطوانة وتصفية من خلال عامل تصفية عقيمة 0.2 ميكرون في زجاجة تخزين وسائط مل 1,000 عقيمة.
  2. إعداد الخميرة استخراج لوحات ببتون سكر العنب (YPD). 1 للأم، حل 20 غراما من ببتون و 10 جرام من "خميرة استخراج" في 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. تتدفق اسطوانة، وملء يصل إلى 960 مل بالماء المقطر. صب مل 2,000 قارورة Erlenmeyer وإضافة 15 غم أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 40 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
    1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
  3. تحضير الوسائط الحد الأدنى الاصطناعية الكاملة (المجلس الأعلى للقضاء)-لوحات الراديكالي. 1 للأم، حل ز 6.7 من "قاعدة النيتروجين الخميرة" دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء يصل إلى 960 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة ز 0.7-الحزب-اجتمع مزيج التسرب، 20 ملغ من الميثيونين وز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 40 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
    1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
  4. إعداد لوحات اجتمع المجلس الأعلى للقضاء-لوي. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة وشغل تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة 1.005 ز من-لوي-اجتمع ميكس التسرب و 15 غرام من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
    1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
  5. إعداد لوحات المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة 1.005 ز-الحزب-لوي + ميكس التسرب 40Ade و 240 ملغ من الأدنين ز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
    1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
  6. يعد المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب اللوحات. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة من 0.975 ز-الحزب-لوي-له + ميكس التسرب 40Ade 240 ملغ من الأدنين وز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. مزيج جيد من دوامات.
    1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
  7. يعد المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب-3AT لوحات. 1 للأم، حل ز 10.05 قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية إلى 800 مل ماء المقطر في كوب مل 1,000. صب اسطوانة، وملء تصل إلى 940 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة من 0.975 ز-الحزب-لوي-له + ميكس التسرب 40Ade 240 ملغ من الأدنين وز 15 من أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. استخدام ماصة إضافة 60 مل جلوكوز 50%. في 100 ميليلتر مخزون العقيمة م 1 من 3-الأمينية 1,2,4 تريازولي (3AT) مزيج من دوامات.
    1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
  8. إعداد لوحات كانر رطل. 1 للأم، استخراج حل 10 جرام تريبتوني، 5 غ خميرة و 10 جرام من كلوريد الصوديوم في 800 مل من الماء في كوب مل 1,000 المقطر. صب اسطوانة، وملء يصل إلى 1,000 مل من الماء المقطر. صب مل 2,000 من قارورة Erlenmeyer وإضافة 15 غم أجار. اﻷوتوكﻻف وباردة في حمام الماء 37 درجة مئوية حتى قد تبريد درجة حرارة حمام الماء إلى ما يقرب من 42-50 درجة مئوية. إضافة 50 ملغ كاناميسين ومزيج من دوامات.
    1. من أجل سلسلة من لوحات 100 ملم مع 20 مل من وسائل الإعلام ماصة.
  9. إعداد YPD، المجلس الأعلى للقضاء-لوي التقى، المجلس الأعلى للقضاء-الحزب الراديكالي-لوي-المجلس الأعلى للقضاء والمجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب وسائل الإعلام. استخدم الإجراء أعلاه للوحات ما عدا بدلاً من سكب قارورة Erlenmeyer، صب في زجاجة تخزين وسائل الإعلام وتجاهل أجار.
  10. إعداد بيبدا (ايبدا مخزنة بشكل مؤقت). تأخذ وسائل الإعلام YPD العقيمة وإضافة الأدنين 200 مغ/لتر في الماء المقطر المعقم. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 3.7 مع HCl. التصفية من خلال عامل تصفية عقيمة 0.2 ميكرون في زجاجة معقمة.
  11. إعداد المخزن المؤقت للتحول: السوربيتول م 2، ثنائي هيدرات خلات الليثيوم م 1، 10 مم تريس درجة الحموضة 7.6، 0.5 مم يدتا، 0.2 مم كلوريد الكالسيوم في الماء المقطر. التصفية من خلال فلتر 0.2 ميكرون معقمة في زجاجة معقمة.
  12. إعداد الحل شماعة: 70% w/v البولي إثيلين غليكول 3350 في الماء المقطر. تعقيم اﻷوتوكﻻف.
  13. إعداد برم: م 8 اليوريا، 4% w/v الحزب الديمقراطي الصربي، 50 مم تريس الأس الهيدروجيني 6.8، 10% v/v والغليسيرول، 0.02% w/v بروموفينول الأزرق في تعقيم ماء مقطر.
  14. إعداد الظريف (TE قوية): 50 مم تريس، 20 مم يدتا، pH 8.0 في الماء المقطر. التصفية من خلال فلتر 0.2 ميكرون معقمة في زجاجة معقمة.
  15. إعداد حل زيمولاسي الأسهم: 10 ملغ/مل زيمولاسي 100T في 50 مم بوتاسيوم فوسفات مائي pH 7.5، المقطر 50% v/v والغليسيرول المخزن المؤقت في تعقيم المياه (المخزنة في-20 درجة مئوية).

2-الاستنساخ وتحقق البلازميدات الطعم

ملاحظة: بناء Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال والبلازميدات. حاليا، هناك مجموعة متنوعة من نظم Y2H المتاحة تجارياً واكاديميا المتاحة. ديبن يمكن أن تستوعب العديد من هذه شريطة أن يكون بلازميد الطعم معربا عن بروتين الفائدة التي تنصهر فيها إلى مجال الحمض النووي ملزم TRP1--التي تحتوي على بلازميد. متطلبات المتلقين للمعلومات الأخرى هي أن التسلسل على الفور مكتبة فريسة المعروف إدراج المنبع والتي يمكن أن سجل Y2H تفاعل إيجابي من إنتاج His3 يسمح بالتحديد في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الحامض الأميني. هنا ونحن سوف تصف استخدام بلازميد الطعم Y2H الجديد (بتيف-اختطارها، الشكل 2)، ومع ذلك، يمكن أن تستخدم والبلازميدات الطعم Y2H الأخرى بما في ذلك pGBKT7 كذلك. للبناء وتقييم والبلازميدات الطعم، ونحن سوف تصف استخدام اختطارها بتيف. وكملاحظة عامة، نوصي بتوليف الجينات لإنتاج إطار القراءة المفتوحة التي تتمسك بالتحيز كودون الخميرة للمساعدة على ضمان التعبير الجيد وسهولة مع الاستنساخ. ضمان أن نظام الاستنساخ يسمح للطعم في الإطار مع المجال Gal4 الحمض النووي ملزم وأن عند الاستنساخ في الموقع 3 '، يتبع كودون توقف منطقة الطعم الترميز.

  1. إعداد ناقلات بلازميد. بلازميد بتيف-اختطارها يسمح باستنساخ جزء ترميز بروتين الفائدة 5 'أو 3' منطقة ترميز المجال Gal4 الحمض النووي ملزم باستخدام أسلوب التجميع سريع. للإدراج في 5 'موقع هضم ميكروغرام 3 من اختطارها بتيف مع الرابطة واكوري أو هضم للإدراج في الموقع 3'، مع بامهي وزهوي حاء – 2-4 نموذج اليكتروفوريسي في 1% الحمض النووي [اغروس] هلام يحتوي على 0.2-0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد (أتبر) في 100 ف المكوس bp قص 5,630 اختطارها TEF وتنقية باستخدام مجموعة أدوات استخراج هلام الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وتحديدها كمياً الحمض النووي بامتصاص في 260 nm جهاز المطياف الضوئي12.
    ملاحظة: جيل إدراج الترميز الطعم. الحمض النووي وشظايا البروتينات ترميز أو شظايا البروتين من الفائدة يمكن أن يكون جعلت استخدام التوليف الجيني والمتاحة كأجزاء أونكلونيد. من المستحسن أن codons هي الأمثل للتعبير في Saccharomyces cerevisiae وأدوات الإنترنت للتحسين كودون مدرجة في قائمة المواد.
  2. 5 'الإدخال، الجناح جزء الحمض النووي على ترميز كودون بدء ATG واسطة 5'-تاجااااكااكتجتاكجاتك-3 'و 5'-جكجككتاتجتجتجاكاااجكتات-3 '، على التوالي. 3 'إدراجها في الإطار مع المجال ملزمة Gal4 الحمض النووي، الجناح بلغة الترميز قبل 5'-كتجكاتاتجككاتجاجككجا-3 'و 5'-تاجتاكتاجكاتاككككتجججكك-3 '.
  3. بلازميد البناء، استخدام أسلوب التجميع السريع كما هو محدد في إرشادات الشركة المصنعة للشظايا الاستنساخ إلى قطع بتيف-اختطارها.
    1. لوحة كل ما حولت كولاي على لوحات كانر رطل واحتضانها ح 16-20 عند 37 درجة مئوية. يمكن تحديد المستعمرات السكنية اختطارها بتيف مع إدراج المطلوب [بكر] تضخيم استخدام النوكليوتيد: 5 '-كجتكتكاتتكتكاجتتكاج-3' و 5 '-جاجتاكجاكاتكككاجتجتك-3' 5 'إدراج و 5'-كاككجتاتتكتجككاككتكتكك-3 ' و --جكاككجكاكتاتتجاجكجكتج 5 '-3' ل 3 ' إدراج. هذه النوكليوتيد أيضا بمثابة كبسولة تفجير لترتيب الإدراج.
    2. خطة بشأن إعداد > 10 ميكروغرام كل مشتق بتيف اختطارها واختطارها بتيف وحدها لتوفير المواد للتحولات التسلسل والخميرة.
    3. استخدام PCR الشروط التالية: 3 دقيقة عند 98 درجة مئوية، تليها دورات 25 من 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، و 2 دقيقة في 72 درجة مئوية، تليها 5 دقائق عند 72 درجة مئوية باستخدام المخزن مؤقت الذي يحتوي على 2.5 مم مجكل2 ، 0.5 U/100 ميليلتر دنا بوليميريز، وملكية المخزن المؤقت.

3-التعبير عن المجال Gal4-الحمض النووي-ملزم البروتينات الانصهار

  1. جعل الخميرة المختصة.
    1. خط من الخميرة PJ69-4A على صفيحة YPD بأخذ قضيب خشبي عقيمة، إلغاء 1 مم3 -80 درجة مئوية تجميد الأسهم وفرك عليه بلطف عبر لوحة YPD. نقل قضيب خشبي أسفل اللوحة بحيث يذهب كل مرور عبر جزء متأثر من سطح وسائط الإعلام. احتضان لوحة YPD في 30 درجة مئوية لمدة يومين أو حتى مستعمرات واحدة مرئية. جعل الأسهم المجمدة من الخميرة PJ69-4A بتعليق الخميرة في الماء أو نمو وسائل الإعلام والمكمل مع [دمس] إلى 7%، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    2. تطعيم مستعمرة واحدة في 5 مل ثقافة YPD في أنبوب ثقافة 20 مم × 150 مم باستخدام قضيب خشبي عقيمة وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة.
    3. تلقيح 50 مل YPD في 250 مل قارورة Erlenmeyer العقيمة مع 4 مل ثقافة بين عشية وضحاها من سلالة الخميرة PJ69-4A. تنمو في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة لكثافة بصرية (OD600) لما يقرب من 1.2، كما يحددها كانت مع مسار ضوء قياسية 1 سم. وعادة ما يستغرق نمو ح 5-7.
    4. عزل الخميرة بالترسب في 50 مل أنبوب مخروطي في 4,696 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. تجاهل المادة طافية بإغراق النفايات السائلة. استخدام ماصة، ريسوسبيند بيليه في 5 مل من المخزن المؤقت للتحول ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي. ريسيديمينت تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند الخميرة في 1 مل حجم المخزن المؤقت للتحول مع ماصة 1000 ميليلتر النهائي.
    5. احتضان خلايا الخميرة لمدة 60 دقيقة في 30 درجة مئوية بينما تهز 200 لفة في الدقيقة ومن ثم ضع على الجليد لمدة 30-90 دقيقة.
  2. التحول بلازميد الخميرة.
    1. في 1.5 مل أنبوب ميكروسينتريفوجي العقيمة، إضافة 1 ميكروغرام من بلازميد المستندة إلى اختطارها بتيف و 5 ميليلتر من 10 ملغ/مل الحيوانات المنوية السلمون الناقل حل الحمض النووي. وتشمل أيضا أنبوب يحتوي على الحيوانات المنوية السلمون الناقل الحمض فقط كعنصر تحكم تحول سلبي. إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية الخميرة المثلج إلى كل أنبوب ماصة. إضافة 100 ميليلتر من 70% الحل الوتد مع ماصة 1000 ميليلتر والمزيج بلطف بالتحريك الأنبوب 5-10 مرات (لا دوامة).
    2. احتضان عند 30 درجة مئوية، في حاضنة تهز 200 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة.
    3. صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    4. الرواسب في ميكروسينتريفوجي في 845 g x لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، "الماصة؛" إيقاف وتجاهل المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في 150 ميليلتر من الماء المعقم من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وتنتشر على سطح صفيحة الحزب المجلس الأعلى للقضاء.
    5. ضع الجانب الأيمن لوحات أعلى في حاضنة 30 درجة مئوية واحتضان لمدة 2-3 أيام حتى مستعمرات مرئية. لوحات قد يكون رأسا لتجنب التكثيف على سطح لوحة بعد الحضانة عند 30 درجة مئوية ح 6-12.
    6. تأخذ 2-3 مستعمرات للتحول والانتصارات كتصحيح على لوح الحزب المجلس الأعلى للقضاء استخدام مسواك عقيمة. واسمحوا أن تنمو على ح 24 في 30 درجة مئوية.
  3. جعل ليساتيس للتعبير البروتين.
    1. تطعيم 3 مل من المجلس الأعلى للقضاء-الراديكالي السائل وسائل الإعلام مع مباراة-رئيس--حجم الخميرة من التصحيح وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في أنبوب ثقافة 20 مم × 150 مم، بينما تهز 200 لفة في الدقيقة. جعل ثقافتين بين عشية وضحاها كل الطعم وناقلات اختطارها بتيف فارغة.
    2. أضف 1 مل YPD لكل مل 3 من المجلس الأعلى للقضاء-الراديكالي الثقافة بين عشية وضحاها. تنمو على ح 1 عند 30 درجة مئوية، بينما تهز 200 لفة في الدقيقة. تحقق التطوير التنظيمي للخلايا بواسطة جهاز المطياف الضوئي.
    3. الرواسب عدد مساو من خلايا، تطبيع وفقا للتوجيه التشغيلي. استخدام معقم 1.5 مل من أنابيب ميكروسينتريفوجي مع 5 دقيقة تدور في 2,348 س ز في درجة حرارة الغرفة في ميكروسينتريفوجي. استخدام ماصة لتجاهل المادة طافية. المخزون النهائي يتوافق مع الحد ني 2.1 OD.
      ملاحظة: عند حساب عدد مساو من خلايا، فإنه يمكن أن يحدث أن أحجام مختلفة قد يكون مطلوباً من كل ثقافة بين عشية وضحاها تحقيق OD 2.1 الحد الأدنى.
    4. ريسوسبيند بيليه في 450 ميليلتر من 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسينتريفوجي الخلايا لمدة 2 دقيقة في 2,348 س ز في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية بواسطة ماصة.
    5. ريسوسبيند بيليه مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للدوامة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً بعناية فيما يتعلق بعدم جعل الفقاعات. عينة الحرارة لمدة 5 دقائق في 70 درجة مئوية.
  4. التحقق من وجود تعبير البروتين من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
    1. استخدام هلام تدرج من 4-20% لضمان مجموعة كبيرة من الأوزان الجزيئية يمكن حلها. تحميل ما يعادل مبلغ (نفس OD) عينات في الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة جل وتأكد من تضمين نموذج واحد على الأقل يحتوي على14،،من13متجه اختطارها بتيف غير معدلة15.
    2. بعد فصل الغرواني الكهربي، نقل جل النيتروسليلوز وإيمونوبلوت باستخدام حركة مضادة أجسام [مونوكلونل] أو [بولكلونل] ويصدرون الكشف عن الحل (الشكل 3).

4-التنشيط الذاتي اختبار

  1. متواصلة من الخميرة ماتالفا من المخزون-80 درجة مئوية المقابلة لسلالة الإسكان المكتبة فريسة للفائدة على طبق من ذهب YPD بأخذ قضيب خشبي عقيمة وإلغاء كمية صغيرة من الخميرة من القنينة و streaking أنه عبر لوحة YPD. احتضان لوحة YPD في 30 درجة مئوية لمدة يومين أو حتى مستعمرات واحدة مرئية. تصحيح بضع مستعمرات واحد على لوحة YPD واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: هو سلالة جديدة وضعت هنا لمكتبة البيت فريسة PLY5725 بينما يتم إيواء بعض المكتبات Y2H المتاحة تجارياً متوافقة في Y187.
  2. اتبع الإجراءات المذكورة في 3.3.1-3.3.4 لتحويل PLY5725 مع LEU2--على أساس بلازميد تستخدم لإيواء المكتبة الفريسة المنشودة. للمكتبات التي وضعت هنا، هو بلازميد المقابلة pGal4AD (pPL6343). لاسترداد الخميرة ترانسفورمانتس، طبق على لوحات اجتمع المجلس الأعلى للقضاء-لوي. بعد المستعمرات تنشأ، متواصلة كبقع على صفيحة اجتمع المجلس الأعلى للقضاء-لوي واحتضانها ح 24 في 30 درجة مئوية.
  3. يتبع البروتوكول في 3-4 لتأكيد التعبير عن pPL6343 باستخدام ناقلات فارغة لمكافحة--ها أجسام [مونوكلونل] أو [بولكلونل] ويصدرون الكشف عن الحل.
  4. خط كل من الخميرة PJ69-4A تحول في نمط صليب مع PLY5725 بنيات على لوحة YPD التي تأكدت في التعبير عن البروتين في البروتوكول القسم 3-4 و 4.3 واحتضان عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. فصل تأخذ 1 مم3 للخلايا حيث نمت معا سلالات اثنين والتصحيح على المجلس الأعلى للقضاء-لوي التقى، الحزب المجلس الأعلى للقضاء والمجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي ألواح وتنمو ح 24.
    ملاحظة: سوف تنمو diploids المرجوة على لوحات لوي-الحزب-المجلس الأعلى للقضاء. النمو في المجلس الأعلى للقضاء-لوي-اجتمع ولوحات الحزب المجلس الأعلى للقضاء بمثابة عنصر إيجابي لنمو الخميرة.
  5. ينمو ديبلويدس في 1 مل من المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي الوسائط بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. أنبوب الرواسب 500 ميليلتر الخلايا في 1.5 مل ميكروسينتريفوجي في س 2,348 ز، 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في ميكروسينتريفوجي. تجاهل المادة طافية بواسطة ماصة. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل الماء المعقم وكرر الترسب واستثارة. تحقق OD600 من الخلايا.
  6. جعل سلسلة من 01:10 تخفيف المسلسل لكل تعليق خلية باستخدام الماء المعقم مع بدء معظم يتركز الحل لكل منهما في التطوير التنظيمي 0.5. بقعة 5 ميليلتر لتمييع كل على طبق من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وطبق من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب ومن المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-3AT لوحة له +. احتضان عند 30 درجة مئوية وتفتيشها للنمو يوميا على مدى 3 أيام (الشكل 4).
    ملاحظة: بالنسبة 01:10 إضعاف المسلسل، "الماصة؛" 10 ميليلتر من الأنبوب الذي يحتوي على OD 0.5 إلى 90 ميليلتر من الماء ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تواصل بذل 01:10 تخفيف تسلسلي حتى يتوفر ما مجموعة ستة تركيزات مختلفة على الفور.

5-إنشاء السكان الخميرة مع الطعم ومكتبة فريسة

ملاحظة: لا رفيقه سلالة Y187 الذي يضم والبلازميدات مكتبة فريسة التجارية أيضا. وهكذا، أن الشروط الأمثل التالية مطلوبة للحفاظ على الطابع المعقد للمكتبة. PLY5725 سلالة فريسة Y2H التي تحتوي على مكتبات الأصحاب أفضل، ويمكن استخدام نفس الإجراء التزاوج مع هذه السلالة (الشكل 5).

  1. تلقيح مل 3 من الثقافات من كل من ترانسفورمانتس PJ69-4A تحمل مختلف TRP1-تتضمن اختطارها بتيف الطعم بلازميد في وسائل الإعلام الراديكالي المجلس الأعلى للقضاء في أنبوب ثقافة. وتشمل ثقافتين منفصلة تحتوي على بلازميد ناقل اختطارها بتيف وحدها لتكون بمثابة الضوابط الإجرائية. احتضان الثقافات عند 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة ح 6 وتمييع ثم إلى 25 مل ثقافة في قارورة Erlenmeyer عقيمة للنمو بين عشية وضحاها.
  2. ذوبان الجليد قنينة المجمدة (-80 درجة مئوية) من الخلايا التي تحتوي على LEU2ماتالفا-تحمل "فريسة" مكتبة في درجة حرارة الغرفة. تلقيح 125 مل وسائط المجلس الأعلى للقضاء-لوي-اجتمع في قارورة Erlenmeyer عقيمة مع القنينة كاملة المذابة. تنمو جميع الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: يلزم OD600 الثقافات بين عشية وضحاها تتراوح ما بين 1.0 إلى 1.5 قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
  3. الطرد المركزي 21 OD مكافئات لكل الثقافات ترانسفورمانت PJ69-4A مع 5 دقيقة تدور في 4,696 س ز في درجة حرارة الغرفة. لكل 10 ردود فعل التزاوج المطلوب، بيليه 39 OD600 مكافئات من سلالة ماتالفا تحمل والبلازميدات مكتبة منفصلة 50 مل من أنابيب مخروطية الشكل.
    1. ريسوسبيند الخلايا في 10 مل الماء المعقم وإعادة بيليه في الجديدة 50 مل من أنبوب مخروطي 4,696 س ز 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. استخدام ماصة، إزالة المادة طافية بلطف دون تعطيل الخلايا الأعلاف.
    2. ريسوسبيند الكريات الخلايا PJ69-4A في 4 مل من والخلايا PLY5725 في 10 مل بيبدا (3.7 درجة الحموضة).
  4. لإنشاء إضافة ردود فعل التزاوج، 1 مل من PJ69-4A تحول الخلايا ومل 1 من الخلايا التي تحتوي على مكتبة ماتالفا 1 مل من بيبدا الأس الهيدروجيني 3.7 إلى 50 مل جديدة من أنابيب مخروطية الشكل. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الانفعالات مداري لطيف (100-130 لفة في الدقيقة) لمدة 90 دقيقة.
    1. الطرد المركزي خلايا لمدة 5 دقائق في 4,696 س ز، في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. إزالة المادة طافية ماصة وريسوسبيند بيليه في 2 مل bYPDA:YPD 1:1. لوحة كل 2 مل من على لوحة YPD 100 ملم ماصة، واحتضان عند 30 درجة مئوية لحوالي 20 ح.
  5. حصاد الخلايا من لوحات YPD باستخدام مكشطة خلية إزاحة الخلايا إلى 2-3 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام. خلايا ماصة فكها إلى 50 مل أنبوب مخروطي. شطف لوحات 4-5 مرات مع 2-3 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام بيبيتينج حتى وسائل الإعلام استخدام 1000 ميليلتر "الماصة؛" وإخراج الوسائط بلطف عبر سطح لوحة YPD.
    1. الطرد المركزي خلايا لمدة 5 دقائق في 4,696 س ز في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي benchtop. تجاهل المادة طافية بواسطة ماصة وريسوسبيند الخلايا في 40 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام من بيبيتينج صعودا وهبوطاً (دو لا دوامة).
  6. لتقدير عدد الخلايا ضعفاني شكلت، يضعف 4 ميليلتر من خليط النباتات إلى 200 ميليلتر والإعلام المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي ميليلتر 2000. لوحة 200 ميليلتر لتمييع كل على طبق من ذهب المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي.
    ملاحظة: تمثل لوحات اثنين إضعاف إضعاف المضيفين و 1: 100.000 رصيد diploids المقطوع والغلة مستعمرات المتوقعة ~ 9,000-27,000 على لوحة تمييع المضيفين بعد الحضانة عند 30 درجة مئوية ل h. 36-40 لوحات الاختيار بعد الخطوة 5، 7. مطلوب عدد أدنى من المستعمرات 200 لوحة تمييع المضيفين المضي قدما إلى الخطوة 5، 8
  7. أخذ ما تبقى من كل 40 مل من استثارة الخلية على الفور وتلقيح مل 1,000 من قارورة Erlenmeyer الذي يحتوي على 500 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام. تأخذ التطوير التنظيمي أولى600. احتضان هذه قوارير عند 30 درجة مئوية مع الهز 180 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى الإشباع (~2.0 OD/mL). هذا يستغرق عادة حوالي 36-40 h. رصد النمو في 24 ساعة ثم مرة أخرى في ح 36 من OD600.
  8. استخدام ماصة، إزالة 20 مل مختبرين من كل من 500 مل مشبعة للثقافات وتطعيم مل 2,000 من قوارير Erlenmeyer، واحدة تحتوي على 750 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام وفي الثانية تحتوي على 750 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب مع أدنى مستوى من 3AT أن يزيل الخلفية (قرر سابقا في القسم 4-5). مزيج الثقافات الجديدة (770 مل) جيدا بدوامات وتأخذ التطوير التنظيمي أولى600.
  9. احتضان الثقافات عند 30 درجة مئوية بينما تهز 180 لفة في الدقيقة حتى وصلت إلى التشبع، والذي عادة ما يحدث خلال 24 ساعة للثقافة المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي غير محددة ويمكن أن يستغرق أكثر من 70 ح للثقافات ضمن التحديد للتفاعلات Y2H.
  10. متى وصلت الثقافات تشبع (OD ~ 2.0)، إزالة 11 مل من ماصة، الرواسب الخلايا مع 5 دقيقة تدور في س 4,696 ز في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية بواسطة ماصة، وتجميد في-20 درجة مئوية أو تستمر على استخراج الحمض النووي. عينات مختارة وغير محددة سواء ستستخدم لتسلسل عميق.

6-نموذج إعداد "تسلسل عميق ديبن"

  1. استخراج الحمض النووي.
    1. استخدام ماصة إلى ريسوسبيند الكريات الخلية من قسم البروتوكول 5.7 في 500 ميليلتر صق المخزن المؤقت ونقل إلى 1.5 مل أنبوب ميكروسينتريفوجي. إضافة 3 ميليلتر من بيتاميركابتوثانول و 10 ميليلتر للأوراق المالية زيمولاسي. يخلط جيدا واحتضانها في الحاضنات 37 درجة مئوية ح 24-36.
    2. استخراج العينة مرتين مع 500 ميليلتر الفينول/كلوروفورم/إيسواميل الكحول أثناء استخدام غطاء دخان16.
    3. إضافة ميليلتر 7 من 4 م كلوريد الصوديوم، ميليلتر 900 الجليد الباردة 100% إيثانول (ETOH)، ومزيج من انعكاس وأما تجميد-20 درجة مئوية، أو تواصل الرواسب الحمض النووي من الغزل في 21,130 س ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في ميكروسينتريفوجي.
    4. تجاهل المادة طافية بواسطة ماصة. أغسل بيليه ثلاث مرات مع ميليلتر 900 70% ETOH.
    5. بيليه 21,130 س ز 2 دقيقة الترسبات وإزالة بقايا ETOH الغسيل بواسطة ماصة. بيليه الجافة لمدة 7 دقائق في 42 درجة مئوية.
    6. ريسوسبيند بيليه في 120 ميليلتر من صق 0.1 x في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، ونفض الغبار أنابيب لخلط كل 30 دقيقة.
    7. "الماصة؛" 60 ميليلتر من الحمض النووي المستخرج في معقم 1.5 مل من أنبوب ميكروسينتريفوجي. إضافة 120 ميليلتر من الظريف، 3.5 ميليلتر رناسي بالمساكن، ونفض الغبار لخلط واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
    8. لكن استخدام الإيثانول متسرعا كما سبق القيام به في قسم 6.1.3-6.1.5، ميليلتر 7 من خلات الأمونيوم م 5 بدلاً من 4 م كلوريد الصوديوم.
    9. ريسوسبيند رناسي تعامل بالحمض النووي في 55 ميليلتر من صق 0.1 x في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، ونفض الغبار أنابيب لخلط كل 30 دقيقة من الحمض النووي كوانتيفي بامتصاص في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي.
  2. إدراج كدنا PCR.
    1. أداء اثنين، 50 ميليلتر بكر ردود فعل كل عينة الحمض النووي. كل رد يحتوي على 25 بمول لكل إلى الأمام وعكس التمهيدي مطابقة بلازميد فريسة-مكتبة (انظر المواد). ردود الفعل أيضا تحتوي على 25 ميليلتر من x PCR عالية الدقة 2 ميكس ماجستير، 5 ميكروغرام من عينات الحمض النووي، والمياه تصل إلى 50 ميليلتر. أسهب ردود الفعل لدورات 25 مع تمديد أوقات 3 دقيقة في 72 درجة مئوية، ودرجة حرارة أنيل من 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ويشوه عند 98 درجة مئوية يسبق س. 10 ركوب الدراجات جانب تمسخ s 30 98 درجة مئوية والمتابعة مع حضانة 5 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
    2. تحليل 4 ميليلتر بكر كل فعل 1% الحمض النووي [اغروس] هلام التفريد مع الحمض النووي [اغروس] هلام المحتوية على 0.2-0.5 ميكروغرام/مل أتبر17. تصور عينة الحمض النووي التي تضوء الأشعة فوق البنفسجية. وسوف تظهر عينات مختارة تشويه للحمض النووي حوالي 1-3 كيلو بايت، حيث يمكن إيجاد نمط النطاقات للعينات حيث كان هناك تفاعل Y2H (الشكل 6).
    3. الجمع بين مكررة PCR عينات وتنقية باستخدام أدوات تنقية PCR وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وتحديدها كمياً الحمض النووي بامتصاص في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي.

7-عمق التسلسل

ملاحظة: إعداد العينة وتعاقب على منصة تسلسل عميق متاح عادة في المرافق الأساسية تسلسل الحمض النووي التجارية والأكاديمية.

  1. نغ القص 600 منتج PCR باستخدام الترا عالية أداء-سونيكاتور لإعطاء الشظايا بطول ~ 300 شركة بريتيش بتروليوم.
  2. إنشاء تسلسل مفهرس المكتبات باستخدام مجموعة أدوات إعداد لتسلسل العميق أن يضيف linkers ترميز الرموز الشريطية، فتيلة المواقع، والتقاط تسلسل شكل غير متماثل على طرفي الشظايا من الحمض النووي.
  3. القيام بإعداد المكتبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تجمع فهرسة المكتبات والتسلسل كما يقرأ إقران نهاية فترة طويلة على منصة تسلسل عميق (مثلاً، 2 × 150 ما يلي: بي بي بي). العدد المطلوب من القراءات الموجهة لكل عينة ما بين 10 و 40 مليون، مع أكثر القراءات المطلوبة للسكان غير المحددة التي تكون عادة أكثر تعقيداً. نوصي بما يلي على الأقل 20 مليون أو أكثر للسكان غير محددة.

8-بيوينفورماتيك تجهيز والتحقق

  1. الحمض النووي عملية تسلسل البيانات في شكل فستق مع مجموعة من البرامج المستقلة برامج مبنية على (1) خريطة تسلسل قراءة الملفات في تنسيق عالمي سام (2) قياس تخصيب الجينات بين مجموعات البيانات (3) إجراء تحليل إحصائي للبيانات في النظام إلى مرتبة المرشح الذي الجينات إيجابية للتفاعل Y2H (4) تقديم معلومات بشأن ما region(s) وما هو الإطار متعدية الجنسيات كل من كدنا فريسة كل الجينات الشظايا التي تسفر عن إيجابية Y2H وتتكون التفاعلات، و (5) تقديم الأدوات اللازمة لإعادة بناء ليس فقط 5 'بل أيضا 3' نهاية أجزاء متفاعلة فيما بينها مما يسمح إعادة الإعمار والتحقق في شكل Y2H تقليدية. تشغيل هذه البرامج بالتفصيل في الدراسة المرفقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإنزيم Y2H وقد استخدمت على نطاق واسع لإيجاد تفاعلات البروتينات: البروتين، وقد وضعت عدة تكييفات ونظم. معظمها، أن نفس الاعتبارات التي تساعد على ضمان نجاح هذه النهج السابقة تعتبر هامة ديبن. بعض المعايير الهامة تشمل: ضمان التعبير عن مجال الحمض النووي ملزم البروتينات الانصهار، ضمان خلفية منخفضة زائفة له + النمو في ديبلويدس التي تحتوي على الطعم يحظى باهتمام بلازميد فريسة فارغة، كفاءة عالية التزاوج من الطعم التي تحتوي على الخميرة ماتا مع المكتبة التي تحتوي على الخميرة ماتالفا، وأخيراً، ظروف التقشف المنخفضة التي تتيح للسكان أن ينمو في ظل الظروف التي حدد للكثير من ردود الفعل الإيجابية Y2H، حتى تلك التي تنتج مستويات منخفضة من النشاط His3 وضعف استجابة النسخي Y2H.

أحد الجوانب الحاسمة ديبن هو تكاثر إدخال المكتبة Y2H إلى السلالات التي تحتوي على البلازميدات الطعم مختلف وحدد هؤلاء السكان لتلك والبلازميدات المكتبة التي تخلق إيجابية Y2H التفاعلات موثوق. وهذا يصبح أكثر صعوبة عندما يزيد من التعقيد في مكتبة Y2H نظراً لأنه من الصعب ضمان النقل الكافي لمكتبة بأكملها عبر مختلف قطاعات السكان الأولى. وبالإضافة إلى ذلك، حجم السكان اختارت أن تنمو تحت ظروف الاختيار وعمق التسلسل يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لمراقبة التغييرات استنساخه في تكوين بلازميد Y2H لتحديد التفاعلات Y2H إيجابية حقيقية موثوق بها. في دراسات سابقة، قمنا باستخدام مكتبات كدنا Y2H المتاحة تجارياً. وجدنا التغير في توزيع مكتبة Y2H بين السكان منفصلة تحمل والبلازميدات الطعم نفس منخفضة، مع أوفيرديسبيرسيون بين اثنين من السكان الأولية قبل اختيار < 0.01 عادة، و 0.35-0.55 لفصل السكان بعد التحديد4. ومع ذلك، الطابع المعقد لبعض من هذه المكتبات المتاحة تجارياً Y2H منخفضة إلى حد ما (الشكل 7). وبالإضافة إلى ذلك، العديد من استنساخ داخله (~ 60 ٪) هي مصنوع بالكامل من شظايا كدنا أن 3 ' منطقة الترميز، مما يحد من زيادة فائدتها. لإثبات أن الأساليب المذكورة أعلاه كانت قادرة على استيعاب أكثر تعقيداً Y2H المكتبات، وأنشأنا مكتبة Y2H جديدة في 'فريسة' مكافحة ناقلات بلازميد مبسطة (pGal4AD) التي تحتوي على شظايا من الحمض النووي من سيريفيسيا ساككاروميسيس (سلالة PLY5725). تم تجزئة الحمض النووي بالقص، الحجم المحدد لنطاقات من 600-1500 شركة بريتيش بتروليوم، تعديل مع محولات، وإدراجها في pGal4AD لإنشاء مكتبة SacCer_TAB Y2H (الشكل 8). تم تحويل المكتبة إلى PLY5725، الذي أنتج سكان خميرة التي تم تزاوج ثم فصل عينات ماتا PJ69-4A يحمل بلازميد اختطارها بتيف وحدها. كانت تزرع السكان مثنوية مكررة تحت ظروف غير انتقائية وانتقائية. إدراج مكتبة بلازميد Y2H حللت بتسلسل عميق. عند تعيينها إلى الحمض النووي يشمل 100 bp المنبع والمصب من البروتين كل ترميز المنطقة (84% الجينوم كله)، وجدنا > 1.1 مليون والبلازميدات مختلفة في مكتبة ليُقدّر حجم إجمالي للمكتبة في خميرة ~1.35 مليون مختلفة والبلازميدات. على سبيل مقارنة، نحن أيضا تحول من خميرة هو موضح سابقا الجينوم Y2H مكتبة11 (PJ_C1، C2، C3 Y2H مكتبة) في الخميرة ماتالفا، وتعرض عليه لنفس التحليل أعلاه. لقد وجدنا أن تعقيد مكتبتنا Y2H الخميرة جزء عشوائي أعلى بكثير وأكثر بكثير من البلازميدات ترميز الشظايا في الإطار لكل الجينات من المكتبة المنشورة سابقا (الشكل 9). الأهم من ذلك، كان جيل الأولى مكتبة تحتوي على السكان مثنوية استنساخه جداً مع أوفيرديسبيرسيون من < 0.01 (الشكل 10). وعلاوة على ذلك، تنتج إمكانية تكرار نتائج وجود السكان الخميرة منفصلة اثنين وجود مماثلة من البلازميدات بعد تحديد التفاعلات Y2H الإيجابية كانت جيدة جداً، مما أسفر عن أوفيرديسبيرسيون 0.3. وهكذا، استيعاب الأساليب هنا مكتبات Y2H أكبر من التعقيد أعلى من تلك التي كانت تستخدم من قبل.

من حيث زيادة سهولة ديبن، نحن نفضل استخدام التوليف الجيني لجعل إدراج الترميز للبروتين الطعم للفائدة. يسمح ترميز المناطق لنطاقات البروتين، والتركيبات، وطفرات لإدراجها بسهولة في Y2H الطعم والبلازميدات هذا، ولكن كما يسمح بها codons الأمثل للتعبير في S. cerevisiae. ويتجلى التعبير عن المجال Gal4-الحمض النووي--ربط مختلفة اثنين الانصهار البروتينات في الشكل 3. وأعدت اثنين ترانسفورمانتس الخميرة مختلفة عن أي من اثنين من البروتينات الانصهار الطعم ويتعرضون للحزب الديمقراطي الصربي صفحة وإيمونوبلوتينج مع حركة مضادة الأجسام المضادة. ملاحظة مستويات التعبير من البروتينات الطعم بالنسبة للمجال Gal4 الحمض النووي الملزمة وحدها من متجه فارغة. وجدنا أن من المهم ليس فقط للتحقق من التعبير عن البروتين الانصهار الطعم، ولكن أيضا للتحقق من التعبير في مستعمرة ترانسفورمانت الخميرة ماتا الدقيقة التي سيتم استخدامها لتوسيع ورفيقه إلى الخميرة التي تحتوي على مكتبة فريسة. مرة واحدة تم التعرف ترانسفورمانت، فمن الممكن تجميدها لأسفل وتخزينها لاستخدامها لاحقاً.

ويبين الشكل 4 اختبار للتنشيط الذاتي حيث يتم مطلي بإضعاف الخلايا ضعفاني مسلسل على المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي (+ له)، المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي-صاحب (-له)، والمجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي-له + 3AT (-له + 3AT) ألواح ويسمح له بالنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام. النتيجة المرجوة مراقبة النمو في الوجود ولكن ليس غياب الحامض الأميني بغض النظر عن ما إذا كان هناك 3AT. هذا وسوف تسمح باستخدام المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي-صاحب لتحديد للخميرة مع وجود تفاعل 2-هجين خميرة إيجابية. إذا كان هناك نمو في المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب اللوحات، ثم تشكيلة Y2H يمكن لا يزال الحصول على استخدام أدنى تركيز 3AT يمنع النمو. ونجد أن إذا يمكن تجميد النمو في المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي-صاحب + 0.1 مم 3AT، ثم الفحص ديبن المتابعة باستخدام هذا الشرط لتحديد التفاعلات Y2H. إذا، ومع ذلك، يتطلب تثبيط نمو ديبلويدس التي تحتوي على pGal4AD أو بلازميد فريسة فارغة أخرى وبلازميد الانصهار بتيف-اختطارها-الطعم تركيزات أعلى من 3AT، فإنه سوف يعرض للخطر أداء الإجراء ديبن وبلازميد طعم مختلف وينبغي التماس. علما أن بلده + النمو هو التحديد الوحيد لتفاعل إيجابي Y2H. وقد وجدنا أن هذه كافية لإثراء للتفاعلات Y2H دفعة واحدة.

أحد الإجراءات الأكثر أهمية في سير العمل ديبن تحقيق الكفاءة العالية التزاوج من الخميرة ماتا يحمل بلازميد الطعم مع الخميرة ماتالفا تحمل المكتبة فريسة Y2H. أننا وجدت أن بعض سلالات (مثلاً، Y187)18، الإسكان مكتبات كدنا المتاحة تجارياً، وكفاءة التزاوج فقيرة نسبيا. ولهذا السبب، نحن هندسيا سلالة القيام بالمكتبات Y2H. وتستند هذه السلالة BY4742، مشتق S288c. هذه السلالة يفتقر إلى GAL4، GAL80، TRP1، LEU2، و HIS3. أنه يحتوي على الصحفيين لا تستجيب لبروتين Gal4 هجين ولا هجين مختلفة (مثلاً، ليزا VP16). بدلاً من ذلك، مصدر الإنتاج الناجمة عن Y2H His3 يقع ضمن سلالة ماتا الذي سيحمل بلازميد الطعم خاصة. هذا يبسط النظام ويتيح قدرا أكبر من المرونة في أن واحد استخدام نفس الخلايا التي تحتوي على مكتبة ماتالفا لرفيقه بسلالة الإعراب عن بروتين انصهار ليزا-طعم ومراسل LexA(UAS)-HIS3 أو بروتين انصهار Gal4-دبد-طعم و Gal4 (UAS)-مراسلHIS3 .

حالما يتم إنشاؤها للسكان ضعفاني تحمل بلازميد طعم والمكتبة، فهي تضعف ويسمح للنمو في ظل الظروف التي حدد فقط لكلا البلازميدات (مثلاً، المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي) أو والبلازميدات وتفاعل إيجابي Y2H أن محركات إنتاج His3 (مثلاً، المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب). من المهم أن تبدأ مع كمية كبيرة من السكان الانطلاق لتجنب التطوري 'عنق الزجاجة' التي يمكن أن تحرف السكان أن النتائج بعد اختيارهم لتفاعل إيجابي Y2H. وهكذا، لدينا إجراءات تحدد باستخدام 20 مل من الخروج من 500 مل الثقافة السكاني ضعفاني لزراعتها في 750 مل الإعلام المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب الطازجة لتجنب هذه المشكلة. مع بتيف اختطارها بلازميد الطعم، وجدنا أن جولة واحدة من تمييع والنمو لا يكفي لتتطور سكان الزاخر بمعلومات. استخدام البلازميدات الطعم مختلف سابقا، استخدمنا جولتين من تمييع والنمو، أولى 20 مل من إلى 750 مل، وثم مشبعة 2 مل من أن الثقافة المخفف في 75 مل. ويبين الشكل 6 النتائج من [بكر] تضخيم عبر إدراج مكتبة للسكان مثنوية نمت تحت ظروف غير انتقائية، فضلا عن جولة متتالية الأولى والثانية من تمييع والنمو في حالة انتقائية لاثنين مختلفة بيت والبلازميدات. لاحظ أنه مع عدم التحديد، وهناك تشويه معمم لمنتجات PCR الإرشادية من خليط معقد وتطبيع جيدا نسبيا من الشظايا. عند التحديد، يتغير هذا النمط، مع بعض الأنواع إلى حد كبير في إثراء حتى أنه يمكن تمييز الفرق الفردية. درجة معينة من النطاقات نموذجية للتجارب الناجحة التي أجريت حتى الآن، ولكن نمط تشهير بالإضافة إلى أو بدلاً من نمط النطاقات، يدل على خليط معقد من إدراج فريسة ومرغوب فيه إذا كان أحد يرغب في زيادة عدد المرشحين أن الكشف عن ديبن. نمط النطاقات قوية جداً، حيث تم العثور على معظم المنتج بكر في نطاقات 1-3، تشير إلى أن معظم البيانات التسلسل سوف تهيمن فقط 1-3 فريسة إدراجات. واحد يمكن التعويض عن هذا جزئيا بتكريس ما يلي المزيد من هذه العينة. واحدة يمكن أن نرى أنه إذا كان السكان المخفف ونمت كذلك (انظر 'd2 المحدد' في الشكل 5)، نمط النطاقات أكثر بروزا، مما يشير إلى أن فريسة والبلازميدات منح التفاعلات Y2H ضعيفة ولكن أصيلة تتلاشى حين فريسة قلة مختارة والبلازميدات تتزايد كثرة. يعتبر تمييع المتعاقبة والنمو إلى هذا المستوى المفرط يؤدي إلى نتائج عكسية بهدف اصطياد أكبر عدد من المرشحين المحتملين، ومن ثم مع البروتوكول هنا، من المستحسن استخدام جولة واحدة من تمييع والنمو.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي لسير العمل ديبن. المخطط العام للإجراءات المختبرية التي تظهر على يسار جنبا إلى جنب مع الوقت التقريبي المطلوب لإكمال المهمة المطابق. على اليمين هو سير العمل المعلوماتية الحيوية باستخدام حزم البرمجيات ديبن و Stat_Maker. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التخطيطي من بتيف-اختطارها. TRP1--التي تحتوي على نسخة منخفضة Gal4 الحمض النووي ملزم المجال الانصهار البروتين التعبير بلازميد يرد. يتميز بالمروج TEF1 التأسيسي، حركة حانمه العلامة، اتبعت المجال Gal4 الحمض النووي ملزم T7 رنا بوليميراز ربط الموقع، بوليلينكير، وفاصل PRM9 داخل السنترومير (س)-على أساس بلازميد. هذا بلازميد تنطوي أيضا على مقاومة كاناميسين ومنشأ ColE1 الجرثومي للنسخ المتماثل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تعبير البروتينات الانصهار الطعم Gal4. ليساتيس من الخميرة معربا عن البروتينات الطعم المختلفة تنصهر فيها المجال Gal4 الحمض النووي ملزم المعرب عنها في بتيف-اختطارها تعرضوا للحزب الديمقراطي الصربي صفحة وإيمونوبلوتينج مع حركة مضادة الأجسام المضادة. بتيف-اختطارها يعرب فقط المجال Gal4-الحمض النووي-بيندنج وحدها؛ وتعرب عن بتيف-اختطارها-bait1 Gal4-الحمض النووي-بيندنج المجال تنصهر فيها روا تفتقر إلى موقعها برينيليشن ج-الطرفية والإسكان طفرة تأمينه في تكيف غتب زمنياً؛ بتيف-اختطارها-bait2 تعرب عن المجال Gal4-الحمض النووي-بيندنج تنصهر فيها روا تفتقر إلى موقعها برينيليشن ج-الطرفية والإسكان طفرة تأمينه في تشكيل الناتج المحلي الإجمالي زمنياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التنشيط الذاتي Test. ديبلويدس مصنوعة من الخلايا PJ69-4A تحمل والبلازميدات الطعم المشار إليها والخلايا PLY5725 يحمل بلازميد فريسة المشار إليه تسلسلياً المخفف ورصدت على لوحات ولوحات المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-أن المجلس الأعلى للقضاء المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-لوي-الحزب-3AT لوحات له + ونمت لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية. وكانت ترانسفورمانتس PJ69-4A المستخدمة للتزاوج الأول من كل زوج هو مبين في الشكل 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: التزاوج كفاءة Y187 مقابل PLY5725- رد فعل التزاوج بين PJ69-4A التي تحتوي على TRP1-التي تحتوي على ناقل الطعم و Y187 أو PLY5725 يحمل بلازميد فريسة قد أنجز. كانت مطلية بتخفيف المضيفين على المجلس الأعلى للقضاء-الحزب-لوي لتحديد ديبلويدس. سلالة PLY5725 يظهر أعلى كفاءة التزاوج من سلالة Y187 مع ~ 10 إضعاف إنتاج المزيد من المستعمرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: بكر إدراج مكتبة فريسة. الحمض النووي تم عزلها من مثنوية الخميرة التي تحتوي على مكتبة الجارحة التي كانت تزرع تحت ظروف غير انتقائية (المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب وسائل الإعلام) أو شروط تحديد لتفاعل إيجابي Y2H (المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب وسائل الإعلام). بكر عبر المكتبة إدراج يكشف عن فروق في مرجع إدراجات مختارة. وقد استخدمت جولتين من النمو الانتقائي. جولة أولية للنمو التي قدمتها إلى تمييع 20 مل من 500 مل الثقافة مثنوية في 750 مل من وسائل الإعلام المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الراديكالي غير انتقائية، وآخر 20 مل من إلى 750 مل من المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-صاحب وسائط الإعلام من أجل جولة أولية من النمو الانتقائي (d1). أعقب ذلك جولة إضافية من النمو (d2) أدلى بأخذ 2 مل ثقافة d1 وتمييع إلى 75 مل من وسائل الإعلام الانتقائي المجلس الأعلى للقضاء-لوي-الحزب-له. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: تعقد مكتبة كدنا Y2H. تحليل المحتوى لمكتبات فريسة كدنا Y2H الماوس المتوفرة تجارياً: مكتبة من كدنا الدماغ الماوس وواحد من الأنسجة الماوس متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: إنشاء مكتبة الجينوم يفتت خميرة Y2H. ألف التخطيطي الجمعية يصف مكتبة الجينوم يفتت خميرة في pGal4AD. الحمض النووي من سلالة PLY5725 كان عشوائياً المنفصمة ومتصلة مع Y-محولات المشار إليها ومتصلة إلى صفي قطع pGal4AD. ليجيشنز تحولت إلى البكتيريا للعائد 2.2 x 106 مستعمرات مستقلة جنبا إلى جنب، ونمت قبل عزلة على بلازميد الحمض النووي تشمل المكتبة SacCer_TAB Y2H. ب LEU2--التي تحتوي على بلازميد (pGal4AD) السكن Gal4 في مجال التنشيط النسخي يرد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: تعقد مكتبة الجينوم الخميرة Y2H. مكتبة الجينوم SacCer_TAB تحولت إلى سلالة ماتالفا PLY5725 و PJ_C1، C2، C3 مكتبة الجينوم الخميرة وتحولت إلى سلالة ΜΑΤalpha Υ187. وأدلى ديبلويدس هؤلاء السكان التزاوج لسلالة PJY69-4A. السكان قد نمت أجيال 10 وشظايا فريسة بكر تضخيم تعرضوا للتسلسل الفائق والتحليل. ويبين ألف مرتبة ترتيب القراءة الواحدة كل الجينات في مكتبات Y2H مقسوماً على ما يلي كل الجينات التي وجدت بتسلسل جينوم الخميرة. ونظرا لوفرة مكافئة لكل الجينات، سيكون كل الجينات قيمة 1. ب الرسم البياني يبين عدد والبلازميدات فريدة من نوعها للجينات ترميز جزء موجود في البروتين ترميز المنطقة (ORF) وفي الإطار السليم القراءة متعدية الجنسيات. جيم- مقارنة عدد والبلازميدات مختلفة في كل مكتبة ترميز الجينات الخميرة والنسبة من هذه وليست في الإطار الصحيح القراءة متعدية أو يتم إدراجها إلى الوراء. د قطع عرض المواقف ووفرة من الوصلات التي خريطة للجينات مثال (VPS8 و VPS16) وجدت البلازميدات في كل مكتبة. وتتم تسمية والبلازميدات مع اندماج الجينات الموجودة في الإطار الصحيح القراءة متعدية الجنسيات الأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
رقم 10: إمكانية تكرار نتائج ديبن مع مكتبة الجينوم الخميرة Y2H المعقدة. ألف أربعة من السكان مثنوية الخميرة مختلفة تم إنشاؤها بواسطة التزاوج مع مكتبة SacCer_TAB Y2H يقع في PLY5725، ونمت تحت ظروف غير انتقائية، ومتسلسلة. يقرأ كل الجينات لكل السكان المرسومة على حدة كدالة لترتيب رتبة متوسط القيمة عبر جميع السكان. باء يظهر على ما يلي كل الجينات بين عينتين بعد اختيارهم للتفاعلات Y2H إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم دليل لكيفية إجراء فحوصات Y2H دفعة واحدة باستخدام طرق محسنة. وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في الإجراء للمساعدة على ضمان أن سكان الخميرة التي ستوضع تحت التحديد ممثل مكتبة البداية وأن ما يكفي من السكان الخميرة انطلاق يستخدم الخضوع للتحديد للحد من تقلب . الأهم من ذلك، هذه المقاييس سهلة نسبيا لتحقيق جنبا إلى جنب مع تكييف أساليب ومواد الإنزيم Y2H تقليدية، مما يجعل هذا النهج متاحة لمعظم المختبرات مجهزة للبيولوجيا الجزيئية القياسية. ديبن يسمح التحديد من السكان فريسة المكتبة نفسه أثناء استخدام البلازميدات الطعم مختلف. ومن ثم، يمكن مقارنة مجموعة المرشحين المتفاعلة التي تنتج من تفاعل Y2H مع الطعم واحد مقابل آخر مباشرة. لأنه يتم استخدام تسلسل عميق، يمكن للمرء التحقق من تكوين مكتبة الانطلاق لكل السكان الخميرة الخاصة بالطعم واتبع في إثراء كل مرشح فريسة الجينات في المكتبة بشكل مستقل. تجهيز الدفعات يتيح الاستعلام عن نفس المكتبة ضد مختلف الطعوم بطريقة شبه كمي ثم يسمح أحد لحساب تصنيف الإحصائي4.

وهناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح. واحد أنه يجب الحصول على عدد كبير من ديبلويدس لضمان التمثيل الملائم للمكتبة فريسة Y2H مختلطة مع بلازميد الطعم كل الاهتمام. وقد تم تحسين التزاوج الإجراء الموضح هنا باختلاف العديد من المعلمات. لقد وجدنا أن التزاوج الإجراء الموضح هنا بعض سلالات البيت التجاري Y2H المكتبات رفيقه سيئة بشكل عام، ومع ذلك، يمكن أن تولد 2 × 106-2 × 107 ديبلويدس عند اتباعها، مما يتيح نقل كافية واستنساخه Y2H مكتبة في السكان. جانب حاسم آخر إجراء لضمان خلق تفاعل إيجابي Y2H بمفردها أو مع مجال التنشيط Gal4 الفارغة فريسة بلازميد بلازميد الطعم للفائدة لا. تطالب بطريقة اختيار تفاعل Y2H بالنمو في الغياب من الحامض الأميني فيه تفاعل Y2H إيجابي يدفع النسخ من HIS3 للسماح للخلايا لتكون له +. بينما بشكل روتيني يمكن إضافة فحوصات Y2H التقليدية 3AT مثبط تنافسي يقلل النمو الخلفية أو استخدام سائر الصحفيين3 وهذا الإجراء يعمل بشكل أفضل عندما يمكن أن تنمو خلايا مع ضعف Y2H التفاعلات وبالتالي زيادة الصرامة للنمو واختيار فقط للخلايا مع حدود التفاعلات Y2H قوية مرجع والبلازميدات الجارحة التي يمكن تحديدها. جانب حاسم آخر للتأكد من أن كمية كبيرة من السكان مثنوية انطلاق المستخدمة للنمو في ظل ظروف انتقائية وغير انتقائية لتجنب الاختناقات التطوري من أخذ العينات خطأ4 . بعد أحجام الثقافة وخلية الأرقام المحددة هنا سوف تساعد ضمان إمكانية تكرار نتائج ويقلل من الضوضاء.

أحد الأسباب أن النهج ديبن قوية أنه يمكن أن يتبع شاملة جميع والبلازميدات في مكتبة معينة فريسة لقدرتها على التفاعل مع الطعم للفائدة. وهكذا، هو أحد أوجه قصور ديبن تعقد المكتبة المستخدمة. لبعض المكتبات التجارية مثل تلك التي كنا هنا، وجدنا أن عدد والبلازميدات ترميز أجزاء النية من كدنا ORF الموجودة في نفس الإطار القراءة في مجال التنشيط Gal4 ما بين 3-6 × 104 مع تمثيل ~ 6,000-8,00 0 جينات مختلفة. ووجدنا أن قرابة 75 في المائة من هذه المكتبات الواردة الأجزاء المقابلة فقط لمناطق كدنا أن كانت 3 ' تسلسل الحمض النووي الترميز (CDS/ORF). وعلاوة على ذلك، ما يقرب من ثلث الجينات التي كانت الشظايا في المكتبة ليس لديه شيء التي تقابل المناطق ORF أو المنبع من ORF.

أحرزنا ثلاثة تغييرات أخرى إلى أسلوب ديبن. واحد هو سلالة ماتالفا جديدة التي يمكن أن تحمل 'فريسة' المكتبات داخل بلازميد TRP1 وأن الأصحاب أفضل بكثير من بعض السلالات التي تحتوي على مكتبة متاحة تجارياً مثل Y187. وهذا يساعد على ضمان نقل كاملة من السكان مكتبة لكل بيت من الفائدة. ونحن أيضا أدلى جديدة 'الطعم' التعبير بلازميد، الذي يختلف عن والبلازميدات تم وصفه مسبقاً باستخدام نسخة متغير على أساس 2µ العمود الفقري10. هنا يصف لنا بلازميد الشبكة نسخة منخفضة (بتيف-اختطارها) وتجد أن جولة واحدة من النمو الانتقائي يكفي لإثراء للتفاعل فريسة والبلازميدات. وأخيراً، يمكننا أن نبني ناقل مكتبة مبسطة 'فريسة' وتستخدم لإنتاج مكتبة عشوائي، يفتت المجينية Y2H عالي الكثافة ساكتشارومسيس cerevisiae، الذي ينبغي أن يكون مفيداً في المستقبل لاكتشاف ووصف التفاعلات amonst بروتينات الخميرة. عموما، أن التحسينات التي أدخلت على المواد والأدوات المعلوماتية الحيوية (الموصوفة في العمل المصاحبة) ديبن نهج طريقة موجوداً وممكناً، وكفاءة أداء شاشات Y2H شاملة ومقارنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

ونحن نشكر الموظفين داخل معهد "الوراثة البشرية" لإعداد مكتبة خ ع وتسلسلها. ونحن نشكر سنير آنيات لخبرتها في إعداد مكتبة الجينوم الشظايا لمكتبة بلازميد Y2H هنا. هذا العمل كان يدعمها في "المعاهد الوطنية للصحة": R21 المعاهد الوطنية للصحة EB021870-01A1 و "منحة مشروع بحوث جبهة الخلاص الوطني": 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 136، التفاعل البروتين، والجيل التالي التسلسل، تحليل تسلسل الحمض النووي، الخميرة 2-الهجين
شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter