Summary
En vrac gene expression mesures nuage cellule individuelle différences dans les populations de cellules hétérogènes. Nous décrivons ici un protocole pour analyse de l’expression génique et l’index Comment unicellulaires Tri par Florescence activé cellule Tri (FACS) peut être combiné pour délimiter l’hétérogénéité et immunophenotypically caractériser les populations cellulaires moléculairement distinctes.
Abstract
Immunophénotypiques caractérisation et analyse moléculaire ont longtemps servis à délimiter l’hétérogénéité et de définir les populations cellulaires distincts. FACS est en soi un dosage unicellulaires, toutefois avant l’analyse moléculaire, les cellules cibles sont souvent prospectivement isolées en vrac, perdant ainsi la résolution unicellulaire. Analyse de l’expression génique de la cellule unique fournit un moyen de comprendre les différences moléculaires entre les cellules individuelles dans les populations de cellules hétérogènes. Dans l’analyse de cellules en vrac une surreprésentation d’un type de cellules distinctes donne les préjugés et les occlusions des signaux des cellules rares avec importance biologique. En utilisant FACS indice tri couplé à l’analyse de l’expression génique de la cellule unique, les populations peuvent être étudiées sans la perte de résolution unicellulaire, tandis que les cellules avec l’expression de marqueurs de surface de cellules intermédiaires sont également capturés, permettant l’évaluation de la pertinence de l’expression du marqueur de surface continue. Nous décrivons ici une approche qui combine monocellulaires transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) et FACS index tri afin de caractériser simultanément le moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité au sein de populations de cellules.
Contrairement aux méthodes de séquençage de l’ARN unicellulaire, l’utilisation de qPCR avec l’amplification de la cible spécifique permet des mesures robustes des transcriptions de faible abondance avec moins d’abandons, alors qu’il n’est pas confondue par les questions liées aux variations de cellule-à lire profondeur. En outre, par directement tri indice unique-cellules en lysis buffer cette méthode, permet pour la synthèse de cDNA et préamplification cible spécifique à effectuer en une seule étape, aussi bien en ce qui concerne la corrélation des signatures moléculaires dérivés par la suite avec la surface de la cellule expression du marqueur. L’approche décrite a été développé pour enquêter sur le single-cellules hématopoïétiques, mais ont aussi été utilisées avec succès sur d’autres types de cellules.
En conclusion, l’approche décrite ci-après permet de mesurer sensible d’expression de l’ARNm pour un groupe de gènes présélectionnés avec la possibilité d’élaborer des protocoles d’isolement éventuels ultérieur de sous-populations moléculairement distinctes.
Introduction
Chaque cellule individuelle de sang est censé résider dans une hiérarchie cellulaire, où les cellules souches forment l’apex au sommet d’une série de plus en plus engagés progéniteurs intermédiaires qui différencient finalement en phase terminale dans les cellules effectrices final porteurs spécifiques fonctions biologiques1. Une grande partie de la connaissance au sujet de comment sont organisés les systèmes de cellules souches a été générée dans le système hématopoïétique, principalement en raison de la capacité d’isoler prospectivement des populations distinctes de hématopoïétiques hautement enrichies pour les cellules souches ou cellules souches diverses2 par un tri de FACS. Cela a permis à bon nombre de ces populations à analyser sur le plan fonctionnel ou moléculairement, principalement à travers l’expression de gènes3,4. Toutefois lorsque analyser l’expression des gènes de la majeure partie des populations des différences individuelles entre les cellules sont en moyenne et perdu5. Ainsi, l’incapacité à détecter les variations de la cellule-cellule au sein des fractions cellulaires hétérogènes peut-être entraîner notre compréhension des processus biologiques critiques si petits sous-ensembles des cellules responsables de la fonction biologique inférée de cette population6, 7. À l’inverse, enquête des signatures d’expression génique à cellule unique résolution offrent une possibilité de délimiter l’hétérogénéité et contourner les influences éclipsa surreprésentés sous-ensembles de cellules8.
À ce jour de nombreux protocoles pour l’analyse de l’expression génique de la cellule unique ont été développées ; avec chaque approche ayant ses propres réserves. La première méthode était RNA Fluorescent in situ hybridation (RNA-poisson), qui mesure un nombre limité de relevés de notes à la fois, mais est unique parce qu’elle permet pour enquête de RNA localization9,11. Méthodes précoces à l’aide de la PCR et qPCR pour détecter qu'un seul ou quelques transcriptions ont été également mis au point12. Cependant, ils ont dernièrement été remplacés par des méthodes axées sur la microfluidique qui peuvent analyser simultanément l’expression de centaines de transcriptions par cellule chez des centaines de cellules par l’intermédiaire de qPCR et ainsi permettre d’hétérogénéité de grande dimension à l’aide de l’analyse prédéterminé gène panneaux10,13. Récemment technologies basées sur le séquençage de RNA ont devenu employé couramment pour analyse unicellulaires, puisque ceux-ci peuvent théoriquement mesurer le transcriptome entier d’une cellule et ainsi ajouter une dimension exploratoire à l’hétérogénéité analyse10, 14. multiplexé qPCR analyse et le séquençage de RNA unicellulaires ont des caractéristiques différentes, la justification de l’utilisation de méthodes dépend donc de la question posée ainsi que le nombre de cellules dans la population cible. Le haut débit et à faible coût par cellule ainsi que des caractéristiques non biaisées, exploratoires du séquençage de RNA unicellulaires sont souhaitables lorsque cellule inconnue ou grandes populations ont été étudiées. Cependant, séquençage RNA unicellulaire est également biaisé en faveur de séquençage hautes transcriptions abondantes plus fréquemment tandis que les relevés de notes peu abondantes sont sujettes aux décrocheurs. Cela peut conduire à des données beaucoup complexes qui met haute-exigences sur l’analyse bioinformatique pour révéler les signaux moléculaires importants qui sont souvent subtiles ou masqués en bruit technique15. Ainsi, pour tissus bien caractérisés, monocellulaires qPCR analyse utilisant prédéterminé panneaux amorces sélectionnées pour fonctionnellement importants gènes ou marqueurs moléculaires peut servir d’une approche sensible, simple pour déterminer l’hétérogénéité d’un population. Toutefois, il est à noter que par rapport à cellule unique RNA-seq, le coût par cellule est généralement plus élevé pour les méthodes qPCR unicellulaires. Nous décrivons ici une approche qui combine single-cell RT-qPCR (modifié d’après J. Teles et al. ( 16), à l’index de FACS tri simultanément les17 et bioinformatique analyse18 afin de caractériser l’hétérogénéité moléculaire et immunophénotypiques au sein des populations.
Dans cette approche, la population de cellules d’intérêt est tachée et single-cellules sont triés par FACS directement dans le tampon de lyse en plaques PCR 96 puits. Simultanément, les niveaux d’expression d’un ensemble de marqueurs de surface cellulaire supplémentaires sont comptabilisés pour chaque cellule unique pendant FACS-tri, une méthode qui est appelée indice de tri. Le matériau à cellules lysées est amplifié par la suite et l’expression de gène d’un ensemble sélectionné de gènes analysés avec la RT-qPCR, utilisant une plate-forme microfluidique. Cette stratégie permet une analyse moléculaire de la caractérisation de cellule unique mais aussi simultanée triée d’expression de marqueurs de surface cellulaire de chaque cellule individuelle. En mappant directement des sous-ensembles moléculairement distinctes des cellules à l’expression des marqueurs triés indexées, les sous-populations peuvent être liées à une immunophenotype spécifique qui peut être utilisé pour leur isolement éventuels. La méthode est décrite étape par étape dans la Figure 1. Outre une Comité pré-déterminé gène contribue à une résolution plus élevée de l’expression du gène ciblé, car il contourne la mesure de non pertinents gènes abondantes qui peuvent autrement occlure des signaux d’expression génique subtile. De plus, l’amplification de la cible spécifique, transcription inverse une étape et amplification permet de mesurer robuste de faibles transcriptions exprimées, comme des facteurs de transcription ou non-poly-adenylated ARN. Ce qui est important, les méthodes de qPCR permettent pour la mesure des ARNm des protéines de fusion, qui sont importants dans les enquêtes sur certaines maladies malignes19. Enfin, le nombre ciblé des gènes étudiés, faibles taux d’abandon, et limité les différences techniques entre les cellules font cette méthode facilement analysée par rapport aux méthodes dimensionnelles plus élevées, comme unicellulaires RNA-Seq. En suivant le protocole, une expérience entière peut être effectuée, du tri des cellules aux résultats analysés, dans les trois jours, ce qui en fait une méthode simple et rapide pour l’analyse d’expression génique de cellules individuelles sensibles et à haut débit.
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Protocol
1. préparation des plaques de lyse
- À l’aide d’un banc libre ARN/ADN, préparer suffisamment tampon de lyse à 96 puits, avec 10 % de bonus, en mélangeant l’eau libre nucléase µL 390, 17 µL de 10 % NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT et inhibiteur de RNAse 5,3 µL (voir Table des matières). Vortex et la centrifuger.
- Distribuer 4 µL de tampon de lyse dans chaque puits d’une plaque de PCR 96 puits et les plaques avec du film adhésif d’étanchéité. Tournez en bas tubes pour recueillir le liquide au fond des assiettes. Conservez les plaques sur la glace jusqu'à cellule Tri (maximum 24h).
2. préparation des cellules pour le tri des cellules
- Décongeler le nombre approprié de cellules (ici, CD34 enrichi souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices) pour l’expérience. 1 x 106 cellules ne conviennent pas pour le tri environ trois plaques à 96 puits de single-cellules avec des contrôles.
- Transfert de cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1 mL FBS toutes les 30 s jusqu'à ce que soit atteint un volume total de 8 mL. Tourner les cellules dans une centrifugeuse à 350 x g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules en 8 mL tampon de coloration (PBS contenant 2 % FBS) et centrifuger à 350 g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Remettre les cellules en coloration de 200 µL tampon et éliminer les cellules pour les taches de contrôle.
- Faire de Fluorescence moins une commande (OGP) à chaque fluorophore, par coloration une fraction des cellules dans 50 µL de tampon de coloration. Dans cet exemple, 6 tubes de microcentrifuge avec 20 000 cellules sont utilisées comme FMOSs. Notez que le nombre de cellules doit être ajusté selon les populations étudiées. Ajouter tous les anticorps à la même concentration que dans la coloration de l’échantillon sauf un dans chaque tube.
- Faire des taches unique pour chaque fluorophore par coloration une fraction des cellules dans 50 µL de tampon pour chaque fluorophore utilisé. Dans cet exemple, 6 tubes de microcentrifuge avec 20 000 cellules sont utilisés. Notez que l’objectif pour chacun des anticorps doit être exprimé par les cellules utilisées pour les contrôles. Ajouter chaque anticorps à la même concentration que dans la coloration de l’échantillon dans des tubes individuels. En outre garder 20 000 cellules incolores dans 50 µL comme un contrôle non coloré.
- Ajouter à l’échantillon cellulaire, anticorps à leur concentration appropriée. Utilisés ici sont CD34-FITC à une concentration de 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 et lignée Mix : CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, 1/50, CD16-PECy5 et CD235a-PECy5 1/1000.
- Incuber les cellules avec des anticorps pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité.
- Laver les cellules avec 3 mL de tampon de coloration. Centrifuger à 350 x g pendant 10 min à 4 ° C, les cellules et éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules et répétez l’étape 2,9.
- Resuspendre échantillon dans 500 µL et OGP dans 100 µL de tampon avec des cellules 7AAD et filtre de 1/100 de coloration à travers un filtre de 50 µm pour obtenir une suspension de cellules individuelles.
3. cellule Tri
- Assurez-vous que la machine de FACS est réglée correctement avec retard de goutte et cytomètre installation et suivi (CST) qui ont récemment été exécutés conformément aux instructions du fabricant, pour s’assurer que les cellules appropriées sont triés. Pour les cellules hématopoïétiques, l’utilisation de la vitesse de 85 microns buse et maximum de 4 est recommandée, tandis que le taux d’événements optimale est entre 800 et 2000 événements/s.
- Corriger de chevauchement spectrale par exécuter la compensation de fluorescence et définissez gates selon FMO contrôles ou contrôles négatifs internes.
- Effectuer une nouvelle analyse de la population cible en triant au moins 100 cellules cibles dans un nouveau tube de microcentrifuge avec 100 µL de tampon de la tache. FACS analyser les cellules triées en enregistrant l’échantillon trié et s’assurer qu’ils se retrouvent dans la porte de la sorte.
- Mise en place simple plaque cellulaire tri en centrant la chute dans le puits A1 dans une plaque 96 puits. Quand elle est centrée, trier les particules de 50 – 100 6 µm dans tous les puits sur le pourtour d’une assiette bien 96 vide pour s’assurer que tous les puits aura une cellule au centre de chaque puits.
- Si possible, un contrôle supplémentaire pour s’assurer que les cellules viables sont triés peut être ajouté en triant les single-cellules in vitro la croissance. Cellules hématopoïétiques peuvent être cultivés en fond U 96 plaques puits dans 100 µl SFEM avec 1 % streptomycine de pénicilline, 100 ng/mL FLT3L, TPO et SCF. Analyser chaque puits après 3 jours de culture pour les colonies de cellules à l’aide d’un microscope.
- Retirer pellicule adhésive de plaques. Trier une seule cellule d’intérêt (ICIS Lin-CD34 + CD38-cellules) en 92 sur les 96 puits, activer INDEX-tri dans les FACS tri logiciel pour sauvegarder le profil immunophénotypiques des autres marqueurs d’intérêt (ici CD45RA, CD49f et CD90) pour chaque cellule.
- Trier les deux puits avec des cellules de 10 et 20 respectivement pour les contrôles de linéarité dans l’amplification par PCR. Puits H1 et H2 sont habituellement utilisés.
- Garder deux puits sans n’importe quelle cellule comme modèle de non contrôle, généralement puits H3 et H4.
- Sceller les plaques avec du film transparent adhésif et tourner les plaques à 300 x g pendant 1 min avant snap gel sur la glace sèche.
- Stocker des plats congelés à-80 ° C.
NOTE : Point d’arrêt sécurisé. Cellules triées et lysés peuvent être conservés à-80 ° C pour le stockage à long terme.
4. inverser la Transcription et l’Amplification de la cible spécifique
- Préparer le mélange de l’apprêt pour toutes les cibles de gène 96 en ajoutant 2 µL de chaque paire d’amorces, y compris amorces pour contrôle dopés à ARN et amorces de gène de ménage dans un tube gratuit de RNAse sur un banc libre ARN/ADN de 1,5 mL. Si vous utilisez moins de 96 amorces, ajouter un volume équivalent d’eau libre nucléase pour les amorces manquants. Amorces sont classés séparément pour faire correspondre le panneau du gène désiré.
- Faire la transcription inverse et amplification de cible spécifique mélanger en ajoutant 632,5 µL 2 x mélange réactionnel, 101,2 µL Taq/SuperscriptIII, 151,8 µL Amorce mix et 0.7 µL dopés dans control RNA. Préforme cette étape sur un banc libre de l’ADN. Mix de vortex et rotation vers le bas pour recueillir le liquide dans le fond du tube. Rester sur la glace jusqu'à addition à l’échantillon.
- Marque non-reverse transcription contrôle mix pour quatre puits en mélangeant 27,5 µL de 2 x mélange réactionnel, 1,76 µL d’enzyme Taq, 6,6 µL du mélange de l’apprêt et 2,64 µL d’eau libre nucléase. Spike dans control RNA. Effectuez cette étape sur un banc libre de l’ADN. Vortex et rotation vers le bas pour recueillir le liquide dans le fond du tube et les garder sur la glace jusqu'à l’ajout d’échantillon.
- Décongeler le lysats plaques sur la glace. Ajouter 8,75 µL de la transcriptase inverse préalablement préparée et cible spécifique amplification mix à 92 Herbert George wells, y compris les contrôles de linéarité et de non-modèle. Ajouter 8,75 µL du mélange de contrôle de non-reverse transcription dans les quatre puits restants. Joint de plaques avec film transparent adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.
- Préforme de la transcriptase inverse et l’amplification de la cible spécifique en exécutant la plaque dans une machine PCR selon le programme de préampli ; étape 01:50 ° C pendant 60 min, étape 2 : 95 ° C pendant 2 min, étape 3 : 95 ° C pendant 15 s, étape 4 : 60 ° C pendant 4 min, répéter les étapes 3 et 4 24 fois et enfin l’étape 5 : 8 ° C pour toujours.
- Après que PCR est terminée, garder la plaque à 8 ° C pour le stockage à court terme et -20 ° C pour le stockage à long terme.
NOTE : Point d’arrêt sécurisé. Matériel amplifié peut être conservé à 8 ° C pour le stockage à court terme et à-20 ° C pour le stockage à long terme.
5. préparation de l’échantillon et de plaques d’essai pour Multiplex Microfluidic Gene Expression Analysis
- Préparer l’essai de plaque de chargement de pipetage 3 µL de réactif de chargement test dans chaque puits d’une plaque 96 puits. Ajouter 3 µL de chaque amorce dans des puits individuels dans l’essai de plaque de chargement.
- Flasque avec film adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.
- Préparez plaque de dilution en pipettant : 8 l de nucléase eau gratuite dans tous les puits d’une plaque 96 puits. Ajouter 2 µL de l’échantillon amplifié à la plaque de la dilution, faire une dilution finale de 1 / 5.
- Flasque avec film adhésif, de la composition de la plaque de vortex pour 10 s et enfin tourner à frais viré liquide au fond des assiettes.
- Préparer les mix de chargement d’échantillon en mélangeant soigneusement 352 µL du mélange maître avec 35,2 µL de réactif de chargement d’échantillon. Préparer la plaque de chargement d’échantillon en aliquotage 3.3 µL du mélange dans chaque puits d’une plaque 96 puits de chargement.
- Ajouter 2,7 µL de l’échantillon dilué dans chaque puits de l’échantillon plaque de chargement.
- Flasque avec film adhésif et un essorage à frais viré liquide au fond des assiettes.
6. chargement de la puce microfluidique
- Souscrire à une nouvelle puce microfluidique de 96 x 96. Préparer les anses de piquer avec une seringue avec cap sur pour s’assurer qu’ils peuvent être déplacés.
- Retirer les bulles de seringues. Ajouter plein volume des seringues à chaque valve tout en inclinant la puce 45 degrés et en appuyant vers le bas de la soupape. Premier morceau avec le contrôleur de la SFI.
- Chargez chaque entrée de dosage avec 4,25 µL de chaque puits dans l’essai de plaque de chargement. Éviter les bulles. Si des bulles apparaissent dans le puits, enlevez-les avec un embout de la pipette.
- Continuer à charger la bouche de chaque échantillon avec un 4,25 µL de chaque puits dans l’échantillon de plaque de chargement, d’éviter les bulles et si des bulles apparaissent, enlevé à la pointe de pipette.
- Puce de charge avec le contrôleur de la SFI.
- Vérifiez que la puce semble encore et que toutes les chambres ont été chargés. Enlever la poussière de la surface de la puce par le toucher avec du ruban adhésif. Exécutez la puce dans la plate-forme d’expression de gène multiplex microfluidiques.
7. exécution Chip sur Multiplex Microfluidic Gene Expression plate-forme
- Après chargement de puce dans la plate-forme d’expression de gène multiplex microfluidique, nom de l’échantillon.
- La valeur de ROX comme colorant passive. Fluorescence de définir seule sonde et FAM-BTP. Utilisez 96 x 96 standard v2 comme protocole. Commencer l’exécution.
- Supprimer les puces lorsqu’il est exécuté sont terminée.
8. preliminary Analysis of Chip Run
- Charger des données dans le logiciel d’analyse de PCR en temps réel.
- Charger les noms de gènes et cellules en collant cellulaire et génique mises en page d’un fichier délimité par des tabulations.
- Ouvrez affichage de l’image et sélectionnez ROX comme colorant. Vérifiez si tous les puits ont colorant passive ROX.
- Vérifier si toutes les placettes d’amplification regarder OK, avec une courbe d’amplification lisse sans crampons (semblable à la Figure 3E).
- S’assurer que toutes les cellules de single-expression de contrôle fortifiés à ARN pour s’assurer que tous ont été chargés correctement.
- S’assurer que toutes les cellules sont l’expression de gène de ménage et donc ont été triées correctement.
- S’assurer que les contrôles de linéarité cellule 10 et 20 environ 1ct différence pour valider l’amplification linéaire.
- Vérifier si il y a expression dans les échantillons de contrôle noRT. Si expression est détectée dans noRT envisager de changer les sondes aux sondes qui ne détectent pas l’ADN génomique pour les exécutions suivantes.
- Exporter des données dans des fichiers csv pour une analyse ultérieure.
9. unicellulaires analyse à l’aide de SCExV
Remarque : Un film d’introduction est présents20 d’introduire l’outil. Ici, une recommandation courte du comment faire l’analyse en utilisant les contrôles introduits dans le protocole est présentée.
- Se connecter au site Web SCexV20.
- Télécharger des fichiers CSV exportés.
- A choisi le contrôle dopés à RNA comme contrôle positif. Supprimer n’importe quelle cellule qui possède un contrôle RNA CT supérieure à 25. Normaliser les données d’expression médiane du contrôle RNA.
- Cliquez sur « ici -> Analyze ». Enlever le noRT, notemplate, 10 et 20 contrôles de cellule dans l’option de cellule d’exclure.
- Grappe de cellules avec la démarche de clustering de choix avec le nombre attendu de grappes. Valeur des exportations a analysé.
10. tri des Index analyse
- Ouvrez le logiciel d’analyse de FACS et charger les échantillons indexées.
- Ouvrez l’éditeur de script et exécutez le script disponible de Quinn J. et al. 21
- Maintenant que le logiciel d’analyse de FACS aurait dû une porte pour chacune des cellules simples, ouvrez l’éditeur de mise en page et la couleur les cellules selon le groupement de SCexV (disponible dans le fichier nommé « Sample_complete_Data.xls »).
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Representative Results
Le protocole décrit est rapide, facilement exécutées et très fiable. Un aperçu de la mise en place expérimentale est présenté dans la Figure 1. L’ensemble du protocole, du tri de simples cellules, amplification de la cible spécifique, mesures d’expression de gène et analyse préliminaire peut être effectué en trois jours. Un exemple des résultats analysés sous la forme d’une carte de chaleur qui représente ont analysé les données préliminaires de l’analyse l’expression génique de la cellule unique à l’aide de 96 amorces et 96 cellules soit un malade de leucémie myéloïde chronique (LMC) ou 96 cellules d’un appariés selon l’âge en bonne santé le contrôle est présenté dans la Figure 2. À l’aide de clustering hiérarchique, les cellules analysées peuvent être divisés en quatre sous-groupes selon leurs signatures d’expression de gène. La visualisation de carte de chaleur est un moyen pratique d’obtenir une vue d’ensemble des données ainsi que le contrôle des puits qui doivent être exclus de l’analyse (par exemple, les puits de contrôle). Figure 2 b est une analyse en composantes principales (PCA) visualiser comment les cellules de chaque groupe sont les uns aux autres à l’aide de réduction de la dimension. Ici, les valeurs aberrantes sont facilement distingués du reste des cellules. Pour analyser comment les gènes individuels sont distribués parmi les pôles ainsi que diffèrent entre eux, les parcelles de violon sont utiles. Dans la Figure 2, l’expression des gènes représentant quatre figurent : le gène de fusion BCR-ABL1, qui marque toutes les cellules leucémiques ; le cycle cellulaire marqueur mKI67, qui s’exprime dans un groupe de partage activement ; le marqueur de différenciation myéloïde FTU, qui se limite au cyclisme sous-groupe ; et enfin la maison gardant gène RPS18, qui s’exprime dans toutes les cellules. Enfin, en 2D Figure les signatures moléculaires ont été corrélés à immunophenotyped, comme les identités de chaque cellule dans chaque cluster sont utilisés pour colorer les cellules individuelles dans une parcelle de FACS généré à partir de l’index de tri. Montré est l’expression de marqueurs de surface cellulaire pour les marqueurs de cellules souches hématopoïétiques CD90 et CD45RA qui dans ce cas pourrait servir à distinguer certains des clusters et les isoler prospectivement pour analyse fonctionnelle.
La microfluidique utilisée pour effectuer le qPCR unicellulaire est très sensible à l’introduction de l’air ou les particules dans le système. Par conséquent, il est essentiel de faire une vérification de qualité post exécution des données. La figure 3 illustre représentant de données et le contraste entre un succès et un échec exécutent en raison de la faible échantillon. Figure 3 illustre comment les niveaux de Rox après un succès exécuté propagation uniformément sur tous les puits rassurant de constater que le chargement a réussi. En revanche, la Figure 3 b illustre comment les échantillon et le chargement de l’essai ont échoué comme en témoigne l’absence de ROX dans de grandes parties de la puce. Une fois que la qualité de Rox a été évaluée, la qualité des signaux expression génique brutes peut être évaluée. Dans la Figure 3, une carte de chaleur d’une exécution réussie est présentée, où expression soit étalée uniformément dans les échantillons avec un signal fort de près de 7-25 Ct:s. en contraste, ne Figure 3D montre une carte thermique d’une exécution ratée où beaucoup d’échantillons avez aucun signal ou expression d’un nombre limité de gènes. Les résultats en 3D de la Figure sont probables dues à une erreur dans le tri de FACS avant analyse d’expression génique de la cellule unique, étant donné que plusieurs cellules ont des signaux d’expression claire alors que d’autres manquent complètement d’expression. Enfin, la Figure 3E affiche la courbe d’amplification attendu de contrôle fortifiés à RNA avec tous les puits ayant une expression claire d’environ 10 CT avec peu ou pas de variation. Ce contrôle positif mesure l’efficacité de toutes les étapes de l’analyse de qPCR unicellulaires. Pour s’assurer que l’amplification est au sein de la gamme dynamique, nombre de cellules différentes est inclus en tant que contrôles de linéarité ; ici, les 10 et 20 éléments contrôles sont utilisés. Les différences de CT entre contrôles de linéarité devraient refléter les différences dans le nombre de cellules. Enfin, aucun contrôles négatifs modèle et pas la transcription inverse (noRT) veiller à ce qu’aucun faux signaux positifs ne sont détectés d’ADN génomique ou de contaminations, respectivement.
Figure 1 : vue schématique du protocole. Les cellules sont colorées, triés avec Tri par index application activée pour enregistrer l’expression du marqueur de surface et lysées pour libérer de l’ARNm. l’ARNm est inversée par la suite transcrits d’ADNc et amplifié à l’aide d’amplification de la cible spécifique. Ensuite, les échantillons sont chargés avec des amorces individuels dans une puce microfluidique, lorsque le profil d’expression génique de chaque cellule est analysé à l’aide de la RT-qPCR. Après la collecte de données, les données sont prétraitées pour éliminer les cellules de faible qualité et clustering est effectué afin de définir des populations cellulaires moléculairement distinctes. Enfin, des sous-populations moléculairement définies sont corrélées à l’expression du marqueur de surface du FACS indice tri données à immunophenotypically caractérisent l’hétérogénéité des populations. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse les résultats représentatifs trois succès cellule unique d’expression des gènes des cellules souches hématopoïétiques normales et leucémiques. (A) chaleur carte montrant unicellulaires gène mesures expression de 270 cellules individuelles d’un patient de la leucémie myéloïde chronique, mais aussi un témoins du même âge en bonne santé analysés par clustering hiérarchique à l’aide de SCExV 18, un outil d’analyse conçu pour ce type de données. Rouge représente haute expression, bleu faible et aucune expression « grise ». Les cellules ont été divisés en quatre groupes différents, basés sur leurs signatures d’expression de gène. Il est clair d’après les données que la population des cellules souches leucémiques chez ce patient peut être divisée en une seule population quiescente (groupe 3), avec l’expression de seulement quelques marqueurs de différenciation et une population active de démarcation qui a initié l’expression de gènes liés à la différenciation myéloïde (groupe 4). Les données utilisées ici sont d’un patient sélectionné inclus dans les travaux déjà publié par Warfvinge et al. 22 (B) Principal analyse en composantes (PCA) les données affichées dans A, où les quatre groupes séparés peut être démontré. (C) violon tracés des quatre gènes avec l’expression spécifique de cluster, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 et MPO. Chaque parcelle de violon représente l’expression dans chaque cluster et la ligne pointillée sur la valeur moyenne d’expression pour toutes les cellules. (D) analyse de tri des Index de l’un des sérums des patients représentés dans la carte thermique, où chaque cellule individuelle est marquée avec la couleur de ses sous-populations moléculaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : contrôles de la qualité de qPCR multiplex dans le logiciel PCR en temps réel. (A) image de Rox chargement d’échantillon réussie et chargement de l’essai. Rox (B) image d’échantillon infructueuse et essai de chargement de chargement, où charges ayant échouées d’échantillons sont représentés par un manque de ROX en lignes horizontales. Échec de chargement d’essais serait montré en lignes verticales. (C) exemple d’une réussite exécuté en vue de la carte thermique, où single-cellules représentent des lignes et gènes représentent les colonnes. Expression génétique élevée est indiquée dans l’expression jaune et basses en bleu et aucune expression détectée en noir. (D) exemple d’un échec exécuter en vue de la carte thermique, où single-cellules représentent des lignes et gènes représentent les colonnes. Expression génétique élevé est représentée en jaune, expression faible est représentée par bleu et aucune expression détectée comme noir. (E) normalisé intensité (à gauche) et l’intrigue amplification (à droite) d’un contrôle de RNA dopés-en. CT-valeurs d’environ 10 et courbes avec une variation limitée indiquent réussi et robuste reverse transcription, pré-amplification et qPCR analyse dans tous les puits. (F) normalisé intensité (à gauche) et l’intrigue d’amplification (à droite) d’un gène défectueux. Les intensités normalisées ne forment pas une courbe et le tracé de l’amplification montre grandes pointes en fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ces dernières années, analyse de l’expression génique de la cellule unique est devenu un atout précieux pour définir l’hétérogénéité des différentes cellules populations23. L’avènement des technologies de séquençage de RNA offre théoriquement une possibilité permettant de mesurer le transcriptome entier d’une cellule, cependant ces méthodes sont compliquées par des variations de profondeurs de séquençage de cellule-cellule et abandons. Unicellulaire qPCR offre une analyse sensible et robuste de l’expression de plusieurs centaines de gènes critiques où toutes les cellules sont traitées de la même façon, réduisant le bruit technique. L’analyse ciblée d’un nombre limité de transcriptions plus permet une analyse simplifiée sans interférence des gènes exprimés fortement.
Puisque l’approche examine uniquement un sous-ensemble de gènes exprimés dans les cellules, il est très important de choisir le bon ensemble de gènes lors de la conception du panneau de gène. Le choix des gènes peut se faire de plusieurs façons ; par le biais de la littérature, les résultats précédents par l’analyse en vrac et analyse bioinformatique des données accessibles au public. Ce n’est pas trivial ; Cependant, avec l’ensemble correct de gènes, l’approche peut être très puissant. Lorsque le panneau de gène ont été conçu, il est important de valider que les amorces n’interfèrent pas au cours de multiplexage. Ici nous recommandons d’analyser si les amorces sont linéaires de préformage une série de dilutions avec amplement d’éléments ; une dilution en série d’amorces utilisées dans cette étude est indiqué dans le supplément figure 2D dans Warfvinge et al. 22
Les deux principales limitations du protocole présenté ici sont du nombre limité de cellules et les gènes étudiés. Toutefois, même si seulement 96 cellules sont étudiées dans chaque course, ce protocole relativement simple peut être complété en une seule journée et ainsi des centaines de cellules peuvent être analysés en une semaine. En outre, le nombre de gènes étudiés pourrait être augmenté si les amorces plus sont inclus dans l’étape de pré amplification spécifique à la cible. Dans ce cas, plusieurs puces sont nécessaires pour enquêter sur chaque série de 96 amorces.
Si fortement exprimée des gènes ou des cellules de haute teneur en ARN-sont en cours d’analyse, le nombre de cycles optimisés pour des cellules souches hématopoïétiques faible global gene expression23 devrait être modifié. Modification des cycles d’amplification est également important dans les enquêtes sur les populations en vrac. Pour l’analyse de cellules souches hématopoïétiques (100 cellules) en vrac, nous vous recommandons réduisant la quantité de pré-amplification cycles de 25 à 18.
Le plus commun motifs n’a pas pu s’exécute est due à tri infructueuse de single-cellules dans le puits de la plaque de lyse, tri des cellules non viables, sous-optimale pré-amplification ou puce échec de chargement. Le niveau de Rox dans chaque chambre de réaction est un indicateur de la charge de l’échantillon ou le dosage, et si ceux-ci sont faibles, il est recommandé que les échantillons sont ré-exécuter sur une nouvelle puce, depuis Rox bas niveaux sont probablement causés par l’introduction de bulles pendant le chargement. Manque de contrôle fortifiés à expression RNA est un indicateur de qui les préamplis ont échoué, probablement en raison de problèmes avec pré-amplification- ou inverser les réactifs de la transcription. Dans ce cas, il est recommandé qu’une nouvelle puce est gérée avec les cellules nouvellement triées et nouveaux réactifs. Détection du contrôle RNA mais aucune indication d’autre expression de gène des signaux est une indication d’infructueuse unicellulaires FACS trier avant l’analyse de l’expression génique. Pour éviter les erreurs au cours de la FACS Trier que c’est important de s’assurer que les single-cellules sont triés au centre de chaque puits. Cela peut être fait par triage des perles dans une assiette vide et inspection visuelle où la goutte terres. S’assurer d’essai-sort dans tous les puits dans les bords de la plaque pour faire en sorte que la mise en place n’est pas seulement correct pour les quelques premiers puits. Le cas échéant, single-cellules peuvent être triés en parallèle pour la croissance in vitro et analysées avant l’analyse de qPCR au contrôle pour les protocoles de tri avec succès. Index-tri des informations ne permettant pas seulement d’enquêter sur l’immunophenotyped d’une sous-population moléculairement distincte mais peuvent également fournir des renseignements utiles lors du dépannage, si vous triez une population non définie et de nombreuses cellules de faible qualité sont présent dans l’analyse d’expression génique de la cellule unique. Les informations de tri des index peuvent servir à optimiser la stratégie de blocage et d’éviter de futures tri des cellules de qualité inférieure.
Analyse de l’expression génique de la cellule unique est révolutionner comment hétérogène cell populations sont étudiées et ouvrant la voie à davantage de compréhension de la différenciation cellulaire. Dans l’hématopoïèse, analyse de l’expression génique de la cellule unique ont été utilisés pour affiner les stratégies de tri pour des sous-ensembles de CSH7, pour résoudre l’hétérogénéité des populations de souches multipotentes6,24,25 et d’identifier la thérapie insensibles les cellules souches leucémiques populations22,26. Combinaison des index de tri avec les unicellulaires gene expression - et analyse fonctionnelle a déjà démontré pour être fiable et efficace lors d’enquêtes sur les immunophenotype et l’hétérogénéité des différentes populations27, 28,,29. Ici, une approche pour l’enquête de moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité de cellule de populations ont été décrits où combinant qPCR monocellulaires avec indice tri permet des résultats rapides et reproductibles sans analyse compliquée dans une courte calendrier.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions du suédois Cancer Society, The Swedish Research Council, The Swedish Society for Medical Research, The Swedish Childhood Cancer Foundation, la Fondation de Söderberg de Ragnar et The Knut et Alice Wallenberg Foundation
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
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