여기, 우리 주변 혈액과 내 피 매체의 관류 하 여 세제 및 recellularization를 사용 하 여 saphenous 정 맥 decellularization에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
혈관 도관 대부분 혈관 수술 하는 동안 사용 되는 종종 면역 억제와 가난한 patency로 인 한 합병증으로 이어질 수용자 또는 합성 이식입니다. 조직 공학 decellularization 및 recellularization 메서드를 사용 하 여 받는 사람의 세포를 포함 하는 자연적인 기질과 개인된 이식 생성 하 새로운 솔루션을 제공 합니다. 우리 주변 혈액의 재 관류에 의해 인간의 saphenous 정 맥 및 recellularization의 decellularization를 수행 하기 위한 자세한 방법을 보여줍니다. Perfusing 1%에서 정 맥 decellularized 했다 트라이 톤 X-100, 1% 트라이-n-부 틸-인산 염 (TnBP) 및 deoxyribonuclease (DNase)의 2000 Kunitz 단위. 트라이 톤 X-100 및 TnBP DNase 4 h 37 ° C에서 10 mL/min에 끼얹는다는 하는 동안 4 h 35 mL/min에 끼얹는다 했다. 정 맥 초순와 PBS로 세척 되었고 0.1% 초 산에 멸 균. 그것은 다시 PBS로 세척 되었고 preconditioned 내 피 중간에. 정 맥은 생물에 연결 되었고 끼얹는다 50 IU/mL를 포함 하는 내 피 매체 1 h. Recellularization에 대 한 헤 파 린 신선한 혈액으로 생물, Steen 솔루션, 희석된 1: 1을 작성 하 고 내 분 비 동맥에서 파생 된 추가 의해 수행 됐다 혈관 내 피 성장 인자 (80 ng/mL), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (4 µ L/mL), 및 아 세 틸 살리실산 (5 µ g/mL). 생물에 인큐베이터에 이동 했다 그리고 3-9 mmol/l. 사이 포도 당을 유지 하면서 2 mL/min에서 48 h에 끼얹는다 나중에, 정 맥 PBS로 세척, 내 피 매체 가득 이었고 인큐베이터에서 96 h 끼얹는다. 트라이 톤 X-100, TnBP와 DNase 치료 5 사이클에서 saphenous 정 맥 decellularized. Decellularized 정 맥 백색 정상 및 recellularized 정 맥 (라이트 레드) 달리 보였다. 되며 & 오신 (H & E) 얼룩만 정상 decellularized 정 맥에만 핵의 존재를 보여주었다. Recellularized 정에서 H & E 염색는 정 맥의 luminal 표면에 세포의 존재를 보여주었다.
혈관 도관이 동맥 류, 경 동맥 협 착 증 및 심한 혈관 문제로 이어지는 동맥 경화 같은 여러 임상 조건에 대 한 필요 합니다. 외과 “헌, 수용자 또는 합성 혈관 도관”을 사용 하 여 복원 기능 혈액 공급. 만 헌 혈관의 사용은 여전히 이상적인 접근, 환자에서 가용성 majorly 제한 됩니다. 수용자 또는 합성 이식 등 대안 면역 치료와 가난한 patency reoperation1,2, 국가 경제 부담 주요 건강 결과로 이어지는 깊은 문제가 있다. 혈관의 조직 공학 자연 상 동 및 autologous 세포 이식 제공 하는 것을 목표로. 따라서, 받는 사람 면역 시스템 자체도 이식된 이식 인식 하 고 이러한 이식 자연 단백질 및 원래 구성에 있는 셀에 포함 되어 있는, 그것은 현재 대안에 비해 더 나은 작동 수도 있습니다. 3방광, 요도4, 기관5및 정 맥6,7, 성공적으로 사용 되었습니다 병원에서와 같은 조직 기관, 설계.
조직 공학 생산 맞춤된 이식 decellularization 및 recellularization 기증자 로부터 이식을 필요 합니다. Decellularization 조직 및 장기8,,910에서 세포를 제거 하는 유망한 기술 이다. Decellularization 특정 물리적, 화학적 및 효소 방법11 또는 그들을 결합 하 여 수행할 수 있습니다. 이러한 방법의 최적 사용에 decellularized 조직 기질 비슷한 기본 조직에에서 유사한 구조상과 기능적인 단백질을 가질 수 있습니다. 이러한 장기 첨부 파일, 마이그레이션, 확산, 그리고 들어오는 줄기 세포의 분화를 향상 시키기 위해 본질적인 능력 소유.
Recellularization 세포는 이식에 뿌리기의 동적 프로세스 이며 받는 사람 줄기 세포 임상 이식에 사용할 수 있습니다. 현재 이러한 목적을 위해 사용 하는 줄기 세포 골 수, 간 엽 등 장기 거주자3,,56. 동물 및 연구 지향적인 연구 태아 및 유도 만능12,,1314엽 기원에서 줄기 세포를 이용 했다. 이 프로세스에서는 생물 반응 기 (정 맥을 보유 하 고 온도, 가스, pH, 압력과 같은 필요 조건을 제공 하는 챔버), 세포 및 문화 미디어. Recellularization에도 전에 세포의 특정 유형 및 셀 전체 조직 또는 기관에 도달할 수는 시드 전략의 필요한 수를 얻을 것입니다. 비록 완전 한 조직 또는 기관 구조적 및 기능적으로 생성 되었으며 지금까지 평가, 필드와 초기 결과에 여러 발전 미래의 가능성15를 표시 합니다. 정 맥의 핵심 기능 조직 및 수축에 도움이 되 고 또한 혈압16를 힘을 제공 한다 중간 매끄러운 근육 층으로 선 동적인 세포의 침투를 제어 luminal endothelium에 놓여 있습니다. 연구는 손상, 동안 endothelialization 발생 또는 순환 혈액17,,1819에 내 피 조상 세포 (Epc)에서 문 합에서 설명 했다. 혈관의 recellularization에 대 한 우리의 전략 Epc 혈액 순환에 의존 합니다.
정 맥과 동맥의 조직 공학 다른 decellularization 및 recellularization 전략20,21다음 여러 그룹에 의해 수행 되었다. 우리의 그룹은 또한 수행 하 고 장 골과 유 정 맥6,7decellularization 및 recellularization 전략을 개발. Decellularization은 트라이 톤 X-100, 트라이-n-부 틸 인산 (TnBP), 그리고 효소 deoxyribonuclease (DNase)에서 정 맥의 동요에 의해 수행 되었다. recellularization 파생 하는 골 수 내 피와 부드러운 근육 세포6 또는 주변 혈액7를 사용 하 여 수행 되었다. 혈관 중 프로토콜 추가 간 문맥 방해6,7소아 환자 이식에 기능 혈액 공급을 제공 하 임상 약속을 보여주었다 recellularized.
우리는 현재 직경이 작은 혈관의 decellularization, recellularization 및 생물 처리의 향상 된 쉽고 성능에 대 한 동일한 프로토콜의 수정된 된 버전을 개발 했습니다. 현재 decellularization 프로토콜 세제와 동요 대신 압력을 사용 하 여 정 맥을 통해 세제의 관류가 필요 합니다. Recellularization 프로토콜의 늘어진 세포 접착 및 세포 접착, 생존 및 확산 개선을 위한 혈액 순환에 성장 요인의 개선에 대 한 추가 단계를 포함 한다. 우리는 또한 상업적으로 사용할 수 있는 제품을 사용 하 여 생물 반응 기의 디자인을 개량 했다. 이 논문에서는, decellularization와 인간의 saphenous 정 맥의 recellularization를 수행 하기 위한 수정 된 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 선물이.
Saphenous 정 맥의 decellularization에 대 한 여기에 제시 된 기술 또한 탯 줄 고 유 방 정 맥 처럼 모든 직경이 작은 혈관에 적용 될 수 있는 쉽게, 간단 하 고 비용 효율적인 방법입니다. Decellularization 솔루션 및이 방법에 사용 되는 그들의 농도 우리의 이전 결과6,7. 비록 decellularization의 5 주기를 권장 하 고, 특정 혈관에 우리도 눈치 3 주기에서 완전 한 decellularization. 그러나, 재현 결과 5 주기를 사용 하 여 얻은 했다. 우리는 다양 한 길이의 혈관 decellularized이 프로토콜을 적용, 30 cm까지 성공적으로 (되지 않은 결과). 45 m decellularization 솔루션의 콘센트를 리프팅 정 맥 안에 33 mmHg의 압력을 만들 것입니다. 우리의 경험에서 우리 전체 맥락을 균일 하 게 decellularizing에 그리고 reproducibly 5 주기에서 주요 단계로이 나타났습니다. 선택된 압력은 정상적인 saphenous 정 맥 압력 (5-10 mmHg) 보다 3 배 높은 하지만 무능에서와 같이 혈관 (정 맥)23. 또한, 우리는이 높은 압력 정 맥 벽에 큰 힘을 만들 것입니다 하 고 따라서 효율적이 고 빠른 세포 제거에 도움이 있습니다, 사색 한다.
TnBP은 유기 용 매와 물에 불용 성, 흐린 될 때까지 세제를 감동이 중요; 그렇지 않으면, 세제에 플 로트 것입니다. 같은 이유로 TnBP 솔루션, 혼합 계속 세제의 콘센트 튜브가 두었다 호스 콘센트와 함께 유리 항아리의 상단에. 효율적인 제거 후 씻어 물에 TnBP 방울의 부재 모든 주기에 그것의 사용을 볼 수 있습니다 정 맥에서 TnBP의. 우리는 또한 decellularized 조직 생산 또한 DNase 단계를 건너뛰는 하지만 몇 가지 경우, decellularized 조직에서 비교적 높은 DNA 콘텐츠 발견 했다 나타났습니다. 높은 압력 및 높은 흐름 율 효율적인 DNase 활동에 대 한 필요 하지 않습니다, 낮은 관류 속도 (10 mL/min) 사용할 수 있습니다. 그것의 더 작은 크기는 설치의 쉬운 처리에 도움이 됩니다 다른 연동 펌프 사용 했다. 이후 우리는 주기 2에에서 decellularization 결과 중 대부분의 세포의 손상을 발견, 건너뛰는 DNase 1 고 3 (게시 되지 않은 결과) 주기 동안 치료 하는 것이 좋습니다. 특성화 및 정량화의 세포 외 기질 단백질이이 원고 수행 했다, 비록 유사한 decellularization 프로토콜 우리의 이전 경험이 했다 biomechanical 속성의 보존 세포 외 기질 단백질 및 구조7. 비록 이러한 혈관 우리의 예비 정량화 실험 (미 발표) 비슷한 결과 생산, 우리의 이미 게시 된 결과이 신뢰를 강화 것입니다.
Recellularization 혈액을 사용 하 여 하나 긴 셀 확장 시간, 환자에 대 한 확장 된 셀, 외과 침략, 및 불편에 자발적인 돌연변이 피할 수 있다 확장 하는 골 수 세포를 통해 편리 하 고 쉬운 프로세스입니다. 이후 endothelialization도 Epc 순환에서 발생할 수 있습니다, 우리는 혈액 내 피 매체 관류 뒤 그 관류 가설 알려져 있다 recellularization에 대 한 충분 한 될 것입니다. 이러한 두 개의 혈관 여분 간 문맥 방해7자식으로 이식 했다 때 비슷한 메서드를 사용 하 여 설계 하는 정 맥 조직의 안전 이식의 성공적인 결과에서 볼 수 있다. 우리는 decellularized 세포 외 기질에 성장 요인 혈액24에서 Epc를 순환의 첨부 파일을 허용할 것 이다을 추측 한다. 유사한 프로토콜에 따라 혈관의 recellularization 셀 VEGF 수용 체-2와 차별화 (CD) 14 CD45 표현 셀 adventitia7에서 보인 동안 루멘에의 클러스터에 대 한 긍정적인 했다. 우리는 또한 그 지속적인 내 피 층 하지 관찰 수 있습니다 모든 경우에 이러한 개인 조상 세포25순환 수가 감소 알려진 대로 이전 하 고 병에 걸린 환자에서 혈액을 사용 하는 경우에 특히 상상. 그러나 우리는 관류와 받는 사람의 자신의 가정 혈액 항 원 decellularization 때문에 노출 되 고 따라서 불리 한 염증 반응 때 반대만 이식 이식의 기회를 줄일 수 있습니다의 많은 마스크 수 있습니다 decellularized 혈관입니다. 또한, 혈액 관류 루멘에 조상 세포 vivo에서recellularization의 빠른 과정에 인 순환의 증가 숫자를 모집 수 있습니다 adventitia에 성장 요인의 증가 수준을 입금 수 있습니다.
이 연구에 사용 된 생물 반응 기 디자인의 장점은 완전 한 압력가 마로 소독, 쉬운 조립, 비용 효율성, 쉬운 취급 및 손상의 적어도 가능성입니다. 우리의 경험에서는, 현재 디자인, 정 맥 길이 10 cm까지 했다 recellularized를 사용 하 여. 비록 최대 정 맥 길이 25cm는 생물 안에 “U” 모양 정 맥을 유지 하 여 recellularized도 수, 유효성을 검사 해야 합니다. 생물 반응 기 디자인 정 맥에서 흐름의 방향은 중력에 대 한 설계 되었습니다 같은 때문에 인 간에 있는 이러한 혈관에 대 한 흐름의 수직 방향을 보여줍니다. 내 피 중간 단계의 12 h 관류 혈관 precondition 들어오는 Epc의 첨부 파일에 대 한 선호도 증가입니다. 추가 추가 헤 파 린 및 1 시간에 대 한 관류의 혈액 관류 동안 튜브에 혈전 형성의 위험을 낮출 것 이다.
필요한 혈액의 양을 정 맥의 길이에 따라 달라 집니다. 우리 혈액 볼륨에 따라 기본 원리는 정 맥 혈액에 빠져들 수 한다입니다. 45 mL 보다 큰 혈액 볼륨을 처리 하는 동안 가끔 혼합 세포는 생물의 하단에 축적을 방지 하기 위해 요구 수 있습니다. 우리 혈액의 단백질 조직 장기 이식26,27동안 건강 한 유지 하는 데 필요한 높은 금액을 포함 하기 때문에 Steen의 솔루션 추가. 그들은 강력한 신생 성장 인자28 및 마이그레이션, 확산, 및 Epc29,,3031,32의 차별화를 유도 하는 그들의 존재로 VEGF와 b-FGF의 추가 도움이 됩니다. . VEGF 추가 금액은 Epc의 확산 80 ng/mL에서 목격 된 우리의 이전 되지 않은 결과 기반으로 합니다. 아스피린의 혈소판33 내 피 층에 그들의 부착의 기회 감소의 활성화를 억제. 지속적인 모니터링 및 포도의 추가 세포 증식 및 적혈구의 용 혈을 방지 도움이 됩니다.
간단한 혈액 샘플만 받는 이기 때문에, 보다 적게 기술 전문 간단 하 고 가능한 절차로 여겨질 수 있다. 비록, 완료부터 여기 표시 된 모든 절차는 20 일 소요, 저장으로 decellularized 혈관은 선반에서 제품 환자에 대 한 일 절차 단축 됩니다. Decellularized 혈관의 스토리지 기술적으로 미치지 않습니다 recellularization 효율성, 비록 평가 되어야 합니다. 조직 설계 혈관 생성이 절차에 따라 병원에 바이패스 수술, 방해 혈관, 면역 억제를 위한 필요 없이 정을 선도 하 고 따라서 더 나은 품질을 제공 하는 정 맥 불충분을 대체 사용할 수 있습니다. 환자를 위한 생활입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 교수 Anders Jeppsson는 실험에 사용 된 혈관을 제공 하는 방법에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구를 융자 되었다 SSH LUA ALF 그랜트에 의해.
4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
Blood Glucose monitoring system – Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
Shaker | Ika | KS4000 i control | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Steen solution | Xvivo | 19004 | |
Suture | Agnthos | 14817 | |
Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |