Her beskriver vi en protokoll for saphenous åre decellularization bruke vaskemidler og recellularization av perfusjon av perifert blod og endothelial medium.
Vaskulær rør brukes under de fleste vaskulær operasjoner er allogene eller syntetiske grafts som ofte fører til komplikasjoner forårsaket av immunsuppresjon og dårlig patency. Tissue engineering tilbyr en ny løsning for å generere personlig grafts med en naturlig ekstracellulær matrix som inneholder mottakerens celler ved hjelp av decellularization og recellularization. Vi viser en detaljert metode for å utføre decellularization av menneskelig saphenous åre og recellularization av perfusjon av perifert blod. Venen var decellularized av perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-fosfat (TnBP) og 2000 Kunitz enheter av deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 og TnBP var parfyme på 35 mL/min 4 h mens DNase var parfyme på 10 mL/min på 37 ° C 4 h. Venen ble vasket i ultrapure vann og PBS og deretter sterilisert i 0,1% peredikksyre. Det var vasket igjen i PBS og preconditioned endothelial medium. Venen var koblet til en bioreactor og parfyme med endotelial medium som inneholder 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization ble utført ved å fylle den bioreactor med friskt blod, fortynnes 1:1 i Steen løsning, og legge til endokrine kjertel-avledet vaskulære endotelial vekstfaktor (80 ng/mL), grunnleggende fibroblast vekstfaktorer (4 µL/mL) og acetyl Salicylsyre (5 µg/mL). Bioreactor ble deretter flyttet inn i en inkubator og parfyme for 48 timer på 2 mL/min samtidig glukose mellom 3-9 mmol/L. Senere ble venen vasket med PBS, fylt med endotelial medium og parfyme 96 h i inkubator. Behandling med Triton X-100, TnBP og DNase decellularized saphenous fotsporene i 5 sykluser. Decellularized åre så hvit i motsetning til normal og recellularized årer (rødt). Hematoxylin & eosin (H & E) flekker viste tilstedeværelse av kjerner bare i normalvisning, men ikke i decellularized årer. I recellularized ånd viste H & E flekker tilstedeværelse av celler på luminal overflaten av venen.
Vaskulær rør kreves for flere kliniske forhold som aneurysms, arteria carotis stenose og aterosklerose fører til alvorlige vaskulære problemer. Kirurger bruker autologous, fører allogene eller syntetiske vaskulær rør gjenopprette funksjonelle blodtilførselen. Selv om bruken av autologous blodkar fremdeles den ideelle tilnærmingen, er tilgjengeligheten i pasienter majorly begrenset. Alternativer som allogene eller syntetiske grafts har dype problemer med suppressive behandlinger og dårlig patency fører til reoperation1,2, som resulterer i store helse økonomiske byrder til land. Vev utvikling av blodkar mål å gi grafts med en naturlig homologi og autologous celler. Dermed mottaker immunsystemet gjenkjenner transplantert graftet som selv og siden slik en graft inneholder naturlig proteiner og cellene i den opprinnelige konfigurasjonen, kan det fungere bedre i forhold til gjeldende alternativer. Vev utvikling organer, som blæren3, urinrøret4, spor5og årer6,7, har blitt brukt i klinikken.
Tissue engineering å produsere personlig grafts krever en graft fra en donor etterfulgt av decellularization og recellularization. Decellularization er en lovende teknologi å fjerne celler fra vev og organer8,9,10. Decellularization kan utføres av bestemte fysiske, kjemiske og enzymatiske metoder11 eller ved å kombinere dem. For optimal bruk av disse metodene, kan decellularized vev ha lignende strukturelle og funksjonelle proteiner i en ekstracellulær matrix ligner på eget vev. Slike organer har egenverdi evne til å forbedre vedlegg, migrasjon, spredning og differensiering av innkommende stamceller.
Recellularization er en dynamisk seeding celler til graftet, og mottakeren stamceller kan brukes for klinisk transplantasjon. Stilk celler som brukes til slike formål inkluderer benmargen, mesenchymal og orgel beboere3,5,6. Dyr og forsknings-orienterte studier har brukt stamceller fra mesenchymal opprinnelse som fosterets og indusert pluripotent12,13,14. Denne prosessen krever en bioreactor (et kammer som holder venen og gir de nødvendige forholdene som temperatur, gasser, pH og press), celler og kultur medier. Utfordringen i recellularization er å oppnå nødvendig antall celler som en bestemt type og en seeding strategi som cellene kan nå hele vev eller organ. Selv om ingen fullstendig vev eller organ strukturelt og funksjonelt har blitt generert og evalueres før nå, viser flere fremskritt i feltet og resultatene fremtidig mulighet15. Funksjonen nøkkel i venen ligger i luminal endotelet som styrer infiltrasjon av inflammatoriske celler i vev og den midtre glatte muskulatur laget som hjelper i innsnevring og gir også styrke til å holde blodtrykket16. Studier har vist at skade, endothelialization oppstår fra anastomose eller sirkulerende endoteliale progenitor celler (EPCs) i blodet17,18,19. Vår strategi for recellularization av årer er avhengig av EPCs i sirkulerende blod.
Vev utvikling av vener og arterier ble utført av flere grupper etter ulike strategier20,21-med decellularization og recellularization. Vår gruppe har også utført og utviklet decellularization og recellularization strategier for iliaca og melkekjertlene årer6,7. Decellularization ble utført av uro i Åre i Triton X-100, tri-n-butyl fosfat (TnBP) og enzymet deoxyribonuclease (DNase). Recellularization ble utført benmarg avledet endothelial og glatt muskel celler6 eller perifert blod7. Venene recellularized av begge protokoller viste klinisk lover i å gi funksjonelle blodtilførsel i transplantasjon av pediatriske pasienter med ekstra hepatic portalen blodåre obstruksjon6,7.
Vi har nå utviklet en modifisert versjon av den samme protokollen for forbedret og enkel utførelsen av decellularization, recellularization og bioreactor håndtering av liten diameter årer. Gjeldende decellularization protokollen kreves perfusjon av vaskemidler gjennom åre med press i stedet for omrøring med vaskemidler. Recellularization protokollen innebærer et ekstra trinn i preconditioning for å forbedre celleadhesjon og tillegg av vekstfaktorer i sirkulerende blod for å forbedre celle vedheft, overlevelse og spredning. Vi har også forbedret design av bioreactor bruke kommersielt tilgjengelige produkter. I dette papiret presentere vi en detaljert beskrivelse av endret protokoll for decellularization og recellularization av menneskelig saphenous årer.
Teknikken presentert her for decellularization av saphenous vener er en enkel og kostnadseffektiv metode som kan også brukes på alle liten diameter årer som navle og melkekjertlene årer. Decellularization løsninger og konsentrasjonene brukes i denne metoden er fra våre tidligere resultater6,7. Selv om vi anbefaler 5 sykluser av decellularization, i visse årer vi la også merke fullstendig decellularization i 3 sykluser. Imidlertid ble reproduserbar resultater oppnådd ved hjelp av 5 sykluser. Bruk denne protokollen, vi decellularized årer av varierende lengde opptil 30 cm vellykket (upublisert resultatet). Løfte decellularization løsningen stikkontakt med 45 cm vil skape et trykk på 33 mmHg inne i venen. I vår erfaring merke vi dette som et avgjørende skritt i decellularizing hele venen jevnt og reproduserbar 5 sykluser. Valgte trykket er 3 ganger høyere enn normalt saphenous åre presset (5-10 mmHg) men er det samme som inkompetente vener (åreknuter)23. I tillegg spekulere vi at denne høytrykk vil skape en betydelig styrke på åre vegger og kan derfor hjelpe i effektiv og raskere fjerne.
Siden TnBP er en organisk løsemiddel og uløselig i vann, røring vaskemiddel til det blir skyet er viktig. ellers flytende vaskemiddel. Av samme grunn, for å holde TnBP i løsning, ble vaskemiddels utløp røret plassert på toppen av glasskrukke med slangen uttaket. Effektiv fjerning av TnBP fra venen etter bruken i hver syklus kan sees ved fravær av flytende TnBP dråper i vasket vannet. Vi har også lagt merke til at hoppe DNase trinnet også produsert et decellularized vev, men i noen tilfeller, en relativt høy DNA innhold i decellularized vev ble lagt merke til. Som høyt trykk og høy flow priser ikke er nødvendig for effektiv DNase aktivitet, brukes en lav perfusjon rate (10 mL/min). En annen peristaltiske pumpe ble brukt som sin mindre størrelse hjelper enkel håndtering av oppsettet. Siden vi lagt merke til at skade de fleste celler under decellularization resultater i syklus 2, bør hoppe DNase behandling under sykluser 1 og 3 (upubliserte resultat). Selv om karakterisering og måling av ekstracellulær matrix proteiner ikke ble utført i dette manuskriptet, vår tidligere erfaring med lignende decellularization protokoller viste bevaring av biomekaniske egenskaper, ekstracellulær matrix struktur og proteiner7. Selv om våre foreløpige kvantifisering eksperimenter med disse årene produsert et lignende resultat (upublisert), vil allerede publisert resultatene styrke denne tilliten.
Recellularization bruke blood er en praktisk og enkel prosess over benmarg utvidet cellene som man kan unngå lenge cellen ekspansjon ganger, spontane mutasjoner i utvidet celler, kirurgisk invasjonen og ubehag for pasienten. Siden det er kjent at endothelialization kan også oppstå sirkulere EPCs, vi hypotesen at perfusjon med blod etterfulgt av perfusjon med endotelial medium vil være tilstrekkelig for recellularization. Sikkerheten til vene vev konstruert ved hjelp av en lignende metode er sett fra vellykkede resultatene av transplantasjon når to slike årer ble implantert i barn med ekstra hepatic portalen blodåre obstruksjon7. Vi spekulere at vekstfaktorer i decellularized ekstracellulær matrix vil tillate feste sirkulerende EPCs fra blod24. Recellularization av årer etter en lignende protokoll viste celler positivt for VEGF reseptor-2 og cluster for differensiering (CD) 14 på lumen mens CD45 uttrykke celler ble sett i adventitia7. Vi også tenke seg at et kontinuerlig endothelial lag ikke kan være observert i alle tilfeller særlig når benytter blod fra eldre og syke pasienter som det er kjent at slike individer har redusert antall sirkulerende stamfar celler25. Men vi postulere at perfusjon med mottakerens eget blod kan maskere mange av antigener er utsatt på grunn av decellularization og kan dermed redusere sjansene for inflammatorisk bivirkninger når transplantert i motsetning til transplanting bare decellularized blodkar. I tillegg kan blodperfusjon sette inn økte nivåer av vekstfaktorer på lumen og adventitia som i sin tur kan rekruttere økte antall sirkulerende progenitor celler som resulterer i en rask prosess for recellularization vivo.
Fordelene med bioreactor design brukt i denne studien er fullstendig autoklavering, enkel montering, kostnadseffektivitet, enkel håndtering og minst muligheten for skade. I vår erfaring, bruker du gjeldende utforming, årer opp til 10 cm i lengde var recellularized. Selv om vener opptil 25 cm i lengden kan også være recellularized ved å holde venen i “U”-form inni bioreactor, dette skal valideres. Bioreactor design viser at retningen på strømmen i blodåre mot tyngdekraften og utformes slik fordi det er normal retning av flyt for disse årene hos mennesker. 12 h perfusjon av endothelial middels trinnet er å precondition venen og øke affinitet feste innkommende EPCs. Tillegg av ekstra heparin og perfusjon 1t vil redusere risikoen for danner blodpropp i rør under blodperfusjon.
Volumet av blod kreves er avhengig av lengden på venen. Det grunnleggende prinsippet vi følge blodvolum er at venen bør være neddykket i blodet. Under behandling av blod volumer større enn 45 mL, kanskje sporadisk blande må forhindre celle ansamling i bunnen av bioreactor. Vi lagt Steen løsning på blod siden det inneholder en høy mengde proteiner og komponentene som kreves for å opprettholde vev sunn under organ transplantasjon26,27. VEGF og b-FGF er gunstig som de er potente angiogenic vekstfaktorer28 og deres tilstedeværelse induserer migrasjon, spredning og differensiering av EPCs29,30,31,32 . Hvor mye VEGF lagt er basert på tidligere upubliserte resultatene hvor spredning EPCs ble sett på 80 ng/mL. Tillegg av aspirin hemmer aktivering av blodplater33 og dermed redusere sjansene for sin tilknytning til endotelial lag. Kontinuerlig overvåking og tillegg av glukose vil også være fordelaktig for celle spredning og hindre hemolyse av røde blodlegemer.
Siden bare en enkel blodprøve kreves fra mottakeren, kan det betraktes som en lett og mulig prosedyre som krever mindre teknisk ekspertise. Selv om hele prosedyren vist her fra start til slutt tar 20 dager, lagring av decellularized vener som en hyllevare produktet vil forkorte prosedyren til åtte dager for pasienter. Selv om lagring av decellularized vener teknisk ikke bør påvirke recellularization effektivitet, må det bli vurdert. Vev-konstruert årer generert denne fremgangsmåten kan brukes i klinikken til bypass kirurgi, erstatte hindret årer, venøs insuffisiens fører til åreknuter uten behov for uimottakelig undertrykkelse og dermed gi en bedre kvalitet på liv for pasienten.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Professor Anders Jeppsson for hjelp med å gi blod fartøy brukes i forsøkene. Denne studien ble finansiert av LUA ALF stipendet å SSH.
4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
Blood Glucose monitoring system – Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
Shaker | Ika | KS4000 i control | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Steen solution | Xvivo | 19004 | |
Suture | Agnthos | 14817 | |
Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |