Aquí, describimos un protocolo para la vena safena descelularización mediante detergentes y recelularización, perfusión de la sangre periférica y la endotelial.
Conductos vasculares utilizados en la mayoría de las cirugías vascular son injertos alogénicos o sintéticos que a menudo conducen a las complicaciones causadas por la inmunodepresión y pobre permeabilidad. Ingeniería de tejidos ofrece una solución novedosa para generar injertos personalizados con una matriz extracelular natural que contiene células del destinatario utilizando el método de descelularización y recelularización. Mostramos un método detallado para realizar la descelularización de la vena safena humana y recelularización por la perfusión de la sangre periférica. La vena fue decellularized por perfusión 1% Tritón X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (TnBP) y 2.000 unidades de Kunitz de desoxirribonucleasa (DNasa). Triton X-100 y TnBP fueron perfundidos a 35 mL/min durante 4 h y DNasa se perfunde en 10 mL/min a 37 ° C por 4 h. La vena fue lavada en agua ultrapura y PBS y luego esterilizada en 0,1% de ácido peracético. Se lavó otra vez en PBS y precondicionada en medio endotelial. La vena fue conectada a un biorreactor y perfundida con medio endotelial que contiene 50 IU/mL heparina por 1 h. recelularización fue realizada por llenar el biorreactor con sangre fresca, diluido 1:1 en solución Steen y agregando derivados de glándula endocrina vascular factores de crecimiento endotelial (80 ng/mL), factores de crecimiento básico del fibroblasto (4 μL/mL) y acetil salicílico ácido (5 μg/mL). El biorreactor fue trasladado a una incubadora y perfundido durante 48 h a 2 mL/min, manteniendo la glucosa entre 3-9 mmol/L. Más tarde, la vena se lavaron con PBS, lleno de medio endotelial y perfundida durante 96 horas en la incubadora. Tratamiento con Tritón X-100, TnBP y DNasa decellularized la vena safena en 5 ciclos. La vena decellularized parecía blanca a diferencia de las venas normales y recellularized (rojo claro). La hematoxilina y eosina (H & E) coloración demostró la presencia de núcleos sólo en normal pero no en las venas decellularized. En la vena recellularized, H & E tinción demostraron la presencia de células en la superficie luminal de la vena.
Conductos vasculares son necesarios para varias condiciones clínicas como aneurismas, estenosis de la arteria carótida y ateroesclerosis llevando a problemas vasculares severos. Cirujanos utilizan conductos vasculares autólogos, alogénicos o sintéticos para restaurar el suministro de sangre funcional. Aunque el uso de vasos sanguíneos autólogos todavía se considera el enfoque ideal, la disponibilidad en pacientes está mayormente limitada. Las alternativas tales como injertos alogénicos o sintéticos tienen profundos problemas con tratamientos inmunosupresores y pobre permeabilidad hacia la reintervención1,2, resultando en salud importante cargas económicas a los países. Ingeniería del tejido fino de los vasos sanguíneos pretende ofrecer injertos con una homología natural y células autólogas. Así, el recipiente sistema inmune reconoce el injerto trasplantado como uno mismo y desde tal injerto contiene las células en la configuración original y proteínas naturales, podría funcionar mejor en comparación con las alternativas actuales. Tejido había diseñado órganos, tales como la vejiga3la uretra4, la tráquea5y las venas6,7, se han utilizado con éxito en la clínica.
Ingeniería de tejidos para producir injertos personalizados requiere un injerto de un donante, seguido de descelularización y recelularización. Descelularización es una prometedora tecnología para eliminar las células de los tejidos y órganos8,9,10. Descelularización puede realizarse por métodos físicos, químicos y enzimáticos específicos11 o combinándolas. En el uso óptimo de estos métodos, los tejidos decellularized pueden tener proteínas estructurales y funcionales similares en una matriz extracelular similar al tejido nativo. Tales órganos poseen la capacidad intrínseca para mejorar el apego, la migración, proliferación y diferenciación de las células madre.
Recelularización es un proceso dinámico de la siembra de células en el injerto y receptor de las células madre pueden utilizarse para trasplante de la clínico. Células madre actualmente utilizadas para tales propósitos incluyen la médula ósea, mesenquimal y órgano residentes3,5,6. Animales y estudios orientados a la investigación han utilizado células madre de origen mesenquimal que son pluripotentes inducidas y fetal12,13,14. Este proceso requiere un biorreactor (una cámara que contiene la vena y proporciona las condiciones necesarias como temperatura, gases, pH y presión), las células y los medios de cultivo. El reto de recelularización es obtener el número de células de un tipo particular y una estrategia de siembra por el cual las células pueden llegar a todo tejido u órgano. A pesar de que ningún órgano o tejido completo estructural y funcionalmente ha generado y evaluado hasta ahora, varios avances en el campo y los resultados iniciales demuestran la posibilidad futura de15. La función clave de la vena se encuentra en el endotelio luminal que controla la infiltración de células inflamatorias en los tejidos y la capa media de músculo liso que ayuda en la constricción y también proporciona la fuerza necesaria para mantener la presión arterial16. Los estudios han demostrado que durante el daño, endotelialización ocurre de anastomosis o de circulación de las células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre17,18,19. Nuestra estrategia de recelularización de venas se basa en las EPCs presentes en la sangre circulante.
Ingeniería de tejidos de venas y arterias se realizó por varios grupos siguiendo diferentes descelularización y recelularización estrategias20,21. Nuestro grupo también ha actuado y desarrollado estrategias descelularización y recelularización para venas ilíacas y mamaria6,7. Descelularización fue realizada por la agitación de la vena en Tritón X-100, tri-n-butil fosfato (TnBP) y la enzima desoxirribonucleasa (DNasa). La recelularización fue realizada usando médula ósea derivado de células endoteliales y musculares lisas6 o7de la sangre periférica. Las venas recellularized por cualquier protocolo demostrada promesa clínica en la prestación de suministro de sangre funcional en el trasplante de pacientes pediátricos con extra hepática de la vena porta obstrucción6,7.
Actualmente hemos desarrollado una versión modificada del mismo protocolo para la actuación mejorada y fácil de descelularización y recelularización biorreactor manejo de venas de pequeño diámetro. El protocolo actual de descelularización requiere perfusión de detergentes a través de la vena utilizando presión en lugar de agitación con detergentes. El protocolo de recelularización implica un paso adicional de preacondicionamiento para mejorar la adhesión celular y la adición de factores de crecimiento en la circulación de la sangre para mejorar la supervivencia, proliferación y adhesión celular. También hemos mejorado el diseño del biorreactor utilizando productos comercialmente disponibles. En este trabajo presentamos una descripción detallada del protocolo modificado para realizar descelularización y recelularización de venas safenas humanas.
La técnica presentada aquí de descelularización de venas safenas es un método fácil, sencillo y rentable que puede aplicarse también a todas las venas de pequeño diámetro como las venas umbilicales y mamarias. Las soluciones de descelularización y sus concentraciones utilizadas en este método son de nuestros anteriores resultados6,7. Aunque se recomiendan 5 ciclos de descelularización, en ciertas venas también notamos descelularización completa en 3 ciclos. Sin embargo, se obtuvieron resultados reproducibles mediante el uso de 5 ciclos. Aplicación de este protocolo, decellularized las venas de distintas longitudes hasta 30 cm con éxito (inédito resultado). Salida de la solución de la descelularización de elevación de 45 cm creará una presión de 33 mmHg dentro de la vena. En nuestra experiencia, nos dimos cuenta de esto como un paso clave en decellularizing la vena todo uniforme y reproducible en 5 ciclos. La presión solicitada es 3 veces mayor que la presión de la vena safena normal (5-10 mmHg) pero es que el mismo como incompetente de las venas (varices)23. Además, especulamos que esta alta presión crea una fuerza significativa en las paredes de la vena y puede, por lo tanto, ayudar en la remoción de células más rápido y eficiente.
Ya TnBP es un solvente orgánico insoluble en agua, revolviendo el detergente hasta que se convierte en turbia es importante; de lo contrario, flotará el detergente. Por la misma razón, para mantener TnBP mezclado en solución, se colocó el tubo de salida de detergente en la parte superior de la jarra de cristal con salida de la manguera. Eliminación eficiente de TnBP de la vena después de su uso en cada ciclo se aprecia por la ausencia de flotante TnBP gotitas en el agua lavado. También hemos notado que también omitiendo el paso de la ADNasa produce un tejido decellularized pero en algunos casos, se observó un relativamente alto contenido de ADN en el tejido decellularized. Como de alta presión y alto caudal no es necesarios para la eficiente actividad de DNasa, puede utilizarse una tasa de perfusión baja (10 mL/min). Se utilizó una bomba peristáltica diferentes debido a su tamaño más pequeño ayuda en el fácil manejo de la configuración. Puesto que nos dimos cuenta de que el daño de la mayoría de las células durante resultados de descelularización en ciclo 2, sugerimos saltar tratamiento de DNasa durante los ciclos 1 y 3 (resultados no publicados). A pesar de la caracterización y cuantificación de proteínas de matriz extracelular no se realizaron en este manuscrito, nuestra experiencia anterior con protocolos similares de descelularización demostró la preservación de propiedades biomecánicas, estructura y proteínas de matriz extracelular7. Aunque nuestros experimentos de cuantificación preliminar con estas venas produjeron un resultado similar (inédito), nuestros resultados ya publicados van a fortalecer esta confianza.
Recelularización con sangre es un proceso fácil y práctico sobre las células de la médula ósea ampliada como uno puede evitar largos tiempos de expansión celular, mutaciones espontáneas en células ampliadas, invasión quirúrgica y molestias para el paciente. Ya se sabe que endotelialización también puede ocurrir por circulación de EPCs, presumimos la perfusión de sangre seguido de perfusión con endotelial medio será suficiente para recelularización. La seguridad de los tejidos vena diseñado usando un método similar es vista desde resultados exitosos de trasplante cuando dos tales venas fueron implantadas en niños con obstrucción de vena porta extra hepática7. Especulamos que los factores de crecimiento en decellularized matriz extracelular permite el accesorio de EPCs de circulación de sangre24. Recelularización de venas siguiendo un protocolo similar demostró las células positivas para el receptor VEGF-2 y cluster de diferenciación (CD) 14 en el lumen y CD45 se observaron células expresa en adventicia7. También nos imaginamos que una continua capa endotelial puede no observarse en todos los casos sobre todo cuando con sangre de pacientes mayores y enfermas como es sabido que tales individuos han disminuido el número de circulación de las células progenitoras25. Sin embargo, postulamos que la perfusión con el destinatario sangre muchos de los antígenos que están expuestos debido a descelularización y así pueden disminuir las posibilidades de reacciones inflamatorias adversas cuando trasplantados en comparación con sólo el trasplante puede enmascarar decellularized de los vasos sanguíneos. Además, la perfusión de la sangre puede depositar aumento en los niveles de factores de crecimiento en la luz y la adventicia, que a su vez puede reclutar mayor número de células progenitoras, lo que resulta en un rápido proceso de recelularización en vivoen circulación.
Las ventajas del diseño del biorreactor utilizado en este estudio son completa esterilización en autoclave, fácil montaje, rentabilidad, fácil manejo y la menor posibilidad de daños. En nuestra experiencia, utilizando el diseño actual, las venas se recellularized hasta 10 cm de longitud. A pesar de las venas hasta 25 cm de largo también puede ser recellularized manteniendo la vena en forma de “U” en el biorreactor, esto debe ser validado. El diseño del biorreactor muestra que la dirección del flujo en la vena es contra la gravedad y está diseñada como tal porque es la dirección normal del flujo de estas venas en los seres humanos. La perfusión de 12 h del paso medio endotelial es requisito la vena y aumenta la afinidad para la fijación de las EPCs. Además de la heparina adicional y perfusión de 1 h disminuirá el riesgo de formar coágulos de sangre en los tubos durante la perfusión de la sangre.
El volumen de sangre requerido depende de la longitud de la vena. El principio básico que seguimos para el volumen de sangre es que la vena debe estar sumergida en la sangre. Durante la manipulación de volúmenes de sangre mayores de 45 mL, mezclando ocasionalmente podría ser necesario para evitar la acumulación de células en la parte inferior del biorreactor. Hemos añadido solución de Steen sangre ya que contiene una alta cantidad de proteínas y componentes necesarios para mantener los tejidos sanos durante el trasplante de órgano26,27. Adición de VEGF y FGF b es beneficioso ya que son factores de crecimiento de angiogenic potente28 y su presencia induce la migración, proliferación y diferenciación de EPCs29,30,31,32 . La cantidad de VEGF añadido se basa en nuestros anteriores resultados inéditos donde fue vista la proliferación de las EPCs a 80 ng/mL. Además de la aspirina inhibe la activación de las plaquetas33 disminuyendo las posibilidades de su adhesión a la capa endotelial. Monitoreo continuo y la adición de glucosa también será beneficiosos para prevenir la hemólisis de glóbulos rojos y proliferación celular.
Ya que sólo una muestra de sangre simple se requiere del receptor, puede considerarse como un procedimiento fácil y factible que requieren menos técnicos. A pesar de todo el procedimiento que se muestra aquí de principio a fin tarda 20 días, guardar las venas decellularized como un producto acortará el procedimiento para 8 días para los pacientes fuera de la plataforma. Aunque almacenamiento de venas decellularized técnicamente no debería afectar la eficiencia de recelularización, deben ser evaluado. Ingeniería de tejidos las venas generadas siguiendo este procedimiento pueden utilizarse en la clínica para cirugías de bypass, reemplazando las venas obstruidas, insuficiencia venosa a las venas varicosas sin necesidad de inmunosupresión y proporcionando así una mejor calidad de vida para el paciente.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a profesor Anders Jeppsson por ayuda con el abastecimiento de los vasos sanguíneos utilizados en los experimentos. Este estudio fue financiado por la subvención de LUA ALF para SSH.
4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
Blood Glucose monitoring system – Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
Shaker | Ika | KS4000 i control | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Steen solution | Xvivo | 19004 | |
Suture | Agnthos | 14817 | |
Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |