Summary
우리가 활용 빈도, 얼마나 효율적으로 예측 하려면 높은 해상도에 차이 탐지 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 다양 한 세균성 conjugative DNA 요소 다른 조건 하에서 동작을 이해 하는 목표로, 기증자 박테리아 활용을 시작합니다.
Abstract
세균성 활용 conjugative DNA 요소를 통해 항생제 저항 유전자의 수평 이동에 중요 한 단계는 이다. 다른 조건 하에서 활용 주파수의 심층 비교 자연에서 conjugative 요소를 확산 하는 방법 이해 해야 합니다. 그러나, 활용 빈도 비교 하기 위한 기존의 방법 않습니다 심층 비교에 대 한 적절 한 선택에 추가 활용 이벤트의 발생으로 인 한 높은 배경 때문에. 우리는 성공적으로 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 메서드와 선택적 액체 매체에서 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 도입 하 여 백그라운드를 감소. 또한, 우리 개발 종종 방법의 확률을 추정을 위한 프로토콜 기증자 세포 시작 활용 형광 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬 하 여 받는 사람 풀으로 하나의 기증자 셀을 정렬 하 여. 두 개의 플라스 미드를 사용 하 여, 다른 교 반 속도로 액체 매체에서 pBP136 및 pCAR1, 슈 도모 나 스 putida 셀 활용 주파수에서 차이 검출 될 수 있습니다. 활용 개시의 주파수는 pCAR1에 대 한 보다 pBP136에 대 한 더 높았다. 이러한 결과 사용 하 여, 우리가 더 나은 이러한 두 plasmids의 활용 기능을 이해할 수 있다.
Introduction
세균성 활용 모바일 유전 요소, conjugative 플라스 미드, 그리고 통합 및 conjugative 요소 (얼린 다)의 유전 정보의 수평 확산에 대 한 중요 하다. 그것은 급속 한 세균성 발전 및 적응을 홍보 하 고 multidrug 저항 유전자1,2를 전송할 수 있습니다. 활용 빈도 단백질 DNA (폭도)와 짝짓기 쌍 형성 (MPF)의 동원에 대 한 conjugative 요소에 인코딩된 섹스 pili, 폭도 및 MPF 유형3,4에 따르면 분류 된다를 포함 하 여 영향을 받을 수합니다 있습니다. 5. 그것은 또한 기증자와 받는 사람 쌍6 와 셀7,8,9,10,,1112 (의 성장 조건에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 성장 율, 세포 밀도, 고체 표면 또는 액체 매체, 온도, 양분 가용성 및 양이온의 존재). Conjugative 요소 박테리아 사이에서 확산 하는 방법을 알아야 자세히 활용 주파수를 비교할 필요가 있다.
기증자와 짝짓기 후 받는 사람 쌍 사이 활용 주파수는 다음과 같이 기존의 방법으로 추정 일반적으로. (i) 먼저, 기증자와 받는 사람 식민지의 숫자 계산 됩니다; (ii) 다음, conjugative 요소 (= transconjugants)를 받은 받는 사람 식민지 세 어진다; (iii) 그리고 마지막으로, 활용 주파수 기증자 또는 받는 사람13그는 transconjugants의 단위 (CFU)를 형성 하는 식민지를 나누어 계산 됩니다. 그러나,이 메서드를 사용 하면 배경은 높은 셀 밀도 높은10때 transconjugants를 사용 하는 선택적 접시에도 발생할 수 있습니다 추가 활용 이벤트 때문 이다. 따라서, 주파수 (아래 사진 차이)에 작은 차이 감지 하기가 어렵습니다. 우리는 최근에 항생제의 높은 농도 포함 하는 액체 매체를 사용 하 여 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 방법을 소개 했다. 이 방법은 더 선택적 매체;에 활용을 억제 함으로써 배경 감소 따라서, 활용 빈도 높은 해상도와 추정 될 수 있습니다.
활용 3 단계로 분할 될 수 있다: (1) 기증 받는 첨부 파일 쌍의 conjugative 전송 개시 (2) 및 (3) 쌍14의 분리. 단계 (1) 및 (3), 하는 동안은 물리적 상호작용 기증자와 받는 사람 세포; 따라서, 셀 밀도 및 환경 조건 좌우할 수 있다이 단계, 비록 성 pili의 기능 또한 중요 하다. (2) 단계는 가능성이 플라스 미드, 기증자와 받는 사람의 다양 한 기능에 의해 영향을 받을 수 있는 외부 변화에 대응 활용에 관련 된 여러 유전자의 표현에 의해 규제 됩니다. 실제 첨부 파일 또는 기증자 받는 쌍의 분리 수학적으로 시뮬레이션할 수 입자로 셀의 추정을 사용 하 여, 비록 단계 (2)의 주파수는 실험적으로 측정 되어야 한다. 몇 가지 보고 방법의 직접 관찰에 종종 기증자 활용 [단계 (2)] 형광 현미경 검사 법15,16;를 사용 하 여 시작할 수 있습니다 되었습니다 그러나, 이러한 방법은 셀의 많은 수를 모니터링 해야 하기 때문에 높은 처리 되지 않습니다. 따라서, 우리는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 단계 (2)의 발생 가능성을 예측 하는 새로운 방법을 개발. 우리의 방법 활용에 대 한 필수적인 유전자의 id 없이 어떤 플라스 미드에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 녹색 형광 단백질 (GFP)와 기증자의 준비-고 대 저항 유전자 태그 플라스 미드
- 대상 플라스 미드 pBP136에 마커 유전자의 소개
참고: 이 프로토콜의 목표는 pBP136를 생성 하는::gfp. 세균성 긴장 및이 연구에 사용 된 플라스 미드는 표 1에 나열 됩니다.- 은닉 pBP13617 살 균 Luria 국물 (파운드)과 대장균 S17-1λpir18 pJBA2819 은닉의 5 mL에 대장균 DH10B의 문화를 성장 [대 (Km)를 포함-저항 유전자와 gfp mut3 * 유전자 발기인과 미니-테네시5터미네이터] 50 μ g/mL 킬로미터 하룻밤 37 ° C에서 (O/N, 16-24 h) 200 분당 회전 (rpm)에 동요를 포함 하는 살 균 파운드의 5 ml에서.
- 수확 및 세척
- 각 문화권의 1 mL를 수확, 2 mL microtube 및 원심 분리기 (10000 × g, 실내 온도, 2 분) 그것을 넣습니다. 그리고 삭제는 상쾌한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)의 2 개 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
- 원심 분리기 다시 (10000 × g, 실내 온도, 2 분), 그리고 살 균 PBS의 500 μ에 resuspend.
- 짝짓기를 필터링합니다
- (1.6 %agar)와 살 균 파운드 플레이트를 준비 하 고 그것에 살 균 0.22 μ m 기 공 크기 멤브레인 필터를 배치. 믹스 500 pBP136와 자리 파운드 접시에 필터에 혼합물을 은닉과 DH10B 대장균 과 대장균 S17-1λpir 은닉 pJBA28의 μ. 플레이트 O/N 30 ° c.에 품 어 파운드 플레이트에서 필터를 제거 하 고 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 배치 살 균 PBS의 1 mL을 추가.
참고: pJBA28 수 Π 단백질, pir 유전자18, 의해 존재 및 DH10B S17-1λpir 에서 옮겨질 수 있다. pBP136 아무 표식 유전자17 고 S17-1λpirDH10B에서 옮겨질 수 있다. 따라서, S17-1λpir 이 단계에서 pBP136 및 DH10B 은닉 pBP136 (염색체 또는 pBP136에 transposed) 미니-테네시5 에서 pJBA28를 은닉 구분 하지 않을 수 있습니다. 다음, 우리는 후속 단계 (1.1.4.–1.1.5)에 기증자로 그들의 혼합물을 사용.
- (1.6 %agar)와 살 균 파운드 플레이트를 준비 하 고 그것에 살 균 0.22 μ m 기 공 크기 멤브레인 필터를 배치. 믹스 500 pBP136와 자리 파운드 접시에 필터에 혼합물을 은닉과 DH10B 대장균 과 대장균 S17-1λpir 은닉 pJBA28의 μ. 플레이트 O/N 30 ° c.에 품 어 파운드 플레이트에서 필터를 제거 하 고 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 배치 살 균 PBS의 1 mL을 추가.
- 200 rpm와 슈 도모 나 스 putida KT2440의 문화에서 떨고 37 ° C에서 50 μ g/mL 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드에 위의 짝짓기 혼합물의 O/N 문화 성장 [Km-민감한 (Kms), 리 팜 피신-민감한 Rif (s), gentamicin 민감한 Gm (s), 및 항생물질 내성 (Tcr)] 200 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 12.5 μ g/mL Tc를 포함 하는 매체에서.
- 수확 후 단계 1.1.2로 세포 세척 (O/N, 30 ° C) 단계 1.1.3에서 짝짓기 하는 필터에 대 한 그들 (짝짓기 혼합물 및 KT2440)을 사용 합니다.
- 50 μ g/mL 킬로미터 및 12.5 μ g/mL Tc 포함 하는 살 균 파운드 플레이트를 준비 (LB + 킬로미터 + Tc 판).
- 살 균 PBS 가진 멤브레인 필터에 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 그리고 다음 확산 파운드 + 킬로미터 + Tc에 각 희석 플레이트와 플레이트 2-3 d 30 ° C에서 품 어.
- 격판덮개에서 식민지를 선택, 포함 된 킬로미터 및 Tc P살 균 파운드에 O/N 문화. resinovorans CA10dm4RG (Rifr 및 Gmr)6 Rif 포함 하는 살 균 파운드 (25 μ g/mL)와 Gm (30 μ g/mL) 30 ° C와 200 rpm에서.
참고: 후판 (1.1.7.) 이전 메모, 파운드 + 킬로미터 + Tc에 식민지에 설명 된 대로 들고 있을 수 있습니다 KT2440 은닉 pBP136 미니-테네시5 와 KT2440 미니-테네시5, pJBA28 S17-1λpir 에서 직접 전송 될 수 있기 때문에 은닉 pBP136와 KT2440에 pJBA28입니다. 이 때문에 미니-테네시5 다음 단계에서 대상 pBP136를 얻을 하는 데 필요한 P. resinovorans CA10RG와 다른 짝짓기. - 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.
- Rif, Gm, 및 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드 플레이트를 준비 (Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드 격판덮개).
- 필터에 혼합물을 resuspend 하 고 다음 101– 105희석-접어, Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드에 확산 판, 그리고 30 ° c.에 2-3 d에 대 한 번호판을 품 어
- 식민지를 선택 하 고 만약 그들이 플라스 미드에 대 한 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 pBP136 항구를 확인.
- 대상 플라스 미드 pCAR1에 선택적 마커 유전자의 소개
참고:이 프로토콜의 목표 pCAR1를 생성 하는::gfp- P. putida KT2440의 pCAR1를 은닉 한 O/N 문화 성장 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 200 rpm와 30 ° C 및 대장균 S17-1λpir18 살 균 파운드의 5 ml에서 pJBA28 은닉 200 rpm와 37 ° C에서 50 μ g/mL 킬로미터를 포함 하
- 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.
- 파운드 플레이트에서 필터를 제거 하 고 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 배치 살 균 PBS의 1 mL을 추가.
- 살 균 PBS 가진 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 무 균 선택적 파운드 + Tc + 킬로미터에 희석된 혼합 확산 판.
참고: pCAR1 대장균;에 복제 하지 않습니다 따라서, P. putida KT2440 미니-테네시5 은닉 pCAR1 파운드 + Tc + Km에서 선택할 수 있습니다 접시. - 접시에서 식민지를 선택 하 고 킬로미터 및 Tc와 P의 문화를 포함 하는 살 균 파운드에 O/N 문화를 성장. resinovorans CA10dm4RG 리프와 Gm (200 rpm, 30 ° C)를 포함 하는 살 균 파운드에.
- 수확 후 단계 1.1.2에서 세척, 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기에 대 한 셀을 사용 하 여 단계 1.1.3에서.
- 필터에 혼합물을 resuspend 그것을 희석, 접시, Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드에 확산 하 고 2-3 d 30 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
- 식민지를 선택 하 고 만약 그들이 플라스 미드에 대 한 특정 한 뇌관으로 PCR에 의해 pCAR1 항구를 확인.
- 태그-플라스 미드의 양도 확인 하 고 단계에 대 한 기증자를 준비
참고:이 프로토콜의 목표는 위의 생성 된 플라스 미드의 양도 확인 하 고 다음 단계에 대 한 기증자를 준비 하는.- 은닉 pBP136 P. resinovorans CA10dm4RG의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI의 문화와 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드에gfp q는 Pa 1에서/O4/O3-gfpmut3*의 염색체 lacIq 유전자 때문에 표현 하지]21 파운드 포함 하는 Tc (200 rpm, 30 ° C)의 3 ml.
- 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.
- 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 필터를 배치 하 고 메 마른 PBS의 1 mL와 함께 resuspend. 살 균 PBS 가진 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 무 균 선택적 파운드 + Tc + 킬로미터에 희석된 혼합 확산 판.
- 식민지를 선택 하 고 그들은 각각 특정 한 뇌관으로 PCR에 의해 플라스 미드의 경우 항구 확인.
참고: 플라스 미드 추출 후 직접 연속 미니-테네시5 의 삽입 위치 확인, 삽입은 플라스 미드의 전달 함수에는 영향을 미치지 않습니다 확인을 선택 사항입니다.
2. MPN 방법으로 활용 주파수의 계산
- 살 균 파운드 + 킬로미터와 파운드 + Gm 준비 접시.
- P. putida SMDBS pBP136 은닉의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: 문화와 P. putida KT2440RGD 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드의 3 mL에gfp (Gmr, Rifr) Gm (140 rpm, 30 ° C)를 포함 하는 파운드의 3 ml에서.
- 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 단계 1.1.3에서 45 분 30 ° C에서 짝짓기 하는 필터에 대 한 그들을 사용 합니다.
- 순차적으로 희석 Gm (받는 사람) 형성 단위 (CFU) 식민지를 (3 중에서 각각) 플레이트 + 위의 기증자 및 받는 사람 (101 – 107) 문화와 파운드 + 킬로미터 (기증자) 또는 파운드에 그것을 확산. 2 d 30 ° C에서 번호판을 품 어.
- 살 균 파운드와 Gm를 포함 하는 필터에 혼합물을 resuspend 하 고 순차적으로 희석 (2에서1 224– 107.2) 96-잘 셀 문화 접시 (quadruplicate)을 사용 하 여.
- 적절 한 시간 (30 ° C에서 2 d)에 대 한 96 잘 접시를 품 어.
- 기증자 및 받는 사람 (2.4 단계.) 접시에의 CFU를 계산 하 고는 transconjugants 성장 하는 우물의 수를 계산.
- 자비스 외개발한 MPN 계산 프로그램을 사용 하 여는 MPN 및 그것의 편차를 계산 합니다. 22, http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls에서 사용할 수 있습니다.
- (예, 2018/4/9) 실험, 테스트 시리즈, 수 및 최대의 날짜 (예, '테스트'), 실험의 이름을 입력 합니다. 아니요. Excel의 행 #7 '프로그램'의 시트에서 ('24' 입력) 희석의 파일 (이 하 ' MPN_ver5.xls').
- 입력 ' 2-1 (0.5 =) (= 5.96 × 10-8) 2-24 ' '희석 요인 d'열에 '' 'ml 또는 g w볼륨' 열과 ' 4 0.01'에서 ' 호 튜브 n의 ' 데이터' 입력된'의 자동으로 생성된 테이블에.
- 각 샘플 희석 (0-4)에 transconjugants 성장 하는 우물의 수를 입력 합니다.
- 오른쪽 상단 ' 계산 결과 ' 버튼을 눌러 하 고 (MPN/μ)에서 결과 및 그들의 95% 신뢰 한계 (하단과 상단).
- 기증자와 받는 사람 세포 (CFU/mL)의 숫자에 의해 transconjugants (MPN/mL)의 수를 나누어는 플라스 미드의 활용 빈도 계산 합니다.
3. 기증자 시작 활용의 확률의 추정에 대 한 준비
- P. putida SMDBS pBP136 은닉의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: 문화와 P. putida KT2440RGD 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드의 3 mL에gfp (Gmr, Rifr) Gm 300 mL를 사용 하 여 포함 된 살 균 파운드의 3 ml 플라스 크 (140 rpm, 30 ° C) precultures로.
- Km 또는 Gm 500 mL 플라스 크에 들어 있는 신선한 살 균 파운드의 200 mL에는 preculture의 200 μ를 전송 하 고 140 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 품 어.
- 600에서 탁도 측정 nm (OD600) 자리를 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 문화권의 문화, 파운드에 희석 (101– 108-배 희석), 킬로미터를 포함 하는 파운드 플레이트 또는 1-2 d 30 ° C에 Gm. 품이이 파운드 플레이트에 CFU 결정.
- OD600 가치와 기증자와 받는 사람의 성장 곡선을 생성 하 성장 시간 CFU 플롯.
- 성장 곡선에 따라 중앙 로그 단계로 기증자와 받는 사람 긴장의 문화를 성장.
- 수확 후 세척 셀 101– 103 파운드 및 105– 107 파운드의 100 μ에 받는 사람의 CFU의 10 μ에 기증자의 CFU를 준비 합니다.
- 기증자와 받는 사람 문화 (3 중)에서 96 잘 접시에 다양 한 밀도에 100 μ의 믹스 10 μ. 예를 들어 혼합 101 CFU는 기증자 및 10의5 받는 사람의 CFU 96 웰 스와 믹스 101 기증자의 CFU의 각 10를 추가 하 고6 CFU의 또 다른 96 잘 접시에 받는 사람 등등.
- 45 분, 30 ° C에 혼합물을 품 어 고을 추가 활용을 억제 하기 위해 각 영역 (100 μ g/mL 킬로미터 및 60 μ g/mL Gm) 항생제의 높은 농도 추가 합니다.
- 2 d 30 ° C에서 접시를 품 어.
- Transconjugants 성장 하는 우물의 수를 계산 합니다.
- 위의 데이터를 (transconjugants 96 잘 접시의 적어도 1에 발견 한다)에 따라 기증자 시작 활용의 확률의 추정에 대 한 적절 한 받는 사람 밀도 선택 합니다.
참고: 기증자와 받는 사람 세포의 밀도 높은 때 잘에서 발생 하는 하나 이상의 활용 Transconjugants 모든 우물에 성장할 것입니다. 반면, 아무 transconjugants 셀 밀도 너무 낮을 때 어떤 우물에서 찾을 수 것입니다. 다음 섹션에서 단일 기증자 세포는 잘으로 정렬 됩니다. 따라서 받는 사람 밀도 최대에 이어야 한다.
4. 기증자 시작 활용의 확률의 추정
- 기증자의 중간 로그 단계 문화의 200 mL P. putida SMDBS pBP136을 품고 준비::gfp 또는 pCAR1::gfp 와 P. putida KT2440RGD, 3.6-3.7에서 설명한 대로 받는 사람.
- 장소 106 CFU 96 잘 접시의 각 음에 파운드의 100 μ에 수신자의.
- FACS 시스템 (교류 cytometry 및 셀 정렬 로봇 팔, 488 nm 아르곤 레이저와 70 μ m 노즐 오리 피스)을 설정 합니다. 앞으로 분산형 (FSC), 수집 트리거로 1% 임계값을 설정 합니다. H 이득 및 FSC의 이득 조정 및 부정적인 컨트롤로 PBS를 사용 하 여 거짓 긍정적인 신호를 제외할 수 있는 최대 감도에 측면 살포 (SSC). FSC 그리고 SSC 및 0.5 드롭 최대한 정렬 순도 대 한 정렬 모드에 따라 정렬 게이트를 설정 합니다.
- 정렬 파운드 플레이트 (384 다른 관광 명소), FACS에 의해 셀 단일 기증자 2 d, 그리고 얼마나 많은 식민지 정렬된 셀에서 접시에 나타나는 수 30 ° C에서 접시를 품 어.
참고: 이 절차는 설정의 유효성 검사에 대 한. 접시에 384 식민지는, 100% 정렬 된 식민지를 형성 수 의미 합니다. 정렬의 평균 유효 항상 90-95% 이다. - 받는 사람 (4.2)와 96 잘 접시의 각 음에 FACS에 의해 단일 기증자 셀을 정렬 합니다.
- 30 ° C에서 45 분 동안 접시를 품 어 고을 추가 활용을 방지 하기 위해 각 영역 (100 μ g/mL 킬로미터 및 60 μ g/mL Gm) 항생제의 높은 농도 추가 합니다.
- 2 d 30 ° C에서 접시를 품 어.
- Transconjugants로 증가 했다 우물의 수를 계산 하는 육안으로 검사 하 여 결정.
- 기증자 정렬 했다 웰 스의 총 수로 transconjugants와 우물의 수를 나누어 기증자 시작 활용의 확률을 계산 합니다.
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Representative Results
MPN 방법으로 활용 주파수의 비교
우리의 이전 보고서에서 우리는 pBP136의 활용 빈도 비교::gfp 와 pCAR1:: 125 mL 스피너 플라스 크10를 사용 하 여 45 분 짝짓기 후 다른 교 반 속도 3 배 희석된 파운드 (1/3 파운드) 액체 매체에서gfp . 우리 pBP136의 활용 주파수 비교::gfp 와 pCAR1:: 10gfp 6 다른 교 반 조건 하에서 기증자와 받는 사람 긴장의 CFU/mL (0-600 rpm). 두 plasmids의 활용 빈도 높은 교 반 속도로 증가 하 고 활용 주파수에 최대 차이점은 < 사진 pBP136에 대 한:: pCAR1의 동안 (0와 400 rpm) 사이gfp ::gfp 는 ~ 25-fold (0 사이 그리고 200 rpm; 그림 1)입니다.
기증자 시작 활용의 확률의 추정
기증자 시작 활용의 이전 예상된 확률 표 2에 표시 됩니다. 활용, 분석 실험을 짝짓기의 확률을 비교 하는 데 필요한 받는 사람 세포의 밀도 결정 하기 위해 기증자와 받는 사람의 서로 다른 밀도와 수행 했다. 표 2, pBP136::gfp transconjugants 10를 포함 하는 우물의 100% (96/96)에서 발견 된3 CFU 기증자 및 105-107 CFU의 받는 사람, 그리고 그 102 기증자 및 10의 CFU6-10-7 CFU의 받는 사람을 나타내는 셀 밀도 너무 높았다. 10 분석 짝짓기1 기증자 및 10 CFU6 또는 10 transconjugant 양수 우물의 감소 된 귀착되 었 다5 받는 사람의 CFU (66%와 2.1%, 각각, 표 2). 따라서, > 105 CFU 받는 사람의 단일 기증자 세포와 짝짓기에 필요한 예상 했다. 마찬가지로, 우리는 pCAR1와 짝짓기 분석 수행:: 기증자와 받는 사람 긴장의 서로 다른 밀도에gfp . Transconjugant 양수 우물의 비율 했다 pBP136의 그 보다 훨씬 낮은::gfp (표 2). 가정 하 고 기증자 및 받는 사람 셀에 연결할 수 있는 서로 유사 하 게, pCAR1 기증자에 대 한 활용 개시의 확률 pBP136 기증자에 대 한 보다 낮은 했다. 우리는 결정이 결과 바탕으로, 107 수신자의 CFU FACS에 의해 정렬 단일 기증자 셀 필요 했다.
다음, transconjugant 양성 우물의 숫자 계산 했다. PBP136에 대 한 transconjugant 양수 우물의 비율::gfp pCAR1 보다 더 큰 (1.9%) 했다::gfp (< 0.052%; 표 2)입니다. 따라서, 거기는이 두 개의 플라스 미드 사이 기증자 시작 활용의 가능성에 36-fold 차이 보다 더 많은.
그림 1입니다. PBP136의 활용 주파수의 비교::gfp 와 pCAR1:: 106 콜로 니 형성 단위 (CFU) mL-1 기증자 (슈 도모 나 스 putida SMDBS)의 다른 받는 사람 (P. putida KT2440RGD)gfp 교 반 속도 (0-600 rpm). 오차 막대는 MPN 방법 및 기증자와 받는 사람의 CFU의 표준 편차에 의해 95% 신뢰 한계에 따라 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 세균성 긴장 | 유전자 형 및 관련 표현 형 | 참조 또는 소스 |
| 대장균 DH10B | F-, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (아 라 레 우) 7697, galU, galK , Λ-, rpsL, endA1, nupG | 온도 |
| 대장균 S17-1(λpir) | Tmr, Smr, recA, 티, 프로, hsdR-M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km 테네시7 λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | K ms, Rifs, Gms, Tcr | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | 은닉 pCAR1 KT2440 | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | K ms, Rifr, Gmr, Tcr, miniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress는 염색체에서 inseted은 | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | P. putida KT2440, dapB의 파생 스트레인-삭제, Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacIq 염색체에 삽입 | 21 |
| P. resinovorans CA10RG | K ms, Rifr, Gmr, Tcs | 6 |
| 플라스 미드 | ||
| pBP136 | IncP-1, 폭도P, MPFT 플라스 미드 | 17 |
| pBP136::gfp | pBP136 Kmr Pa 1/04/03- 파라 에gfp 카세트를 들고 (26137 nt) | 21 |
| pCAR1 | IncP-7, 폭도H, MPFF, carbazole degradative 플라스 미드 | 26, 27 |
| pCAR1::gfp | pCAR1 Kmr Pa 1/04/03-ORF171에서gfp 카세트를 들고 (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | Apr, Kmr, 미니-테네시5-Km-Pa 1/04/03-RBSII에 대 한 배달 플라스 미드-gfpmut3*-T0-T1 | 18 |
표 1입니다. 세균성 긴장 그리고 플라스 미드입니다.
| 플라스 미드 | 는 기증자 | 는 받는 사람 | 96 웰 스 당 transconjugants와 우물의 숫자 | 백분율 |
| [CFUs 또는 셀] | [CFUs] | [%] | ||
| pBP136::gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
표 2입니다. PBP136 사이 기증자 시작 활용의 가능성을 비교 하는 transconjugants를 포함 하는 다른 셀 밀도와 우물의 수::gfp 와 pCAR1::gfp.
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Discussion
여기, 우리 transconjugants의 수를 추정 하는 MPN 방법을 사용 하 여 다른 조건 하에서 활용 주파수 차이 탐지 하기 위한 고해상도 프로토콜 제시. 프로토콜의 한 중요 한 단계 아니 transconjugants 성장 때까지 짝짓기 후 기증자와 받는 사람의 혼합물을 diluting은. 또 다른 단계는 선택적 액체 매체 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 추가 하 고. 이 절차는 배경 선택적 매체에 더 활용으로 인 한 줄일 수 있습니다. 우리가 성공적으로 기증자와 받는 사람 사이의 짧은 짝짓기 기간 후에 차이 검출할 수 있었다. 이 프로토콜에 의해 계산 conjugative 주파수 기증자와 받는 사람 긴장의 성장 조건에서 작은 차이 의해 변경 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 조건은 신중 하 게 설계 되어야 한다.
또한, 우리는 단일 기증자 셀 정렬 FACS를 사용 하 여 두 번째 단계 활용의 추정을 위한 프로토콜을 제시. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 정렬 된 단일 기증자 세포에 대 한 받는 사람 세포의 적절 한 밀도 결정 하 고. 때 받는 사람 셀 단일 기증자 세포를 둘러싼 수 기증자와 받는 사람 사이의 큰 만큼, 신체 접촉은 확실 하다. 다음, 활용 주파수 얼마나 자주 기증자와 받는 셀 연락의 확률에 의해 아닙니다 그러나 기증자 시작 활용의 확률에 의해에, 좌우 될 수 있다. FACS에 의해 단일 기증자 셀을 정렬 하는 것은 어려운; 그러나, 96 웰 스 충분 하지 않습니다 항상 확률을 추정. 따라서, 10-100 접시를 준비 한다. 프로토콜의 한계 중 하나는 낮은 주파수 transmissibility와는 플라스 미드의 기증자 시작 활용의 가능성을 측정 하기 위한 적절 한는 것입니다.
이러한 방법 및 그들의 결과 바탕으로, 우리 최근 보고 두 플라스 미드 활용, 부착 및 분리의 첫 번째 및 세 번째 단계에 영향을 미칠 수는 교 반 속도 변경 하 여 액체 매체에서 다른 활용 주파수 보였다 기증 받는 쌍. 또한, 우리는 또한 두 번째 단계10의 확률에 차이가 발견. 이러한 결과 다른 조건 하에서 활용 주파수를 변경 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 특정의 유무에서 호 기성 또는 혐 기성 조건, 다른 기증자 받는 쌍, 다른 온도 나 pH를 포함 하 여 다양 한 조건 및 플라스 미드의 활용 기능을 비교 하는 데 유용 화학 물질, 양이온, 영양분, 항생제 등.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 제공 하는 pCAR1 pBP136 및 교수 박사 헤 노 지리 동경 (일본)의 제공을 위한 닥터 K. 아마의 국립 연구소의 전염병 (일본) 감사 합니다. 우리는 또한 제공 하는 pJBA28에 대 한 덴마크의 기술적인 대학의 교수, 박사 Molin Sølen에 감사입니다. 이 작품은 JSP KAKENHI에 의해 지원 되었다 (부여 번호 15 H 05618와 15KK0278) 석사 (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
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