Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de decellularization van de saphenous ader met behulp van detergenten en recellularization door perfusie van het perifere bloed en het endotheel medium.
Abstract
Vasculaire leidingen gebruikt tijdens de meeste vasculaire chirurgie zijn allogene of synthetische protheses die vaak leiden tot complicaties veroorzaakt door de immuunsuppressie en slecht bij. Weefselengineering biedt een nieuwe oplossing voor het genereren van gepersonaliseerde transplantaties met een natuurlijke extracellulaire matrix met de geadresseerde cellen met behulp van de methode van decellularization en recellularization. Laten we een gedetailleerde methode voor het uitvoeren van decellularization van de menselijke saphenous ader en recellularization door perfusie van perifeer bloed. De ader door zoogdierlevercellen 1% was decellularized Triton X-100, 1% tri-n-butyl-fosfaat (TnBP) en 2.000 Kunitz eenheden van deoxyribonuclease (DNase). Triton-X-100 en TnBP werden geperfundeerd op 35 mL/min. voor 4 h terwijl DNase was geperfundeerd op 10 mL/min bij 37 ° C gedurende 4 uur. De ader werd gewassen in ultrazuiver water en PBS en vervolgens gesteriliseerd in 0,1% Perazijnzuur zuur. Het was weer in PBS gewassen en geconditioneerd in endotheel medium. De ader was aangesloten op een bioreactor en geperfundeerd met endothelial medium met 50 IU/mL heparine voor 1 h. Recellularization werd uitgevoerd door vullen de bioreactor met vers bloed, met een 1:1 verdunde in Steen oplossing, en het toevoegen van endocriene klier afkomstige vasculaire Endotheel groeifactoren (80 ng/mL), fundamentele fibroblast groeifactoren (4 µL/mL) en acetyl salicylzuur (5 µg/mL). De bioreactor werd vervolgens verplaatst naar een incubator en geperfundeerd gedurende 48 uur bij 2 mL/min met behoud van glucose tussen 3-9 mmol/L. Later werd de ader met PBS gewassen, gevuld met endothelial medium en geperfundeerd voor 96 uur in de incubator. Behandeling met Triton X-100, TnBP en DNase decellularized de saphenous ader in 5 cycli. De decellularized ader keek wit in tegenstelling tot normale en recellularized aderen (licht rood). De Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring toonde de aanwezigheid van kernen alleen in de normale maar niet in decellularized aderen. In de recellularized ader toonde H & E-kleuring de aanwezigheid van cellen op het luminal oppervlak van de ader.
Introduction
Vasculaire leidingen zijn vereist voor verschillende klinische omstandigheden zoals aneurysmata, halsslagader stenose en atherosclerose leidt tot ernstige vasculaire problemen. Chirurgen gebruiken autologe en allogene synthetische vasculaire conduits om te herstellen van de functionele bloedtoevoer. Hoewel het gebruik van autologe bloedvaten wordt nog steeds beschouwd als de ideale aanpak, is de beschikbaarheid in patiënten majorly beperkt. De alternatieven zoals allogene of synthetische transplantaties hebben diepgaande problemen met immunosuppressieve behandelingen en arme bij leidt tot reoperation1,2, resulterend in grote gezondheid economische lasten te landen. Weefselengineering van bloedvaten wil transplantaten voorzien van een natuurlijke homologe en autologe cellen. Dus, het ontvangende immuunsysteem herkent de getransplanteerde prothese als het zelf en aangezien zulke een transplantaat de natuurlijke eiwitten en cellen in de oorspronkelijke configuratie bevat, het beter kan functioneren in vergelijking met de huidige alternatieven. Weefsel ontworpen organen, zoals de blaas3, de urethra-4, de luchtpijp5en aders6,7, zijn met succes gebruikt in de kliniek.
Tissue engineering voor de productie van gepersonaliseerde transplantaten vereist een transplantaat van een donor, gevolgd door decellularization en recellularization. Decellularization is een veelbelovende technologie om de cellen van weefsels en organen8,9,10. Decellularization kunnen worden uitgevoerd door specifieke fysische, chemische en enzymatische methoden11 of door ze te combineren. Op optimaal gebruik van deze methoden, kunnen decellularized weefsels hebben soortgelijke structurele en functionele eiwitten in een soortgelijk aan inheemse weefsels extracellulaire matrix. Dergelijke organen beschikken over de intrinsieke vermogen ter verbetering van de bijlage, migratie, proliferatie en differentiatie van stamcellen inkomende.
Recellularization is een dynamisch proces van zaaien van de cellen in de prothese, en ontvangende stamcellen gebruikt kunnen worden voor klinische transplantatie. Stamcellen momenteel gebruikt voor dergelijke doeleinden omvatten het beenmerg, mesenchymale en orgel bewoners3,5,6. Dier en onderzoek gerichte studies hebben stamcellen uit mesenchymale afkomst die foetale en geïnduceerde pluripotente12,13,14 zijngebruikt. Dit proces vereist een bioreactor (een kamer die houdt de ader en biedt de nodige voorwaarden zoals temperatuur, gassen, pH en druk), cellen en kweekmedia. De uitdaging in recellularization is het verkrijgen van het benodigde aantal cellen van een bepaald type en een seeding strategie waaraan de cellen hele weefsel of orgaan bereiken kunnen. Hoewel geen volledige weefsel of orgaan structureel en functioneel is gegenereerd en beoordeeld tot nu toe verschillende verbeteringen op het gebied en de eerste resultaten tonen de toekomstige mogelijkheid15. De belangrijkste functie van de ader ligt in de luminal endotheel waarop de infiltratie van ontstekingscellen in weefsels en de middelste vlotte spier laag die helpt bij vernauwing en biedt ook de kracht om te houden van de bloeddruk16wordt beheerd. Studies hebben aangetoond dat tijdens schade, endothelialization optreedt wapendrager of vanuit het circuleren van endotheliale voorlopercellen (Spoon) in bloed17,18,19. Onze strategie voor recellularization van de aderen, is afhankelijk van de Spoon aanwezig in het bloed circuleren.
Weefselengineering van aders en slagaders werd uitgevoerd door verschillende groepen na verschillende decellularization en recellularization strategieën20,-21. Onze fractie heeft ook uitgevoerd en decellularization en recellularization strategieën voor iliac en de borstklieren aderen6,7ontwikkeld. Decellularization werd uitgevoerd door de beweging van de ader in Triton X-100, tri-n-butyl fosfaat (TnBP) en enzym deoxyribonuclease (DNase). De recellularization werd uitgevoerd met behulp van het beenmerg afgeleid endotheel en vlotte spier cellen6 of perifeer bloed7. De aderen recellularized door ofwel protocol toonde klinische belofte in functionele bloedtoevoer aan transplantatie van pediatrische patiënten te voorzien van extra-hepatische portal vein obstructie6,7.
Momenteel hebben we een gewijzigde versie van hetzelfde protocol voor de verbeterde en eenvoudige uitvoering van decellularization, recellularization en bioreactor behandeling van kleine diameter aderen. De huidige decellularization van het protocol vereist perfusie van detergentia door de ader met druk in plaats van agitatie met detergenten. Het recellularization-protocol omvat een extra stap van conditionering voor de verbetering van de cel adhesie en de toevoeging van factoren die de groei in het circulerende bloed voor de verbetering van de cel adhesie, voortbestaan en verspreiding. We hebben ook het ontwerp van de bioreactor met behulp van commercieel verkrijgbare producten verbeterd. In deze paper presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van het gewijzigde protocol voor het uitvoeren van decellularization en recellularization van menselijke saphenous aderen.
Protocol
Het weefsel wordt gebruikt, en het protocol van dit document volgt de ethische richtsnoeren voor de Universiteit van Göteborg.
1. de weefsels bereiding en opslag
- Het omringende weefsel van de opgehaalde saphenous ader met behulp van chirurgische Tang en schaar te knippen.
Opmerking: De saphenous ader wordt doorsneden door vasculaire chirurgen van de onderste extremiteit van de mens. De saphenous ader gebruikt in dit document is een ongebruikte deel na de bypassoperatie. - Om te voorkomen lekkage tijdens perfusie, afbinden alle kant takken aan de uiteinden met hechtingen en pincet.
- Houd de ader in een tube van 50 mL met 40 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). De ader door het omzetten van PBS 2 - 3 keer in het verwijderen van overtollige bloed wassen. Opslaan van de ader door bevriezing bij-80 ° C.
2. bereiding van Decellularization opstellingen en Recellularization Bioreactor
Opmerking: Het gebruik van schaar, sneed de silicium-buizen zoals aangegeven in tabel 1.
-
Decellularization Setup 1 (voor Triton X-100 perfusie en wassen)
- Kamer met een 2 L (kunststof bad), alle drie stukken van buis A als weergegeven in figuur 1Atape.
Opmerking: Tape een buis naar een muur waar de rand de bodem van de kamer (wasmiddel de inlaat raakt) en de andere twee pijpen aan de tegenoverliggende muur met een afstand van 5-10 cm tussen afhankelijk van de lengte van de ader. Minstens 5 cm van deze buizen moeten ook worden geplakt is aan de vloer van de kamer (ader van inlaat en uitlaat). - Met behulp van de mannelijke en vrouwelijke Luer connectoren, sluit in serie van het wasmiddel inlaat buis voor de buis B gevolgd door buis F, buis C en tenslotte bij de inlaat van de ader. Plaats de buis F in de cassette van de peristaltische pomp ik.
- Neem een andere buis C en sluit het ene uiteinde aan op de wandcontactdoos van de ader. Plaats het andere uiteinde in de glazen pot met de onderste slang uitlaat die 45 cm boven de zaal (wasmiddel outlet) is geplaatst en tape om veilig te stellen. Nemen van buis G en sluit één uiteinde aan op de uitlaat van de slang van de glazen pot en plaats het andere uiteinde in de bedwelmingsruimte ader.
Opmerking: De afbeeldingen van de volledige installatie (rode pijlen), kamer en stroomrichting (witte pijlen) zijn getoond in figuur 1A.
- Kamer met een 2 L (kunststof bad), alle drie stukken van buis A als weergegeven in figuur 1Atape.
-
Decellularization Setup 2 (voor TnBP perfusie)
- Neem een 1 L glazen pot, en plaatst één uiteinde van de buis C (wasmiddel inlaat) in de pot, totdat de buis de bodem van de pot raakt.
- Sluit het andere uiteinde aan buis F gevolgd door buis C. plaats het andere uiteinde van de buis C in de kruik tot helft diepte (ader de inlaat). Plaats buis F in de cassette van peristaltische pomp ik.
- Neem buis D en plaats één uiteinde in de kruik (ader van outlet) tot de helft van de diepte en het andere uiteinde in de glazen pot met de onderste slang geplaatst op een hoogte van 45 cm vanaf de ader de inlaat (wasmiddel stopcontact). Tape wilt beveiligen, de inlaat en uitlaat buizen van het wasmiddel.
- Plaats de 1 L glazen pot op een magneetroerder en houden de magneet in de fles.
- Neem van buis G en sluit een uiteinde op de uitlaat van de slang van de glazen pot en plaats het andere uiteinde in 1 L glazen pot.
Opmerking: De afbeelding voor de volledige installatie (rode pijlen), kamer en stroom richting (witte pijlen) wordt weergegeven in figuur 1B.
-
Decellularization Setup 3 (voor DNase perfusie)
- Neem een fles van 250 mL en plaats van beide uiteinden van de buis C. plaats het middelste gedeelte van de buis in de cassette van peristaltische pomp II.
Opmerking: Ene uiteinde van de buis is de inlaat van de oplossing en het andere uiteinde van de buis is aangesloten bij de inlaat van de ader. Van de ader uitgang blijft vrij in oplossing. - Plaats van de hele installatie met inbegrip van de pomp bij 37 ° C. Het beeld van volledige installatie en stroomrichting is afgebeeld in Figuur 1 c.
- Neem een fles van 250 mL en plaats van beide uiteinden van de buis C. plaats het middelste gedeelte van de buis in de cassette van peristaltische pomp II.
-
Recellularization Bioreactor
- Houd klaar alle onderdelen zoals weergegeven in figuur 2A.
- Zoals aangetoond in figuur 2B, neemt het GLB 4-poorts en invoegen in elke haven, tube H (ader van stopcontact), tube ik (media inlaat) en tube J (ader de inlaat). Sluit het andere uiteinde van de buis H op de 4th -poort (media-outlet).
Opmerking: De weergave van het GLB van de 4-poorts vanaf de bovenkant wordt weergegeven in figuur 2C. Voor gemakkelijk inbrengen van buizen, snijd de randen tot een scherpe punt met een schaar. - Buig het andere uiteinde van de buis J in een U-vormige en binden met een hechtdraad. De vermindering connectoren verbinden met de innerlijke uiteinden van buizen H & J.
- Plaats de buis 60 mL met een vlakke base in de fles van 250 mL en plaats vervolgens de bovenstaande gemaakte setup in de buis zoals weergegeven in figuur 2D. Zoals blijkt uit figuur 2E, verbinding buizen K, E en K in serie. Sluit één buis K bij de inlaat van de ader en een andere buis K bij de inlaat van de media.
Opmerking: Het schema van de installatie, en de stroomrichting wordt gezien in figuur 2F. - De bioreactor steriliseren in autoclaaf.
3. bereiding van de oplossingen
- Oplossing 1 (10 x water): tot 1 L ultrazuiver water, voeg 2 g van natriumazide en 18,6 g ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Roer totdat zouten zijn opgelost.
- Oplossing 2 (1 x water): Breng 100 mL van oplossing 1 en 900 mL ultrazuiver water toe te voegen.
- Oplossing 3 (5 x Triton X-100): 950 ml ultrazuiver water, 50 mL Triton X-100, 1 g van natriumazide en 9.3 g EDTA toevoegen. Roer tot het is opgelost.
- Solutie 4 (1 x Triton X-100): Neem 200 mL van oplossing 3 en 800 mL ultrazuiver water toe te voegen.
- Oplossing 5 (1 x TnBP): Voeg 10 mL van TnBP met een pipet 10 mL tot 990 mL van oplossing 2.
- Oplossing 6 (40 Kunitz eenheden/mL DNase): toevoegen 2.000 Kunitz eenheden van DNaseI in 50 mL Dulbecco van fosfaat Buffer Saline met CaCl2 en MgCl2. Vers bereid en direct gebruiken.
- Oplossing (PBS) 7: 24 g natriumchloride, 0.6 g kaliumchloride, 4,32 g natriumfosfaat en 0,72 g kalium fosfaat toevoegen aan 3 L ultrazuiver water. Roer tot het is opgelost. Breng de pH op 7.4. 1 L van PBS in de autoclaaf steriliseren en bewaar afzonderlijk.
- Oplossing 8 (0,1% Perazijnzuur zuur): toevoegen aan 50 mL steriele oplossing 7, 50 µL van Perazijnzuur zuur. Vers bereid en direct gebruiken.
4. bereiding van Endothelial Medium
- Voeg 5 mL van L-glutamine, 5 mL van anti-anti, 50 mL van menselijk serum van de AB en alle componenten van EGM-2 groeifactor kit met uitzondering van foetale runderserum tot 500 mL van het medium van de MCDB131 onder de motorkap van een steriel.
5. decellularization van Saphenous ader
- Ontdooi de menselijke saphenous ader van-80 ° C bij kamertemperatuur. Opnieuw bevriezen bij-80 ° C en weer ontdooien bij kamertemperatuur.
- Een biopsie van 2 mm lengte met behulp van schaar te knippen en op te lossen in formaldehyde gedurende 24-48 uur bij kamertemperatuur. BIND elk uiteinde van de ader aan de weerhaken van een mannelijke en vrouwelijke Luer aansluiting met een hechtdraad.
- De ader verbinden met decellularization setup 1 en vul 1 L oplossing 2. Perfuse voor 15 min op 35 mL/min. Verwijder de inhoud van de setup.
- Voeg 1 liter oplossing 4 en perfuse voor 4 h op 35 mL/min. Verwijder de inhoud van de setup.
- Voeg toe 500 mL oplossing 2 en perfuse voor 5 min. Verwijder de inhoud van de setup. Herhaal deze stap. De ader verbreken perfusie setup 1 en perfusie setup 2 verbinden.
- Voeg 1 liter oplossing 5, zet de roerder en perfuse gedurende 4 uur bij 35 mL/min.
Opmerking: Oplossing 5 behartigt bewolkt draaien op de roerder en hele perfusie. - De ader verbreken perfusie setup 2 en wassen van de ader van buiten en van binnen met de spuit of een pipet 10 mL in 4 veranderingen ultrazuiver water voor 5-10 min.
- Sluit de ader perfusie Setup 3, voeg toe 50 mL oplossing van 6 en perfuse op 10 mL/min bij een kamer 37 ° C, voor 4 h. leeg van de inhoud van de setup en loskoppelen van de ader van de setup.
- De ader verbinden met perfusie setup 1, vul 1 L oplossing 2 en perfuse's nachts op 35 mL/min. Herhaal stap 5.4 naar 5,9 stap 4 keer (voor een totaal van 5 cycli). Neem een biopsie weer zoals vermeld in stap 5.2.
Opmerking: Skip stap 5.8 tweede deel in cycli 1 en 3. - Verwijder de inhoud van de setup. Vul 1 L oplossing 2 en perfuse gedurende 24 uur bij 35 mL/min. wijziging oplossing 2 na 12 h. Verwijder de inhoud van de setup. Vul 1L van het ultrazuiver water en perfuse gedurende 24 uur bij 35 mL/min. verandering het ultrazuiver water na 12 h.Empty de inhoud van de setup. Vul 1 L oplossing 7 en perfuse gedurende 24 uur bij 35 mL/min. wijziging oplossing 7 na 12 h.
6. verificatie van Decellularization
- De formaline vaste biopsieën in ultrazuiver water voor 15 min. proces in een weefsel processor standaardprotocollen na wassen en inbedden in paraffine22.
- Knip 5 µm delen gebruikend microtome en vlek met Meyers haematoxyline en 0,2% alcoholische eosine (H & E) na standaardprotocollen22.
- Bekijken onder een microscoop om te controleren voor het verlies van kernen in decellularized weefsel in vergelijking met normale weefsel.
7. recellularization
- Het steriliseren van de ader door deze te plaatsen in een tube van 50 mL met 50 mL oplossing 8. Agitate in 80 rotaties per minuut (rpm) in het roteerapparaat gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Omgaan met de ader onder de laminaire flow (LAF) kabinet voortaan te handhaven van de steriliteit. Overdracht van de ader met steriel pincet om een nieuwe tube van 50 mL, met 50 mL steriele oplossing 7 en 500 µL van anti-anti. Agitate zoals hierboven voor 12 h. verandering oplossing 7 ten minste tweemaal binnen-tussen.
- Met behulp van steriele pincet, de ader overbrengen in een nieuwe tube van 50 mL en voeg 50 mL van het endotheel media. Agitate zoals hierboven voor 11u.
- De bioreactor met behulp van steriele handschoenen onder de LAF-kast te monteren. Het binden van de ader van de bioreactor ader inlaat en uitlaat met steriel hechtdraad en pincet.
- Sluit de ader aan de bioreactor en vul met hetzelfde medium. Toevoegen van heparine bij 50 IU/mL en perfuse gedurende 1 uur bij 2 mL/min bij 37 ° C.
- Verzamelen van 15-25 mL vers bloed (afhankelijk van de ader van de lengte) van de donor in heparine gecoat vacutainer buizen en verdunnen 1:1 met Steen oplossing. Later toevoegen endocriene klier afkomstige vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF-EG, 80 ng/mL), fundamentele fibroblast groeifactor (b-FGF, 4 µL/mL) en acetyl salicylzuur (5 µg/mL).
- De bioreactor naar een incubator 37 ° C met 5% CO2 en perfuse voor 48 uur bij 2 mL/min.
- Ongeveer na 12u, naar de bioreactor een LAF-kast, een druppel bloed nemen en meten van glucose met behulp van een bloedglucose controle apparaat. Als het niveau minder dan 3 mmol/L is, voeg glucose om in het bereik van 7-9 mmol/L. Herhaal stap dit elke 8-12 h.
- Na 48u, verplaatsen de bioreactor in de LAF-kast en afvoer van het bloed uit de bioreactor. Voeg 30 mL steriele oplossing 7 en perfuse voor 5 min. Drain de oplossing. Voeg 30 mL steriele oplossing 7 en perfuse voor 5 min. Repeat tweemaal of totdat de bloedrode kleur verloren is.
Opmerking: De biopsie kan worden genomen voor de verificatie van de bijlage van de cel. Koppel de ader, snijd 5 mm randen van de ader met een schaar en deze verwijderen. Neem een biopsie zoals in stap 5.2 en de ader opnieuw verbinding te maken met de bioreactor (een optionele stap). - Voeg 30-45 mL endothelial medium en perfuse voor 96 uur in de incubator op 2 mL/min.
Opmerking: Voeg endothelial medium totdat de ader wordt ondergedompeld. - De bioreactor verplaatsen in de LAF-kast, koppel de recellularized ader, 5 mm randen van de ader met behulp van schaar te knippen en negeren. Neem een biopsie zoals in stap 5.2.
8. controle van Recellularization
- Volg de instructies in hoofdstuk 6 en het uitvoeren van H & E kleuring. De dia's onder een Microscoop voor de aanwezigheid van cellen onderzoeken.
Representative Results
De bruto morfologie van een normale ader is licht rood (figuur 3A). De rode kleur gaat verloren in progressieve decellularization cycli (cyclus 2, figuur 3B; cyclus 3, Figuur 3 c) en door de 5th -cyclus, het ziet er bleek en wit (figuur 3D). De recellularized ader na bloedverspreiding (figuur 3E) en endotheel media perfusie (figuur 3F) kijkt helder rood in kleur. De cellen verwijderd de 5 cycli van decellularization behandeling succesvol uit de ader zoals geen blauwe kernen in de H & E kleuring (figuur 4B) werden gezien. In tegenstelling, werden verschillende kernen gezien in de normale ader (figuur 4A). De aanwezigheid van de gekoppelde cellen aan de luminal kant wordt gezien in de H & E kleuring in recellularized geest met bloed voor 48 h (figuur 4C, zwarte pijlen) en na perfusie met het endotheel medium voor 96 h (figuur 3D, zwarte pijlen).
Figuur 1 : Montage van perfusie setups voor decellularization. A) de foto tonen de geassembleerde decellularization setup 1 voor Triton X-100 en wassen. De witte pijlen wijzen naar het pad van de stroom voor oplossingen en rode pijlen geven aan inhammen en afzetmogelijkheden voor ader en oplossingen. B) de afbeelding van de geassembleerde decellularization setup 2 voor TnBP perfusie. Ook, zoals in decellularization setup 1, witte pijlen geven aan dat het pad van de stroom voor oplossingen en rode pijlen geven aan inhammen en afzetmogelijkheden voor ader en oplossingen. C) de afbeelding van de geassembleerde decellularization setup 3 voor deoxyribonuclease perfusie. De witte pijlen wijzen naar het pad van de stroom voor oplossingen en rode pijlen geven aan inhammen voor ader en oplossingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Voorbereiding en montage van de bioreactor voor recellularization. A) foto weergegeven: materialen voor het samenstellen van de bioreactor vereist. B) foto van de binnenkant van de 4-poorts GLB tonen de plaatsing van de vermindering van de connectoren (rode pijlen), punten voor de verbinding van de ader inlaat en uitlaat (witte pijlen) en regeling van buizen H, I en J. Het vrije uiteinde van de buis H wordt in de bioreactor terugkomen media geplaatst. C) de respectieve buizen gaan in en uit kunnen worden gezien vanaf de bovenzijde van 4 poort GLB. D) afbeelding van de geassembleerde bioreactor. E) afbeelding van de hele bioreactor setup met de peristaltische pomp. De buizen K uitbreiden verbindingen uit de bioreactor met de slangenpomp F) de schematische weergave van de hele bioreactor perfusie systeem. De oranje pijlen geven de richting van de stroom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Bruto morfologie van aderen tijdens decellularization en recellularization. A) de bruto morfologie van normale ader kijkt helder rood in kleur. De kleur is verloren met het toenemend aantal cycli van de decellularization B) cyclus 2 en C) cyclus 3. D) door 5 cycli, de ader ziet er bleek en wit. De ader na zoogdierlevercellen met E) bloed voor 48 h en F) met het endotheel medium voor 96 uur ziet er weer helder rood in kleur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Karakterisering van decellularized en recellularized aderen. De Haematoxyline en eosine-kleuring beeld van A) normale ader bevat vele blauwe kernen maar ze afwezig zijn in B) decellularized ader. In de ader recellularized met C) bloed voor 48 h en met D) endothelial medium voor 96 h, bijlage van cellen (zwarte pijlen) bij lumen werd opgemerkt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De techniek die hier gepresenteerd voor de decellularization van saphenous aderen is een gemakkelijke, eenvoudige en kosteneffectieve methode die kan ook worden toegepast op alle kleine diameter aderen zoals de navelstreng en de borstklieren aderen. De oplossingen van de decellularization en hun concentraties gebruikt bij deze methode zijn uit onze eerdere resultaten6,7. Hoewel we 5 cycli van decellularization aanraden, in bepaalde aderen merkten ook we volledige decellularization in 3 cycli. Echter, reproduceerbare resultaten werden verkregen met behulp van 5 cycli. Toepassing van dit protocol, we decellularized aderen van verschillende lengtes tot 30 cm met succes (ongepubliceerd resultaat). Opheffing van de oplossing van de decellularization uitlaat door 45 cm ontstaat een druk van 33 mmHg binnen de ader. In onze ervaring merkten we dit als een belangrijke stap in het decellularizing van de hele ader uniform en reproducibly in 5 cycli. De gekozen druk 3 keer hoger is dan de normale saphenous veneuze druk (5-10 mmHg) maar is dat hetzelfde als in de incompetente veins (spataderen),23. Bovendien, speculeren we dat deze hoge druk tot een significante kracht op ader muren leiden zal en kan, daarom, steun doeltreffender en sneller cel verwijderd.
Aangezien TnBP een organisch oplosmiddel is en onoplosbaar in water, het wasmiddel roeren totdat het wordt troebel belangrijk is; anders wordt een zwevende werkbalk het wasmiddel. Om dezelfde reden, om te houden van TnBP gemengd in oplossing, werd van het wasmiddel uitlaat buis geplaatst aan de bovenkant van de glazen pot met de uitlaat slang. Efficiënte verwijdering van TnBP uit de ader na het gebruik ervan in elke cyclus kan worden gezien door het ontbreken van drijvende TnBP druppels in het gewassen water. We hebben ook gemerkt dat de DNase stap overslaan ook een decellularized weefsel produceerde maar in enkele gevallen, een relatief hoog DNA-gehalte in het decellularized weefsel werd opgemerkt. Zoals hoge druk en hoge stroomsnelheid niet vereist voor efficiënte DNase activiteit zijn, mogen een lage perfusie tarief (10 mL/min) worden gebruikt. Een verschillende peristaltische pomp werd gebruikt als zijn kleinere formaat bij eenvoudige bediening van de installatie helpt. Aangezien we hebben gemerkt dat schade van de meeste cellen tijdens decellularization resultaten in cyclus 2, is het raadzaam de overslaan DNase behandeling tijdens cycli 1 en 3 (niet-gepubliceerde resultaat). Hoewel de karakterisering en de kwantificering van de extracellulaire matrix eiwitten werden niet uitgevoerd in dit manuscript, onze vorige ervaring met soortgelijke decellularization protocollen toonde het behoud van de biomechanische eigenschappen, extracellulaire matrix structuur en eiwitten7. Hoewel onze voorlopige kwantificering experimenten met deze aderen geproduceerd een vergelijkbaar resultaat (niet uitgegeven), zal onze reeds gepubliceerde resultaten dit vertrouwen versterken.
Recellularization met behulp van bloed is een handige en gemakkelijk proces voorbij uitgebreid beenmergcellen als men lang de tijden van cel-expansie, spontane mutaties in uitgebreide cellen, chirurgische invasie en ongemak voor de patiënt vermijden kan. Aangezien het is bekend dat endothelialization kan ook optreden Spoon blijven circuleren, we veronderstelde dat perfusie met bloed gevolgd door perfusie met endothelial medium zal voldoende zijn voor recellularization. De veiligheid van de weefsels van de ader ontworpen met behulp van een soortgelijke methode wordt gezien van succesvolle resultaten van transplantatie wanneer twee dergelijke aderen kinderen met extra hepatische portal vein obstructie7waren ingeplant. Wij speculeren dat de factoren die de groei in decellularized extracellulaire matrix de bijlage toestaat van de circulerende Spoon van bloed24. Recellularization van aderen volgens een vergelijkbaar protocol toonde aan dat cellen positief voor VEGF receptor-2 en cluster van differentiatie (CD) 14 op de lumen terwijl CD45 waarin cellen werden gezien in adventitia7. Wij denken ook dat een continue endothelial laag niet in alle gevallen kan worden waargenomen, vooral bij het gebruik van bloed van oudere en zieke patiënten, zoals het bekend is dat dergelijke personen gedaald aantal circulerende voorlopercellen cellen25. Echter we postuleren dat perfusie met de geadresseerde eigen bloed kan veel van de antigenen die blootstaan vanwege decellularization en kunnen dus verminderen de kans op nadelige ontstekingsreacties wanneer getransplanteerd in tegenstelling tot alleen verplanten maskeren decellularized van de bloedvaten. Daarnaast kunt bloedverspreiding storten verhoogde niveaus van groei factoren op de lumen en adventitia die op zijn beurt verhoogde aantallen werven kan van circulerende voorlopercellen, wat resulteert in een snelle proces van recellularization in vivo.
De voordelen van de bioreactor ontwerp gebruikt in deze studie zijn volledige autoclaaf, makkelijke montage, kosteneffectiviteit, eenvoudige bediening en de minste mogelijkheid van schade. In onze ervaring, met behulp van het huidige ontwerp, aders tot 10 cm in lengte waren recellularized. Hoewel veins maximaal 25 cm in lengte kunnen ook recellularized worden door het houden van de ader in "U" vorm binnen de bioreactor, dit moet worden gevalideerd. De bioreactor ontwerp toont dat de richting van de stroom in de ader tegen de zwaartekracht is en als zodanig is ontworpen, want het is de normale richting van de stroom voor deze aderen bij de mens. De 12 h perfusie van het endotheel middellange stap is aan de voorwaarde van de ader en verhogen de affiniteit voor bevestiging van inkomende Spoon. Toevoeging van extra heparine en perfusie voor 1 h verlaagt het risico van de vorming van bloedstolsels in de buizen tijdens bloedverspreiding.
De hoeveelheid bloed nodig is afhankelijk van de lengte van de ader. Het basisprincipe dat we voor bloed volume volgen is dat de ader moet worden ondergedompeld in het bloed. Tijdens het verwerken van bloed volumes die groter zijn dan 45 mL, kan occasionele mengen verplicht zijn om te voorkomen dat cel accumulatie in de bodem van de bioreactor. Wij toegevoegd Steens oplossing voor bloed omdat het bevat een hoog gehalte aan eiwitten en onderdelen die vereist zijn om weefsels gezonde tijdens orgaantransplantatie26,27. Toevoeging van VEGF en b-FGF is gunstig omdat ze krachtige angiogenic groeifactoren28 en hun aanwezigheid migratie, proliferatie en differentiatie van Spoon29,30,31,32 induceert . De hoeveelheid toegevoegd VEGF is gebaseerd op de resultaten van onze vorige ongepubliceerde waar de verspreiding van Spoon werd gezien op 80 ng/mL. Toevoeging van aspirine remt de activering van bloedplaatjes33 , daardoor verminderend de kansen van hun gehechtheid aan endothelial laag. Continue monitoring en toevoeging van glucose zal ook gunstig zijn voor celproliferatie en het voorkomen van hemolyse van rode bloedcellen.
Omdat slechts een eenvoudige bloedproef vereist van de ontvanger is, kan het worden beschouwd als een eenvoudig en haalbaar procedure vereisen minder technische expertise. Hoewel de hele procedure hieronder van start tot finish 20 dagen duurt, slaan de decellularized aderen als een van de plank product zal verkorten de procedure tot 8 dagen voor patiënten. Hoewel de opslag van decellularized aderen technisch doet geen afbreuk aan de efficiëntie van de recellularization, moet dan worden beoordeeld. Weefsel-engineered aderen gegenereerd na deze procedure kunnen worden gebruikt in de kliniek voor bypassoperaties, ter vervanging van gehinderd aderen, veneuze insufficiëntie leiden tot spataderen zonder de noodzaak voor immuun onderdrukking en waardoor een betere kwaliteit van leven voor de patiënt.
Disclosures
SSH bezit aandelen in Verigraft, een bedrijf dat de technologie van tissue engineering bloedvaten heeft een licentie. De andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij wil Professor Anders Jeppsson dank voor hulp met het verstrekken van de bloedvaten die in de experimenten worden gebruikt. Deze studie is gefinancierd door de toekenning van de LUA ALF aan SSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
References
- Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).
- O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
- Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
- Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).
- Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).
- Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).
- Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).
- Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).
- L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).
- Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).
- van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).
- Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).
- Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).
- Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).
- Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).
- Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).
- Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).
