Summary
תוך שאיפה להבין את אופני הפעולה של חיידקי conjugative DNA אלמנטים שונים בתנאים שונים, אנו מתארים את פרוטוקול זיהוי הבדלים תדר ההטיה, עם רזולוציה גבוהה, כדי להעריך באיזו מידת יעילות החיידק התורם יוזם ההטיה.
Abstract
קוניוגציה היא צעד חשוב בהעברת אופקי גנים עמידות לאנטיביוטיקה דרך אלמנט דנ א conjugative. חומר השוואתי של תדר ההטיה בתנאים שונים נדרשים להבין איך הרכיב conjugative מתפשט בטבע. עם זאת, שיטות קונבנציונליות להשוואת ההטיה תדירות אינם מתאימים עבור חומר השוואתי בגלל הרקע גבוה נגרם על-ידי ההתרחשות של אירועים נוספים ההטיה בצלחת סלקטיבי. בהצלחה הורדנו את הרקע על ידי החדרת שיטת (MPN) מספר הסביר ביותר, ריכוז גבוה יותר של אנטיביוטיקה כדי למנוע ההטיה במדיום נוזלי סלקטיבי. בנוסף, פיתחנו פרוטוקול עבור הערכת ההסתברות של איך לעיתים קרובות ההטיה אתחול של תאי התורם על-ידי מיון תאי התורם יחיד לתוך בריכות הנמען על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS). בעזרת פלסמידים 2, pBP136, pCAR1, ההבדלים ההטיה תדירות בתאים Pseudomonas putida יכול להתגלות במדיום נוזלי בקצב מלהיב שונה. התדרים של חניכה ההטיה היו גבוהים עבור pBP136 מאשר עבור pCAR1. באמצעות תוצאות אלו, שנוכל להבין את תכונות ההטיה באלה פלסמידים 2.
Introduction
קוניוגציה של מרכיבים גנטיים ניידים, פלסמידים conjugative אלמנטים אינטגרטיבית של conjugative (גלידות) חשוב התפשטות אופקית של מידע גנטי. זה יכול לקדם את ההתפתחות המהירה חיידקי והתאמה ושידור של התנגדות multidrug גנים1,2. תדירות ההטיה עשויה להיות מושפעת חלבונים המקודדים על רכיבי conjugative גיוס של DNA (מאפיה), זוג ההזדווגות היווצרות (MPF), כולל סקס pili, הממויינות לפי המאפיה של MPF type3,4, 5. זה יכול להיות מושפעת גם את התורם וחתן זוג6 ו לתנאי גדילה תאים7,8,9,10,11,12 ( שיעור הצמיחה, צפיפות תא, משטח מוצק או נוזלי בינוני, טמפרטורה, זמינות חומרי הזנה, הנוכחות של קטיונים). כדי להבין כיצד היסודות conjugative להפיץ בין חיידקים, זה הכרחי להשוות תדר ההטיה בפירוט.
תדירות ההטיה בין התורמים לבין הנמען זוגות לאחר ההזדווגות בדרך כלל מוערך על ידי שיטות קונבנציונליות כדלקמן. (א) ראשית, המספרים של המושבות התורם וחתן ייספרו; (ii) ואז נספרים המושבות הנמען, אשר קיבל את הרכיבים conjugative (= transconjugants); (iii), לבסוף, התדר ההטיה הוא מחושב על ידי חלוקת המושבה הקמת יחידות (CFU) transconjugants על ידי אלה של התורם ו/או נמען13. כאשר משתמשים בשיטה זו, הרקע זאת, עקב אירועים נוספים ההטיה עלול להתרחש גם על לוחות סלקטיבי והשיג transconjugants כאשר צפיפות התאים היא גבוהה10גבוה. לכן קשה לזהות הבדלים קטנים תדירות (להלן הבדל 10-fold). אנחנו לאחרונה הציג שיטה (MPN) מספר הסביר ביותר באמצעות מדיום נוזלי המכיל ריכוז גבוה יותר של אנטיביוטיקה. בשיטה זו צמצמה את הרקע על ידי עיכוב נוסף ההטיה במדיום סלקטיבי; לפיכך, תדירות ההטיה יכול להיות מוערך עם רזולוציה גבוהה יותר.
ההטיה יכול להיות מחולק לשלושה שלבים: (1) החזקה של הנמען התורם זוג (2) חניכה של העברת conjugative, ו- (3) דיסוציאציה של זוג14. במהלך השלבים (1) ו- (3), יש מגע פיזי בין התורם ובין תאים הנמען; לפיכך, צפיפות התאים, תנאים סביבתיים יכולים להשפיע על השלבים הבאים, למרות התכונות של pili המין חשובים גם. שלב (2) סביר להניח מוסדר על ידי הביטוי של מספר גנים המעורבים ב נטיה בתגובה לשינויים חיצוניים, אשר יכולה להיות מושפעת תכונות שונות של פלסמיד, התורם, הנמען. למרות החזקה פיזית או ניתוק של זוגות התורם-נמען יכול להיות מבחינה מתמטית מדומה באמצעות הערכה מהירה של תאים כמו חלקיקים, התדירות של שלב (2) יש השפעול למדוד. היו כמה דוחות על תצפיות ישירות על איך לעיתים קרובות תורמים יכולים ליזום ההטיה [שלב (2)] באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ15,16; עם זאת, שיטות אלה אינן תפוקה גבוהה כי מספר גדול של תאים חייב להיות במעקב. לכן, פיתחנו שיטה חדשה כדי להעריך את ההסתברות להתרחשות של שלב (2) על-ידי שימוש תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS). השיטה שלנו ניתן ליישם כל פלסמיד, ללא זיהוי של גנים חיוניים עבור ההטיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תורם עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)- ואת Kanamycin ההתנגדות מתויג ג'ין פלסמידים
- ההיכרות של סמן גנים pBP136 פלסמיד המטרה
הערה: המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר pBP136::gfp. זני חיידקים של פלסמידים השתמשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1.- לגדל תרביות של Escherichia coli DH10B מחסה pBP13617 ב 5 מ ל מרק לוריא סטרילי (LB) ו- e. coli S17-1λפיר18 מחסה pJBA2819 [המכיל kanamycin (ק מ)-gfp ג'ין, ההתנגדות mut3 * ג'ין עם יזם, שליחות קטלנית מיני-Tn5] ב- 5 מ ל LB סטרילי המכיל 50 μg/mL ק ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (O/N, 16-24 h) ברעידות-200 סיבובים לדקה (סל ד).
- קציר, שטיפה
- קציר 1 מ"ל של כל תרבות, מקום זה לתוך microtube 2 מ"ל, צנטריפוגה (10,000 × g, בטמפרטורת החדר, 2 דקות). לאחר מכן, למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 2 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS).
- צנטריפוגה שוב (10,000 × g, בטמפרטורת החדר, 2 דקות), resuspend ב 500 μL ל- PBS סטרילי.
- לסנן ההזדווגות
- הכינו צלחות סטרילי ליברות (עם אגר 1.6%), מקום סטרילי μm 0.22 נקבובית גודל ממברנה מסנן על זה. ΜL 500 מיקס של e. coli S17-1λפיר pJBA28 מחסה עם e. coli DH10B מחסה pBP136, במקום התערובת מסנן על הצלחת ליברות. דגירה הלוח O/N-30 ° C. להסיר את המסנן מהצלחת ליברות, למקם אותו לתוך צינור פלסטיק סטרילית 50 מ ל, וכן להוסיף 1 מ"ל של PBS סטרילי.
הערה: pJBA28 יכולים לשכפל בנוכחות של חלבון Π, מקודדת על ידי הגן פיר 18, ולא ניתן להעביר מ- S17-1λפיר DH10B. pBP136 נושאת סמן גנטי17 , ניתן להעביר מ- DH10B S17-1λפיר. לכן, לא יכולנו להבחין S17-1λפיר מחסה pBP136 ו pJBA28 DH10B pBP136 מחסה, מיני-Tn5 (משורבב לתוך כרומוזום או pBP136) בשלב זה. . אז, אנחנו משמש תערובות של אותם תורמים בצעדים העוקבים (1.1.4.–1.1.5.).
- הכינו צלחות סטרילי ליברות (עם אגר 1.6%), מקום סטרילי μm 0.22 נקבובית גודל ממברנה מסנן על זה. ΜL 500 מיקס של e. coli S17-1λפיר pJBA28 מחסה עם e. coli DH10B מחסה pBP136, במקום התערובת מסנן על הצלחת ליברות. דגירה הלוח O/N-30 ° C. להסיר את המסנן מהצלחת ליברות, למקם אותו לתוך צינור פלסטיק סטרילית 50 מ ל, וכן להוסיף 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- לגדול תרבות O/N של תערובת ההזדווגות לעיל ב- LB סטרילי המכיל 50 μg/mL ק ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות ב 200 סל ד ו. תרבות של Pseudomonas putida KT2440 [ק מ רגיש (ק מs), ריפאמפיצין רגיש (ריףs), רגיש גנטמיצין (Gms), עמידים טטרציקלין (Tcr)] בינוני המכיל μg/מ"ל Tc ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
- לאחר הקטיף, שטיפת התאים כמו שלב 1.1.2, להשתמש בהם (ההזדווגות תערובת ו KT2440) עבור מסנן ההזדווגות (O/N, 30 מעלות צלזיוס) כמו שלב 1.1.3.
- הכנת לוחות LB סטרילי המכילה 50 μg/mL ק ו μg/מ"ל Tc (LB + ק + Tc לוחות).
- לדלל את התערובת resuspended ממברנה מסנן עם PBS סטרילי (1–10 105-מקפלים), ואז התפשטות כל דילול על גבי LB + ק + Tc צלחות, דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 d.
- בחר מושבות של הלוחות, לגדול תרבות O/N ב- LB סטרילי המכיל ק מ, Tc, כמו גם P. resinovorans CA10dm4RG (רי ףr ו- Gmr)6 LB סטרילי המכיל ריף (25 μg/mL) ו- Gm (30 μg/mL)-30 ° C ו 200 סל ד.
הערה: כפי שתואר בהערה הקודמת, המושבות על ק ג + ק + Tc צלחות (מתוך 1.1.7.) pBP136 מחסה KT2440 נושאים של מיני-Tn5 ו- KT2440 עם מיני-Tn5, כי pJBA28 יכול יועברו ישירות מ- S17-1λפיר מחסה pBP136 ו- pJBA28 כדי KT2440. זו הסיבה הזדווגות נוספת עם CA10RG resinovorans פ נדרש כדי להשיג את היעד pBP136 עם מיני-Tn5 בשלבים הבאים. - לאחר הקטיף, שטיפת התאים כמו שלב 1.1.2, להשתמש בהם עבור מסנן ההזדווגות (O/N, 30 מעלות צלזיוס) כמו שלב 1.1.3.
- הכנת לוחות LB סטרילי המכיל ריף, ג'נרל מוטורס ו ק (LB + ריף + ק + Gm לוחות).
- Resuspend את התערובת מסנן, אז למהול אותו1–10 105-מקפלים, להפיץ את זה על גבי LB + ריף + ק + Gm צלחות, דגירה הצלחות במשך 2-3 d ב- 30 ° C.
- לבחור את המושבות, לבדוק אם הם הנמל pBP136 על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפי עבור פלסמיד.
- ההיכרות של גנים סמן סלקטיבי pCAR1 פלסמיד המטרה
הערה: המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר pCAR1::gfp- גדלים של תרבות O/N putida פ KT2440 מחסה pCAR1 (ק מs, Gms, ריףs, Tcr)20 -200 סל ד ו- 30 ° C ו- e. coli S17-1λפיר18 מחסה pJBA28 ב 5 מ ל LB סטרילי המכיל 50 μg/mL ק מ- 200 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר הקטיף, שטיפת התאים כמו שלב 1.1.2, להשתמש בהם עבור מסנן ההזדווגות (O/N, 30 מעלות צלזיוס) כמו שלב 1.1.3.
- להסיר את המסנן מהצלחת ליברות, למקם אותו לתוך צינור פלסטיק סטרילית 50 מ ל, וכן להוסיף 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- לדלל את התערובת resuspended עם PBS סטרילי (1–10 105-מקפלים), ולהפיץ את התערובת מדולל על LB סלקטיבי סטרילי + Tc + ק צלחות.
הערה: pCAR1 לא לשכפל ב e. coli; לפיכך, KT2440 putida פ pCAR1 מחסה עם מיני-Tn5 יכול להיות מסומנת LB + Tc + ק צלחות. - לבחור מושבה מהצלחת, ולגדול תרבות O/N ב- LB סטרילי המכיל ק ו Tc ותרבות של P. resinovorans CA10dm4RG ב LB סטרילי המכילה ריף ו Gm (200 סל ד, 30 מעלות צלזיוס).
- לאחר הקטיף ושטיפת כמו שלב 1.1.2, השתמש התאים עבור מסנן ההזדווגות (O/N, 30 מעלות צלזיוס) כמו שלב 1.1.3.
- Resuspend את התערובת מסנן למהול אותו, מורחים על גבי LB + ריף + ק + Gm צלחות, ואז דגירה הצלחות במשך 2-3 d ב- 30 ° C.
- לבחור את המושבות, לבדוק אם הם הנמל pCAR1 על ידי ה-PCR עם צבעי יסוד מסוים פלסמיד.
- לאשר את transferability של פלסמידים מתויג ולהכין התורמים על השלבים הבאים
הערה: המטרה של פרוטוקול זה היא לאשר את transferability של פלסמידים נבנה לעיל התורמים להתכונן לשלבים הבאים.- גדלים של תרבות O/N resinovorans פ CA10dm4RG מחסה pBP136::gfp או pCAR1::gfp ב- LB סטרילי המכיל ק ותרבות של putida פ SMDBS [ק מsGms, רי ףr, Tcr, לצי q, באילו PA1/O4/O3-gfpmut3* אינו מתבטא בגלל ג'יןq שלה כרומוזומלית לצי]21 ב- 3 מ ל LB המכיל Tc (200 סל ד, 30 מעלות צלזיוס).
- לאחר הקטיף, שטיפת התאים כמו שלב 1.1.2, להשתמש בהם עבור מסנן ההזדווגות (O/N, 30 מעלות צלזיוס) כמו שלב 1.1.3.
- מקם את המסנן לתוך צינור פלסטיק 50 מל סטרילי, ולאחר resuspend עם 1 מ"ל של PBS סטרילי. לדלל את התערובת resuspended עם PBS סטרילי (1–10 105-מקפלים), מורחים את התערובת מדולל על LB סלקטיבי סטרילי + Tc + ק צלחות.
- לבחור את המושבות, לבדוק אם הם הנמל כל אחד פלסמידים מאת PCR עם תחל ספציפיים.
הערה: אישור של העמדה ההכנסה של מיני-Tn5 על ידי רצף ישיר לאחר החילוץ פלסמיד הוא אופציונלי לאשר ההוספה לא משפיע על הפונקציה העברה של פלסמידים.
2. חישוב תדר ההטיה בשיטת MPN
- להכין סטרילי ליברות + ק מ ו ק ג + Gm צלחות.
- לגדול תרבות O/N של putida פ SMDBS מחסה pBP136::gfp או pCAR1::gfp ב- 3 מ ל LB סטרילי המכיל ק ותרבות של putida פ KT2440RGD (Gmr, רי ףr) ב- 3 מ ל LB המכיל Gm (140 סל ד, 30 מעלות צלזיוס).
- לאחר הקטיף, שטיפת התאים כמו שלב 1.1.2, להשתמש בהם עבור מסנן ההזדווגות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות כמו שלב 1.1.3.
- באופן סדרתי שתדללו התורם לעיל ואת המטופל תרבות (101 –107) ולהפיץ אותה לתוך LB + ק (תורם) או LB + Gm (הנמען) פלטות (כל אחד דולר) כדי לספור את המושבה יוצרי יחידות (CFU). דגירה הלוחות ב 30 ° C עבור 2 d.
- Resuspend את התערובת למסנן של LB סטרילי המכיל ק מ ו- Gm, ו לדלל באופן סדרתי (21 עד24–10 27.2) באמצעות צלחת תרבות 96-ובכן תא (ב ארבע פעמים).
- תקופת דגירה את הצלחת 96-ובכן של הזמן המתאים (2 יח ב 30 מעלות צלזיוס).
- לספור את CFU של התורם, הנמען על הלוחות (שלב 2.4.), לספור את מספר בארות אשר צומחים transconjugants.
- לחשב את MPN סטיית שלה באמצעות התוכנית החישוב MPN שפותחה על ידי ג'רביס ואח. 22, הזמינה בכתובת http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
- הזן את השם של הניסוי (אקס, 'בדיקה'), התאריך של הניסוי (אקס, 2018/4/9), המספר של מבחן סדרות, מקס. לא. של דילולים (הזן '24') בגיליון שורה #7 של 'תוכנית' של Excel הקובץ ('MPN_ver5.xls').
- הזן ' 2-1 (= 0.5) ל 2עשרים וארבע (= 5.96 × 10-8)' בעמודה 'דילול פקטור d', '0.01' בעמודה 'נפח מ"ל או g w', ואת ' 4' ב ' מס של צינורות n' את הטבלאות המיוצר אוטומטית של 'קלט נתונים'.
- הזן את המספר של בארות בו transconjugants לגדול ב כל דילול מדגם (0 – 4).
- לחצו על הכפתור 'לחשב תוצאות' נכון העליון ולאחר מכן להשיג את התוצאות (ב MPN/μL) ליכולתם ביטחון 95% (תחתון ועליון).
- לחשב את התדירות ההטיה של פלסמידים על-ידי חלוקת מספר transconjugants (MPN/mL) לפי המספרים של התורם ותאים הנמען (CFU/mL).
3. הכנה שערוך של ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה
- לגדול תרבות O/N של putida פ SMDBS מחסה pBP136::gfp או pCAR1::gfp ב- 3 מ ל LB סטרילי המכיל ק ותרבות של putida פ KT2440RGD (Gmr, רי ףr) ב- 3 מ ל LB סטרילי המכיל Gm באמצעות 300 מ ל מבחנות (140 סל ד, 30 מעלות צלזיוס) כ precultures.
- להעביר 200 μL של preculture 200 מ ל LB סטרילי טריים המכילים ק או Gm ב 500 מ"ל מבחנות, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-140 סל ד.
- למדוד את עכירות-600 nm (OD600) של התרבות באמצעות UV-VIS ספקטרופוטומטרים ספוט התרבות, מעורבבת עם ליברות (1–10 108-מקפלים דילולים), על גבי צלחת LB המכיל ק מ או Gm. Incubate אלה LB צלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 1-2 יח , ולקבוע את CFU.
- מגרש ערכי600 OD לבין CFU עם הזמן הצמיחה כדי ליצור עקומות גדילה של התורם, הנמען.
- לגדול תרבויות של המתח התורם וחתן יומן באמצע שלב, בהתבסס על עקומת הגדילה.
- לאחר הקטיף, שטיפת התאים, להכין 101–103 CFU של התורם ב 10 μL של LB ו-5–10 107 CFU של הנמען ב 100 μL של ליברות.
- מיקס 10 μL 100 μL של התרבויות נמענים בשעה צפיפויות שונות ב 96-ובכן צלחות (בטריפליכאט) בין התורם. לדוגמה, מיקס 101 CFU התורם ו-105 CFU של הנמען ולהוסיף אותו כל אחד בארות 96 ומיקס 101 CFU התורם ו-106 CFU של הנמען בצלחת 96-ובכן אחרת, וכן הלאה.
- דגירה התערובת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, ולאחר מכן להוסיף ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה (μg/mL 100 ק מ ו- 60 μg/mL Gm) כל טוב כדי לעכב עוד ההטיה.
- דגירה את הצלחת ב 30 ° C עבור 2 d.
- לספור את מספר בארות אשר גדלים transconjugants.
- בחר את צפיפות הנמען המתאים עבור הערכה של ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה בהתבסס על הנתונים לעיל (transconjugants צריך למצוא לפחות 1 טוב של צלחת 96-ובכן).
הערה: Transconjugants יגדל בבארות כל כאשר הצפיפויות של תאי התורם וחתן גבוהים ומתרחשת ההטיה אחד או יותר רע. לעומת זאת, transconjugants לא יימצא בבארות כלשהו כאשר צפיפות התאים נמוך מדי. בסעיף הבא, תורם יחיד תא ממוין לבאר. לכן, צפיפות הנמען צריך להיות מקסימום.
4. הערכה של ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה
- להכין 200 מ של תרבות יומן באמצע שלב של התורם putida פ SMDBS מחסה pBP136::gfp או pCAR1::gfp וזו של המטופל putida פ KT2440RGD, כמתואר ב- 3.6-3.7.
- מקום 106 CFU של הנמען ב 100 μL של ליברות כל היטב של צלחת 96-ובכן.
- להגדיר את המערכת FACS (לזרום cytometry ותא סדרן עם זרוע רובוטית, 488 ננומטר לייזר ארגון של דיזה זרבובית 70 μm). הגדר קדימה פיזור (FSC), עם סף 1% כמו ההדק רכישה. לכוון את H ורווח רווח של FSC ופיזור צד (האס) במרב הרגישות, אשר באפשרותך לא לכלול אותות חיובי כוזב, באמצעות PBS כפקד שלילי. הגדר את השער מיון המבוסס על FSC ואת האס טיפה 0.5 מצב מיון עבור מיון מקסימלי טוהר.
- מיון תא תורם יחיד על-ידי FACS בצלחת ליברות (384 כתמים שונים), דגירה את הצלחת ב 30 ° C 2 d, ואז לספור כמה מושבות מופיעים על הצלחת את התאים הממוין.
הערה: ההליך זה לצורך אימות של השער קבע. אם קיימות מושבות 384 בצלחת, פירוש הדבר כי 100% של תאים ממוינים יכול ליצור מושבות. תוקפו הממוצע של המיון הוא תמיד 90 עד 95 אחוז. - מיון תא תורם יחיד על-ידי FACS לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן עם המטופל (4.2).
- דגירה את הצלחת למשך 45 דקות ב 30 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה (μg/mL 100 ק מ ו- 60 μg/mL Gm) כל טוב כדי למנוע ההטיה.
- דגירה את הצלחת ב 30 ° C עבור 2 d.
- לספור את מספר בארות שבו transconjugants גדל ככל שנקבע על-ידי בדיקה ויזואלית בעין בלתי מזוינת.
- לחשב את ההסתברות ההטיה התורם המופעלים על-ידי חלוקת מספר בארות עם transconjugants על ידי המספר הכולל של בארות שבהם מוינה התורם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השוואה של תדירות ההטיה בשיטת MPN
בדוח הקודם שלנו, השווינו את התדרים ההטיה של pBP136::ה-gfp , pCAR1::gfp החולוני מדולל ליברות (1/3 ליברות) נוזלי בינוני עם תעריפים שונים מלהיב לאחר 45 min ההזדווגות באמצעות 125 מ ל טווה מבחנות10. השווינו את התדרים ההטיה של pBP136::ה-gfp , pCAR1::gfp עם 106 CFU/mL של זנים התורם וחתן בתנאים שונים מלהיב (0-600 סל ד). תדירות ההטיה בשני פלסמידים גדל בקצב גבוה יותר מלהיב, ההפרש המרבי בשכיחות ההטיה היה < 10-fold עבור pBP136::gfp (בין 0 ל- 400 סל ד), בזמן של pCAR1::gfp היה ~ 25-fold (בין 0 ו 200 סל"ד; איור 1).
הערכה של ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה
ההסתברות בעבר המשוערת של התורם ביוזמת ההטיה מוצג בטבלה מס ' 2. כדי לקבוע את הצפיפות של תאים הנמען הנדרש כדי להשוות את ההסתברות של נטיה, הזדווגות מבחני בוצעו בצפיפויות שונות של התורם, הנמען. כפי שמוצג בטבלה 2, pBP136::gfp transconjugants אותרו ב- 100% (96/96) של בארות המכיל 103 CFU של התורם ו-5-10 107 CFU של נמען, ואלה עם 102 CFU התורם ו-106-107 CFU של נמען, המציין כי הצפיפות תא היה גבוה מדי. ההזדווגות מבחני עם 101 CFU התורם ו-106 או 105 CFU של נמען, גרמו לירידה במספר בארות transconjugant-חיוביות (66% ו- 2.1%, בהתאמה, בטבלה 2). לפיכך, > 105 CFU של נמען נובא עליו להידרש להזדווגות עם תא תורם יחיד. באופן דומה, ביצענו את מבחני ההזדווגות עם pCAR1::gfp -צפיפויות שונות של זנים התורם ואת המטופל. האחוזים של בארות transconjugant-חיוביות היו הרבה יותר נמוכים מאלה של pBP136::gfp (טבלה 2). בהנחה כי תאי התורם, חתן ניתן לצרף זו לזו באופן דומה, ההסתברות של חניכה ההטיה על התורם pCAR1 היה נמוך יותר עבור התורם pBP136. בהתבסס על תוצאות אלו, קבענו את זה 107 CFU של נמען היה נדרש עבור תא תורם יחיד ממוין לפי FACS.
לאחר מכן, נספרו המספרים של בארות transconjugant-חיוביות. האחוז של בארות transconjugant-חיוביות pBP136::gfp היה גדול יותר (1.9%) מזה pCAR1::gfp (< 0.052%; טבלה 2). לפיכך, היה יותר מאשר הבדל 36-fold ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה בין אלה פלסמידים 2.
איור 1. השוואה של התדרים ההטיה של pBP136::ה-gfp , pCAR1::gfp עם 106 המושבה ויוצרים יחידות (CFU) מ ל-1 של התורם (Pseudomonas putida SMDBS), נמען (putida פ KT2440RGD) ברמות שונות זע המחירים (0-600 סל ד). קווי השגיאה היו מחושבים בהתבסס על מגבלות ביטחון של 95% על ידי שיטת MPN סטיית התקן של CFU של התורם, הנמען. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| זני חיידקים | פנוטיפ גנוטיפ ולא רלוונט | הפניה או מקור |
| Escherichia coli DH10B | F–, mcrA, Δ (האשכים להתפתח-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (ara leu) 7697, הקולות, galK , Λ–, rpsL, endA1, nupG | תרמו |
| E. coli S17-1(λpir) | Tmr, Smr, רקה, thi, pro, hsdR–M+, RP4: 2-Tc: מו:7 ק מ Tn λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | ק מs, ריףs, Gms, Tcr | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | KT2440 pCAR1 מחסה | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | ק מs, רי ףr, Gmr, Tcr, miniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress-a הוא inseted של כרומוזום | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | נגזרות מזן putida פ KT2440, dapB-נמחק, ק מsGms, רי ףr, Tcr, כרומוזום נוסף לציq | 21 |
| CA10RG resinovorans פ | ק מs, רי ףr, Gmr, Tcs | 6 |
| פלסמידים | ||
| pBP136 | IncP-1, המאפיהP, אמ.טי פלסמיד | 17 |
| pBP136::gfp | pBP136 נושאת קr ו- PA1/04/03-gfp קלטת ב פארא (26,137 nt) | 21 |
| pCAR1 | אמ IncP-7, המאפיהHF, פלסמיד degradative carbazole | 26, 27 |
| pCAR1::gfp | pCAR1 נושאת קr ו- PA1/04/03-gfp קלטת ב- ORF171 (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | Apr, קr, פלסמיד משלוח עבור מיני-Tn5ק מ- PA1/04/03- RBSII-gfpmut3*-T0-T1 | 18 |
טבלה 1. זני חיידקים, פלסמידים.
| פלסמיד | . התורם | . נמען | המספרים של בארות עם transconjugants לכל בארות 96 | אחוז |
| [' CFUs ' או ' תא '] | [CFUs] | [%] | ||
| pBP136::gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
בטבלה 2. המספר של וולס, עם צפיפות התאים, המכיל transconjugants כדי להשוות את ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה בין pBP136::ה-gfp , pCAR1::gfp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ברזולוציה גבוהה לגילוי הבדלים ההטיה תדירות בתנאים שונים, באמצעות שיטה MPN כדי להעריך את מספר transconjugants. צעד חשוב בפרוטוקול זה דילול התערובת של התורם ואת המטופל לאחר ההזדווגות עד אין transconjugants לגדול. צעד נוסף הוא הוספת ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה המדיום הנוזלי סלקטיבית כדי למנוע ההטיה. הליכים אלה יכול להפחית את הרקע הנגרמת על ידי ההטיה נוספת במדיום סלקטיבי. בהצלחה לנו היתה לזהות הבדלים, גם לאחר ההזדווגות משך זמן קצר בין התורמים לבין הנמען. תדירות conjugative מחושב על ידי פרוטוקול זה יכול להשתנות על ידי הבדלים קטנים בתנאי צמיחה של זנים התורם ואת המטופל. לפיכך, תנאים אלה צריך להיות מתוכננים בקפידה.
בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול עבור הערכת השלב השני של ההטיה באמצעות FACS למיון תא תורם יחיד. הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא קביעת הצפיפות המתאים של תאים הנמען עבור תא תורם יחיד הממוין. כאשר מספר הנמענים התאים המקיפים תא תורם יחיד הוא גדול מספיק, מגע גופני בין התורמים לבין הנמען הוא מסוימים. לאחר מכן, תדירות ההטיה יכול להיות מושפע, ההסתברות של תדירות תאי התורם ואת המטופל קשר אחד לשני, אלא על ידי ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה. מיון תא תורם יחיד על-ידי FACS אינה קשה; עם זאת, בארות 96 אינן תמיד מספיקים להעריך את ההסתברות. לכן, צריך להיות מוכן 10-100 צלחות. אחת המגבלות של הפרוטוקול הוא שזה לא מתאים למדידת ההסתברות של התורם ביוזמת ההטיה של פלסמיד עם תדירות נמוכה transmissibility.
מבוסס על שיטות אלה ותוצאותיהם, דיווחנו לאחרונה כי פלסמידים 2 הראו תדרים שונים ההטיה בתקשורת נוזלי על-ידי שינוי שיעור מלהיב, אשר יכול להשפיע על המדרגות הראשונה והשלישית של ההטיה, מצורף ולהתנתקות של זוגות התורם-נמען. בנוסף, מצאנו גם הבדלים ההסתברות של השלב השני10. תוצאות אלו מדגימים כיצד משתנה תדירות ההטיה בתנאים שונים. פרוטוקולים אלה שימושיים לצורך השוואת התכונות ההטיה של פלסמידים בתנאים שונים, לרבות התנאים אירובי או אנאירובי, זוגות התורם-נמען שונים, טמפרטורה שונות או pH, ואת נוכחות או העדר ספציפיות חומרים, כגון קטיונים, חומרים מזינים, אנטיביוטיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר ק' Kamachi של לאומי המכון של המחלות הזיהומיות (יפן) על מתן pBP136 פרופ ' ד ר Nojiri ה באוניברסיטת טוקיו (יפן) מתן pCAR1. אנחנו גם מודה ד ר פרופסור Molin Sølen של האוניברסיטה הטכנית של דנמרק על מתן pJBA28. עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI (גרנט מספרי 15H 05618, 15KK0278) ל MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
