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Bioengineering

Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57803

Summary

Aquí, describimos un protocolo para la vena safena descelularización mediante detergentes y recelularización, perfusión de la sangre periférica y la endotelial.

Abstract

Conductos vasculares utilizados en la mayoría de las cirugías vascular son injertos alogénicos o sintéticos que a menudo conducen a las complicaciones causadas por la inmunodepresión y pobre permeabilidad. Ingeniería de tejidos ofrece una solución novedosa para generar injertos personalizados con una matriz extracelular natural que contiene células del destinatario utilizando el método de descelularización y recelularización. Mostramos un método detallado para realizar la descelularización de la vena safena humana y recelularización por la perfusión de la sangre periférica. La vena fue decellularized por perfusión 1% Tritón X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (TnBP) y 2.000 unidades de Kunitz de desoxirribonucleasa (DNasa). Triton X-100 y TnBP fueron perfundidos a 35 mL/min durante 4 h y DNasa se perfunde en 10 mL/min a 37 ° C por 4 h. La vena fue lavada en agua ultrapura y PBS y luego esterilizada en 0,1% de ácido peracético. Se lavó otra vez en PBS y precondicionada en medio endotelial. La vena fue conectada a un biorreactor y perfundida con medio endotelial que contiene 50 IU/mL heparina por 1 h. recelularización fue realizada por llenar el biorreactor con sangre fresca, diluido 1:1 en solución Steen y agregando derivados de glándula endocrina vascular factores de crecimiento endotelial (80 ng/mL), factores de crecimiento básico del fibroblasto (4 μL/mL) y acetil salicílico ácido (5 μg/mL). El biorreactor fue trasladado a una incubadora y perfundido durante 48 h a 2 mL/min, manteniendo la glucosa entre 3-9 mmol/L. Más tarde, la vena se lavaron con PBS, lleno de medio endotelial y perfundida durante 96 horas en la incubadora. Tratamiento con Tritón X-100, TnBP y DNasa decellularized la vena safena en 5 ciclos. La vena decellularized parecía blanca a diferencia de las venas normales y recellularized (rojo claro). La hematoxilina y eosina (H & E) coloración demostró la presencia de núcleos sólo en normal pero no en las venas decellularized. En la vena recellularized, H & E tinción demostraron la presencia de células en la superficie luminal de la vena.

Introduction

Conductos vasculares son necesarios para varias condiciones clínicas como aneurismas, estenosis de la arteria carótida y ateroesclerosis llevando a problemas vasculares severos. Cirujanos utilizan conductos vasculares autólogos, alogénicos o sintéticos para restaurar el suministro de sangre funcional. Aunque el uso de vasos sanguíneos autólogos todavía se considera el enfoque ideal, la disponibilidad en pacientes está mayormente limitada. Las alternativas tales como injertos alogénicos o sintéticos tienen profundos problemas con tratamientos inmunosupresores y pobre permeabilidad hacia la reintervención1,2, resultando en salud importante cargas económicas a los países. Ingeniería del tejido fino de los vasos sanguíneos pretende ofrecer injertos con una homología natural y células autólogas. Así, el recipiente sistema inmune reconoce el injerto trasplantado como uno mismo y desde tal injerto contiene las células en la configuración original y proteínas naturales, podría funcionar mejor en comparación con las alternativas actuales. Tejido había diseñado órganos, tales como la vejiga3la uretra4, la tráquea5y las venas6,7, se han utilizado con éxito en la clínica.

Ingeniería de tejidos para producir injertos personalizados requiere un injerto de un donante, seguido de descelularización y recelularización. Descelularización es una prometedora tecnología para eliminar las células de los tejidos y órganos8,9,10. Descelularización puede realizarse por métodos físicos, químicos y enzimáticos específicos11 o combinándolas. En el uso óptimo de estos métodos, los tejidos decellularized pueden tener proteínas estructurales y funcionales similares en una matriz extracelular similar al tejido nativo. Tales órganos poseen la capacidad intrínseca para mejorar el apego, la migración, proliferación y diferenciación de las células madre.

Recelularización es un proceso dinámico de la siembra de células en el injerto y receptor de las células madre pueden utilizarse para trasplante de la clínico. Células madre actualmente utilizadas para tales propósitos incluyen la médula ósea, mesenquimal y órgano residentes3,5,6. Animales y estudios orientados a la investigación han utilizado células madre de origen mesenquimal que son pluripotentes inducidas y fetal12,13,14. Este proceso requiere un biorreactor (una cámara que contiene la vena y proporciona las condiciones necesarias como temperatura, gases, pH y presión), las células y los medios de cultivo. El reto de recelularización es obtener el número de células de un tipo particular y una estrategia de siembra por el cual las células pueden llegar a todo tejido u órgano. A pesar de que ningún órgano o tejido completo estructural y funcionalmente ha generado y evaluado hasta ahora, varios avances en el campo y los resultados iniciales demuestran la posibilidad futura de15. La función clave de la vena se encuentra en el endotelio luminal que controla la infiltración de células inflamatorias en los tejidos y la capa media de músculo liso que ayuda en la constricción y también proporciona la fuerza necesaria para mantener la presión arterial16. Los estudios han demostrado que durante el daño, endotelialización ocurre de anastomosis o de circulación de las células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre17,18,19. Nuestra estrategia de recelularización de venas se basa en las EPCs presentes en la sangre circulante.

Ingeniería de tejidos de venas y arterias se realizó por varios grupos siguiendo diferentes descelularización y recelularización estrategias20,21. Nuestro grupo también ha actuado y desarrollado estrategias descelularización y recelularización para venas ilíacas y mamaria6,7. Descelularización fue realizada por la agitación de la vena en Tritón X-100, tri-n-butil fosfato (TnBP) y la enzima desoxirribonucleasa (DNasa). La recelularización fue realizada usando médula ósea derivado de células endoteliales y musculares lisas6 o7de la sangre periférica. Las venas recellularized por cualquier protocolo demostrada promesa clínica en la prestación de suministro de sangre funcional en el trasplante de pacientes pediátricos con extra hepática de la vena porta obstrucción6,7.

Actualmente hemos desarrollado una versión modificada del mismo protocolo para la actuación mejorada y fácil de descelularización y recelularización biorreactor manejo de venas de pequeño diámetro. El protocolo actual de descelularización requiere perfusión de detergentes a través de la vena utilizando presión en lugar de agitación con detergentes. El protocolo de recelularización implica un paso adicional de preacondicionamiento para mejorar la adhesión celular y la adición de factores de crecimiento en la circulación de la sangre para mejorar la supervivencia, proliferación y adhesión celular. También hemos mejorado el diseño del biorreactor utilizando productos comercialmente disponibles. En este trabajo presentamos una descripción detallada del protocolo modificado para realizar descelularización y recelularización de venas safenas humanas.

Protocol

El tejido utilizado, y el protocolo de este trabajo sigue las directrices éticas de la Universidad de Gotemburgo.

1. almacenamiento y preparación de tejido

  1. Cortar el tejido circundante de la vena safena obtenido usando tijeras y pinzas quirúrgicas.
    Nota: Se diseca la vena safena de la extremidad inferior de seres humanos por cirujanos vasculares. La vena safena utilizada en este trabajo es una parte no utilizada después de la cirugía de bypass.
  2. Para evitar fugas durante la perfusión, ligar todas las ramas de lado en sus extremos con suturas y pinzas.
  3. Mantener la vena en un tubo de 50 mL que contiene 40 mL de solución salina buffer fosfato (PBS). Lavar la vena cambiando PBS 2 - 3 veces para quitar el exceso de sangre. Almacenar la vena por congelación a-80 ° C.

2. preparación de configuraciones de descelularización y recelularización biorreactor

Nota: Con unas tijeras, cortadas los tubos de silicio como se muestra en la tabla 1.

  1. Configuración de descelularización 1 (para perfusión Triton X-100 y lavado)
    1. A un 2 L compartimiento (recipiente de plástico), cinta todas las tres piezas de tubo como se muestra en la figura 1A.
      Nota: La cinta un tubo a una pared donde el borde toque la parte inferior de la cámara (entrada de detergente) y los otros dos tubos a la pared opuesta con una distancia de 5-10 cm en función de la longitud de la vena. Por lo menos 5 cm de estos tubos debe también ser adherida con cinta al piso de la cámara (entrada y salida de la vena).
    2. Utilizando los conectores Luer macho y hembra, se conectan en serie entrada del detergente al tubo B seguido por el tubo F, tubo C y finalmente a la entrada de la vena. Lugar el tubo F en el cassette de la peristáltica de la bomba me.
    3. Tomar otro tubo y conecte un extremo al enchufe de la vena. Coloque el otro extremo en el tarro de cristal con salida de la manguera inferior que se coloca a 45 cm por encima de la cámara (toma de detergente) y cinta adhesiva para asegurar. Tomar el tubo G y empuje un extremo de la salida de la manguera de la jarra de vidrio y coloque el otro extremo en la cámara de la vena.
      Nota: Las imágenes de instalación completa (flechas rojas), cámara y dirección (flechas blancas) se muestran en la figura 1A.
  2. Descelularización configuración 2 (TnBP para perfusión)
    1. Tomar un frasco de vidrio de 1 L y coloque un extremo del tubo C (entrada de detergente) en la jarra hasta que el tubo toque el fondo de la jarra.
    2. Conecte el otro extremo al tubo F seguido de tubo C. Coloque el otro extremo del tubo C en la jarra hasta la mitad de profundidad (entrada de la vena). Coloque el tubo de F en el cartucho de la bomba peristáltica.
    3. Tomar el tubo D y coloque un extremo en la jarra (salida de la vena) hasta la mitad de la profundidad y el otro extremo en el tarro de cristal con el tubo inferior colocado a una altura de 45 cm de la entrada de la vena (toma de detergente). Para asegurar, cintas tubos de entrada y salida de detergente.
    4. Coloque la jarra de vidrio de 1 L en un agitador magnético y mantener el imán dentro de la botella.
    5. Tomar el tubo G y empuje un extremo en la salida de la manguera de la jarra y coloque el otro extremo un tarro de cristal 1 L.
      Nota: La imagen de instalación completa (flechas rojas), cámara y flujo de dirección (flechas blancas) se muestra en la figura 1B.
  3. Descelularización configuración 3 (perfusión de DNasa)
    1. Tome una botella de vidrio de 250 mL y colocar ambos extremos del tubo C. lugar la zona media del tubo en el cartucho de la bomba peristáltica II.
      Nota: Un extremo del tubo es la entrada de la solución y el otro extremo del tubo está conectado a la entrada de la vena. Salida de la vena queda libre en la solución.
    2. Coloque la configuración entera incluyendo la bomba a 37 ° C. La imagen de instalación completa y la dirección del flujo se muestra en la figura 1.
  4. Biorreactor de recelularización
    1. Mantenga todas las piezas como se muestra en la figura 2A.
    2. Como se muestra en la figura 2B, tomar el tapón de 4 Inserte en cada puerto, H (salida de la vena) del tubo, tubo I (entrada de los medios de comunicación) y tubo J (entrada de la vena). Inserte el otro extremo del tubo de H en el puerto 4 deth (medio de comunicación).
      Nota: La vista de la tapa de 4 puertos de la parte superior se muestra en la figura 2. Para una fácil inserción de tubos, corte los bordes a un punto agudo con una tijera.
    3. Doble el otro extremo del tubo de J en forma de U y atar con una sutura. Conecte los conectores reductores a los extremos interiores de los tubos H & J.
    4. Coloque el tubo de 60 mL con una base plana en la botella de vidrio de 250 mL y luego colocar la anterior configuración hecha en el tubo como se muestra en la Figura 2D. Como se muestra en la Figura 2E, conecte los tubos K, E y K en la serie. Conecte un tubo K a la entrada de la vena y otro tubo K a la entrada de los medios de comunicación.
      Nota: El diagrama esquemático de la configuración y la dirección del flujo se observa en la figura 2F.
    5. Esterilice en autoclave los el biorreactor.

3. preparación de soluciones

  1. Solución 1 (10 x agua): para 1 L de agua ultrapura, añadir 2 g de azida de sodio y 18,6 g de ácido etilendiaminotetracético (EDTA). Revolver hasta que sales se disuelven.
  2. Solución 2 (agua de x 1): 100 mL de solución 1 y añadir 900 mL de agua ultrapura.
  3. Solución 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL de agua ultrapura, añadir 50 mL de Triton X-100, 1 g de azida de sodio y 9,3 g de EDTA. Revuelva hasta que se disuelva.
  4. Solución 4 (1 x Triton X-100): 200 mL de solución 3 y añadir 800 mL de agua ultrapura.
  5. Solución 5 (1 x TnBP): Añadir 10 mL de TnBP con una pipeta de 10 mL a 990 mL de solución 2.
  6. Solución 6 (40 Kunitz unidades/mL DNasa): Añadir Kunitz de 2.000 unidades de DNaseI en 50 mL de fosfato Buffer salino de Dulbecco que contiene CaCl2 y MgCl2. Preparar fresco y utilizar inmediatamente.
  7. Solución 7 (PBS): Añadir 24 g de cloruro de sodio, 0.6 g de cloruro de potasio, 4,32 g de fosfato de sodio y 0,72 g de fosfato de potasio al 3 L de agua ultrapura. Revuelva hasta que se disuelva. Ajustar el pH a 7.4. 1 L de PBS en el autoclave de esterilizar y almacenar por separado.
  8. Solución 8 (0,1% de ácido peracético): Añadir a 50 mL de solución estéril 7, 50 μl de ácido peracético. Preparar fresco y utilizar inmediatamente.

4. preparación del medio endotelial

  1. Añadir 5 mL de L-glutamina, 5 mL de anti-anti, 50 mL de suero humano AB y todos los componentes del kit de factor de crecimiento de EGM-2 excepto suero fetal bovino a 500 mL del medio de MCDB131 bajo una campana de estéril.

5. descelularización de vena safena

  1. Descongelar la vena safena humana de-80 ° C a temperatura ambiente. Otra vez congelar a-80 ° C y descongelar otra vez a temperatura ambiente.
  2. Una biopsia de 2 mm de longitud con unas tijeras de cortar y fijar en formol durante 24-48 h a temperatura ambiente. Atar cada extremo de la vena a las barbas de un conector Luer macho y hembra con una sutura.
  3. Conectar la vena a la configuración de la descelularización 1 y llenar 1 L de solución 2. Perfusión de 15 min a 35 mL/min vaciar el contenido de la configuración.
  4. Añadir 1 L de solución 4 y perfusión de 4 h a 35 mL/min vaciar el contenido de la configuración.
  5. Añadir 500 mL de solución 2 y perfusión de 5 minutos vaciar el contenido de la configuración. Repita este paso. Desconecte la vena de configuración de perfusión 1 y conectar a instalación de perfusión 2.
  6. Añadir 1 L de solución 5, encienda el agitador y perfusión durante 4 h a 35 mL/min.
    Nota: Solución 5 parece nublado después de convertirse en el agitador y la perfusión.
  7. Desconecte la vena de configuración perfusión 2 y lavar la vena fuera y por dentro con jeringa o una pipeta de 10 mL en 4 cambios de agua ultrapura para 5-10 minutos.
  8. Conectar la vena a configuración de perfusión 3, añadir 50 mL de solución 6 y perfusión de 10 mL/min en una cámara de 37 ° C por 4 h. vaciar el contenido de la instalación y desconecte la vena de la configuración.
  9. Conectar la vena para configuración de perfusión 1, llenar 1 L de solución 2 y perfusión durante la noche a 35 mL/min, repita el paso 5.4 paso 5.9 4 veces (para un total de 5 ciclos). Tomar una biopsia otra vez como se ha dicho en el paso 5.2.
    Nota: Omitir paso 5.8 segunda parte en los ciclos 1 y 3.
  10. Vacíe el contenido de la configuración. Llenar 1 L de solución 2 y perfusión durante 24 h a 35 mL/min solución el cambio 2 después de 12 h. vaciar el contenido de la configuración. Llenar 1L de agua ultrapura y perfusión durante 24 h a 35 mL/min cambio agua ultrapura después de 12 h.Empty el contenido de la configuración. Llenar 1 L de solución 7 y perfusión durante 24 h a 35 mL/min solución el cambio 7 después 12 h.

6. verificación de descelularización

  1. El formol fijada biopsias en agua ultrapura para proceso a 15 minutos en un procesador de tejidos siguiendo protocolos de lavado e incrustar en parafina22.
  2. Cortar 5 secciones μm utilizando un micrótomo y mancha con hematoxilina y 0.2% alcohólica eosina Meyer (H & E) siguiendo protocolos estándar22.
  3. Ver bajo un microscopio para verificar la pérdida de los núcleos en el tejido decellularized en comparación al tejido normal.

7. recelularización

  1. Esterilizar la vena colocando en un tubo de 50 mL que contenga 50 mL de solución 8. Agitar a 80 revoluciones por minuto (rpm) en la coctelera por 1 h a 37 ° C.
  2. Manejar una vena bajo la cabina de flujo laminar (LAF) de ahora en adelante para mantener la esterilidad. La transferencia de la vena utilizando pinzas estériles a un nuevo tubo de 50 mL que contenga 50 mL de solución estéril 7 y 500 μl de anti-anti. Menee como arriba de 12 h. cambio solución 7 al menos dos veces en el medio.
  3. Utilizando pinzas estériles, transferir la vena a un nuevo tubo de 50 mL y agregar 50 mL de medio de endotelial. Menee como arriba de 11 h.
  4. Montar el biorreactor utilizando guantes estériles en el gabinete de LAF. Atar la vena a vena entrada y salida con sutura estéril y pinzas el biorreactor.
  5. Conectar la vena con el biorreactor y el relleno con el mismo medio. Añadir heparina 50 IU/ml y perfusión de 1 h a 2 mL/min a 37 ° C.
  6. Recoge 15-25 mL de sangre fresca (dependiendo de la longitud de la vena) de la donante en tubos de vacutainer heparina cubierto y diluir 1:1 con solución Steen. Después, agregar derivados de glándula endocrina factor crecimiento endotelial vascular (EG-VEGF, 80 ng/mL), factor de crecimiento básico del fibroblasto (b-FGF, 4 μL/mL) y acetil salicílico ácido (5 μg/mL).
  7. El biorreactor se mueven a una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 y perfusión durante 48 h a 2 mL/min.
  8. Aproximadamente después de 12 h, mover el biorreactor a un gabinete, LAF tomar una gota de sangre y medir la glucosa usando un dispositivo de monitoreo de glucosa en sangre. Si el nivel es menos de 3 mmol/L, añadir glucosa a traer en el rango de 7 a 9 mmol/L. repetir este paso cada 8-12 h.
  9. Después de 48 h, el biorreactor en el gabinete de LAF y drenar la sangre del biorreactor. Añadir 30 mL de solución estéril 7 y perfusión por 5 min la solución de drenaje. Añadir 30 mL de solución estéril 7 y perfusión durante 5 minutos repetir dos veces o hasta que el color rojo de la sangre se pierde.
    Nota: La biopsia se puede tomar para la verificación del accesorio de la célula. Desconectar la vena, cortar los bordes de 5 mm de la vena con tijera y deshacerse de ellos. Tomar una biopsia como se indica en el paso 5.2 y conectar la vena de nuevo al reactor biológico (paso opcional).
  10. Agregue 30-45 mL de medio de endotelial y perfusión durante 96 horas en la incubadora a 2 mL/min.
    Nota: Agregue medio endotelial hasta que la vena esté sumergida.
  11. Mover el biorreactor en el gabinete LAF, desconectar la vena recellularized, cortar los bordes de 5 mm de la vena utilizando tijeras y deseche. Tomar una biopsia como se indica en el paso 5.2.

8. verificación de recelularización

  1. Siga las instrucciones en la sección 6 y realizar la tinción H & E. Examinar los portaobjetos en un microscopio para detectar la presencia de células.

Representative Results

La morfología gruesa de una vena normal es luz roja (Figura 3A). El color rojo se pierde en la descelularización progresiva ciclos (ciclo 2, figura 3B; ciclo 3, figura 3) y por el 5to ciclo, se ve pálido y blanco (figura 3D). La vena recellularized después de la perfusión de la sangre (figura 3E) y perfusión de medios endotelial (figura 3F) se ve rojo brillante en color. Los 5 ciclos de tratamiento de descelularización habían quitado con éxito las células de la vena como no se ven núcleos azul en la tinción H & E (Figura 4B). En contraste, varios núcleos fueron vistos en la vena normal (Figura 4A). La presencia de células conectadas en el lado luminal se observa tinción H & E en el recellularized de la vena con sangre durante 48 h (figura 4, flechas negras) y después de la perfusión con el medio endotelial de 96 h (figura 3D, flechas negras).

Figure 1
Figura 1 : Montaje de instalaciones de perfusión de descelularización. A) la imagen que muestra la configuración de descelularización montado 1 para Triton X-100 y lavado. Las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican las entradas y salidas para vena y soluciones. B) el cuadro que muestra la configuración de descelularización montado 2 para perfusión TnBP. Del mismo modo, como en configuración de descelularización 1, las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican las entradas y salidas para vena y soluciones. C) el cuadro que muestra la configuración de descelularización montado 3 para perfusión de desoxirribonucleasa. Las flechas blancas indican la trayectoria del flujo de soluciones y flechas rojas indican entradas de vena y soluciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Preparación y montaje del biorreactor de recelularización. A) cuadro muestra materiales necesarios para montar el biorreactor. B) imagen del interior de la tapa del puerto de 4 que muestra la colocación de conectores (flechas rojas), de reducir los puntos para conectar la vena de entrada y salida (flechas blancas) y arreglo de tubos de H, I y J. El extremo libre del tubo de H se coloca en el biorreactor para devolver los medios de comunicación. C) se observan los tubos respectivos entrando y saliendo de la parte superior del tapón de 4. D) foto mostrando el biorreactor montado. E) cuadro que muestra la configuración entera del biorreactor con la bomba peristáltica. Los tubos K amplían las conexiones desde el biorreactor a la bomba peristáltica. F) la representación esquemática del sistema de perfusión de biorreactor todo. Las flechas naranjas indican la dirección del flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : Bruto morfología de las venas durante la descelularización y recelularización. A) la morfología gruesa vena normal se ve rojo brillante en color. El color se pierde con el aumento del número de ciclos de descelularización B) ciclo 2 y C) ciclo 3. D) por 5 ciclos, la vena se ve pálido y blanco. La vena después de perfundiendo con E) sangre durante 48 h y F) con el medio endotelial de 96 h se ve rojo brillante una vez más en color. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Caracterización de las venas decellularized y recellularized. La hematoxilina y eosina tinción imagen de A) vena normal contiene muchos núcleos azul pero están ausentes en B) la vena decellularized. En la vena recellularized con C) sangre durante 48 h y con D) observó medio endotelial por 96 h, fijación de las células (flechas negras) en el lumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Discussion

La técnica presentada aquí de descelularización de venas safenas es un método fácil, sencillo y rentable que puede aplicarse también a todas las venas de pequeño diámetro como las venas umbilicales y mamarias. Las soluciones de descelularización y sus concentraciones utilizadas en este método son de nuestros anteriores resultados6,7. Aunque se recomiendan 5 ciclos de descelularización, en ciertas venas también notamos descelularización completa en 3 ciclos. Sin embargo, se obtuvieron resultados reproducibles mediante el uso de 5 ciclos. Aplicación de este protocolo, decellularized las venas de distintas longitudes hasta 30 cm con éxito (inédito resultado). Salida de la solución de la descelularización de elevación de 45 cm creará una presión de 33 mmHg dentro de la vena. En nuestra experiencia, nos dimos cuenta de esto como un paso clave en decellularizing la vena todo uniforme y reproducible en 5 ciclos. La presión solicitada es 3 veces mayor que la presión de la vena safena normal (5-10 mmHg) pero es que el mismo como incompetente de las venas (varices)23. Además, especulamos que esta alta presión crea una fuerza significativa en las paredes de la vena y puede, por lo tanto, ayudar en la remoción de células más rápido y eficiente.

Ya TnBP es un solvente orgánico insoluble en agua, revolviendo el detergente hasta que se convierte en turbia es importante; de lo contrario, flotará el detergente. Por la misma razón, para mantener TnBP mezclado en solución, se colocó el tubo de salida de detergente en la parte superior de la jarra de cristal con salida de la manguera. Eliminación eficiente de TnBP de la vena después de su uso en cada ciclo se aprecia por la ausencia de flotante TnBP gotitas en el agua lavado. También hemos notado que también omitiendo el paso de la ADNasa produce un tejido decellularized pero en algunos casos, se observó un relativamente alto contenido de ADN en el tejido decellularized. Como de alta presión y alto caudal no es necesarios para la eficiente actividad de DNasa, puede utilizarse una tasa de perfusión baja (10 mL/min). Se utilizó una bomba peristáltica diferentes debido a su tamaño más pequeño ayuda en el fácil manejo de la configuración. Puesto que nos dimos cuenta de que el daño de la mayoría de las células durante resultados de descelularización en ciclo 2, sugerimos saltar tratamiento de DNasa durante los ciclos 1 y 3 (resultados no publicados). A pesar de la caracterización y cuantificación de proteínas de matriz extracelular no se realizaron en este manuscrito, nuestra experiencia anterior con protocolos similares de descelularización demostró la preservación de propiedades biomecánicas, estructura y proteínas de matriz extracelular7. Aunque nuestros experimentos de cuantificación preliminar con estas venas produjeron un resultado similar (inédito), nuestros resultados ya publicados van a fortalecer esta confianza.

Recelularización con sangre es un proceso fácil y práctico sobre las células de la médula ósea ampliada como uno puede evitar largos tiempos de expansión celular, mutaciones espontáneas en células ampliadas, invasión quirúrgica y molestias para el paciente. Ya se sabe que endotelialización también puede ocurrir por circulación de EPCs, presumimos la perfusión de sangre seguido de perfusión con endotelial medio será suficiente para recelularización. La seguridad de los tejidos vena diseñado usando un método similar es vista desde resultados exitosos de trasplante cuando dos tales venas fueron implantadas en niños con obstrucción de vena porta extra hepática7. Especulamos que los factores de crecimiento en decellularized matriz extracelular permite el accesorio de EPCs de circulación de sangre24. Recelularización de venas siguiendo un protocolo similar demostró las células positivas para el receptor VEGF-2 y cluster de diferenciación (CD) 14 en el lumen y CD45 se observaron células expresa en adventicia7. También nos imaginamos que una continua capa endotelial puede no observarse en todos los casos sobre todo cuando con sangre de pacientes mayores y enfermas como es sabido que tales individuos han disminuido el número de circulación de las células progenitoras25. Sin embargo, postulamos que la perfusión con el destinatario sangre muchos de los antígenos que están expuestos debido a descelularización y así pueden disminuir las posibilidades de reacciones inflamatorias adversas cuando trasplantados en comparación con sólo el trasplante puede enmascarar decellularized de los vasos sanguíneos. Además, la perfusión de la sangre puede depositar aumento en los niveles de factores de crecimiento en la luz y la adventicia, que a su vez puede reclutar mayor número de células progenitoras, lo que resulta en un rápido proceso de recelularización en vivoen circulación.

Las ventajas del diseño del biorreactor utilizado en este estudio son completa esterilización en autoclave, fácil montaje, rentabilidad, fácil manejo y la menor posibilidad de daños. En nuestra experiencia, utilizando el diseño actual, las venas se recellularized hasta 10 cm de longitud. A pesar de las venas hasta 25 cm de largo también puede ser recellularized manteniendo la vena en forma de "U" en el biorreactor, esto debe ser validado. El diseño del biorreactor muestra que la dirección del flujo en la vena es contra la gravedad y está diseñada como tal porque es la dirección normal del flujo de estas venas en los seres humanos. La perfusión de 12 h del paso medio endotelial es requisito la vena y aumenta la afinidad para la fijación de las EPCs. Además de la heparina adicional y perfusión de 1 h disminuirá el riesgo de formar coágulos de sangre en los tubos durante la perfusión de la sangre.

El volumen de sangre requerido depende de la longitud de la vena. El principio básico que seguimos para el volumen de sangre es que la vena debe estar sumergida en la sangre. Durante la manipulación de volúmenes de sangre mayores de 45 mL, mezclando ocasionalmente podría ser necesario para evitar la acumulación de células en la parte inferior del biorreactor. Hemos añadido solución de Steen sangre ya que contiene una alta cantidad de proteínas y componentes necesarios para mantener los tejidos sanos durante el trasplante de órgano26,27. Adición de VEGF y FGF b es beneficioso ya que son factores de crecimiento de angiogenic potente28 y su presencia induce la migración, proliferación y diferenciación de EPCs29,30,31,32 . La cantidad de VEGF añadido se basa en nuestros anteriores resultados inéditos donde fue vista la proliferación de las EPCs a 80 ng/mL. Además de la aspirina inhibe la activación de las plaquetas33 disminuyendo las posibilidades de su adhesión a la capa endotelial. Monitoreo continuo y la adición de glucosa también será beneficiosos para prevenir la hemólisis de glóbulos rojos y proliferación celular.

Ya que sólo una muestra de sangre simple se requiere del receptor, puede considerarse como un procedimiento fácil y factible que requieren menos técnicos. A pesar de todo el procedimiento que se muestra aquí de principio a fin tarda 20 días, guardar las venas decellularized como un producto acortará el procedimiento para 8 días para los pacientes fuera de la plataforma. Aunque almacenamiento de venas decellularized técnicamente no debería afectar la eficiencia de recelularización, deben ser evaluado. Ingeniería de tejidos las venas generadas siguiendo este procedimiento pueden utilizarse en la clínica para cirugías de bypass, reemplazando las venas obstruidas, insuficiencia venosa a las venas varicosas sin necesidad de inmunosupresión y proporcionando así una mejor calidad de vida para el paciente.

Disclosures

SSH tiene acciones en Verigraft, una empresa que ha licenciado la tecnología de la ingeniería de los vasos sanguíneos de tejidos. Otros autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a profesor Anders Jeppsson por ayuda con el abastecimiento de los vasos sanguíneos utilizados en los experimentos. Este estudio fue financiado por la subvención de LUA ALF para SSH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Port Cap CPLabSafety WF-GL45-4Kit
Acetyl salicylic acid Sigma Aldrich A5376
Anti-Anti Life Technologies 15240-062
B-FGF Lonza cc-4113B
Blood Glucose monitoring system - Free style Lite Abbott 70808-70
D-Glucose Sigma Aldrich G8769
DNase-I Worthington LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
EDTA disodium salt dihydrate AlfaAesar A15161.OB
EGM-2 Growth Factors Kit Lonza CC-4176
EG-VEGF Peprotech 100-44
Glass bottle 250ml VWR 2151593 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass bottle 1L VWR 2151595 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass jar 500ml with bottom hose outlet Kimble Chase Life Science 14607
Heparin Leo 387107
Heparin Coated Vacutainer Tubes Becton Dickinson 368480
Human AB Serum Sigma Aldrich H3667
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Luer Female with 1/8" ID Barb Oina LF-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Female with 3/32" ID Barb Oina LF-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 3/32" ID Barb Oina LM-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 1/8" ID Barb Oina LM-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Male with 5/32" ID Barb Cole Parmer EW-45518-06 For 5X8mm silicon tube
MCDB 131 Life Technologies 10372-019
Per acetic acid Sigma Aldrich 433241
Peristaltic pump I Masterflex 7524-45 For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75
Peristaltic pump II Ismatec ISM941 For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Potassium hydrogen phosphate Sigma Aldrich P9791
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm Biotech ISM569A
Shaker Ika KS4000 i  control
Sodium Azide Sigma Aldrich 71290
Sodium chloride Sigma Aldrich 13423
Sodium hydrogen phosphate Merck 71640-M
Steen solution Xvivo 19004
Suture Agnthos 14817
Tri-n-butyl Phosphate AlfaAesar A16084.AU
Triton-X-100 AlfaAesar A16046.OF
Tube 60ml with flat base Sarstedt 60596
Tube A VWR 2280706 Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube B VWR 2280706 Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup
Tube C VWR 2280706 Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3
Tube D VWR 2280706 Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2
Tube E VWR 2280706 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube F VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube G VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube H VWR 2280703 Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup
Tube I VWR 2280703 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube J VWR 2280703 Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup
Tube K VWR 2280703 Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup

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References

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Descelularización y recelularización metodología de venas safenas humanas
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Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).More

Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).

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