Summary
Bir amaçla çeşitli bakteri Konjügatif DNA öğeleri farklı koşullar altında davranışlarını anlamak için biz nasıl verimli bir şekilde tahmin etmek için yüksek çözünürlüklü konjugasyon frekans farklılıkları algılamak için bir protokol tarif donör bakteri konjugasyon başlatır.
Abstract
Bakteriyel konjugasyon antibiyotik direnç genleri yatay havalesi yoluyla Konjügatif bir DNA öğesi içinde önemli bir adımdır. Ayrıntılı karşılaştırmalar konjugasyon frekans farklı koşullar altında nasıl Konjügatif öğesi doğada yayılır anlamak için gereklidir. Ancak, konjugasyon frekans karşılaştırmak için geleneksel yöntemler, seçici plaka üzerinde ek fiil olayların neden yüksek arka plan nedeniyle ayrıntılı karşılaştırmalar için uygun değildir. Başarılı bir şekilde arka planda en olası bir numara (MPN) yöntemi ve yoğun daha fazla konjugasyon selektif sıvı ortamda önlemek için antibiyotik tanıtarak azaltılmış. Buna ek olarak, sık sık nasıl olasılığını tahmin etmek için bir protokol donör hücreleri başlatmak konjugasyon floresans aktif hücre (FACS) sıralama alıcı havuzlarında tek donör hücreleri sıralayarak geliştirdik. İki plazmid kullanarak, pBP136 ve pCAR1, Pseudomonas putida hücreleri konjugasyon sıklıkla farklılıkları farklı heyecan verici fiyatlara sıvı ortamda tespit edilemedi. Konjugasyon inisiyasyon frekanslar için pCAR1 için pBP136 yüksekti. Bu sonuçları kullanarak, biz daha iyi bu iki plazmid konjugasyon özelliklerinde anlayabiliyorum.
Introduction
Mobil genetik öğeleri, Konjügatif plazmid ve bütünleştirici ve Konjügatif öğeleri (ICES) bakteriyel konjugasyon genetik bilgi yatay yaymak için önemlidir. Bu hızlı bakteri evriminin ve adaptasyon teşvik ve tedavisine direnç genleri1,2iletmek. Konjugasyon frekans mafya ve MPF tip3,4göregizli seks pili de dahil olmak üzere proteinler DNA ' (çete) and çiftleşme çifti oluşumu (MPF), hareketlilik için Konjügatif öğeler üzerinde kodlanmış etkilenebilir, 5. Donör ve alıcı çift6 ve hücre7,8,9,10,11,12 (büyüme şartları tarafından da etkilenebilir büyüme oranı, hücre yoğunluğu, katı yüzey veya sıvı orta, sıcaklık, besin kullanılabilirlik ve katyonlar varlığı). Nasıl Konjügatif öğeleri bakteriler arasında yayılır anlamak için konjugasyon frekans ayrıntılı olarak karşılaştırmak gereklidir.
Donör ve çiftleşme sonra alıcı çiftleri arasında konjugasyon frekans genellikle tahmin edilmektedir geleneksel yöntemlerle aşağıdaki gibi. (i) ilk olarak, donör ve alıcı kolonileri sayılar dikkate alınır; (ii) sonra (transconjugants =) Konjügatif öğeleri alınan alıcı koloniler sayılır; (III) ve son olarak, konjugasyon Frekans birimleri (CFU) transconjugants oluşturan colony Bu donör ve/veya alıcı13göre bölünerek hesaplanır. Ancak, bu yöntemi kullanırken, arka plan hücre yoğunluğu yüksek10olduğunda transconjugants elde etmek için kullanılan seçici tabaklarda alınamayabilir ek fiil olaylar nedeniyle yüksektir. Bu nedenle, frekans (aşağıda bir 10 kat fark) küçük farklılıkları tespit etmek zordur. Biz son zamanlarda yoğun antibiyotik içeren sıvı orta kullanarak en olası numara (MPN) yöntemi tanıttı. Bu yöntem daha fazla seçici ortamda konjugasyon engelleyerek arka azalır; Böylece, daha yüksek çözünürlük ile konjugasyon frekans tahmin edilebilir.
Konjugasyon üç adım ayrılabilir: Eki (1) verici alıcının çifti (2) Konjügatif transfer inisiyasyon ve ayrılma (3) çift14. Adımları (1) ve (3) sırasında donör ve alıcı hücreler arasındaki fiziksel etkileşim olduğunu; Böylece, eğitimdir, aynı zamanda seks pili özelliklerinden önemli hücre yoğunluğu ve çevre koşulları aşağıdaki adımları etkileyebilir. Adım (2) büyük olasılıkla birkaç genler konjugasyon plazmid, donör ve alıcı çeşitli özellikleri tarafından etkilenebilir dış değişiklikler karşısında yer alan ifade tarafından düzenlenmiştir. Her ne kadar fiziksel ek veya dekolmanı verici-alıcı çiftlerinin matematiksel bir tahmini hücre tanecik olarak kullanarak benzetimi yapılabilir, adım (2) sıklığı deneysel olarak ölçülmelidir. Orada-si olmak be birkaç raporları nasıl doğrudan gözlemleri kez bağış başlatmak floresans mikroskobu15,16; kullanarak konjugasyon [adım (2)] çok sayıda hücre izlenmesi gerekir çünkü ancak, bu yöntemleri yüksek üretilen iş değildir. Bu nedenle, floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak adım (2) geçtiği olasılığını tahmin etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Bizim Yöntem konjugasyon için gerekli genler tanımlaması olmadan herhangi bir plazmid uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yeşil flüoresan Protein (GFP) ile bir donör hazırlanması- ve sefaloridin direnç Gene öğesini plazmid
- Giriş işaretçisi genlerin hedef plazmid pBP136
Not: Bu iletişim kuralının amacı pBP136 üretmektir::gfp. Bakteri suşları ve plazmidlerin Bu çalışmada kullanılan Tablo 1' de listelenmiştir.- PBP13617 5 ml steril Luria suyu (LB) ve E. coli S17-1λpir18 pJBA2819 yataklık yataklık kültürleri Escherichia coli DH10B büyümek [sefaloridin (Km) içeren-direnç gen ve gfp mut3 * gen organizatörü ve Sonlandırıcı bir mini-Tn5] 5 ml steril LB 50 μg/mL / dakika (devir/dakika) 200 devrimler, sallayarak ile Km 37 ° C gece (O/N, 16-24 h) içeren.
- Hasat ve yıkama
- Her kültür 1 mL hasat, bir 2 mL microtube ve santrifüj (10.000 × g, oda sıcaklığında, 2 dk) içine yerleştirin. O zaman, süpernatant atın ve hücre Pelet 2 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspend.
- Santrifüj tekrar (10.000 × g, oda sıcaklığında, 2 dk) ve steril PBS 500 μL içinde resuspend.
- Çiftleşme filtre
- Steril LB tabak (% 1.6 agar) hazırlamak ve bir steril 0,22 mikron gözenek boyutu membran filtre üzerine yerleştirin. PBP136 ve spot karışımı LB plaka üzerinde filtre üzerinde barındıran Mix 500 μL, E. coli S17-1λpir barındıran pJBA28 E. coli DH10B ile. Plaka O/N 30 ° C'de kuluçkaya LB plaka filtreyi kaldırmak, steril 50 mL plastik tüpün içine koyun ve 1 mL steril PBS ekleyin.
Not: pJBA28 Π protein, pir gen18tarafından kodlanmış huzurunda çoğaltabilir ve DH10B için S17-1λpir aktarılabilir. pBP136 hiçbir marker gen17 taşır ve DH10B S17-1λpiriçin transfer edilebilir. Bu nedenle, pBP136 ve pJBA28 DH10B barındıran pBP136 ve mini-Tn5 (kromozom veya pBP136 aktarılması) Bu aşamada yataklık S17-1λpir ayırt edilebileceğini değil. O zaman, onları karışımları bağış sonraki adımda (1.1.4.–1.1.5.) olarak kullanılır.
- Steril LB tabak (% 1.6 agar) hazırlamak ve bir steril 0,22 mikron gözenek boyutu membran filtre üzerine yerleştirin. PBP136 ve spot karışımı LB plaka üzerinde filtre üzerinde barındıran Mix 500 μL, E. coli S17-1λpir barındıran pJBA28 E. coli DH10B ile. Plaka O/N 30 ° C'de kuluçkaya LB plaka filtreyi kaldırmak, steril 50 mL plastik tüpün içine koyun ve 1 mL steril PBS ekleyin.
- 50 μg/mL Km 37 ° c ile 200 d/d ve Pseudomonas putida KT2440 kültürünün sallayarak içeren steril LB yukarıdaki çiftleşme karışımı bir O/N kültür büyümek [Km-duyarlı (Kms), rifampisin (Rifs), gentamisin duyarlı (Gms) ve tetrasiklin dayanıklı (Tcr)] 12.5 μg/mL Tc 30 ° c ile 200 devir / dakikada sallayarak içeren ortamda.
- Hasat ve hücreler olduğu gibi adım 1.1.2 yıkama sonra onları (çiftleşme karışımı ve KT2440) filtresi (O/N, 30 ° C) olduğu gibi adım 1.1.3 çiftleşme için kullanın.
- 50 μg/mL Km ve 12.5 μg/mL Tc içeren steril LB tabak hazırlamak (LB + Km + Tc plakaları).
- Membran filtre steril PBS ile resuspended karışımı seyreltik (101–105-kat) ve her seyreltme LB + Km + Tc üzerine tabaklar ve plakaları için 2-3 d 30 ° C'de kuluçkaya sonra yayıldı.
- Koloniler tabakaları gelen cevap, Km ve Tc gibi Piçeren steril LB O/N kültüründe büyümek. resinovorans CA10dm4RG (Rifr ve Gmr)6 ' Rif içeren steril LB (25 μg/mL) ve Gm (30 μg/mL) 30 ° C ve 200 rpm.
Not: PJBA28 doğrudan S17-1λpir transfer çünkü önceki notun LB + Km + Tc kolonileri tabak (dan 1.1.7.) açıklandığı gibi KT2440 barındıran pBP136 bir mini-Tn5 ve KT2440 mini-Tn5ile taşıyor pBP136 ve pJBA28 KT2440 için yataklık. Bu yüzden başka bir çiftleşme ile P. resinovorans CA10RG hedef pBP136 aşağıdaki adımlarda bir mini-Tn5 ile elde etmek için gereklidir. - Hasat ve hücreler olduğu gibi adım 1.1.2 yıkama sonra onları adım 1.1.3 olduğu gibi (O/N, 30 ° C) çiftleşme filtre için kullanın.
- Rif, Gm ve Km içeren steril LB tabak hazırlamak (LB + Rif + Km + Gm plakaları).
- Karışımı üzerinde filtre resuspend ve sonra 101–105seyreltik-kat, LB + Rif + Km + Gm yayılmış tabaklar ve plakalar için 2-3 d 30 ° C'de kuluçkaya
- Kolonilerin almak ve onlar için plazmid belirli primerler kullanılarak PCR tarafından pBP136 liman kontrol edin.
- Hedef plazmid pCAR1 içine bir seçici marker gen giriş
Not: Bu protokol pCAR1 oluşturmak için hedeftir::gfp- PCAR1 barındıran bir O/N kültürünü P. putida KT2440 büyümek (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 200 devir/dakika ve 30 ° C ve E. coli S17-1λpir18 pJBA28 5 mL steril LB de içinde barındıran, 50 μg/mL Km 200 devir/dakika ve 37 ° c de içeren
- Hasat ve hücreler olduğu gibi adım 1.1.2 yıkama sonra onları adım 1.1.3 olduğu gibi (O/N, 30 ° C) çiftleşme filtre için kullanın.
- LB plaka filtreyi kaldırmak, steril 50 mL plastik tüpün içine koyun ve 1 mL steril PBS ekleyin.
- Steril PBS ile resuspended karışımı seyreltik (101–105-kat) ve steril seçici LB + Tc + Km üzerine seyreltilmiş karışımı spread plakaları.
Not: pCAR1 E. coli; çoğaltmak değil Böylece, bir mini-Tn5 barındıran pCAR1 LB + Tc + Km üzerinde seçili olmalıdır P. putida KT2440 plakaları. - Bir koloni plaka almak ve steril LB Km, Tc ve Pkültürünü içeren bir O/N kültüründe büyür. resinovorans CA10dm4RG steril LB Rif ve Gm (200 d/d, 30 ° C) içeren içinde.
- Hasat ve adım 1.1.2 olduğu gibi yıkama sonra hücreleri (O/N, 30 ° C) çiftleşme filtre için adım 1.1.3 olduğu gibi kullanın.
- Karışımı üzerinde filtre resuspend ve sonra o sulandırmak, LB + Rif + Km + Gm plakalar yaymak ve plakalar için 2-3 d 30 ° C'de kuluçkaya
- Kolonilerin almak ve onlar PCR tarafından pCAR1 plazmid için belirli astar ile liman kontrol edin.
- Tagged plazmid aktarılabilirliği onaylayın ve bağış hazırlamak için sonraki adımlar
Not: Bu protokol yukarıdaki inşa plazmid aktarılabilirliği onaylamak ve bağış için sonraki adımlar hazırlamak için hedeftir.- P. resinovorans CA10dm4RG bir O/N kültür pBP136 yataklık büyümek::gfp veya pCAR1::gfp Km ve P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI kültürünü içeren steril LB q, içinde hangi PA1/O4/O3-gfpmut3* nedeniyle onun kromozom lacIq gen ifade değil]21 Tc (200 d/d, 30 ° C) içeren LB 3 ml.
- Hasat ve hücreler olduğu gibi adım 1.1.2 yıkama sonra onları adım 1.1.3 olduğu gibi (O/N, 30 ° C) çiftleşme filtre için kullanın.
- Filtre bir steril 50 mL plastik tüpün içine yerleştirin ve 1 mL steril PBS ile resuspend. Steril PBS ile resuspended karışımı seyreltik (101–105-kat), steril seçici LB + Tc + Km üzerine seyreltilmiş karışımı spread plakaları.
- Kolonilerin almak ve onlar her PCR tarafından plazmid belirli astar ile liman kontrol edin.
Not: Ekleme plazmid transfer işlevini etkilemez onaylamak isteğe bağlı, mini-Tn5 tarafından plazmid çıkarma sonra doğrudan sıralama ekleme konumunu bir onayıdır.
2. konjugasyon frekans MPN yöntemi tarafından hesaplanması
- Hazırlamak steril LB + Km ve LB + Gm plakaları.
- PBP136 yataklık P. putida SMDBS O/N kültürünü büyümek::gfp veya pCAR1::gfp 3 ml steril LB Km ve P. putida KT2440RGD kültürünü içeren (Gmr, Rifr) Gm (140 d/d, 30 ° C) içeren LB 3 ml.
- Hasat ve hücreler olduğu gibi adım 1.1.2 yıkama sonra filtre için adım 1.1.3 olduğu gibi 45 dk 30 ° C'de çiftleşme için bunları kullanın.
- Seri olarak seyreltik yukarıdaki donör ve alıcı kültür (101 –107) ve LB + Km (donör) veya LB yayıldı + Gm (alıcı) tabaklar (her nüsha) birimleri (CFU) oluşturan colony saymak için. Tabak 2 d için 30 ° C'de kuluçkaya.
- Steril LB Km ve Gm içeren filtre üzerinde karışım resuspend ve seri olarak sulandırmak (21 224–107.2olarak) bir 96-şey hücre kültür tabak (quadruplicate) kullanarak.
- 96-şey plaka uygun saat (30 ° C'de 2 d) için kuluçkaya.
- Donör ve alıcı (adım 2.4.) tabaklarda CFU saymak ve hangi transconjugants büyümeye wells saymak.
- MPN ve onun sapma Jarvis ve arktarafından geliştirilen MPN hesaplama programı kullanarak hesaplar. http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls kullanılabilir 22.
- Deney (örneğin, 'test') adını (örneğin, 2018/4/9) deney, test seri numarasını ve max tarihini girin. Hayır. Excel satır #7 'Programının' sayfasındaki ('24' girin) dilutions, ('MPN_ver5.xls') dosya.
- ' (= 0.5) 2-1 2-24 (= 5.96 × 10-8)' 'seyreltme faktörü d'sütununda, '0.01' 'birim ml veya g w've ' 4' girin ' No tüpler n ' 'giriş veri' otomatik olarak üretilen tablolar.
- Transconjugants her numune dilüsyonu (0-4) büyümek kuyu sayısını girin.
- Üst sağ 'Sonuçları hesaplamak' düğmeye bas ve sonuçlarda (MPN/μL) ve % 95 güven sınırları (alt ve üst) elde edilir.
- Plazmid konjugasyon frekans transconjugants (MPN/mL) sayısına bölünmesi ile donör ve alıcı hücreler (CFU/mL) sayıda tarafından hesaplayın.
3. hazırlık donör tarafından başlatılan konjugasyon olasılığının tahmini için
- PBP136 yataklık P. putida SMDBS O/N kültürünü büyümek::gfp veya pCAR1::gfp 3 ml steril LB Km ve P. putida KT2440RGD kültürünü içeren (Gmr, Rifr) 300 mL kullanarak Gm içeren steril LB 3 ml Şişeler (140 d/d, 30 ° C) olarak precultures.
- Preculture 200 μL 200 mL taze steril LB Km ya da 500 mL şişe Gm içeren içine aktarmak ve 140 rpm'de sallayarak ile 30 ° C'de kuluçkaya.
- 600 bulanıklık ölçmek nm (OD600) bir UV-VIS spektrofotometre ve nokta kullanarak kültür kültür, seyreltilmiş içinde LB (101–108-dilutions kat), Km içeren bir LB plaka veya Gm. Incubate bu LB tabak 30 ° c için 1-2 d ve CFU belirlemek.
- OD600 değerleri ve büyüme eğrileri donör ve alıcı oluşturmak için CFU büyüme saat ile çizmek.
- Donör ve alıcı zorlanma kültürleri orta log fazı, büyüme eğri dayalı büyümeye.
- Hasat ve hücreleri yıkama sonra 101–103 CFU LB ve 105–107 CFU alıcının lb 100 μL içinde 10 μL bağış hazırlayın.
- Donör ve 100 μL 96-şey tabak (içinde nüsha) içinde farklı yoğunlukları, alıcı kültürlerin karışımı 10 μL. Örneğin, mix 101 CFU donör ve 105 CFU alıcının ve her 96 wells ve mix 101 CFU bağış ve 10 eklemek6 CFU alıcının başka bir 96-şey plaka, ve benzeri.
- Karışım için 45 dk 30 ° C'de kuluçkaya ve her şey için daha fazla konjugasyon etkisizleştirmek için yüksek konsantrasyonda antibiyotik (100 μg/mL Km ve 60 μg/mL Gm) ekleyin.
- Plaka 2 d için 30 ° C'de kuluçkaya.
- Hangi transconjugants büyümeye wells saymak.
- Uygun donör tarafından başlatılan konjugasyon (transconjugants en az 1 de bir 96-şey tabak içinde bulunan) Yukarıdaki veriler temel olasılık tahmini için alıcı yoğunluğu seçin.
Not: Transconjugants bütün wells donör ve alıcı hücreler yoğunlukları yüksektir ve birden fazla fiil bir kuyuda bu sırada büyüyecek. Buna ek olarak, hücre yoğunluğu çok düşük olduğunda hiçbir transconjugants herhangi bir kuyu içinde bulunacaktır. Aşağıdaki bölümde, bir kuyunun içine bir tek verici hücre sıralanır. Bu nedenle, alıcı yoğunluğu en yüksek seviyede olmalıdır.
4. donör tarafından başlatılan konjugasyon olasılığının tahmini
- PBP136 yataklık P. putida SMDBS 200 mL donör orta log fazı kültürünün hazırlamak::gfp veya pCAR1::gfp ve bu alıcının P. putida KT2440RGD, 3.6-3.7 içinde açıklandığı gibi.
- Yer 106 CFU alıcının 100 μL lb her iyi bir 96-şey plaka içinde.
- FACS sistemine (Akış Sitometresi ve hücre sıralayıcısı bir robot kol, 488 nm argon lazer ve 70 mikron meme delik) ayarlayın. İleri dağılım (FSC), ile % 1 eşik edinme tetikleyici olarak ayarlayın. H kazanç ve kazanç FSC ayarlamak ve yan dağılım (SSC), bir negatif kontrol PBS kullanarak yanlış pozitif sinyaller dışlayabilirsiniz maksimum hassasiyet. FSC ve SSC ve maksimal sıralama saflık için 0.5 damla sıralama modu dayanarak sıralama geçit ayarlayın.
- Sıralama bir LB plaka (384 farklı noktalar), bir tek verici cepten FACS tarafından kuluçkaya plaka 30 ° c 2 d, ve o zaman kaç kolonileri sıralanmış hücrelerden plaka üzerinde görünür.
Not: Bu yordam kümesi kapısı doğrulamak için kullanılabilir. Plaka üzerinde 384 kolonileri varsa, sıralanmış hücrelerinin % 100 koloniler şeklinde anlamına gelir. Sıralama ortalama her zaman % 90-95'i bağlıdır. - Her şey bir 96-şey plaka bir tek verici hücreye FACS tarafından alıcının (4,2) sıralamak.
- 30 ° C'de 45 dk plaka kuluçkaya ve her şey için daha fazla konjugasyon önlemek için yüksek konsantrasyonda antibiyotik (100 μg/mL Km ve 60 μg/mL Gm) ekleyin.
- Plaka 2 d için 30 ° C'de kuluçkaya.
- Kuyu içinde transconjugants büyüdü olarak saymak görsel denetim çıplak gözle tarafından belirlenir.
- Donör sıralanmış kuyu toplam sayısına göre transconjugants ile kuyu sayısı bölerek donör tarafından başlatılan konjugasyon olasılığını hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konjugasyon frekans MPN yöntemi ile karşılaştırılması
Bizim önceki raporda, biz pBP136 konjugasyon frekansları göre::gfp ve pCAR1::gfp 125 mL spinner şişeler10kullanarak çiftleşme bir 45 dakika sonra farklı karıştırma oranları ile üç kat seyreltilmiş LB (1/3 LB) sıvı ortamda. Biz pBP136 konjugasyon frekansları göre::gfp ve pCAR1::gfp 10 ile6 CFU/mL donör ve alıcı suşları farklı karıştırma koşullar altında (0-600 devir/dakika). Her iki plazmid konjugasyon sıklığını yükselen karıştırma oranlarda ve en fazla farkı konjugasyon sıklıkla oldu < 10 kat pBP136 için::gfp (0 ile 400 d/d) arasında süre bunu pCAR1::gfp oldu ~ 25-fold (arasında 0 ve 200 d/d; Res. 1).
Donör tarafından başlatılan konjugasyon olasılığının tahmini
Donör tarafından başlatılan konjugasyon önceden tahmini olasılık Tablo 2' de gösterilmiştir. Alıcı hücreler konjügasyon, deneyleri çiftleşme olasılığını karşılaştırmak için gerekli yoğunluğunu belirlemek için donör ve alıcı farklı yoğunlukları ile gerçekleştirilmiştir. Tablo 2' de, pBP136 gösterildiği gibi::gfp transconjugants % 100 (96/96) 10 içeren Wells algılandı3 CFU donör ve 105-107 CFU alıcının ve bu 10 ile2 CFU donör ve 106-107 CFU alıcının, hücre yoğunluğu çok yüksek olduğunu belirten. Deneyleri ile 10 çiftleşme1 CFU donör ve 106 veya 105 CFU alıcının transconjugant pozitif wells azalmış bir dizi sonuçlandı (%66 ve % 2.1, sırasıyla, Tablo 2). Böylece, > 105 CFU alıcıya ait tahmin tek verici hücresiyle çiftleşme için gerekli. Benzer şekilde, çiftleşme deneyleri pCAR1 ile gerçekleştirilen::gfp donör ve alıcı suşlarının farklı yoğunlukları. Transconjugant-pozitif wells yüzdeleri bu pBP136 daha çok daha düşük::gfp (Tablo 2). Donör ve alıcı hücrelerin birbirine benzer şekilde ekleyebilirsiniz varsayılarak, konjugasyon başlama pCAR1 donör için olasılık pBP136 donör için daha düşük. Bu sonuçlara dayanarak, biz kararlı 107 CFU alıcının FACS tarafından sıralanmış bir tek verici hücre için gerekli.
O zaman, transconjugant-pozitif wells numaralarını sayıldı. Transconjugant-pozitif kuyular için pBP136 yüzdesi::gfp pCAR1 için bundan daha büyük (% 1,9) yapıldı::gfp (< %0.052; Tablo 2). Böylece, vardı bu iki plazmid arasında konjugasyon donör tarafından başlatılan olasılığı 36-fold bir fark daha fazla.
Şekil 1. PBP136 konjugasyon frekansları karşılaştırılması::gfp ve pCAR1::gfp 106 koloni oluşturan birimler (CFU) mL-1 donör (Pseudomonas putida SMDBS) ve alıcı (P. putida KT2440RGD) farklı yönü ile oranları karıştırarak (0-600 rpm). Hata çubukları göre % 95 güven sınırları MPN yöntemi ve standart sapması CFU donör ve alıcı tarafından hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bakteri suşları | İlgili ve genotip fenotip | Başvuru veya kaynak |
| Escherichia coli DH10B | F-, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (ara Leyi) 7697, galU, galK , λ-, rpsL, endA1, nupG | Termo |
| E. coli S17-1(λpir) | TMr, Smr, recA, thi, pro, hsdR-M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km Tn7 λpir | 18 |
| Pseudomoans putida KT2440 | Kms, Rifs, Gms, Tcr | 25 |
| Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) | KT2440 barındıran pCAR1 | 20 |
| Pseudomoans putida KT2440RGD | Kms, Rifr, Gmr, Tcr, miniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress-a inseted kromozom içinde olduğunu | 10 |
| Pseudomoans putida SMDBS | Türev suşu P. putida KT2440, dapB-silinmiş, Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacIq kromozom içinde eklenir | 21 |
| P. resinovorans CA10RG | Kms, Rifr, Gmr, Tcs | 6 |
| Plazmid | ||
| pBP136 | INCP-1, mafyaP, MPFT plazmid | 17 |
| pBP136::gfp | pBP136 Kmr ve PA1/04/03- parA gfp kasete taşıyor (26,137 nt) | 21 |
| pCAR1 | INCP-7, mafyaH, MPFF, karbazol degradative plazmid | 26, 27 |
| pCAR1::gfp | pCAR1 Kmr ve PA1/04/03- ORF171gfp kasete taşıyor (182,625 nt) | 21 |
| pJBA28 | APr, Kmr, teslimat plazmid mini-Tn5-Km-pA1/04/03- RBSII-gfpmut3*-T0-TRT1 | 18 |
Tablo 1. Bakteri suşları ve Plazmidlerin.
| Plazmid | bir Donör | bir Alıcı | Wells transconjugants 96 kuyu başı ile numaralarını | Yüzde |
| [CFUs veya hücre] | [CFUs] | [%] | ||
| pBP136::gfp | 103 | 107 | 96/96 | 100 |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 96/96 | 100 | ||
| 102 | 107 | 96/96 | 100 | |
| 106 | 96/96 | 100 | ||
| 105 | 54/96 | 56 | ||
| 101 | 107 | 71/96 | 74 | |
| 106 | 63/96 | 66 | ||
| 105 | 2/96 | 2.1 | ||
| 1 | 107 | 23/1212 | 1.9 | |
| pCAR1::gfp | 103 | 107 | 6/96 | 6.3 |
| 106 | 6/96 | 6.3 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 102 | 107 | 1/96 | 1 | |
| 106 | 1/96 | 1 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 101 | 107 | 0/96 | 0 | |
| 106 | 0/96 | 0 | ||
| 105 | 0/96 | 0 | ||
| 1 | 107 | 1/1920 | < 0.052 |
Tablo 2. Wells, farklı hücre yoğunluğu, pBP136 arasında konjugasyon donör tarafından başlatılan olasılığını karşılaştırmak için transconjugants içeren ile sayısı::gfp ve pCAR1::gfp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, farklı koşullarda konjugasyon frekans farklılıkları algılamak için yüksek çözünürlüklü bir protokol transconjugants sayısını tahmin etmek için bir MPN yöntemi kullanarak mevcut. Bir önemli adım protokolündeki donör ve alıcı karışımı yok transconjugants büyümek kadar çiftleşmeden sonra erkeğini sulandrarak. Bir adım daha yüksek konsantrasyonda antibiyotik daha fazla konjugasyon önlemek için selektif sıvı orta olarak ekliyor. Bu yordamları Seçmeli Orta daha fazla konjugasyon neden arka plan azaltabilir. Biz başarıyla donör ve alıcı arasında çiftleşme kısa bir süre sonra bile farklılıklar tespit olabilir. Bu iletişim kuralı tarafından hesaplanan Konjügatif frekans donör ve alıcı suşları büyüme şartları küçük farklılıklar tarafından değiştirilmiş. Böylece, bu koşulları dikkatle tasarlanmış olmalıdır.
Buna ek olarak, biz konjugasyon ikinci adımında FACS hücre tek verici sıralama kullanarak tahmin etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı konusunda en önemli adım bir sıralanmış tek verici hücre için alıcı hücrelerin uygun yoğunluk belirliyor. Tek verici hücre çevreleyen alıcı hücre sayısı kadar büyük donör ve alıcı arasında fiziksel temas ne zaman kesindir. O zaman, konjugasyon frekans ne sıklıkta donör ve alıcı hücrelerin birbirlerine temas olasılığı, ancak donör tarafından başlatılan konjugasyon olasılığını tarafından etkilenebilir. Bir tek verici hücre FACS tarafından sıralama zor değil; Ancak, 96 wells her zaman olasılığını tahmin etmek yeterli değildir. Bu nedenle, 10-100 tabak hazırlanmalıdır. Protokol sınırları donör tarafından başlatılan konjugasyon bir plazmid, olasılığı düşük frekanslı aktarılabilirliği ile ölçmek için uygun olmadığını biridir.
Bu yöntemler ve bunların sonuçları bağlı olarak, biz son zamanlarda iki plazmid farklı konjugasyon Frekanslar sıvı ortamda konjügasyon, ek ve dekolmanı birinci ve üçüncü adımları etkileyebilir karıştırma oranlarını değiştirerek gösterdi rapor verici-alıcı çiftleri. Buna ek olarak, Ayrıca ikinci adım10olasılık farklılıkları bulduk. Bu sonuçlar konjugasyon frekans farklı koşullar altında nasıl değiştiğini göstermektedir. Bu protokoller özel içinde plazmid aerobik veya anaerobik koşul, farklı verici-alıcı çiftleri, farklı sıcaklık ve pH, dahil olmak üzere çeşitli koşullarda ve konjugasyon özelliklerini karşılaştırmak için yararlıdır kimyasallar, katyonlar, besin ve antibiyotik gibi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dr. K. Kamachi, Ulusal Enstitüsü, bulaşıcı hastalıklar (Japonya) pBP136 ve Prof. Dr. H. Nojiri Tokyo Üniversitesi (Japonya) pCAR1 sağlamak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca pJBA28 sağlamak için Danimarka Teknik Üniversitesi Profesör Doktor Molin Sølen için minnettarız. Bu eser JSP'ler KAKENHI tarafından desteklenmiştir (Grant sayıları 15H 05618 ve 15KK0278) MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F.
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E.
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
