Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بيوبرينتابل الجينات/الجيلاتين المائية 3D في المختبر النموذجي النظم الحث على تشكيل خلية كروي

Published: July 2, 2018 doi: 10.3791/57826
Automatic Translation
*1, *2,3, 2, 4, 4, 3, 2,5
1Department of Mechanical Engineering, McGill University Montreal, 2Department of Bioengineering, McGill University Montreal, 3Department of Molecular Biology, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C. (IPICyT), 4Department of Mining and Materials Engineering, McGill University Montreal, 5Department of Biomedical Engineering, McGill University Montreal
* These authors contributed equally

Summary

قمنا بتطوير نموذج سرطان الثدي غير متجانسة تتألف من خلايا الورم وتنتجها الخلايا الليفية مخلدة جزءا لا يتجزأ من بيوينك الجينات/جيلاتين بيوبرينتابل. النموذج الذي يجمل في فيفو وورم المكروية ويسهل تشكيل الماغنيسيوم متعددة الخلايا السرطانية، مما أسفر عن التبصر في آليات القيادة tumorigenesis.

Abstract

لا هو لخص التغايرية الخلوية والبيوكيميائية والفيزيائية الحيوية من الأم وورم المكروية بخطوط الخلايا السرطان مخلدة تزايد استخدام الثقافة التقليدية من خلية ثنائية الأبعاد (2D). ويمكن التغلب على هذه التحديات باستخدام تقنيات بيوبرينتينج لبناء نماذج غير متجانسة الورم (3D) ثلاثي الأبعاد حيث يتم تضمين أنواع مختلفة من الخلايا. الجينات والجيلاتين وهما الحيوية الأكثر شيوعاً المستخدمة في بيوبرينتينج نظراً لتوافق مع الحياة، بيوميميكري، والخواص الميكانيكية. عن طريق الجمع بين اثنين البوليمرات، حققنا المائية بيوبرينتابل مركب مع أوجه التشابه مع بنية مجهرية ستروما الورم الأصلي. علينا درس برينتابيليتي من مركب المائية عن طريق ريولوجيا وحصل على نافذة الطباعة المثلى. خلايا سرطان الثدي والخلايا الليفية جزءا لا يتجزأ من الهلاميات المائية وطباعتها على شكل نموذج ثلاثي الأبعاد محاكاة المكروية في فيفو . النموذج غير متجانسة بيوبرينتيد تحقق من صلاحية عالية لزراعة الخلايا طويلة الأجل (> 30 يوما)، ويشجع التجميع الذاتي لخلايا سرطان الثدي في متعددة الخلايا السرطانية الماغنيسيوم (MCTS). لقد احتفلنا بالهجرة والتفاعل بين الخلايا المرتبطة بالسرطان تنتجها الخلايا الليفية (اجواءه) مع المراكز في هذا النموذج. باستخدام منصات الثقافة خلية بيوبرينتيد كنظم الثقافة المشارك، يوفر أداة فريدة لدراسة اعتماد توموريجينيسيس على تكوين سدى. ويتميز هذا الأسلوب الفائق، وإمكانية تكرار نتائج منخفضة التكلفة وعالية، ويمكن أن توفر أيضا نموذج بديل لثقافات أحادي الطبقة الخلية التقليدية والنماذج الحيوانية الورم لدراسة بيولوجيا السرطان.

Introduction

على الرغم من أن الثقافة الخلية 2D يستخدم على نطاق واسع في أبحاث السرطان، توجد قيود كما تزرع الخلايا في شكل أحادي الطبقة بتركيز موحد من المواد المغذية والأكسجين. تفتقر هذه الثقافات الهامة خلية خلية والخلية-مصفوفة التفاعلات الموجودة في الأم وورم المكروية (TME). ونتيجة لذلك، هذه النماذج الخص سوء الظروف الفسيولوجية، أسفر عن السلوكيات الشاذة الخلية، بما في ذلك مورفولوجيس غير طبيعي والمنظمة مستقبلات غير النظامية واستقطاب الغشاء والتعبير الجيني غير طبيعي، بين أمور أخرى الشروط1،2،،من34. من ناحية أخرى، يقدم الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد، حيث يتم توسيع الخلايا في مساحة حجمية كمجاميع، الماغنيسيوم، أو أورجانويدس، أسلوب بديل لإيجاد بيئات في المختبر أكثر دقة لدراسة بيولوجيا الخلية الأساسية وعلم وظائف الأعضاء. يمكن أيضا أن تشجع ثقافة الخلية 3D نماذج التفاعلات الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة التي هي حاسمة الخصائص الفسيولوجية لأن TME الأصلي في المختبر4،،من15. بيوبرينتينج 3D التكنولوجيا الناشئة توفر إمكانيات لبناء النماذج التي تحاكي TME غير متجانسة.

بيوبرينتينج 3D مستمدة من النماذج الأولية السريعة ويمكن تلفيق المجهرية 3D قادرة على محاكاة بعض تعقيدات المعيشة عينات الأنسجة6،7. وتشمل أساليب بيوبرينتينج الحالي النافثة للحبر، البثق، وساعدت ليزر الطباعة8. فيما بينها، يسمح طريقة البثق التغايرية التحكم داخل المصفوفات المطبوعة بدقة تحديد المواقع أنواع متميزة من المواد في مختلف المواقع الأولية. ولذلك، هو أفضل نهج لاختلاق غير متجانسة في المختبر النماذج التي تنطوي على أنواع متعددة من الخلايا أو المصفوفات. بيوبرينتينج البثق وقد استخدمت بنجاح لبناء السقالات على شكل إذني9، هياكل الأوعية الدموية10،،من1112، والجلد الأنسجة13، مما أدى إلى دقة الطباعة العالية وخلية البقاء. ميزات التكنولوجيا أيضا تحديدات مادية متعددة الاستعمالات، القدرة على إيداع المواد مع الخلايا المضمنة مع الكثافة المعروفة، وإمكانية تكرار نتائج عالية14،،من1516،17 . كثيرا ما تستخدم بيوينكس الهلاميات المائية الطبيعية والاصطناعية بيوبرينتينج ثلاثية الأبعاد بسبب ما توافق مع الحياة وبيواكتيفيتي وشبكاتها ماء يمكن إجراء هندسة عكسية ليشابه هيكلياً ECM7،18 ،19،،من2021،،من2223. الهلاميات المائية أيضا مفيدة حيث أنها يمكن أن تشمل مواقع لاصقة للخلايا، والعناصر الهيكلية، النفاذية للمواد الغذائية والغازات، والخلية الخصائص الميكانيكية الملائمة لتشجيع التنمية24. على سبيل المثال، توفر الكولاجين الهلاميات المائية إنتغرين مرسى المواقع التي يمكن أن تستخدم الخلايا لإرفاق إلى المصفوفة. الجيلاتين، الكولاجين التشويه والتحريف، يحتفظ بمواقع الالتصاق خلية مماثلة. وفي المقابل، الجينات بيوينيرت لكنه يوفر السلامة الميكانيكية عن طريق تشكيل كروسلينكس مع أيونات ديفالينت25،26،،من2728.

في هذا العمل، قمنا بتطوير المائية مركب بيوينك، تتألف من الجينات والجيلاتين، مع أوجه التشابه مع بنية مجهرية ستروما الورم الأصلي. خلايا سرطان الثدي والخلايا الليفية كانت جزءا لا يتجزأ من الهلاميات المائية وطباعة عبر بيوبرينتير البثق المستندة إلى إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد يحاكي المكروية في فيفو . يسمح البيئة 3D الهندسة الخلايا السرطانية لتشكيل الورم متعددة الخلايا الماغنيسيوم (MCTS) مع صلاحية عالية لفترات طويلة من ثقافة الخلية (> 30 يوما). هذا البروتوكول يوضح منهجيات توليف مركب الهلاميات المائية، ووصف المواد المجهرية وبرينتابيليتي، بيوبرينتينج الخلوية نماذج غير متجانسة، ومراقبة تشكيل المراكز. يمكن تطبيق هذه المنهجيات الأخرى بيوينكس في بيوبرينتينج البثق، فضلا عن تصاميم مختلفة لنماذج الأنسجة غير متجانسة مع التطبيقات المحتملة في فحص المخدرات وفحوصات الهجرة الخلية والدراسات التي تركز على الخلية الأساسية الوظائف الفسيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد مواد والمائية، ومواد الثقافة الخلية

  1. إعداد المواد والحل
    1. غسل وتجفيف 250 مل وقنينة الزجاج 100 مل، النمامون المغناطيسي، ملاعق، وخراطيش 10 مل، ز 25 فوهات أسطواني مع (بطول 0.5 في) وقطر داخلي من 250 ميكرون. تعقيم المواد بالتعقيم منهم 121 درجة مئوية/15 دقيقة/1 atm. الحفاظ على هذه المواد تحت ظروف معقمة حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تشير إلى الجدول للمواد اللازمة لمعلومات المورد.
    2. تزن 3 ز من الجينات (3% w/v) و 7 غرام من الجيلاتين (7% w/v) (المعرفة ك A3G7 الآخرة).
    3. تعقيم البنود التالية تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمالا يقل عن 4 h: الجينات والجيلاتين المساحيق، والفيلم البارافين، قطع رقائق الألومنيوم من 5 سم2، و 1 مل والمحاقن 5 مل. تعقيم في نهاية أحرف كبيرة وتلميح قبعات والمكابس بغمر لهم في الإيثانول 70% على الأقل من 4 ح وغسلها x 2 مع تعقيم المياه النقية فائقة.
      ملاحظة: تشير إلى الجدول للمواد اللازمة لمعلومات المورد.
    4. حل 4 غرام من [اغروس] مع المياه النقية فائقة وتعقيم من قبل التعقيم.
      ملاحظة: يذوب في [اغروس] تماما بعد عملية التعقيم.
    5. تعد حلاً 100 مم من كلوريد الكالسيوم اللامائى (كاكل2) في تعقيم المياه نقية جداً وعامل تصفية عقيمة (مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر) قبل الاستخدام.
    6. [اغروس] المغلفة جيدا 6 لوحات، تذوب في [اغروس] عقيمة في فرن ميكروويف للحصول على حل سائل؛ ثم، في إطار "مجلس الوزراء" السلامة الأحيائية (BSC) واستخدام ميكروبيبيتي 1 مل، إضافة 2 مل كل بئر ومزجها برفق لإنشاء طبقة موحدة في أسفل البئر. تترك لتبرد وختم البئر مع الفيلم البارافين. يبقيه في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.
  2. إعداد السلائف المائية A3G7
    1. مزيج الجيل الثالث 3g للجينات وز 7 من مساحيق الجيلاتين في كوب 250 مل داخل BSC. إضافة محرض المغناطيسية و 100 مل من دببس. ختم أخلطه مع البارافين العقيم إحباط الفيلم والألومنيوم (5 سم2) لتجنب التلوث.
    2. حل المساحيق تحت تحريض مستمر في لوحة مغناطيسية أو الساخن مع 600 لفة في الدقيقة 60 درجة مئوية ح 1 و RT لإضافية ح 2.
    3. تسخين المواد عند 37 درجة مئوية حتى الجل يمر مرحلة انتقال إلى الحالة السائلة (من أجل 100 مل من محلول جل الأسهم، وهذا يأخذ حوالي 45 دقيقة). نقل الحل إلى أنابيب الطرد المركزي المخروطية العقيمة 50 مل وختم عليها، والطرد المركزي هذه الأنابيب في 834 ز x لمدة 5 دقائق للقضاء على أي فقاعات الغاز من المواد.
    4. نضح السلائف المائية إلى 10 مل المحاقن. ختم المحاقن مع قبعات والفيلم البارافين. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. خلية ثقافة
    ملاحظة: يجب إجراء الخطوات المذكورة في هذا القسم تحت ظروف معقمة.
    1. إعداد متوسطة دميم القاعدية على النحو التالي (بالنسبة ل 1): في بكالوريوس، مزيج 100 مل مصل البقر الجنين (FBS) بالإضافة إلى 10 مل من محلول المضادات الحيوية/فطري (100 × الحل استقرت) في حاوية معقمة جديدة. إضافة دميم المتوسطة لضبط الخليط يصل إلى 1,000 مل. ختم الحاوية وإبقائه في 4 درجات مئوية.
    2. في حمام مائي حرارة سابقا (37 درجة مئوية)، تذويب 1 قنينة من جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231-التجارة والنقل (خط خلية سرطان الثدي البشري التعريب المسمى التجارة والنقل والطاقة النووية) وقنينة 1 من معدل وفيات الرضع-90-مشري (تنتجها الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان الخلية خطوط المسمى مشري، مع التعريب هيولى ) الخلايا من تخزين النيتروجين السائل بتحريكها برفق إلى الماء. خطوط الخلايا، والبلازميدات للتجارة والنقل، ووسم مشري، متاحة تجارياً.
    3. نقل 160 ميليلتر/جيدا لحل الخلية (3 × 106 خلية/مل) في لوحة 6-جيدا وإضافة 5 مل متوسطة دميم القاعدية المعالجون (37 درجة مئوية). احتضان اللوحة في 37 °C/5% CO2 لح 24-48 حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80%.
    4. بعد الخلايا إلى التقاء، تجاهل المتوسطة وشطف الخلايا مرتين مع دببس؛ احتضان الخلايا مع 500 ميليلتر التربسين-يدتا الحل/بئر (0.25%، س 1، سابقا ارتفعت درجة حرارة عند 37 درجة مئوية) في 37 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. ثم إلغاء تنشيط التربسين بإضافة 500 ميليلتر من FBS واسترداد الحل خلية ونقلها إلى قوارير T-75. احتضان لهم مرة أخرى في 37 °C/5% CO2 حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80%.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم الحل يدتا التربسين السفينة نمو الخلايا.
    5. كرر الخطوة السابقة للعمل مع الخلايا في سن 3-4 وهذا عندما تحتوي الخلايا على زيادة النشاط الأيضي والاستقرار.
    6. عد الخلايا باستخدام مقايسة تريبان أزرق (0.4 في المائة) لتحديد تركيز الأولية من الخلايا لتكون مختلطة مع المائية.

2-قياسات لخصائص انسيابية من الهلاميات المائية

  1. إعداد السلائف المائية الجينات/الجيلاتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.
    ملاحظة: ظروف معقمة غير مطلوبة للعينات التي تم إنشاؤها لاختبار الميكانيكية والتحليل. يتم إجراء كافة الاختبارات انسيابية في ثلاث نسخ.
  2. أخذ حقنه من السلائف المائية والاحماء في حمام مائي 37 درجة مئوية ح 1.
  3. قم بتشغيل في رهيوميتير وتهيئة نظام وفقا للخطوات التالية.
    1. قم بتشغيل ضاغط هواء متصلاً رهيوميتير واسمحوا ضاغط هواء تشغيل 30 دقيقة التبديل في مربع التحكم في درجة الحرارة رهيوميتير، قم بالتبديل في رهيوميتير نفسه، والتبديل على جهاز الكمبيوتر متصلاً رهيوميتير.
    2. فتح برنامج رهيوميتير، انقر فوق تهيئة في لوحة التحكم، والسماح لإنهاء عملية التهيئة. ضبط درجة حرارة النظام الأساسي إلى 37 درجة مئوية في لوحة التحكم.
    3. انقر فوق علامة التبويب مجموعة قياس وانتقل إلى بدء تشغيل وظيفة خدمة، حدد ضبط السائق الجمود في القائمة المنسدلة وانقر فوق بدء تشغيل التكيف في إطار منبثق.
    4. جبل مواز قياس أداة في رهيوميتير. جميع التجارب التي يؤديها هنا استخدام لوح قطرها 25 مم مع وجود فجوة 1 ملم بين اللوحات.
    5. انقر فوق تعيين صفر-الفجوة في "لوحة التحكم" والانتظار لهذا الإجراء حتى النهاية. إيلاء الاهتمام للقوة العادية أثناء هذه العملية.
      ملاحظة: بعد هذا الإجراء، يجب أن تكون القوة العادية 0.
    6. انقر فوق علامة التبويب مجموعة قياس وانتقل إلى بدء تشغيل وظيفة الخدمةوحدد قياس ضبط العلوي نظام القصور الذاتي، وانقر فوق بدء تشغيل التكيف في إطار منبثق. بمجرد القيام بذلك، انقر فوق زر مثلث في لوحة التحكم للسماح لأداة قياس لتحريك لأعلى.
  4. إجراء اكتساح سعة.
    1. انقر فوق ابدأ، ثم انقر فوق إدراج في أعلى القائمة، حدد الانتظار من القائمة المنسدلة. سحب إطار الإعداد، وتعيين وقت الانتظار إلى ح 2.
      ملاحظة: هذا سيتم إضافة خطوة انتظار قبل الاختبارات.
    2. انقر فوق ابدأ، ثم انقر فوق الزر إدراج مرة أخرى، ومن القائمة المنسدلة، حدد الجهاز. سحب ما يصل إلى إطار الإعداد، اختر درجة الحرارة، وتعيين أن تكون 25 درجة مئوية. قم بإلغاء تحديد المربع الانتظار حتى يتم الوصول إلى قيمة.
    3. انقر فوق الخطوة القياس، ثم انقر فوق المتغير سلالة التذبذب، وسحب ما يصل إلى إطار الإعداد، تعيين الشخصية أن يكون اللوغاريتم المنحدر، وتغيير القيمة إلى 0.001 في المائة و 100 في المائة كسلالة الأولية والنهائية من الضغوط، على التوالي. ضبط التردد عند 0.01 هرتز.
    4. انقر فوق الزر " إضافة " إضافة متغير درجة الحرارة . انقر فوق متغير درجة الحرارة وتعيين أن تكون 25 درجة مئوية. في إطار تبعده، توسيع الحاسبة، تعيين كثافة نقطة إلى 10 نقاط/العقد.
    5. أخذ حقنه من حمام الماء وقذف حوالي 0.5 مل السلائف إلى ساحة رهيوميتير.
    6. انقر فوق أسفل زر مثلث في لوحة التحكم. الانتظار لأداة قياس لتحريك لأسفل إلى الموضع التشذيب.
    7. استخدام ملعقة لتقليم أي سلائف الزائدة التي هربت عند الحافة أداة قياس وتجاهل مواد زائدة عن الحاجة.
    8. "الماصة؛" الزيوت المعدنية على حافة أداة قياس والانتظار حتى النفط الأختام تماما الحدود.
    9. انقر فوق متابعة في لوحة التحكم. ثم انقر فوق الزر ابدأ (المثلث الأخضر)، متبوعاً بالنقر فوق الزر متابعة في أسفل الشاشة.
    10. عندما يتم إجراء الاختبار، الإفراج عن أداة قياس ومن ثم انقر فوق أعلى زر مثلث في لوحة التحكم. إزالة أداة قياس وتنظيفه مع الإيثانول 70%. تنظيف الأساسي مع الإيثانول 70%.
    11. في المشروع الحالي، انقر فوق الخطوة القياس وسحب ما يصل إلى إطار الإعداد. الآن، تبقى مجموعة التردد إلى 100 هرتز. المعلمات الأخرى دون تغيير.
    12. كرر الخطوات 2.4.5-2.4.10.
    13. انقر فوق الرسم التخطيطي. مراقبة منحنى ز '، ز" مقابل سلالة التذبذب. البحث عن نقاط انحراف ز ' لكل الترددات (0.01 هرتز و 100 هرتز). البحث عن سلالات التذبذب المقابلة لكل انحراف من النقاط.
    14. اختر سلالة التذبذب أصغر واستخدام 1/10 من هذه السلالة لجميع الاختبارات التذبذب التي أجريت بعد ذلك.
      ملاحظة: بداية ز ' يعتبر انحراف في نهاية المطاف الخطي مطاطا سلالة (ULES) التي يجب عدم تجاوزها في اختبارات المتابعة. عادة ما يستخدم نسبة 1/10 في الهندسة لأسباب تتعلق بالسلامة. وهذا حساب يتم الرمز إلى سلالة زج.
    15. بعد الانتهاء من الاختبار، انقر فوق الجدولونسخ كافة البيانات ولصقها في ملف نصي.
  5. القيام بعملية تمشيط في درجة حرارة.
    1. انقر فوق تطبيقات بلدي وحدد القالب منحنى درجة الحرارة، والقص متذبذبة: جيليشن.
    2. اسم المشروع.
    3. انقر فوق الخطوة القياس في سير العمل. ثم انقر فوق متغير درجة الحرارةوسحب ما يصل إلى إطار الإعداد، وضبط درجة حرارة الأولية والنهائية لتكون 37 درجة مئوية و 25 درجة مئوية، على التوالي.
    4. في إطار تبعده، تعيين سلالة التذبذب إلى 0.1%، التردد التذبذب إلى 1 هرتز. قم بتعيين العدد نقاط البيانات لتكون 61. تعيين تواتر جمع البيانات إلى النقطة 1/دقيقة انقر فوق الحاسبة وتعيين نقطة الكثافة إلى 0.2 درجة مئوية/نقطة.
      ملاحظة: هذا سوف تسمح درجة الحرارة إلى تغيير بمعدل 0.2 درجة مئوية/دقيقة.
    5. تحميل العينة على منصة رهيوميتير وإجراء الاختبار باتباع الخطوات 2.4.5-2.4.10.
    6. انقر فوق الرسم التخطيطي، نلاحظ ز '، ز" مقابل درجة الحرارة. العثور على نقطة التقاطع من ز 'وز". البحث عن درجة الحرارة عند نقطة التقاطع.
      ملاحظة: هذا هو درجة حرارة التحول سول/جل من السلائف المائية.
    7. كرر الخطوة 2.4.15.
  6. إجراء اكتساح وقت متحاور.
    1. انقر فوق تطبيقات بلدي والبحث عن وانقر فوق قالب اختبار الحرارة وقت متحاور. انقر فوق الخطوة القياس في سير العمل، وثم انقر فوق المتغير سلالة التذبذب، وسحب ما يصل إلى إطار الإعداد، تعيين سلالة التذبذب إلى 0.1%، وتعيين وتيرة التذبذب إلى 1 هرتز. في إطار تبعده، تعيين عدد نقاط البيانات إلى 120. تعيين تكرار جمع البيانات إلى 1 نقطة/دقيقة.
      ملاحظة: قيمة هذه السلالة على أساس النتائج من اكتساح السعة.
    2. انقر فوق الزر " إضافة " إضافة متغير درجة الحرارة . انقر فوق متغير درجة الحرارة في الإطار الأوسط وتعيينها إلى 25 درجة مئوية.
      1. الحق انقر فوق الخطوة نقل الجهاز إلى قياس نقطة في سير العمل، انقر فوق حذف. قم بإلغاء تحديد مربع الانتظار حتى يتم الوصول إلى قيمة، ثم انقر فوق الخطوة الجهاز تعيين القيمةوتعيين القيمة إلى 25 درجة مئوية. انقر فوق الصورة، و الذرة، و أزرار في أسفل الشاشة، قم بإلغاء تحديد مربع متابعة. ثم انقر فوق الخطوة ابدأ، اسم المشروع وحفظه.
    3. تحميل العينة على منصة رهيوميتير وبدء الاختبار باتباع الخطوات 2.4.5-2.4.10.
    4. ملاحظة ز '، ز" مقابل الوقت. العثور على نقطة التقاطع من ز 'وز". العثور على الوقت عند نقطة التقاطع. بعد الانتهاء من الاختبار، انقر فوق الجدولونسخ كافة البيانات ولصقها في ملف نصي.
      ملاحظة: هذا هو وقت انتقال سول/هلام السلائف المائية عند 25 درجة مئوية.
  7. قياس قوة الغلة في مختلف الأوقات التبلور.
    1. انقر فوق تطبيقات بلدي والبحث عن وانقر فوق القالب الإجهاد الغلة والتدفق، مثل هلام. اسم المشروع. انقر فوق الخطوة بدء تشغيل سير العمل. انقر فوق إدراج في أعلى القائمة، وفي القائمة المنسدلة، حدد الانتظار. سحب إطار الإعداد، وتعيين وقت الانتظار أن يكون 20 دقيقة.
      ملاحظة: هذا سيتم إضافة خطوة انتظار قبل الاختبارات.
    2. انقر فوق ابدأ، ثم انقر فوق إدراج مرة أخرى، وفي القائمة المنسدلة، حدد الجهاز. سحب إطار الإعداد، واختيار درجة الحرارة، وتعيينها إلى 25 درجة مئوية. قم بإلغاء تحديد مربع الانتظار حتى يتم الوصول إلى قيمة.
    3. انقر فوق الخطوة القياس في سير العمل، حدد متغير إجهاد القص، سحب ما يصل إلى إطار الإعداد، وتعيين إجهاد القص الأولى والأخيرة للسلطة الفلسطينية 0 و 10 آلاف، على التوالي.  انقر فوق الحاسبة، وتعيين كثافة نقطة إلى 0.2 نقطة/السلطة الفلسطينية. في علامة التبويب نقاط البيانات على اليسار، قم بتعيين نقطة 1 في الثانية.
      ملاحظة: هذا سوف ينتج بمعدل إجهاد تكثف السلطة الفلسطينية 5/s.
    4. انقر فوق علامة التبويب التحكم الحدث في الجزء السفلي من النافذة تبعده وتعيين معيار التوقف: التوقف عن القياس إذا كان القص معدل s > 100-1.
      ملاحظة: هذا سوف تتوقف القياس إذا هي تسفر عن المواد تلقائياً.
    5. تحميل العينة على منصة رهيوميتير وبدء الاختبار باتباع الخطوات 2.4.5-2.4.10.
    6. انقر فوق الرسم التخطيطي. مراقبة منحنى الإجهاد-الإجهاد. العثور على نقطة انحراف من التوتر والإجهاد المقابلة لها. كرر الخطوات 2.7.2-2.7.6، ولكن تغيير وقت الانتظار إلى 30 و 40 و 50 دقيقة لكل تكرار؛ وهذا سيؤدي إلى مقاومة الخضوع في أوقات مختلفة في التبلور.
      ملاحظة: يعتبر هذا الإجهاد لمقاومة الخضوع الظاهر.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف البرامج من النقرات بنماذج رهيوميتير وإصدارات البرامج. نوصي للقراء أن تأخذ مرجع المعلمات الاختبار نقدم، بينما تشير إلى دليل رهيوميتير/برامج معينة في الاستخدام العملي.
       

3-سقالة التصميم والمائية المحملة بالخلية، ونماذج 3D الطباعة

  1. تصميم سقالة
    1. رسم نموذج مثل المروحة على الورق.
      ملاحظة: تم تصميم الطراز مثل المروحة استناداً إلى الاعتبارات التالية: (أ) أنه يحاكي في فيفو السيناريو حيث الخلايا السرطانية هي محاطة اجواءه؛ (ب) أنه يقلل تركيز الإجهاد عن طريق استخدام الهندسيات التعميم؛ (ج) مرنة حيث أن المزيد من القطاعات يمكن إضافتها إلى النموذج في المستقبل دون تغيير هندستها الحالية؛ ومن (د) شقة في نطاقها الرأسي لتيسير نشر العناصر المغذية.
    2. السماح لمركز المروحة تكون الأصل واستخدام الرموز R0، ص1 وص2 لتمثل أقصى نصف قطر الدائرة الداخلية والقطاع الأوسط، والقطاع الخارجي، على التوالي. استخدام رموز m و n تمثل عدد الأقواس الداخلية وأشعة داخل منطقة القطاع، على التوالي.
    3. حساب إحداثيات كل عقده على نموذج يشبه المروحة وكتابتها في تعبيرات رمزية R0، ص1، ص2، mو ن.
    4. بدء تشغيل البرنامج نصي برنامج وتعيين R0، ص1، ص2، م، و ن كمتغيرات وإدخال تعبير رمزي لكل عقده رئيسية.
      ملاحظة: تشير إلى الجدول للمواد اللازمة لأي معلومات البرامج.
    5. ترتيب طريق الذي يربط بين العقد وتعيين خرطوشة للدائرة الداخلية والقطاعين الأوسط والقطاعات الخارجية. تعيين سمك طبقة 150 ميكرومتر وعدد الطبقات إلى 4.
    6. واسمحوا برنامج إخراج ملف نص في تنسيق ز-الرمز الذي يمكن التعرف عليه قبل بيوبرينتير.
    7. تعيين R0 = 3.85، ص1 = 6.85، ص2 = 8.65، m = 2 و n = 5. تشغيل البرنامج النصي واسترداد الملف ز-التعليمات البرمجية الذي تم إنشاؤه. نسخ ولصق الملف إلى المجلد ز-مدونة مكرسة بيوبرينتير.
    8. قم بتشغيل في بيوبرينتير وبه برنامج حاسوبي لمراقبة. تهيئة الطابعة. فتح ز-رمز البرنامج النصي فقط التي تم إنشاؤها وتعيين جميع الضغوط إلى الصفر. العودة إلى برنامج السيطرة وانقر فوق علامة التبويب مولد سكافولدير، ومن ثم انقر فوق الزر تشغيل الموجود في الركن السفلي الأيمن. مراقبة نقل مسار الطابعة.
      ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى اختبار دقة ز-التعليمات البرمجية المنشأة. الرجوع إلى الجدول للمواد للحصول على المعلومات ذات الصلة بيوبرينتير.
    9. هذه الخطوة اختيارية. بناء نموذج ثلاثي الأبعاد تتضح استناداً إلى المعلمات أعلاه عن طريق برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
      ملاحظة: تشير إلى الجدول للمواد اللازمة لمعلومات البرامج البائع.
  2. جعل محملة بخلية سليفة المائية A3G7
    ملاحظة: يجب إجراء الخطوات المذكورة في هذا القسم تحت ظروف معقمة. الحفاظ بيوبرينتير داخل BSC.
    1. تعقيم في بيوبرينتير بالرش الإيثانول 70% دقيق ويعرضها للأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
    2. أخذ حقنه من السلائف المائية (عند 4 درجة مئوية) والحارة أنه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ح 1.
    3. T-قارورة مع الخلايا (راجع الخطوة 1، 3) من أول أكسيد الكربون2 حاضنة ووضعه داخل BSC. تجاهل المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا مع دببس مرتين. إضافة حل يدتا التربسين المعالجون (3.0 مل) واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 6 إيناكتيفاتي التربسين بنفس حجم FBS. عد الخلايا باستخدام مقايسة تريبان الأزرق.
    4. أخذ حقنه السلائف المائية من حمام الماء وتنظيفه، وتعقيم أنه مع الإيثانول 70%. وضع المحاقن درجة البكالوريوس.
    5. قذف حوالي 3 مل سلائف المائية إلى خرطوشة طباعة 10 مل. مزيج السلائف مع خلايا جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء في 1 × 106 خلايا/مل ببطء بيبيتينج، تجنب إنتاج الفقاعات. تغطية الخرطوشة مع نهاية عقيمة وأغطية رأس وختم ذلك مع الفيلم البارافين. الطرد المركزي أنه في 834 ز x لمدة 1 دقيقة لإزالة أي فقاعات الغاز المنتجة.
    6. كرر الخطوات 3.2.3-3.2.5 للسلائف الخلية لادن معدل وفيات الرضع-90-مشري والسلائف الخلية الحرة.
    7. تعقيم جميع خراطيش 3 مع الإيثانول 70% وثم تحميلها على دوائر بيوبرينتير. في برامج التحكم الخاصة بالطابعة، تعيين خرطوشة درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية. انتظر 35 دقيقة للسماح تمهيدا للتوصل إلى شروط للطباعة.
      ملاحظة: لا يؤثر هذا الوقت صلاحية الخلايا المضمنة في المائية.
  3. نماذج الطباعة ثلاثية الأبعاد
    1. في برامج التحكم الخاصة بالطابعة، توسيع علامة التبويب رأس الأداة في برامج التحكم الخاصة بالطابعة، انقر فوق 1 خرطوشة في الواجهة الرسومية على الجانب الأيسر، وثم انقر فوق الزر تدبير قصير لقياس موقف طرف فوهة. كرر هذه العملية الخراطيش 2 الأخرى.
    2. ضع ميكروسكوبية البوليستيرين واضحة وفتح ملف التعليمات البرمجية ز، وتغيير الضغط إلى 200 الجيش الشعبي الكوري لجميع خراطيش. العودة إلى برامج التحكم وانقر فوق علامة التبويب مولد سكافولدير، تحديد نقطة للبدء في الطباعة، وثم انقر فوق الزر تشغيل الموجود في الركن السفلي الأيمن. كرر هذه الخطوة للحصول على 3 replicates أكثر.
    3. بعد طباعة replicates جميع النماذج المروحة، إضافة 100 مم كاكل2 الحل تشابك هذه النماذج لمدة 1 دقيقة وشطف من x 2 مع دببس لإزالة فائض أيونات Ca++ .
    4. نقل النماذج على لوح 6-جيدا [اغروس] المغلفة استخدام ملعقة بعناية. إضافة 5 مل من دميم وسائل الإعلام لكل بئر. احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
      ملاحظة: تأكد من النماذج التي تطفو في الآبار.
    5. استبدال مستنبت الخلية مع متوسطة جديدة كل 3 أيام، والثقافة أنه لمدة 30 يوما في المجموع.

4-استمرارية وكروي تشكيل تجارب على الأقراص المائية.

  1. إعداد القرص المائية
    1. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.6.
      ملاحظة: من الممكن استبدال الخرطوشة مع حاوية معقمة صغيرة.
    2. استخدام المحاقن معقمة تخرج 1 مل وقص الفوهة لإنشاء حفرة كبيرة في المحاقن (الثقب له نفس القطر كبقية الأنبوب المحاقن). تنظيف مع الإيثانول 70% وأتركها حتى تصبح جافة.
      ملاحظة: القيام بذلك في BSC عقيمة.
    3. استخدام غطاء لوحة جيدا، وإضافة 100 مم كاكل2 حتى يتم تغطية السطح؛ بعد ذلك، تأخذ المائية المحملة بخلية لملء المحاقن؛ بثق 100 ميليلتر المعلقة باستخدام إسقاط الأسلوب. اترك المائية لمدة 1 دقيقة وشطف أنه مع دببس المفرطة. نقل الأقراص المائية على صفيحة 6-جيدا-[اغروس] المغلفة وإضافة 5 مل دميم القاعدية، واحتضان لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة تصل إلى 30 يوما. تحديث كل 3 أيام في المتوسط.
  2. سلامة الخلية وكروي
    1. استخدام فحص النظام التجاري المتعدد الأطراف لتحديد جدوى الخلية. تغسل كل قرص مع دببس ومقطعة 4 أجزاء بشفرة معقمة غرامة. جمع أجزاء القرص كله ونقلها إلى لوحة 96-جيدا. ثم إضافة 100 ميكروليتر من دميم بالإضافة إلى 20 ميكروليتر من النظام التجاري المتعدد الأطراف المتفاعلة لكل بئر واحتضان المخلوط في 37 درجة مئوية ح 2.
    2. بعد رد فعل النظام التجاري المتعدد الأطراف، استعادة المادة طافية ونقلها إلى لوحة نظيف 96-جيدا. قياس امتصاص عينات في 490 نانومتر.
  3. تشكيل كروي
    1. إخراج نموذج المروحة أو القرص المحتضنة من الحاضنات في الأيام 0، 7، 15، 21، و 30 من الثقافة ونقلها إلى لوحة نظيفة 6-جيدا.
    2. استخدام مجهر المقلوب قرص غزل [كنفوكل] إلى تصور الماغنيسيوم والحصول الصور باستخدام عدة مواقف ومداخن z. الصورة كل المروحة، أو طراز القرص، على طول قطرها الأفقي من اليسار إلى اليمين مع وجود فجوة 500 ميكرومتر واكتساب z-كومة من الأسفل إلى أعلى المستوى البؤري في كل موضع أفقي.
      ملاحظة: تشير إلى الجدول للمواد اللازمة لمعلومات المورد.
    3. إعادة إنشاء الصورة باستخدام أداة حسابية مكدس الحد أقصى، المقدمة من البرنامج إيماجيج، لإنشاء الصور ثنائية الأبعاد المستخدمة لتحليل كروي.

5-فحص المجهر الإلكتروني (SEM)

  1. إعداد الجينات/الجيلاتين المائية كما هو موضح في الخطوة 1.2.
    ملاحظة: ظروف معقمة غير مطلوبة.
    تنبيه: النتروجين السائل وبارافورمالدهيد خطيرة ويجب التعامل معها بحذر.
  2. وضع 1 مل المائية في قذيفة هاون وإضافة النيتروجين السائل، وطحن باستخدام مدقة. استمر في إضافة النيتروجين السائل لتجنب المائية من إزالة الجليد. نقل المسحوق في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل، ختم، وتخزينها في-80 درجة مئوية ل 2 حاء فريزيدري العينة ح 24.
  3. لتصوير كروي، يغسل المائية برفق مع دببس 2 x، إصلاح الخلايا بالانغماس في بارافورمالدهيد 4% لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ومن ثم شطف لهم مع دببس وتجميدها بالنيتروجين السائل. وأخيراً، فريزيدري العينة ح 24.
  4. تحليل هيكل المائية/كروي ومورفولوجيا مع المسح الإلكتروني المجهري (SEM) في 25.0 كيلو فولت، 70 تحت السلطة الفلسطينية (دائرة الضغط) مع بير 40 × يصل إلى 5، 000 X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

اكتساح درجة الحرارة يظهر فرقا متميزة من السلائف A3G7 في 25 درجة مئوية و 37 درجة مئوية. السلف هو سائل عند 37 درجة مئوية ولزوجته معقدة 1938.1 الآلام والكروب الذهنية ± 84.0 x s، والذي تم التحقق من صحته من a G أكبر "عبر ز'. كما انخفضت درجة الحرارة، يخضع السلائف جيليشن المادية بسبب تشابك المادية عفوية من جزيئات الجيلاتين إلى29،تشكيل ثلاثي-الحلزون30. كلا G 'و ز"زيادة وتتلاقى عند 30.6 درجة مئوية، مما يشير إلى انتقال سول-جيل. بواقي سيستمر في الزيادة، مع انخفاض درجة الحرارة، والتوصل إلى 468.5 ± 34.2 "السلطة الفلسطينية ز" 'و 140.7 ± 9.3 السلطة الفلسطينية ز"عند 25 درجة مئوية (الشكل 1a). استناداً إلى نتائج اكتساح درجة الحرارة، اخترنا 25 درجة مئوية كدرجة حرارة الطباعة. يحاكي التجربة الحركية جيليشن تغير درجات الحرارة الذي يحدث أثناء إعداد العينة والمناولة (أيإزالة العينة من 37 درجة مئوية ماء الحمام ووضعه في قاعة بيوبرينتير 25 درجة مئوية). ز '، ز"، و | η * | زيادة مع مرور الوقت في انخفاض درجة الحرارة، ويحدث التحول سول-جل في ~ 17 دقيقة عند 25 درجة مئوية، عند ز 'ز ≈"≈ 64.3 السلطة الفلسطينية وعامل الخسارة يساوي 1 (الشكل 1 باء و جيم 1). وتواصل تشديد السلائف وتصل إلى نافذة طباعة بعد 50-90 دقيقة من جيليشن. ضمن هذا الإطار الطباعة، السلف يمكن بسلاسة مقذوف باستخدام فوهة G25 أسطواني مع ضغط 200 كيلو باسكال. وجود الإجهاد الغلة يعني سلوكاً الصلبة الشبيهة المواد ويثير السلامة الهيكلية بعد البثق لتحمل لها وزن31. تسلم منحنى الإجهاد الإجهاد الغلة في أوقات مختلفة جيليشن. وتبين النتائج أن الإجهاد العائد يزيد مع زيادة الوقت جيليشن. 50 دقيقة من جيلاتيون، يصل الضغط العائد إلى 325.9 السلطة الفلسطينية، مؤكدا أن هذا النموذج مستقرة بعد قذف.

ويبين الشكل 2 ألفالنموذج المطبوع المروحة. ويؤكد مجهرية [كنفوكل] مواقع قذف الأولى جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231-التجارة والنقل ومعدل وفيات الرضع-90-مشري الخلايا (الشكل 2). جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء الخلايا يبدأ بوضع الماغنيسيوم 15 يوما في فترة الثقافة، تليها الزيادة في حجم وعدد من الماغنيسيوم حتى يوم 30 (الشكل 2 ج - 2 واو). وتشكل بعض الخلايا معدل وفيات الرضع-90-مشري أيضا التجمعات (الشكل 2 ز - 2j). ملحوظ، بعد 30 يوما ثقافة، ومعدل وفيات الرضع-90-مشري الخلايا لوحظت في المنطقة المحتلة في البداية بالخلايا جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء (الشكل 2 واو)، مما يعني أحداث الهجرة الممكنة في النموذج. وبالمثل، يمكن أيضا ملاحظة تم ترحيلها-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء الخلايا في المنطقة معدل وفيات الرضع-90-مشري تهيمن في يوم 30 (الرقم 2j).

ويبين الشكل 3 ألفطراز القرص. ويؤكد مجهرية [كنفوكل] توزيع الخلية متجانسة داخل القرص (الشكل 3b). جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء الخلايا تتصرف بشكل مشابه في طراز القرص كما فعلوا عند طباعتها كنموذج مروحة. يتم عرض الصور الممثل في الشكل 3 جيم - 3f. ويكشف تصوير SEM المائية كروي لادن-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء بعد 21 يوما ثقافة (الشكل 4 أ). يتم التحقق من صحة الجيل، والوجود، كروي بمقارنة الصور وزارة شؤون المرأة مع الخلية الحرة الهلاميات المائية (الشكل 4 باء).

ويتجلى صلاحية خلية لكل أنواع الخلايا في الشكل 4 ج. جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء الخلايا express بقاء خلية أعلى مقارنة بمعدل وفيات الرضع-90-مشري الخلايا. من المثير للاهتمام، تظهر الخلايا جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء اتجاها زيادة الصلاحية قبل يوم 15، مع ثلاثة إضعاف من عدد خلايا قابلة للحياة بالمقارنة مع اليوم 0. ويعقب هذا نقصانا في يوم 21، قبل أن ينتعش مرة أخرى في يوم 30. وفي المقابل، قد الخلايا معدل وفيات الرضع-90-مشري تقلبات ضئيلة في بقاء خلال كامل فترة الثقافة. تتوافق مع قيم متناقصة في جدوى الخلايا جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء في يوم 21 إلى تشكيل متكس كبيرة، التي طورت النوى نخرية.

Figure 1
رقم 1: توصيف انسيابية للسلائف هيدروجيل. () باكتساح درجة الحرارة يظهر الانتقال سول-جل في 30.6 درجة مئوية. (ب-ج) حركية جيليشن من السلائف A3G7 يظهر زيادة قدرها ز '، ز"، و | η*| في الوقت جيليشن، وسول-الهلام يحدث الانتقال إلى حوالي 17 دقيقة عند 25 درجة مئوية. (د) يظهر هذا الفريق الضغط العائد من السلائف مقابل وقت جيليشن. ويلاحظ زيادة الغلة الإجهاد مع وقتاً أطول من التبلور. يتم إظهار النتائج في يعني ± التنمية المستدامة، n≥ 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: MCTS تكوين داخل نموذج المختبر في بيوبرينتيد ثلاثية الأبعاد تتكون من معدل وفيات الرضع-90-مشري أرومية وخلايا سرطان الثدي-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء- () هذه الصور تظهر بيوبرينتيد العينة في المختبر (يسار) ونموذج CAD (يمين). (ب) يظهر هذه الصورة الوقت الفاصل بين [كنفوكل] الممثل جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231-التجارة والنقل (الأخضر) ومعدل وفيات الرضع-90-مشري (أحمر) خلايا بيوبرينتيد داخل النموذج. (ج - f) هذه التكبير الإضافية إظهار المناطق الخلية-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء (مربعات منقطة أبيض). (غ - ي) هذه الوظائف الإضافية التكبير تظهر المناطق الخلية معدل وفيات الرضع-90-متشيري (مربعات منقطة أصفر). أشرطة مقياس 2 مم في الفريق 2 ألفو 1 مم في لوحة 2b500 ميكرومتر في لوحات ج 2 - 2j لمناطق مختارة، والتكبير هو 10 X. يعني رأس المال "د" في الصور "أيام للثقافة". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تشكيل المراكز داخل قرص 3D المائية جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-التجارة والنقل-آدن- () تظهر هذه الصورة قرص المائية. (ب) تظهر هذه الصورة [كنفوكل] الممثل-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء الخلايا المضمنة في المركب. (ج-f) إظهار هذه الوظائف الإضافية التكبير منطقة الخلية-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء (المربع المنقط أبيض في لوحة 3b) في (ج) 0، (د) 7، (ه) 15، و (و) 21 يوما للثقافة. أشرطة مقياس 2 مم في لوحة 3aو 1 مم في لوحة 3b500 ميكرومتر في لوحات ج 3 - 3f لمناطق مختارة، والتكبير هو 10 X. يعني رأس المال "د" في الصور "أيام للثقافة". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: جدوى خلية ومورفولوجيا متكس. () الصورة SEM هذا يظهر "المراكز"-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء داخل الجل بعد 21 يوما ثقافة، وعرض المراكز الصغيرة (يشير السهم). (ب) "وزارة شؤون المرأة هذه" الصورة يظهر المائية الجينات/جيلاتين دون خلايا. التكبير هو 350 X. (ج) يظهر هذا الفريق بقاء الخلية-جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء ومعدل وفيات الرضع-90-مشري خلال 30 يوما ثقافة داخل المائية. حللت ك ± يعني SD النتائج وتحليلها إحصائيا باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه واختبار بونفيروني بعد. ف (*) < 0.05، n ≥ 3. وكان تطبيع البيانات إلى كثافة الخلايا المستخدمة لإنشاء النماذج في اليوم 0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن أن يثير الشبهة هياكل محملة بخلية في حالة حدوث تلوث (بيولوجية أو كيميائية) في أي نقطة في هذه العملية. عادة، ويعتبر التلوث البيولوجي بعد سنتين أو ثلاثة أيام ثقافة كلون تغيير في ثقافة وسائل الإعلام أو بنية بيوبرينتيد. ولذلك، عملية التعقيم (تعقيم الفيزيائية والكيميائية) خطوة أساسية لجميع العمليات المتصلة بالخلية. الجدير بالذكر، الجيلاتين التعقيم تغيير خصائصه التبلور، التي جعلت جل أبطأ في المحاكمات التي أجريناها. ولذلك، نحن تعقيمها الجينات والجيلاتين السلطة عن طريق الأشعة فوق البنفسجية التعرض. بسبب القدرة على اختراق محدودة جداً للأشعة فوق البنفسجية، ينبغي أن تستخدم طبقة رقيقة جداً (< 0.5 مم). يمكن تغيير تركيز الجينات والجيلاتين تعسفاً لضبط الخصائص الميكانيكية والبيولوجية32. في هذا العمل، اخترنا A3G7، لأنه يوفر برينتابيليتي المرغوب فيه خلال نافذتها الطباعة، والمائية كروسلينكيد يوفر استقرار عالية من خلال التجربة 30 يوما. التدفئة إلى 60 درجة مئوية بينما تذويب مسحوق في دببس يساعد على تعزيز ليكويفيكيشن الجيلاتين، الذي يخفف التحريك. يمكن أن تستخدم أيضا في انخفاض درجة حرارة؛ ومع ذلك، ثم سيكون المطلوبة وقتاً أطول من إثارة.

اكتساح انسيابية درجة الحرارة يعطي نقطة سول-جل في 30.6 درجة مئوية، ومتوافق مع المنشورات الأخرى33. من الناحية النظرية، يمكن أن تسيل أي درجة حرارة أعلى من 30.6 درجة مئوية السلائف. لقد اخترنا 37 درجة مئوية تبسيط العمل، كما مستنبت الخلية المعالجون مسبقاً في حمام مائي 37 درجة مئوية. استناداً إلى حركية جيليشن (قبل الجل السلائف)، هناك حوالي 17 دقيقة لخلط الخلية؛ بعد هذا الوقت، خلط الخلايا والسلائف المائية أمر صعب نظراً لزيادة اللزوجة وبواقى، مما تسبب في بيوينك محملة بالخلية غير متجانسة. ولذلك، فإننا نقترح معالجة عمل خلط الخلية ضمن أول 10 دقيقة من التبلور. لا يعتبر الضغط الغلة تكون سمة مادية التي تؤثر على برينتابيليتي حتى الآونة الأخيرة34؛ بغض النظر، فإنه قد على نطاق واسع اعترفت بالعلماء البوليمر كعلامة ل السوائل إستي/الحبيبية31،35،،من3637. وجود الإجهاد الغلة يساعد على بناء سلامة هيكلية لتحمل الوزن الخاصة به. يمكن أن تتطلب التأكيد عالية غلة أيضا بدء زيادة ضغط في قذف؛ وهكذا، قد ينتج الضرر للخلايا بسبب الإجهاد المفرط القص32. يمكن أن يثير الشبهة الدقة النموذجي في حالة حدوث عملية قذف خارج الإطار الطباعة المثلى. وتظهر مؤشرات مشتركة لهذه المشكلة في هيكل بيوبرينتيد النهائي: فإما أن خشنة للغاية أو سائلة جداً عند الحواف. السلائف A3G7 المعارض نافذة طباعة مثلى خلال 50-90 دقيقة من التبلور التي تستوفي الاستقرار الهيكلي وبقاء الخلية، ويمكن استخدامها كوسيلة لبناء ورم غير متجانسة نماذج14.

ارتفاع إجمالي طراز المروحة 600 ميكرون كما أنها ولدت من أربع طبقات 150 ميكرومتر خيوط. يسمح هذا التصميم للمغذيات وغاز تبادل كما في معظم الخلايا 300 ميكرون من سطح الاتصال بوسائط الإعلام أثناء الاحتضان. أعلى نماذج قابلة للتحقيق في التلفيق ولكن هي اختنقت بالمسافة نشر محدودة من المواد الغذائية في38المائية التي يمكن أن تؤدي بقاء خلية منخفضة في المنطقة الأساسية.

قد وضعت استراتيجيات مختلفة للنموذج MCTS في المختبر، مثل انخفاض شنقاً، موائع جزيئية رقاقة والجمعية بيوبرينتينج39. ومع ذلك، يمكن أن تغير بعض هذه المنهجيات خلية علم وظائف الأعضاء والكيمياء الحيوية وتوليد الخلية مختلف السلوكيات التي تحدث في أنسجة الورم العادي. على سبيل المثال، إسقاط معلقة أسلوب واحد قوات الخلايا على البقاء كمجاميع الخلية عن طريق الولادة المادية40. أيضا، يمكن أن يغير التعريفي الكيميائية للنموذج MCTS بإضافة ببتيد الكيمياء الحيوية من الماغنيسيوم41. مركب هيدروجيل الموصوفة هنا يسمح تشكيل المراكز عن طريق تهيئة بيئة المحاكاة البيولوجية دون الضغوطات الخارجية. بدأت كخلايا مفردة جيدا مشتتة، بعد سبعة أيام ثقافات، وتنظيم الخلايا كالمراكز الصغيرة (أكثر من 6 خلايا كل كروي)، زيادة حجمها والكمية خلال 30 يوما ثقافة.

في نتائج هذا البحث، وجدنا أن الماغنيسيوم جمعية نجمة داود الحمراء ميغابايت-231-بروتينات فلورية خضراء إنقاص صلاحية خلية في يوم 21، ربط هذه الظاهرة مع تشكيل الماغنيسيوم كبيرة. ورم صلب يتكون من ثلاث طبقات مختلفة، حيث يعرض الطبقة الخارجية بمعدل انتشار عالية بالمقارنة مع الطبقة الوسطى والداخلية نخرية أو مسن جوهر كروي18. وهذا يمكن أن يفسر انخفاض صلاحية النتائج.

هذه القيود المفروضة على هذا البروتوكول هي ديناميات (1) بيوينك و (2) خلية نوع التوافق. بيوينك ديناميات تشير إلى خصائص المواد المختلفة أثناء عملية جيليشن، الناشئة في إطار طباعة مثلى بعدها هيكل المطبوع عيب. توافق نوع الخلية يشير إلى عجز بعض أنواع الخلايا (خط الخلية أو الثقافة الأولية) يحمل سلوك أصلي في فيفو .

المائية A3G7 يحقق استمرارية الاستقرار وخلية عالية. يمكن استخدام بيوبرينتينج ثلاثية الأبعاد لبناء نماذج 3D المرض غير متجانسة مع إمكانية تكرار نتائج الفائق ومنخفضة التكلفة وعالية كبديل أكثر واقعية لزراعة الخلايا التقليدية ونماذج الورم الحيوانات الصغيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

جيانغ تاو يشكر مجلس المنح الدراسية الصيني (201403170354) وجائزة الدكتوراه هندسة ماكغيل (90025) لتمويل المنح الدراسية هذه. شكرا خوسيه زاي مونجويا لوبيز مبرزين (250279 و 290936 و 291168) وفرقنت (258421) لتمويل المنح الدراسية هذه. شكرا سلفادور فلوريس-توريس مبرزين للمنح الدراسية تمويل (751540). جوزيف م. Kinsella بفضل العلم الوطني ومجلس البحوث الهندسية، والمؤسسة الكندية للابتكار، ومؤسسة الأسرة امار توونشند، وجامعة ماكغيل لتمويلها. نود أن نشكر اهرليتشير الين على السماح لنا باستخدام له رهيوميتير، دان نيكولاو على السماح لنا باستخدام مجهر [كنفوكل]، وبارك موراغ لمنح لنا الوصول إلى خطوط الخلايا المسماة فلوريسسينتلي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1 (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , Wiley-Interscience. Hoboken, NJ. (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. Fluidity and plasticity. , McGraw-Hill. New York, NY. (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، 137 قضية، بيوبرينتينج 3D، والمائية، والخلايا السرطانية، الماغنيسيوم الورم، الجينات، والجيلاتين
بيوبرينتابل الجينات/الجيلاتين المائية 3D <em>في المختبر</em> النموذجي النظم الحث على تشكيل خلية كروي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, T., Munguia-Lopez, J.,… More

Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter