כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להצפנה decellularization וריד saphenous באמצעות חומרי ניקוי, recellularization על ידי זלוף של הדם ההיקפיים, המדיום אנדותל.
תעלות כלי דם בשימוש במהלך רוב ניתוחי כלי דם הם שתלים allogeneic או סינתטי לעיתים קרובות לגרום לסיבוכים הנגרמת על ידי החיסוני patency המסכן. הנדסת רקמות מציע פתרון חדשניים ליצירת שתלי אישית עם מטריצה חוץ-תאית טבעי המכיל התאים של המטופל באמצעות השיטה של decellularization ושל recellularization. אנו מראים שיטה מפורטת לביצוע decellularization של וריד saphenous אנושי, recellularization על ידי זלוף דם היקפיים. הווריד היה decellularized על-ידי % 1 פרפוזיה טריטון X-100, 1% tri-n-בוטיל-פוספט (TnBP) ו- 2,000 יחידות קוניץ של deoxyribonuclease (DNase). טריטון X-100 ו- TnBP היו perfused ב 35 מ ל/דקה במשך 4 שעות בעוד DNase היה perfused ב- 10 מ ל/דקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. תקחי את שטף מים הנדסה גנטית, PBS, ואז מעוקר ב 0.1% חומצה peracetic. זה היה נשטף שוב ב- PBS, preconditioned בינוני אנדותל. הווריד מחובר מגיב ביולוגי, perfused בינונית אנדותל המכיל 50 IU/mL הפארין עבור ה 1 Recellularization בוצע על ידי מילוי של ביוריאקטור עם דם טרי, 1:1 מדולל בפתרון סטין, והוספת בלוטה אנדוקרינית-derived כלי דם גורמי גדילה אנדותל (80 ng/mL), גורמי גדילה בסיסי פיברובלסט (4 µL/mL), חומצה אצטיל-סליצילית (5 µg/mL). ביוריאקטור היה ואז עבר לגור אינקובטור, perfused במשך 48 שעות ב- 2 מ ל/דקה תוך שמירה על גלוקוז בין 3-9 mmol/ל’ מאוחר יותר, הווריד היה נשטף עם PBS, מלא בינונית אנדותל, perfused עבור h 96 בחממה. טיפול עם טריטון X-100, TnBP ו- DNase decellularized וריד saphenous 5 מחזורים. הווריד decellularized נראה לבן בניגוד ורידים רגיל ו- recellularized (אדום בהיר). Hematoxylin & אאוזין (H & E) צביעת הראה הנוכחות של גרעינים רק רגיל אך לא ורידים decellularized. את תקחי את recellularized, H & E מכתים הראה הנוכחות של תאים על-פני luminal הווריד.
תעלות כלי דם יש צורך במספר תנאים קליניים כמו מפרצות, היצרות העורק הראשי, טרשת עורקים המובילים לבעיות קשות של כלי הדם. מנתחים להשתמש תעלות כלי דם עצמיים, allogeneic או סינתטיים כדי לשחזר את אספקת הדם פונקציונלי. למרות השימוש של כלי דם עצמיים עדיין נחשב הגישה האידיאלית, זמינות בחולים מוגבל צהובה. החלופות כגון שתלי allogeneic או סינתטי יש בעיות עמוקה עם טיפולים לדיכוי המערכת החיסונית ואת עני patency שמוביל reoperation1,2, וכתוצאה מכך הבריאותיות העיקריים בנטל כלכלי למדינות. הנדסת רקמות של כלי הדם שואפת לספק שתלי הומולוגיה הטבעי של תאים עצמיים. לפיכך, המערכת החיסונית הנמען מזהה השתל מהתורם העצמי, מאחר שתל כזה מכיל חלבונים טבעיים של תאים בתצורה המקורית, זה עשוי לתפקד טוב יותר לעומת החלופות הנוכחי. רקמות מהונדסים איברים, כמו למשל את שלפוחית השתן3, את השופכה4, קנה הנשימה5ו6,ורידים7, בהצלחה שימשו במרפאה.
הנדסת רקמות לייצר שתלים אישית דורשת השתלה מתורם ואחריו decellularization ו recellularization. Decellularization היא טכנולוגיה מבטיח להסיר תאים לרקמות ואיברים8,9,10. Decellularization יכול להתבצע על ידי שיטות ספציפיות פיזי, כימי אנזימטי11 או שילובם. -שימוש אופטימלי של שיטות אלה, רקמות decellularized יכולות להיות דומה חלבונים מבניים ופונקציונליים מטריצה חוץ-תאית דומה לרקמות מקורית. איברים כאלה בעלי יכולת מהותי כדי לשפר את הקובץ המצורף, הגירה, התפשטות, התמיינות של תאי גזע נכנסות.
Recellularization הוא תהליך דינאמי של זריעה תאים לתוך השתל, תאי גזע הנמען יכול לשמש עבור השתלת קליניים. תאי גזע בשימוש כיום למטרות כאלה כוללים מח העצם, mesenchymal איבר תושבים3,5,6. חיה ולימודי מחקר מונחה השתמשו בתאי גזע ממוצא mesenchymal שאינם pluripotent עוברית, מושרה12,13,14. תהליך זה דורש מגיב ביולוגי (חדר מחזיקה את הווריד ומספק את התנאים הנדרשים כמו טמפרטורה, גזים, pH לחץ), תאים ומדיה תרבות. האתגר של recellularization הוא כדי להשיג את המספר הנדרש של תאים של סוג מסוים של אסטרטגיה זריעה שבו תאים יכולים להגיע כל רקמה או איבר. למרות אין איבר או רקמה מלאה מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית יש כבר נוצר, מוערכים עד עכשיו, מספר הפיתוחים בשדה ואת תוצאות ראשוניות להראות את האפשרות העתידית15. הפונקציה מפתח של הווריד טמון אנדותל luminal השולטת חדירה של תאים דלקתיים ברקמות, השכבה האמצעית שריר חלק, מסייע לתעוקה ומספק גם את הכוח להחזיק את לחץ הדם16. מחקרים הראו כי במהלך נזק, endothelialization מתרחשת השקה או מלהסתובב אנדותל ובתאים (EPCs) דם17,18,19. האסטרטגיה שלנו עבור recellularization של ורידים מסתמך על EPCs ההווה במחזור הדם.
הנדסת רקמות של ורידים, עורקים בוצע על ידי מספר קבוצות עוקב אחר decellularization ו- recellularization אסטרטגיות20,21. הקבוצה שלנו יש גם לבצע ופיתח אסטרטגיות decellularization ו- recellularization ורידים iliac ואת החלב6,7. Decellularization בוצע על ידי חרדה הווריד ב טריטון X-100, tri-n-בוטיל פוספט (TnBP), וכן אנזים deoxyribonuclease (DNase). Recellularization בוצעה באמצעות מח עצם נגזר אנדותל וחלק שרירים תאים6 או דם היקפיים7. הורידים recellularized על-ידי פרוטוקול גם הראו הבטחה קליניים במתן אספקת דם תפקודי השתלת של ילדים חולים עם6,חסימה נוספת וריד שער7.
כיום פותחו גירסה שונה של פרוטוקול זהה עבור ביצועים משופרים וקל של decellularization, recellularization, ביוריאקטור טיפול ורידים בקוטר קטן. פרוטוקול decellularization הנוכחי נדרש זלוף של דטרגנטים דרך הווריד של באמצעות הלחץ במקום עצבנות עם דטרגנטים. פרוטוקול recellularization כרוך צעד נוסף של preconditioning לשיפור הידבקות תאים ותוספת של גורמי גדילה במחזור הדם לשיפור הידבקות תאים, הישרדות והתפשטות. גם שיפרנו את העיצוב של ביוריאקטור שימוש במוצרים זמינים מסחרית. בנייר זה, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול שונה עבור ביצוע decellularization ו- recellularization של האדם הורידים saphenous גדולות.
הטכניקה המובאת כאן עבור decellularization של הורידים saphenous גדולות היא שיטה קלה, פשוטה וחסכונית, באפשרותך גם להחיל על כל ורידים בקוטר קטן כמו ורידים הטבור ואת החלב. הפתרונות decellularization וריכוזי שלהם בשימוש בשיטה זו הם שלנו6,הקודם תוצאות7. אף-על-פי מומלץ 5 מחזורים של decellularization, בורידים מסוימים גם הבחנו decellularization מלאה ב- 3 מחזורים. עם זאת, תוצאות לשחזור התקבלו באמצעות 5 מחזורים. יישום פרוטוקול זה, אנחנו decellularized ורידים באורכים משתנים עד 30 ס מ בהצלחה (לא פורסם התוצאה). הרמה outlet של הפתרון decellularization 45 ס מ ייצור בלחץ של 33 מ מ כספית בתוך הווריד. מניסיוננו, שמנו לב זה כצעד מפתח ב decellularizing את הווריד כל בצורה אחידה, reproducibly 5 מחזורים. הלחץ שבחרת הוא גבוה פי 3 מאשר הלחץ הרגיל וריד saphenous (5-10 מ מ כספית) אבל שכמו פסול כלי הדם (ורידים)23. בנוסף, אנו משערים כי זו בלחץ גבוה תיצור כח משמעותי על קירות וריד, עשויים, לכן, לסייע בהסרת התאים באופן יעיל ומהיר.
מאז TnBP הממס אורגני מסיס במים, לערבב הנוזל עד שיהפוך מעונן חשובה; אחרת, הנוזל יצוף. מאותה סיבה, כדי לשמור על TnBP מעורבת בפתרון, הונח צינור עודפים של הנוזל בראש צנצנת הזכוכית עם השקע צינור. הסרה יעילה של TnBP מ הווריד לאחר השימוש בבכל מחזור ניתן לראות בגלל היעדר צף TnBP טיפות במים שטף. יש לנו גם לב כי דילוג על השלב DNase גם הפיק רקמה decellularized, אבל במקרים אחדים, תוכן ה-DNA יחסית גבוהה בתוך הרקמה decellularized היה לב. כפי בלחץ גבוה, זרימה גבוהה המחירים אינם נדרשים לפעילות DNase יעיל, עשוי לשמש שיעור נמוך זלוף (10 מ ל/דקה). משאבה סחרור שונות שימש כמו גודלו קטן עוזר בטיפול קל של ההתקנה. מאז ששמנו לב את הנזק של רוב התאים במהלך decellularization תוצאות במחזור 2, אנו מציעים דילוג על טיפול DNase במהלך מחזורי 1 ו- 3 (תוצאה שלא פורסמו). אף-על-פי אפיון של כימות של מטריצה חוץ-תאית חלבונים לא בוצעו כתב יד זה, ניסיון העבר שלנו עם פרוטוקולים decellularization דומה הראה על שימור נכסים ביו-מכני, מטריצה חוץ-תאית המבנה של חלבונים7. למרות ניסויים כימות הראשוני שלנו עם ורידים אלה הפיק תוצאה דומה (לא פורסם), התוצאות שפורסמו כבר שלנו יחזק את הביטחון הזה.
Recellularization דם הוא תהליך קל ונוח על תאים במח העצם מורחבת ככל אחד יכול להימנע זמן תא הרחבה פעמים, מוטציות ספונטניות תאים מורחבת, הפלישה כירורגית ו אי נוחות לחולה. כיוון שידוע כי endothelialization יכול להתרחש גם מלהסתובב EPCs, שיערנו כי זלוף בדם ואחריו זלוף בינונית אנדותל יהיה מספיק עבור recellularization. הבטיחות של וריד רקמות מהונדסים באמצעות שיטה דומה נראה מתוצאות מוצלחת של השתלת כאשר שני ורידים כאלה שהיו מושתלים לתוך ילדים עם הפרעה נוספת וריד שער7. אנו משערים כי הגורמים צמיחה decellularized מטריצה חוץ-תאית יאפשר את הקובץ המצורף של מחזורי EPCs מן הדם24. Recellularization של ורידים בעקבות פרוטוקול דומה הראתה. תאי חיובי עבור VEGF קולטן-2 ואשכול של בידול (CD) 14-לומן תוך CD45 התאים מבטאים נראו ב- adventitia7 אנו גם לדמיין כי שכבת אנדותל רציף לא ייבחנו בכל המקרים במיוחד בעת שימוש דם מחולים מבוגרים וחולים כפי שהוא מוכר כי אנשים כאלה פחתו מספרים של מחזורי תאים קדמון25. עם זאת, אנחנו בקביעתו כי זלוף עם האישי של המטופל דם עשוי להסוות רבים של אנטיגנים נחשפים בגלל decellularization, ובכך עשויה להקטין את הסיכויים של תגובות דלקתיות שליליות כאשר מושתלים בניגוד משתילים רק decellularized כלי הדם. בנוסף, הדם זלוף יכול להפקיד רמות גבוהות של גורמי גדילה לומן, adventitia אשר בתורו יכול לגייס מספר רב יותר של מחזורי ובתאים וכתוצאה מכך תהליך מהיר של recellularization ויוו.
היתרונות של עיצוב ביוריאקטור השתמשו במחקר זה הם autoclaving מלאה, הרכבה קלה, משתלמת, טיפול קל, את האפשרות לפחות של נזק. מניסיוננו, באמצעות העיצוב הנוכחי, הורידים עד 10 ס מ אורך היו recellularized. למרות הוורידים עד 25 ס מ אורך גם יכול להיות recellularized על ידי שמירה על הווריד של במצב “U” בתוך ביוריאקטור, זה לאמת. העיצוב ביוריאקטור מראה הכיוון של זרימה בווריד נגד כוח המשיכה תוכנן כך כי זה הכיוון הרגיל של הזרימה עבור ורידים אלה בבני אדם. זלוף 12 שעות של צעד בינוני אנדותל היא precondition את הווריד, להגדיל את הזיקה עבור החזקה של EPCs נכנסות. תוספת של הפארין נוספת זלוף עבור 1 h תפחית את הסיכון של יצירת קרישי דם בתוך הצינורות במהלך הדם זלוף.
נפח הדם הנדרש תלוי אורך הווריד. העיקרון הבסיסי שנעקוב אחרי עבור נפח הדם היא כי הווריד צריך להיות שקוע בתוך הדם. תוך כדי טיפול גדול יותר 45 מ ל דם כרכים, ערבוב מזדמן יידרש כדי למנוע הצטברות תאים בתחתית ביוריאקטור. הוספנו לפתרון של סטין דם כיוון שהוא מכיל כמות גבוהה של חלבונים, הרכיבים הדרושים כדי לשמור על רקמות בריא במהלך26,של השתלת איברים27. תוספת של VEGF ו- b-FGF מועיל כפי הם גורמי גדילה האנגיוגנזה חזק28 ומשרה את נוכחותם ההעברה, התפשטות, הבידול של EPCs29,30,31,32 . הכמות של VEGF הוסיף מבוסס על תוצאות שלא פורסמו הקודמת שלנו איפה ההתפשטות של EPCs נראתה ב- 80 ng/mL. תוספת של אספירין מעכב את ההפעלה של טסיות33 ובכך להקטין את הסיכוי שלהם מצורף שכבת אנדותל. ניטור רציף, תוספת של גלוקוז גם יהיה מועיל התפשטות תאים ולמניעת המוליזה של כדוריות דם אדומות.
מאז רק דגימת דם פשוטה נדרש מן הנמען, זה יכול להיות נחשב הליך קל של ריאלי הדורש מומחיות טכנית פחות. למרות, כל התהליך המוצג כאן מההתחלה לסיים לוקח 20 ימים, אחסון הורידים decellularized כמו מהמדף מוצר יקטין את ההליך כדי 8 ימים עבור חולים. למרות אחסון של ורידים decellularized טכנית לא תשפיע על היעילות recellularization, זה חייב להיות מוערך. רקמות מהונדסים ורידים שנוצר בעקבות הליך זה יכול לשמש במרפאה לניתוח מעקפים, החלפת חסמים ורידים, אי ספיקה ורידית מובילים דליות ורידים ללא צורך דיכוי המערכת החיסונית, ובכך לספק איכות טובה יותר של החיים עבור המטופל.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות פרופסור אנדרס Jeppsson על העזרה במתן כלי דם בשימוש הניסויים. מחקר זה מומן על ידי המענק LUA אלף ל SSH.
4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
Blood Glucose monitoring system – Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
Shaker | Ika | KS4000 i control | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Steen solution | Xvivo | 19004 | |
Suture | Agnthos | 14817 | |
Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |