Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول ديسيلولاريزيشن الوريد الصافن باستخدام المنظفات وريسيلولاريزيشن نضح الدم المحيطي والمتوسطة بطانية.
Abstract
قنوات الأوعية المستخدمة خلال معظم جراحات الأوعية الدموية هي الطعوم متمكنة أو الاصطناعية التي غالباً ما تؤدي إلى المضاعفات الناجمة عن الكبت المناعي وسالكيه الفقيرة. هندسة الأنسجة يقدم حلاً رواية لتوليد الطعوم شخصية مع مصفوفة خارج الخلية طبيعية التي تحتوي على الخلايا للمستلم باستخدام أسلوب ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن. نعرض طريقة مفصلة لأداء ديسيلولاريزيشن البشرية الوريد الصافن وريسيلولاريزيشن قبل التروية الدموية المحيطية. كان ديسيلولاريزيد الوريد بنسبة 1% بيرفوسينج X-100 تريتون، 1% تراي-ن-بوتيل-الفوسفات (تنبب) و 2000 [كونيتز] وحدة من ديوكسيريبونوكليسي (الدناز). كانت perfused Triton X-100 وتنبب في الدقيقة 35 مل ح 4 بينما كان perfused الدناز في 10 مل/دقيقة عند 37 درجة مئوية ح 4. وعلى المنوال غسلها في الماء عالي النقاوة وبرنامج تلفزيوني وتعقيمها ثم في حمض الاستيك 0.1%. وكان غسلها مرة أخرى في برنامج تلفزيوني وإخضاع في المتوسط بطانية. كان متصلاً مفاعل حيوي الوريد و perfused مع بطانية المتوسطة التي تحتوي على 50 وحدة دولية/مل أنجز الهيبارين ل 1 h. ريسيلولاريزيشن بملء مفاعل حيوي بدماء جديدة، المخفف 1:1 في حل ستين، وإضافة المستمدة من الغدة الصماء والأوعية الدموية عوامل النمو غشائي (80 نانوغرام/مل) وعوامل النمو الأساسية تنتجها الخلايا الليفية (4 ميليلتر/mL) أسيتيل حمض الصفصاف (5 ميكروغرام/مل). مفاعل حيوي ثم انتقلت إلى حاضنة و perfused ح 48 في 2 مل/دقيقة مع الحفاظ على السكر بين 3-9 ملمول/ل. في وقت لاحق، على المنوال كان غسلها مع برنامج تلفزيوني ومليئة ببطانية المتوسطة و perfused ح 96 في الحاضنة. المعاملة مع Triton X-100 وتنبب الدناز ديسيلولاريزيد الوريد الصافن في 5 دورات. السياق ديسيلولاريزيد بدت بيضاء على عكس الأوردة العادية وريسيلولاريزيد (أحمر فاتح). الهيماتوكسيلين & ويوزين (H & E) تلطيخ أظهرت وجود نواة فقط في العادي ولكن ليس في الأوردة ديسيلولاريزيد. في السياق ريسيلولاريزيد، ح & ه تلطيخ أظهرت وجود خلايا على سطح لومينال الوريد.
Introduction
قنوات الأوعية الدموية مطلوبة من أجل العديد من الشروط السريرية مثل تمدد الأوعية الدموية وتضيق الشريان السباتي وتصلب الشرايين مما يؤدي إلى مشاكل حادة في الأوعية الدموية. الجراحين استخدام قنوات الأوعية الدموية ذاتي، متمكنة أو الاصطناعية لاستعادة إمدادات الدم الوظيفية. على الرغم من أن استخدام الأوعية الدموية الذاتي لا يزال ينظر في النهج المثالي، والتوافر في المرضى الذين يقتصر مجورلي. البدائل مثل الطعوم الاصطناعية أو متمكنة فيها مشاكل عميقة مع العلاجات المثبطة للمناعة وسالكيه الفقيرة مما يؤدي إلى ريوبيريشن1،2، أسفر عن الصحة الرئيسية الأعباء الاقتصادية للبلدان. هندسة الأنسجة من الأوعية الدموية يهدف إلى توفير الطعوم مع التماثل طبيعي وخلايا ذاتي. وهكذا، المناعي المتلقية تسلم الاختلاس زرع بالذات ومنذ هذه طعم يحتوي على البروتينات الطبيعية والخلايا في التكوين الأصلي، قد تعمل على نحو أفضل بالمقارنة مع البدائل الحالية. هندسة الأنسجة الأجهزة، مثل المثانة3مجرى البول4،5من القصبة الهوائية والاوردة6،7، قد استخدمت بنجاح في العيادة.
هندسة الأنسجة لإنتاج الطعوم شخصية يتطلب طعم من مانح متبوعاً ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن. ديسيلولاريزيشن تكنولوجيا واعدة لإزالة الخلايا من الأنسجة والأعضاء9،،من810. يمكن إجراء ديسيلولاريزيشن بالطرق الفيزيائية والكيميائية والانزيميه المحددة11 أو بالجمع بينها. في الاستخدام الأمثل لهذه الأساليب، يمكن أن يكون ديسيلولاريزيد الأنسجة البروتينات الهيكلية والوظيفية المماثلة في مصفوفة خارج الخلية مماثلة لانسجة أصلية. هذه الأجهزة تملك القدرات الجوهرية لتعزيز مرفق والهجرة، وانتشار، وتمايز الخلايا الجذعية واردة.
ريسيلولاريزيشن عملية دينامية لبذر الخلايا إلى الفساد، ويمكن استخدام الخلايا الجذعية المتلقية لزرع السريرية. وتشمل الخلايا الجذعية المستخدمة حاليا لمثل هذه الأغراض نخاع العظام، والوسيطة وهيئة المقيمين3،،من56. وقد استخدمت الحيوان والدراسات الموجهة نحو البحوث الخلايا الجذعية من أصول الوسيطة التي تكون الجنين والمستحثه pluripotent12،،من1314. وتتطلب هذه العملية مفاعل حيوي (غرفة التي تحمل على المنوال ويوفر الشروط اللازمة مثل درجة الحرارة والغازات والحموضة والضغط)، خلايا وثقافة الإعلام. هو التحدي في ريسيلولاريزيشن للحصول على العدد المطلوب من الخلايا من نوع معين، واستراتيجية نثر البذور التي يمكن أن تصل إلى خلايا الأنسجة كاملة أو الجهاز. على الرغم من لا أنسجة كاملة أو الجهاز وقد ولدت هيكلياً ووظيفيا وتقييمها حتى الآن، عدة أوجه التقدم في هذا الميدان والنتائج الأولية تظهر إمكانية المستقبل15. المهمة الرئيسية لهذا السياق يكمن في البطانة لومينال الذي يتحكم بتسلل خلايا التحريضية إلى الأنسجة وطبقة العضلات الملساء الأوسط الذي يساعد في انقباض، وتوفر أيضا قوة إجراء ضغط الدم16. وقد أثبتت الدراسات أن endothelialization يحدث أثناء الضرر، من ملامسة أو من تعميم خلايا السلف غشائي (ابكس) في الدم17،،من1819. استراتيجيتنا ريسيلولاريزيشن الأوردة يعتمد على ابكس الحالية في تعميم الدم.
هندسة الأنسجة للاوردة والشرايين أجريت عدة مجموعات في أعقاب مختلف ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن استراتيجيات20،21. كما يؤديها مجموعتنا ووضع استراتيجيات للاوردة الحرقفي والثديية6،7ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن. وأجرى ديسيلولاريزيشن بالانفعالات الوريد في تريتون X-100، تراي-ن-بوتيل الفوسفات (تنبب)، وإنزيم ديوكسيريبونوكليسي (الدناز). وأجرى ريسيلولاريزيشن استخدام نخاع العظام تستمد العضلات بطانية والسلس خلايا6 أو الدم المحيطي7. ريسيلولاريزيد الأوردة أما بروتوكول تبشر السريرية في توفير إمدادات الدم الوظيفية في زرع للأطفال المرضى بانسداد الوريد البابي خارج الكبد6،7.
وقد وضعنا حاليا نسخة معدلة من نفس البروتوكول لأداء محسن وسهلة للتعامل مع ديسيلولاريزيشن، وريسيلولاريزيشن، ومفاعل حيوي عروق صغيرة القطر. بروتوكول ديسيلولاريزيشن الحالي يتطلب نضح المنظفات عن طريق الوريد باستخدام الضغط بدلاً من إثارة الشغب مع المنظفات. ويشمل البروتوكول ريسيلولاريزيشن خطوة إضافية من preconditioning لتحسين الالتصاق الخلية وإضافة عوامل النمو في تعميم للدم من أجل تحسين التصاق الخلايا والبقاء على قيد الحياة وانتشار. ونحن قد تحسنت أيضا تصميم مفاعل حيوي باستخدام المنتجات المتاحة تجارياً. في هذه الورقة، نقدم وصفاً مفصلاً للبروتوكول المعدل لأداء ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن للاوردة الصافن البشرية.
Protocol
تستخدم الأنسجة، والبروتوكول لهذه الورقة فيما يلي المبادئ التوجيهية الأخلاقية بجامعة غوتنبرغ.
1-الأنسجة التحضير والتخزين
- قطع الأنسجة المحيطة من الوريد الصافن تم استردادها باستخدام الملقط الجراحي ومقص.
ملاحظة: يتم تشريح الوريد الصافن من الجزء السفلي من البشر من جراحي الأوعية الدموية. الوريد الصافن المستخدمة في هذه الورقة جزء غير المستخدمة بعد عملية جراحية. - لمنع التسرب أثناء التروية، اضطر جميع الفروع الجانبية في أهدافها مع خياطة الجروح والملقط.
- الاحتفاظ الوريد في أنبوب 50 مل يحتوي على 40 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS). أغسل الوريد عن طريق تغيير برنامج تلفزيوني 2-3 مرات لإزالة الدم الزائد. تخزين على المنوال بالتجميد في-80 درجة مئوية.
2-إعداد الأجهزة ديسيلولاريزيشن ومفاعل حيوي ريسيلولاريزيشن
ملاحظة: باستخدام مقص، قص الأنابيب السليكون كما هو مبين في الجدول 1.
-
الإعداد ديسيلولاريزيشن 1 (لنضح X-100 تريتون والغسيل)
- إلى ل 2 غرفة (الحوض البلاستيك)، الشريط كل ثلاث قطع من الأنبوب A كما هو مبين في الشكل 1 ألف.
ملاحظة: الشريط أنبوب واحد لجدار واحد حيث يلامس الحافة الجزء السفلي من الدائرة (مدخل للمنظفات) واثنان أنابيب أخرى إلى الحائط المقابل بمسافة 5-10 سم بين اعتماداً على طول الوريد. كما ينبغي أن تكون مسجلة 5 سم على الأقل من هذه الأنابيب الكلمة للدائرة (مدخل ومخرج) في الوريد. - باستخدام موصلات اللوير الذكور والإناث، الاتصال في سلسلة مدخل للمنظفات متبوعاً ب أنبوب إلى أنبوب أنبوب أنبوب ج و وأخيراً إلى مدخل الوريد. مكان الأنبوب و في الكاسيت لتحوي مضخة أنا.
- أخذ أنبوب آخر ج وتواصل واحدة من نهاية للتيار الاتجاه. وضع الطرف الآخر في جرة زجاجية مع مخرج الخرطوم السفلي يوضع 45 سم فوق الدائرة (منفذ المنظفات) والشريط لتأمين. أخذ أنبوب ز ودفع واحدة من نهاية مأخذ خرطوم جرة الزجاج ووضع الطرف الآخر في قاعة الوريد.
ملاحظة: الصور لإكمال الإعداد (الأسهم الحمراء)، ودائرة، واتجاه تدفق (الأسهم البيضاء) ويبين الشكل 1A.
- إلى ل 2 غرفة (الحوض البلاستيك)، الشريط كل ثلاث قطع من الأنبوب A كما هو مبين في الشكل 1 ألف.
-
الإعداد ديسيلولاريزيشن 2 (نضح تنبب)
- وعاء زجاجي 1 لتر، ومكان واحدة من نهاية الأنبوب ج (مدخل المنظفات) في الجرة حتى يلامس الأنبوب السفلي الجرة.
- توصيل الطرف الآخر للأنبوب و تليها أنبوب جيم مكان الطرف الآخر من الأنبوب ج في الجرة حتى عمق نصف (المدخل في الوريد). وضع أنبوب و في الكاسيت مضخة تمعجية أنا.
- أخذ أنبوب د ووضع نهاية واحدة في الجرة (المنفذ في الوريد) حتى عمق نصف والطرف الآخر في جرة زجاجية مع خرطوم أسفل توضع على ارتفاع 45 سم من مدخل على المنوال (منفذ المنظفات). لتأمين، الشريط الأنابيب مدخل ومخرج للمنظفات.
- وضع جرة زجاجية 1 لتر على محرض مغناطيسية وإبقاء المغناطيس داخل الزجاجة.
- أخذ أنبوب ز ودفع نهاية واحدة على منفذ خرطوم جرة الزجاج ووضع الطرف الآخر في جرة زجاجية 1 لتر.
ملاحظة: الصورة لإكمال الإعداد (الأسهم الحمراء)، يظهر اتجاه الدائرة وتدفق (الأسهم البيضاء) في الشكل 1B.
-
الإعداد ديسيلولاريزيشن 3 (نضح الدناز)
- تأخذ زجاجة زجاج 250 مل ووضع طرفي أنبوب مكان جيم المنطقة الوسطى من الأنبوب في الكاسيت مضخة تمعجية الثاني.
ملاحظة: واحدة من نهاية الأنبوب هو مدخل الحل والنهاية الأخرى للأنبوب متصلاً بمدخل على المنوال. ويترك منفذاً على المنوال مجاناً في الحل. - ضع الإعداد كلها بما في ذلك ضخ عند 37 درجة مئوية. ويبين الشكل 1الصورة لإكمال الإعداد واتجاه تدفق.
- تأخذ زجاجة زجاج 250 مل ووضع طرفي أنبوب مكان جيم المنطقة الوسطى من الأنبوب في الكاسيت مضخة تمعجية الثاني.
-
مفاعل حيوي ريسيلولاريزيشن
- تبقى على استعداد جميع أجزاء كما هو مبين في الشكل 2 ألف.
- كما هو مبين في الشكل 2 (ب)، تتخذ غطاء 4 منافذ وإدراج في كل منفذ وأنبوب ح (المنفذ في الوريد) وأنبوب أنا (مدخل الإعلام) وأنبوب J (المدخل في الوريد). إدراج الطرف الآخر من أنبوب ح في منفذال 4 (وسائل الإعلام).
ملاحظة: عرض الحد الأقصى 4-منفذ من الجزء العلوي ليظهر في الشكل 2. لسهولة الإدراج من الأنابيب، قطع الحواف نقطة حادة مع مقص. - ثني الطرف الآخر من أنبوب ي في شكل U والتعادل مع خياطة الجروح. الاتصال الموصلات الحد الداخلي نهايات أنابيب ح & ج.
- ضع الأنبوب 60 مل مع قاعدة مسطحة في زجاجة زجاج 250 مل ومن ثم ضع الإعداد جعلت أعلاه في الأنبوب كما هو موضح في الشكل 2D. كما هو موضح في الشكل 2E، قم بتوصيل أنابيب K و E و K في السلسلة. قم بتوصيل أنبوب واحد ك إلى مدخل على المنوال وأنبوب آخر ك إلى مدخل وسائل الإعلام.
ملاحظة: يعتبر الرسم التخطيطي للإعداد، واتجاه التدفق في الشكل 2 واو. - تعقيم في مفاعل حيوي بالتعقيم.
3-إعداد الحلول
- حل 1 (10 x المياه): إضافة إلى 1 لتر من الماء عالي النقاوة، ز 2 من أزيد الصوديوم و 18.6 g حمض الإيثيلين (يدتا). يقلب حتى يتم حل الأملاح.
- حل 2 (1 x المياه): تأخذ 100 مل من محلول 1 وإضافة 900 مل من الماء عالي النقاوة.
- الحل 3 (5 × Triton X-100): إلى 950 مل من الماء عالي النقاوة، إضافة 50 مل من Triton X-100، ز 1 من أزيد الصوديوم، و 9.3 ز يدتا. يقلب حتى يذوب.
- حل 4 (1 × Triton X-100): تأخذ 200 مل من محلول 3 وإضافة 800 مل من الماء عالي النقاوة.
- الحل 5 (1 x TnBP): إضافة 10 مل تنبب مع ماصة 10 مل إلى 990 مل من محلول 2.
- الحل 6 (40 [كونيتز] وحدة/مل الدناز): إضافة 2,000 [كونيتز] وحدات دناسي في 50 مل من دولبيكو "الفوسفات المخزن المؤقت المالحة" التي تحتوي على كاكل2 ومجكل2. إعداد جديدة واستخدامها على الفور.
- حل 7 (PBS): إضافة 24 غرام كلوريد الصوديوم 0.6 جم من كلوريد البوتاسيوم، ز 4.32 من فوسفات الصوديوم وز 0.72 من فوسفات البوتاسيوم إلى 3 لتر الماء عالي النقاوة. يقلب حتى يذوب. قم بضبط ال pH إلى 7.4. تعقيم 1 لتر من برنامج تلفزيوني في اﻷوتوكﻻف وتخزينها بشكل منفصل.
- الحل 8 (0.1% حمض الاستيك): إضافة إلى 50 مل من محلول معقم 7، 50 ميليلتر من حمض الاستيك. إعداد جديدة واستخدامها على الفور.
4-إعداد متوسطة غشائي
- إضافة 5 مل من لام الجلوتامين، 5 مل مكافحة المضادة، 50 مل مصل أساسها الإنسان وجميع مكونات EGM-2 طقم عامل النمو باستثناء الجنين المصل البقري إلى 500 مل الوسط MCDB131 تحت غطاء عقيمة.
5-ديسيلولاريزيشن الوريد الصافن
- ذوبان الجليد في الوريد الصافن البشرية من-80 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة. تجميد مرة أخرى في-80 درجة مئوية وذوبان الجليد مرة أخرى عند درجة حرارة الغرفة.
- قص خزعة طول 2 ملم باستخدام مقص وإصلاحها في فورمالدهايد ح 24-48 في درجة حرارة الغرفة. ربط كل نهاية الوريد لانتقادات لاذعة الموصل اللوير الذكور والإناث مع خياطة.
- الاتصال الوريد للإعداد ديسيلولاريزيشن 1 وملء L 1 حل 2. نتخلل لمدة 15 دقيقة في 35 مل/دقيقة إفراغ محتويات برنامج الإعداد.
- إضافة 1 لتر حل 4 ونتخلل لإفراغ محتويات الإعداد من 4 ح في 35 مل/دقيقة.
- إضافة 500 مل من محلول 2 ونتخلل للحد الأدنى 5 إفراغ محتويات برنامج الإعداد. كرر هذه الخطوة. قطع الوريد من نضح الإعداد 1 والاتصال نضح الإعداد 2.
- إضافة 1 لتر حل 5 وتشغيل محرض ونتخلل عن ح 4 في 35 مل/دقيقة.
ملاحظة: حل 5 تبدو غائمة بعد تحول محرض وطوال فترة التروية. - قطع الوريد من نضح الإعداد 2 وغسل الوريد في داخل وخارج مع المحاقن أو ماصة 10 مل من 4 تغييرات في الماء عالي النقاوة لمدة 5-10 دقائق.
- الاتصال على المنوال نضح الإعداد 3 وإضافة 50 مل من محلول 6 ونتخلل في 10 مل/دقيقة في دائرة 37 درجة مئوية 4 حاء إفراغ محتويات الإعداد وقطع الوريد من الإعداد.
- الاتصال على المنوال نضح الإعداد 1، ملء L 1 حل 2 ونتخلل بين عشية وضحاها في 35 مل/دقيقة تكرار الخطوات من 5.4 إلى 5.9 4 مرات (لما مجموعة 5 دورات). أخذ خزعة مرة أخرى كما ذكر في الخطوة 5، 2.
ملاحظة: تخطي الخطوة الجزء الثاني 5.8 في دورات 1 و 3. - إفراغ محتويات برنامج الإعداد. ملء L 1 حل 2 ونتخلل عن 24 ساعة في 35 مل/دقيقة الحل تغيير 2 بعد 12 حاء إفراغ محتويات برنامج الإعداد. ملء 1 لتر الماء عالي النقاوة ونتخلل عن 24 ساعة في 35 مل/دقيقة تغير الماء عالي النقاوة بعد 12 h.Empty محتويات برنامج الإعداد. ملء 1 لتر حل 7 ونتخلل عن 24 ساعة في 35 مل/دقيقة الحل تغيير 7 بعد 12 ساعة.
6-تحقق ديسيلولاريزيشن
- أغسل الفورمالين الثابتة خزعات في الماء عالي النقاوة للحد الأدنى 15 عملية في معالج أنسجة عقب البروتوكولات القياسية وتضمين في البارافين22.
- قص 5 ميكرومتر الأقسام باستخدام مبضع ووصمة عار مع الهيماتوكسيلين و 0.2 في المائة الكحولية ويوزين ماير (H & E) عقب البروتوكولات القياسية22.
- عرض تحت مجهر للتحقق من وجود خسارة الأنوية في الأنسجة ديسيلولاريزيد مقارنة بأنسجة طبيعية.
7-ريسيلولاريزيشن
- تعقيم الوريد بوضعه في أنبوب 50 مل تحتوي على 50 مل من محلول 8. تحرض على تناوب 80 في الدقيقة (لفة في الدقيقة) في شاكر ح 1 في 37 درجة مئوية.
- التعامل مع الوريد تحت الاندفاق الصفحي (الجيش اللبناني) مجلس الوزراء من الآن فصاعدا للحفاظ على العقم. نقل في السياق استخدام الملقط المعقم لأنبوب 50 مل جديدة تحتوي على 50 مل من حل معقم 7 و 500 ميليلتر لمكافحة مكافحة. تحرض على النحو الوارد أعلاه ل 12 حاء 7 الحل تغير مرتين على الأقل في بين.
- استخدام الملقط العقيمة، نقل في الاتجاه إلى أنبوب 50 مل جديدة وإضافة 50 مل من وسائل الإعلام بطانية. تحرض على النحو الوارد أعلاه ح 11.
- تجميع مفاعل حيوي باستخدام قفازات معقمة ضمن القوات المسلحة اللبنانية مجلس الوزراء. ربط الوريد إلى في مفاعل حيوي المنطلق مدخل ومخرج بخياطة العقيمة والملقط.
- الاتصال على المنوال إلى مفاعل حيوي والتعبئة مع المتوسط نفسها. إضافة الهيبارين في 50 وحدة دولية/مل ونتخلل عن ح 1 في 2 مل/دقيقة في 37 درجة مئوية.
- جمع 15-25 مل دم الطازج (اعتماداً طول على المنوال) من الجهة المانحة في أنابيب vacutainer الهيبارين المغلفة وتمييع 1:1 مع الحل ستين. إضافة فيما بعد، المستمدة من الغدة الصماء الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (EG-فيجف، 80 نانوغرام/مل) وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (ب-صندوق الأجيال القادمة، 4 ميليلتر/mL) أسيتيل حمض الصفصاف (5 ميكروغرام/مل).
- الانتقال في مفاعل حيوي لحاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ونتخلل عن ح 48 في 2 مل/دقيقة.
- تقريبا بعد 12 ساعة، نقل مفاعل حيوي للقوات المسلحة اللبنانية مجلس الوزراء، تأخذ قطره دم وقياس الجلوكوز جلوكوز دم جهاز الرصد باستخدام. إذا كان المستوى أقل من 3 مليمول/لتر، إضافة السكر جلب في النطاق من 7-9 mmol/l. كرر هذه الخطوة كل ح 8-12.
- بعد 48 ساعة، نقل مفاعل حيوي إلى القوات المسلحة اللبنانية مجلس الوزراء واستنزاف الدم من مفاعل حيوي. إضافة 30 مل من محلول معقم 7 ونتخلل لأدنى 5 استنزاف الحل. إضافة 30 مل من محلول معقم 7 ونتخلل لأدنى 5 كرر مرتين أو حتى لون الدم الحمراء المفقودة.
ملاحظة: يمكن أن تؤخذ الخزعة لتحقق المرفق الخلية. قطع الوريد وقطع حواف 5 مم الوريد مع المقص وتجاهلها. أخذ خزعة كما ذكر في الخطوة 5، 2 والاتصال في السياق مرة أخرى إلى مفاعل حيوي (خطوة اختيارية). - إضافة 30-45 مل متوسطة بطانية ونتخلل عن 96 ساعة في الحاضنة في 2 مل/دقيقة.
ملاحظة: إضافة المتوسطة غشائي حتى هي مغمورة في الوريد. - الانتقال مفاعل حيوي إلى مجلس الوزراء القوات المسلحة اللبنانية وقطع الوريد ريسيلولاريزيد وقطع حواف 5 مم الوريد باستخدام مقص وتجاهل. أخذ خزعة كما ذكر في الخطوة 5، 2.
8-تحقق ريسيلولاريزيشن
- اتبع الإرشادات الموجودة في المقطع 6 وأداء تلطيخ ح & ه. دراسة الشرائح تحت مجهر لوجود خلايا.
Representative Results
مورفولوجيا الإجمالي الوريد العادي هو الضوء الأحمر (الشكل 3A). يتم فقدان اللون الأحمر في دورات ديسيلولاريزيشن التدريجي (دورة 2، الرقم 3 (ب)؛ ودورة 3، الرقم 3) ومن دورةال 5، يبدو شاحب وأبيض (3D الشكل). تبدو السياق ريسيلولاريزيد بعد التروية الدموية (الشكل 3E) ونضح غشائي وسائط الإعلام (الشكل 3F) أحمر في لون. 5 دورات العلاج ديسيلولاريزيشن بنجاح إزالة الخلايا من هذا السياق كما شوهدت لا الأنوية الأزرق في تلطيخ ح & ه (الشكل 4 باء). وفي المقابل، اعتبرت نويات عدة في السياق العادي (الشكل 4 أ). ويعتبر وجود خلايا المرفقة على الجانب لومينال في تلطيخ ح & ه في السياق ريسيلولاريزيد بالدم ح 48 (الشكل 4، السهام السوداء) وبعد التروية مع متوسطة بطانية لمدة 96 ساعة (3D الشكل، السهام السوداء).
الشكل 1 : تجميع الأجهزة نضح ديسيلولاريزيشن. A) الصورة تبين الإعداد ديسيلولاريزيشن المجمعة 1 X-100 تريتون والغسيل. إظهار الأسهم البيضاء مسار تدفق للحلول والأسهم الحمراء تشير إلى مداخل ومنافذ الوريد والحلول. ب) الصورة تظهر الإعداد ديسيلولاريزيشن المجمعة 2 لنضح تنبب. وبالمثل، كما هو الحال في الإعداد ديسيلولاريزيشن 1، تشير الأسهم البيضاء إلى مسار تدفق للحلول والأسهم الحمراء تشير إلى مداخل ومنافذ الوريد والحلول. ج) صورة تظهر الإعداد ديسيلولاريزيشن المجمعة 3 لنضح ديوكسيريبونوكليسي. إظهار الأسهم البيضاء مسار تدفق للحلول والأسهم الحمراء تشير إلى مداخل الوريد والحلول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : إعداد وتجميع مفاعل حيوي ريسيلولاريزيشن. A) صورة تبين المواد المطلوبة لتجميع في مفاعل حيوي. ب) صورة داخل غطاء 4-منفذ عرض موضع الحد من الموصلات (الأسهم الحمراء)، يشير إلى الاتصال مدخل الوريد ومنفذ (الأسهم البيضاء) وترتيب أنابيب ح وأنا وياء نهاية الأنبوب ح الحرة يوضع داخل مفاعل حيوي لإعادة الوسائط. ج) يتبين أنابيب كل منهما الذهاب والخروج من الجانب العلوي من 4 ميناء كاب. د) صورة تظهر مفاعل حيوي المجمعة. ه) صورة تظهر الإعداد مفاعل حيوي كامل مع مضخة تمعجية. تمديد أنابيب ك الاتصالات من مفاعل حيوي مضخة تمعجية. و) التمثيل التخطيطي نظام التروية مفاعل حيوي كله. الأسهم البرتقالية تشير إلى اتجاه التدفق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الإجمالي مورفولوجيا الأوردة خلال ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن- A) مورفولوجية الإجمالي من السياق العادي يبدو أحمر اللون. اللون يتم فقدان مع الإعداد المتزايدة من دورات ديسيلولاريزيشن ب) دورة 2 و ج) دورة 3. د) من 5 دورات، والمنطلق يبدو شاحب وأبيض. وعلى المنوال بعد بيرفوسينج مع ه) للدم من أجل ح 48 وو) مع متوسطة بطانية لمدة 96 ساعة تبدو مرة أخرى أحمر في لون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : توصيف عروق ديسيلولاريزيد وريسيلولاريزيد- والهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ صورة A) السياق العادي يحتوي على العديد من الأنوية الأزرق ولكنها غائبة في ب) ديسيلولاريزيد الوريد. في هذا السياق ريسيلولاريزيد مع ج) دم ح 48 ومع د) قد لاحظت المتوسطة بطانية ل 96 ح، مرفق للخلايا (الأسهم السوداء) في التجويف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
هذه التقنية المقدمة هنا ديسيلولاريزيشن الأوردة الصافن هو طريقة سهلة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن تطبق أيضا على جميع شرايين قطرها صغير مثل الأوردة الحبل السري والثديية. الحلول ديسيلولاريزيشن وهذه التركيزات المستخدمة في هذا الأسلوب من أعمالنا السابقة نتائج6،7. على الرغم من أن نوصي 5 دورات ديسيلولاريزيشن، في بعض الأوردة كما لاحظنا ديسيلولاريزيشن كاملة في 3 دورات. ومع ذلك، تم الحصول على النتائج استنساخه باستخدام 5 دورات. تطبيق هذا البروتوكول، ونحن ديسيلولاريزيد الأوردة ذات أطوال مختلفة تصل إلى 30 سم بنجاح (غير منشورة النتيجة). رفع منفذاً لحل ديسيلولاريزيشن من 45 سم سيقوم بإنشاء ضغطه من 33 ملم زئبق داخل الوريد. في تجربتنا، فقد لاحظنا هذا كخطوة أساسية في ديسيلولاريزينج وفي السياق كله موحدا وتكاثر في 5 دورات. الضغط الذي تم اختياره هو 3 إضعاف الضغط الوريد الصافن العادية (5-10 ملم زئبقي) ولكن هو نفسه كما هو الحال في غير كفء الأوردة (الدوالي)23. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا التكهن أن هذا الضغط العالي سوف يخلق قوة كبيرة على جدران الوريد وقد، ولذلك، تساعد في إزالة خلية كفاءة وأسرع.
منذ تنبب المذيبات عضوية وغير قابلة للذوبان في الماء، إثارة مواد التنظيف حتى يصبح غائم الهامة؛ وبخلاف ذلك، سوف تطفو المنظفات. ولنفس السبب، إبقاء تنبب مختلطة في الحل، وضع أنبوب منفذ للمنظفات في الجزء العلوي من جرة زجاج مع مخرج الخرطوم. كفاءة إزالة تنبب من الوريد بعد يمكن رؤية استعماله في كل دورة بسبب غياب العائمة تنبب قطرات في الماء غسلها. وقد لاحظنا أيضا أن تخطي الخطوة الدناز أيضا إنتاج أنسجة ديسيلولاريزيد ولكن لوحظ في حالات قليلة، محتوى المرتفع نسبيا من الحمض النووي في الأنسجة ديسيلولاريزيد. كما ضغط عالية ومعدلات تدفق عالية ليست مطلوبة من أجل كفاءة الدناز النشاط، يمكن استخدام معدل التروية منخفضة (10 مل/دقيقة). تم استخدام مضخة تمعجية مختلفة كما يساعد صغر حجمها في سهولة التعامل من برنامج الإعداد. إذ لاحظنا أن الضرر من معظم الخلايا أثناء ديسيلولاريزيشن النتائج في دورة 2، فإننا نقترح تخطي الدناز المعاملة خلال دورات 1 و 3 (النتيجة غير منشورة). حتى ولو لم يتم القيام بالتوصيف والتحديد الكمي للمصفوفة خارج الخلية البروتينات في هذه المخطوطة، أظهرت تجربتنا السابقة مع مماثلة ديسيلولاريزيشن البروتوكولات الحفاظ على خصائص النشاط الحيوي، المصفوفة خارج الخلية بنية والبروتينات7. على الرغم من أن تنتج تجاربنا الكمي الأولية مع هذه الأوردة نتيجة مماثلة (غير منشورة)، ستعزز النتائج المنشورة بالفعل هذه الثقة.
ريسيلولاريزيشن استخدام الدم عملية سهلة ومريحة على خلايا نخاع العظام الموسع كما واحدة يمكن تجنب خلية التوسع في أوقات طويلة، والطفرات العفوية في توسيع نطاق الخلايا وغزو الجراحية وعدم الراحة للمريض. حيث أنه من المعروف أن endothelialization يحدث أيضا من تعميم ابكس، افترضنا أن التروية بالدم يليه نضح مع بطانية المتوسطة ستكون كافية ريسيلولاريزيشن. ويعتبر سلامة الأنسجة الوريد هندسيا باستخدام أسلوب مماثل من النتائج الناجحة لزرع الأعضاء عندما تم زرع اثنين من هذه الأوردة في الأطفال مع انسداد الوريد البابي خارج الكبد7. يمكننا التكهن بأن تسمح عوامل النمو في المصفوفة خارج الخلية ديسيلولاريزيد مرفق تعميم ابكس من الدم24. ريسيلولاريزيشن الأوردة بعد بروتوكول مماثل أظهرت الخلايا إيجابية مستقبلات VEGF-2 وكتلة من التمايز (CD) 14 في التجويف بينما CD45 إذ تعرب عن الخلايا شوهدت في الغلالة7. يمكننا أن نتصور أيضا أن لا يمكن ملاحظة طبقة غشائي مستمر في جميع الحالات لا سيما عند استخدام الدم من المرضى كبار السن ومريضة كما هو معروف أن هؤلاء الأفراد قد انخفضت الأرقام المتداولة السلف الخلايا25. بيد أننا تفترض أن التروية بالخاصة بالمستلم الدم قد تخفي العديد من مولدات المضادات التي يتم كشفها بسبب ديسيلولاريزيشن وقد وبالتالي تقليل احتمالات ردود الفعل الملتهبة المعاكسة عند زرعها بدلاً من زرع فقط ديسيلولاريزيد الأوعية الدموية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إيداع التروية الدموية مستويات متزايدة من عوامل النمو في التجويف والغلالة التي قد توظف بدورها زيادة في إعداد تعميم السلف الخلايا الناتجة في عملية سريعة ريسيلولاريزيشن في فيفو.
مزايا تصميم مفاعل حيوي المستخدمة في هذه الدراسة هي التعقيم الكامل والجمعية سهلة، والفعالية من حيث التكلفة، وسهولة التعامل وإمكانية أقل من الضرر. في تجربتنا، استخدام التصميم الحالي، الأوردة كانت ريسيلولاريزيد يصل إلى 10 سم في الطول. حتى ولو أورده يصل إلى 25 سم في الطول أيضا يمكن أن ريسيلولاريزيد عن طريق الحفاظ على المنوال في شكل "U" بداخل مفاعل حيوي، وهذا ينبغي أن يتم التحقق من صحة. يظهر تصميم مفاعل حيوي أن اتجاه التدفق في هذا السياق ضد الجاذبية وهو مصمم على هذا النحو لأنها طبيعية اتجاه التدفق لهذه الأوردة في البشر. هو نضح ح 12 خطوة متوسطة غشائي مسبق على المنوال وزيادة التقارب للحجز على ابكس واردة. إضافة الهيبارين إضافي ونضح ح 1 سوف يخفض خطر تشكيل جلطات الدم في الأنابيب أثناء التروية الدموية.
حجم الدم المطلوب فيعتمد على طول الوريد. ونحن نتابع لحجم الدم والمبدأ الأساسي أن على المنوال ينبغي أن تكون غارقة في الدم. أثناء التعامل مع الدم كميات أكبر من 45 مل، خلط أحياناً قد تكون مطلوبة لمنع تراكم الخلية في الجزء السفلي من مفاعل حيوي. وأضاف لدينا الحل لستين الدم نظراً لأنه يحتوي على كمية عالية من البروتينات والمكونات المطلوبة للحفاظ على أنسجة صحية خلال جهاز زرع26،27. إضافة VEGF وب-صندوق الأجيال القادمة مفيد كما هي عوامل نمو الأوعية القوية28 ووجودهم الحث على الهجرة، والانتشار، والتفريق بين ابكس29،،من3031،32 . يستند مقدار VEGF وأضاف لدينا نتائج غير منشورة السابق كان ينظر فيها إلى انتشار ابكس في 80 نانوغرام/مليلتر. بالإضافة للاسبرين يحول دون تنشيط الصفائح الدموية33 مما يقلل من فرص تمسكهم بطبقة بطانية. الرصد المستمر وإضافة السكر أيضا سيكون مفيداً لتكاثر الخلايا ومنع انحلال الدم خلايا الدم الحمراء.
منذ عينة دم بسيطة فقط مطلوب من المتلقي، فإنه يمكن اعتبار إجراء سهلة والممكنة التي تتطلب خبرة تقنية أقل. حتى ولو، يأخذ الإجراء بأكمله المعروضة هنا من البداية إلى النهاية 20 يوما، تخزين الأوردة ديسيلولاريزيد سوف يقصر المنتج على الرف الإجراء لمدة 8 أيام للمرضى. على الرغم من أن تقنيا تخزين عروق ديسيلولاريزيد لا ينبغي أن تؤثر كفاءة ريسيلولاريزيشن، فإنه يجب تقييم. يمكن استخدام الأوردة هندسة الأنسجة التي تم إنشاؤها باتباع هذا الإجراء في العيادة لجراحات الالتفافية، الاستعاضة عن إعاقة الأوردة، عدم كفاية الوريدية مما يؤدي إلى توسع الأوردة دون الحاجة لقمع المناعة ومما يوفر نوعية أفضل من الحياة بالنسبة للمريض.
Disclosures
سة يحمل أسهم في فيريجرافت، إحدى الشركات التي رخصت تكنولوجيا الأنسجة الهندسة الأوعية الدموية. ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلفين الآخرين.
Acknowledgments
نود أن نشكر البروفسور أندرس جيبسون للمساعدة في توفير الأوعية المستخدمة في التجارب. وتم تمويل هذه الدراسة من منحة ألف لوا إلى سة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
References
- Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).
- O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
- Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
- Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).
- Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).
- Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).
- Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).
- Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).
- L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).
- Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).
- van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).
- Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).
- Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).
- Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).
- Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).
- Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).
- Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).
