Hier beschrijven we een protocol voor de decellularization van de saphenous ader met behulp van detergenten en recellularization door perfusie van het perifere bloed en het endotheel medium.
Vasculaire leidingen gebruikt tijdens de meeste vasculaire chirurgie zijn allogene of synthetische protheses die vaak leiden tot complicaties veroorzaakt door de immuunsuppressie en slecht bij. Weefselengineering biedt een nieuwe oplossing voor het genereren van gepersonaliseerde transplantaties met een natuurlijke extracellulaire matrix met de geadresseerde cellen met behulp van de methode van decellularization en recellularization. Laten we een gedetailleerde methode voor het uitvoeren van decellularization van de menselijke saphenous ader en recellularization door perfusie van perifeer bloed. De ader door zoogdierlevercellen 1% was decellularized Triton X-100, 1% tri-n-butyl-fosfaat (TnBP) en 2.000 Kunitz eenheden van deoxyribonuclease (DNase). Triton-X-100 en TnBP werden geperfundeerd op 35 mL/min. voor 4 h terwijl DNase was geperfundeerd op 10 mL/min bij 37 ° C gedurende 4 uur. De ader werd gewassen in ultrazuiver water en PBS en vervolgens gesteriliseerd in 0,1% Perazijnzuur zuur. Het was weer in PBS gewassen en geconditioneerd in endotheel medium. De ader was aangesloten op een bioreactor en geperfundeerd met endothelial medium met 50 IU/mL heparine voor 1 h. Recellularization werd uitgevoerd door vullen de bioreactor met vers bloed, met een 1:1 verdunde in Steen oplossing, en het toevoegen van endocriene klier afkomstige vasculaire Endotheel groeifactoren (80 ng/mL), fundamentele fibroblast groeifactoren (4 µL/mL) en acetyl salicylzuur (5 µg/mL). De bioreactor werd vervolgens verplaatst naar een incubator en geperfundeerd gedurende 48 uur bij 2 mL/min met behoud van glucose tussen 3-9 mmol/L. Later werd de ader met PBS gewassen, gevuld met endothelial medium en geperfundeerd voor 96 uur in de incubator. Behandeling met Triton X-100, TnBP en DNase decellularized de saphenous ader in 5 cycli. De decellularized ader keek wit in tegenstelling tot normale en recellularized aderen (licht rood). De Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring toonde de aanwezigheid van kernen alleen in de normale maar niet in decellularized aderen. In de recellularized ader toonde H & E-kleuring de aanwezigheid van cellen op het luminal oppervlak van de ader.
Vasculaire leidingen zijn vereist voor verschillende klinische omstandigheden zoals aneurysmata, halsslagader stenose en atherosclerose leidt tot ernstige vasculaire problemen. Chirurgen gebruiken autologe en allogene synthetische vasculaire conduits om te herstellen van de functionele bloedtoevoer. Hoewel het gebruik van autologe bloedvaten wordt nog steeds beschouwd als de ideale aanpak, is de beschikbaarheid in patiënten majorly beperkt. De alternatieven zoals allogene of synthetische transplantaties hebben diepgaande problemen met immunosuppressieve behandelingen en arme bij leidt tot reoperation1,2, resulterend in grote gezondheid economische lasten te landen. Weefselengineering van bloedvaten wil transplantaten voorzien van een natuurlijke homologe en autologe cellen. Dus, het ontvangende immuunsysteem herkent de getransplanteerde prothese als het zelf en aangezien zulke een transplantaat de natuurlijke eiwitten en cellen in de oorspronkelijke configuratie bevat, het beter kan functioneren in vergelijking met de huidige alternatieven. Weefsel ontworpen organen, zoals de blaas3, de urethra-4, de luchtpijp5en aders6,7, zijn met succes gebruikt in de kliniek.
Tissue engineering voor de productie van gepersonaliseerde transplantaten vereist een transplantaat van een donor, gevolgd door decellularization en recellularization. Decellularization is een veelbelovende technologie om de cellen van weefsels en organen8,9,10. Decellularization kunnen worden uitgevoerd door specifieke fysische, chemische en enzymatische methoden11 of door ze te combineren. Op optimaal gebruik van deze methoden, kunnen decellularized weefsels hebben soortgelijke structurele en functionele eiwitten in een soortgelijk aan inheemse weefsels extracellulaire matrix. Dergelijke organen beschikken over de intrinsieke vermogen ter verbetering van de bijlage, migratie, proliferatie en differentiatie van stamcellen inkomende.
Recellularization is een dynamisch proces van zaaien van de cellen in de prothese, en ontvangende stamcellen gebruikt kunnen worden voor klinische transplantatie. Stamcellen momenteel gebruikt voor dergelijke doeleinden omvatten het beenmerg, mesenchymale en orgel bewoners3,5,6. Dier en onderzoek gerichte studies hebben stamcellen uit mesenchymale afkomst die foetale en geïnduceerde pluripotente12,13,14 zijngebruikt. Dit proces vereist een bioreactor (een kamer die houdt de ader en biedt de nodige voorwaarden zoals temperatuur, gassen, pH en druk), cellen en kweekmedia. De uitdaging in recellularization is het verkrijgen van het benodigde aantal cellen van een bepaald type en een seeding strategie waaraan de cellen hele weefsel of orgaan bereiken kunnen. Hoewel geen volledige weefsel of orgaan structureel en functioneel is gegenereerd en beoordeeld tot nu toe verschillende verbeteringen op het gebied en de eerste resultaten tonen de toekomstige mogelijkheid15. De belangrijkste functie van de ader ligt in de luminal endotheel waarop de infiltratie van ontstekingscellen in weefsels en de middelste vlotte spier laag die helpt bij vernauwing en biedt ook de kracht om te houden van de bloeddruk16wordt beheerd. Studies hebben aangetoond dat tijdens schade, endothelialization optreedt wapendrager of vanuit het circuleren van endotheliale voorlopercellen (Spoon) in bloed17,18,19. Onze strategie voor recellularization van de aderen, is afhankelijk van de Spoon aanwezig in het bloed circuleren.
Weefselengineering van aders en slagaders werd uitgevoerd door verschillende groepen na verschillende decellularization en recellularization strategieën20,–21. Onze fractie heeft ook uitgevoerd en decellularization en recellularization strategieën voor iliac en de borstklieren aderen6,7ontwikkeld. Decellularization werd uitgevoerd door de beweging van de ader in Triton X-100, tri-n-butyl fosfaat (TnBP) en enzym deoxyribonuclease (DNase). De recellularization werd uitgevoerd met behulp van het beenmerg afgeleid endotheel en vlotte spier cellen6 of perifeer bloed7. De aderen recellularized door ofwel protocol toonde klinische belofte in functionele bloedtoevoer aan transplantatie van pediatrische patiënten te voorzien van extra-hepatische portal vein obstructie6,7.
Momenteel hebben we een gewijzigde versie van hetzelfde protocol voor de verbeterde en eenvoudige uitvoering van decellularization, recellularization en bioreactor behandeling van kleine diameter aderen. De huidige decellularization van het protocol vereist perfusie van detergentia door de ader met druk in plaats van agitatie met detergenten. Het recellularization-protocol omvat een extra stap van conditionering voor de verbetering van de cel adhesie en de toevoeging van factoren die de groei in het circulerende bloed voor de verbetering van de cel adhesie, voortbestaan en verspreiding. We hebben ook het ontwerp van de bioreactor met behulp van commercieel verkrijgbare producten verbeterd. In deze paper presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van het gewijzigde protocol voor het uitvoeren van decellularization en recellularization van menselijke saphenous aderen.
De techniek die hier gepresenteerd voor de decellularization van saphenous aderen is een gemakkelijke, eenvoudige en kosteneffectieve methode die kan ook worden toegepast op alle kleine diameter aderen zoals de navelstreng en de borstklieren aderen. De oplossingen van de decellularization en hun concentraties gebruikt bij deze methode zijn uit onze eerdere resultaten6,7. Hoewel we 5 cycli van decellularization aanraden, in bepaalde aderen merkten ook we volledige decellularization in 3 cycli. Echter, reproduceerbare resultaten werden verkregen met behulp van 5 cycli. Toepassing van dit protocol, we decellularized aderen van verschillende lengtes tot 30 cm met succes (ongepubliceerd resultaat). Opheffing van de oplossing van de decellularization uitlaat door 45 cm ontstaat een druk van 33 mmHg binnen de ader. In onze ervaring merkten we dit als een belangrijke stap in het decellularizing van de hele ader uniform en reproducibly in 5 cycli. De gekozen druk 3 keer hoger is dan de normale saphenous veneuze druk (5-10 mmHg) maar is dat hetzelfde als in de incompetente veins (spataderen),23. Bovendien, speculeren we dat deze hoge druk tot een significante kracht op ader muren leiden zal en kan, daarom, steun doeltreffender en sneller cel verwijderd.
Aangezien TnBP een organisch oplosmiddel is en onoplosbaar in water, het wasmiddel roeren totdat het wordt troebel belangrijk is; anders wordt een zwevende werkbalk het wasmiddel. Om dezelfde reden, om te houden van TnBP gemengd in oplossing, werd van het wasmiddel uitlaat buis geplaatst aan de bovenkant van de glazen pot met de uitlaat slang. Efficiënte verwijdering van TnBP uit de ader na het gebruik ervan in elke cyclus kan worden gezien door het ontbreken van drijvende TnBP druppels in het gewassen water. We hebben ook gemerkt dat de DNase stap overslaan ook een decellularized weefsel produceerde maar in enkele gevallen, een relatief hoog DNA-gehalte in het decellularized weefsel werd opgemerkt. Zoals hoge druk en hoge stroomsnelheid niet vereist voor efficiënte DNase activiteit zijn, mogen een lage perfusie tarief (10 mL/min) worden gebruikt. Een verschillende peristaltische pomp werd gebruikt als zijn kleinere formaat bij eenvoudige bediening van de installatie helpt. Aangezien we hebben gemerkt dat schade van de meeste cellen tijdens decellularization resultaten in cyclus 2, is het raadzaam de overslaan DNase behandeling tijdens cycli 1 en 3 (niet-gepubliceerde resultaat). Hoewel de karakterisering en de kwantificering van de extracellulaire matrix eiwitten werden niet uitgevoerd in dit manuscript, onze vorige ervaring met soortgelijke decellularization protocollen toonde het behoud van de biomechanische eigenschappen, extracellulaire matrix structuur en eiwitten7. Hoewel onze voorlopige kwantificering experimenten met deze aderen geproduceerd een vergelijkbaar resultaat (niet uitgegeven), zal onze reeds gepubliceerde resultaten dit vertrouwen versterken.
Recellularization met behulp van bloed is een handige en gemakkelijk proces voorbij uitgebreid beenmergcellen als men lang de tijden van cel-expansie, spontane mutaties in uitgebreide cellen, chirurgische invasie en ongemak voor de patiënt vermijden kan. Aangezien het is bekend dat endothelialization kan ook optreden Spoon blijven circuleren, we veronderstelde dat perfusie met bloed gevolgd door perfusie met endothelial medium zal voldoende zijn voor recellularization. De veiligheid van de weefsels van de ader ontworpen met behulp van een soortgelijke methode wordt gezien van succesvolle resultaten van transplantatie wanneer twee dergelijke aderen kinderen met extra hepatische portal vein obstructie7waren ingeplant. Wij speculeren dat de factoren die de groei in decellularized extracellulaire matrix de bijlage toestaat van de circulerende Spoon van bloed24. Recellularization van aderen volgens een vergelijkbaar protocol toonde aan dat cellen positief voor VEGF receptor-2 en cluster van differentiatie (CD) 14 op de lumen terwijl CD45 waarin cellen werden gezien in adventitia7. Wij denken ook dat een continue endothelial laag niet in alle gevallen kan worden waargenomen, vooral bij het gebruik van bloed van oudere en zieke patiënten, zoals het bekend is dat dergelijke personen gedaald aantal circulerende voorlopercellen cellen25. Echter we postuleren dat perfusie met de geadresseerde eigen bloed kan veel van de antigenen die blootstaan vanwege decellularization en kunnen dus verminderen de kans op nadelige ontstekingsreacties wanneer getransplanteerd in tegenstelling tot alleen verplanten maskeren decellularized van de bloedvaten. Daarnaast kunt bloedverspreiding storten verhoogde niveaus van groei factoren op de lumen en adventitia die op zijn beurt verhoogde aantallen werven kan van circulerende voorlopercellen, wat resulteert in een snelle proces van recellularization in vivo.
De voordelen van de bioreactor ontwerp gebruikt in deze studie zijn volledige autoclaaf, makkelijke montage, kosteneffectiviteit, eenvoudige bediening en de minste mogelijkheid van schade. In onze ervaring, met behulp van het huidige ontwerp, aders tot 10 cm in lengte waren recellularized. Hoewel veins maximaal 25 cm in lengte kunnen ook recellularized worden door het houden van de ader in “U” vorm binnen de bioreactor, dit moet worden gevalideerd. De bioreactor ontwerp toont dat de richting van de stroom in de ader tegen de zwaartekracht is en als zodanig is ontworpen, want het is de normale richting van de stroom voor deze aderen bij de mens. De 12 h perfusie van het endotheel middellange stap is aan de voorwaarde van de ader en verhogen de affiniteit voor bevestiging van inkomende Spoon. Toevoeging van extra heparine en perfusie voor 1 h verlaagt het risico van de vorming van bloedstolsels in de buizen tijdens bloedverspreiding.
De hoeveelheid bloed nodig is afhankelijk van de lengte van de ader. Het basisprincipe dat we voor bloed volume volgen is dat de ader moet worden ondergedompeld in het bloed. Tijdens het verwerken van bloed volumes die groter zijn dan 45 mL, kan occasionele mengen verplicht zijn om te voorkomen dat cel accumulatie in de bodem van de bioreactor. Wij toegevoegd Steens oplossing voor bloed omdat het bevat een hoog gehalte aan eiwitten en onderdelen die vereist zijn om weefsels gezonde tijdens orgaantransplantatie26,27. Toevoeging van VEGF en b-FGF is gunstig omdat ze krachtige angiogenic groeifactoren28 en hun aanwezigheid migratie, proliferatie en differentiatie van Spoon29,30,31,32 induceert . De hoeveelheid toegevoegd VEGF is gebaseerd op de resultaten van onze vorige ongepubliceerde waar de verspreiding van Spoon werd gezien op 80 ng/mL. Toevoeging van aspirine remt de activering van bloedplaatjes33 , daardoor verminderend de kansen van hun gehechtheid aan endothelial laag. Continue monitoring en toevoeging van glucose zal ook gunstig zijn voor celproliferatie en het voorkomen van hemolyse van rode bloedcellen.
Omdat slechts een eenvoudige bloedproef vereist van de ontvanger is, kan het worden beschouwd als een eenvoudig en haalbaar procedure vereisen minder technische expertise. Hoewel de hele procedure hieronder van start tot finish 20 dagen duurt, slaan de decellularized aderen als een van de plank product zal verkorten de procedure tot 8 dagen voor patiënten. Hoewel de opslag van decellularized aderen technisch doet geen afbreuk aan de efficiëntie van de recellularization, moet dan worden beoordeeld. Weefsel-engineered aderen gegenereerd na deze procedure kunnen worden gebruikt in de kliniek voor bypassoperaties, ter vervanging van gehinderd aderen, veneuze insufficiëntie leiden tot spataderen zonder de noodzaak voor immuun onderdrukking en waardoor een betere kwaliteit van leven voor de patiënt.
The authors have nothing to disclose.
Wij wil Professor Anders Jeppsson dank voor hulp met het verstrekken van de bloedvaten die in de experimenten worden gebruikt. Deze studie is gefinancierd door de toekenning van de LUA ALF aan SSH.
4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
Blood Glucose monitoring system – Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
Shaker | Ika | KS4000 i control | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Steen solution | Xvivo | 19004 | |
Suture | Agnthos | 14817 | |
Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |