Summary
تنقية القنوات الأيونية في كثير من الأحيان تحديا، ولكن متى تحقق، فإنه من المحتمل أن يسمح التحقيقات في المختبر لوظائف وهياكل القنوات. هنا، يمكننا وصف إجراءات تدريجية للتعبير وتنقية البروتينات بيستروفين الثدييات، وعائلة من Ca2 +-تنشيط قنوات Cl– .
Abstract
بترميز الجينوم البشري بارالوجس بيستروفين أربعة، هي: BEST1، BEST2، BEST3، و BEST4. هو BEST1، مرمزة بواسطة الجين BEST1 ، Ca2 +-تنشيط Cl– قناة (كاكك) أعرب غالباً في ظهارة صباغ الشبكية (RPE). أهمية BEST1 الفيزيولوجية والمرضية وهو أبرز حقيقة أن ما يزيد على 200 الطفرات المتميزة في الجينات BEST1 ربطت وراثيا بطائفة اضطرابات التنكسية الشبكية خمسة على الأقل، مثل فيتيليفورم أفضل حثل القرنية (المرض أفضل). ولذلك، فهم الفيزياء حيوية القنوات بيستروفين على مستوى جزيء واحد يحمل أهمية كبيرة. ومع ذلك، الحصول على قنوات أيون الثدييات المنقي غالباً مهمة صعبة. هنا، نحن تقرير وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات بيستروفين الثدييات مع نظام نقل الجينات باكولوفيروس باكمام وعلى تنقية بتقارب وحجم الاستبعاد اللوني. تنقية البروتينات لديها القدرة على الاستفادة منها في التحليلات الوظيفية والهيكلية اللاحقة، مثل تسجيل الكهربية في دهن بيلاييرس وعلم البلورات. الأهم من ذلك، يمكن تكييفها لدراسة وظائف وهياكل أخرى قنوات أيون هذا الأنبوب.
Introduction
بيستروفينس عائلة من قنوات أيون المحافظة عليها من خلال الأنواع المختلفة من البكتيريا إلى البشر1. في البشر، وترميز الجينات BEST1 ، الموجود على كروموسوم 11q12.3، بروتين غشائي بيستروفين-1 (BEST1) التي يتم التعبير عنها في الغالب في غشاء خلايا ظهارة (RPE) صباغ الشبكية من عيون2،3 باسولاتيرال ،4. تتألف من الأحماض الأمينية 585، 350 ~ الأولى التي هي المحافظة جداً بين الأنواع وتحتوي على منطقتها transmembrane، BEST1 بمثابة كاكك في البشر1،،من56. وعلاوة على ذلك، هومولوجس BEST1 في الدجاج و الكلبسيله الرئوية تعمل هوموبينتاميرس7،8، مما يوحي بمستوى عال من المحافظة في جميع أنحاء تطور.
في البشر، وربطت ما يزيد على 200 من الطفرات في الجينات BEST1 سريرياً بمجموعة من الأمراض تنكس الشبكية تسمى بيستروفينوباثيس1،9. سجلت خمس بيستروفينوباثيس محددة، بما في ذلك المرض أفضل، فيتيليفورم الكبار-بداية ضمور وجسمية فيتريوريتينوتشورويدوباثي المهيمنة، بيستروفينوباثي مقهورة جسمية والتهاب الشبكية الصباغي3،4 ،،من1011،12،،من1314. هذه الأمراض، مما يؤدي إلى انخفاض البصر وحتى العمى، حاليا غير قابل للعلاج. من أجل تطوير العلاجات العلاجية والطب يحتمل أن تكون شخصية، أنها حاسمة لفهم كيفية تأثير هذه الطفرات المسببة للمرض BEST1 وظيفة وهيكل ل قناة BEST115. ولهذه الأغراض، يحتاج الباحثون الحصول على القنوات بيستروفين المنقي (نوع البرية و/أو متحولة) وقواعد السلوك في المختبر تحليلات5،8.
الخطوة الرئيسية الأولى هو التعبير عن قنوات بيستروفين من الأنواع أعلى في خلايا الثدييات. كما توصيل باكولوفيروس للخلايا و HEK293 (نظام باكمام) وسيلة قوية للتعبير عن هيتيرولوجوسلي غشاء بروتينات16،17، يستخدم هذا البروتوكول متجه باكمام أمثل (شماعة باكمام) لتعبير قوي عن الهدف18من البروتين، وفي هذه الحالة هومولوج بيستروفين الثدييات. وقد استخدمت هذه القوة الموجهة للتعبير عن مختلف البروتينات الغشاء، بما في ذلك مستقبلات إلى جانب البروتين ز والمستقبلات النووية الأخرى قنوات أيون18. وهناك أيضا أدلة على أن البروتينات المنتجة مناسبة لعلم البلورات18. مع مستويات عالية من التعبير في الخلايا HEK293-F، البروتينات يمكن ثم يمكن تنقية استخدام الفصل اللوني؛ على وجه التحديد، في حالة بيستروفينس، يمكن استخدام كل من تقارب وحجم الاستبعاد اللوني.
ثم بمجرد صقل لقناة بيستروفين هذا البروتوكول، يمكن أن تحلل البروتين المنقي لوظيفتها والهيكل عن طريق الدهن مستو بلير والبلورات بالأشعة السينية، على التوالي5،8. بالإجمال، توفر هذه التقنيات خط أنابيب قوية للتحقيقات الفنية والهيكلية بيستروفينس وغيرها من القنوات أيون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إنتاج باكمام التعبير باكولوفيروسيس
- إدراج الترميز تسلسل البروتين المطلوب بيستروفين الثدييات في شماعة باكمام ناقلات18 مع تسلسل اعتراف بحوزتي فيروس أحفر التبغ (TEV)، متبوعاً التجارة والنقل-10 × صاحب العلامة في ج-محطة البروتين.
- عابر ترانسفيكت بلازميد التعبير في مادة لاصقة HEK293 الخلايا19،،من2021،،من2223. تحقق من التعبير عن البروتين بروتينات فلورية خضراء-الانصهار تحت مجهر فلوري مع 10 X أو 20 X التكبير ومصدر إثارة نانومتر 488 مرشح انبعاثات 510 نانومتر (الشكل 1A).
ملاحظة: يتم تعداء المستندة إلى البوليمر بشكل روتيني مع 1 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي لطبق 35 ملم من الخلايا HEK293. - إنتاج باكولوفيروسيس في خلايا الحشرات Sf9 كما هو موضح سابقا16،17.
ملاحظة: مرور 3 (P3) الفيروس، والتي ستستخدم لتصيب الخلايا و HEK293 لإنتاج البروتين، يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. - تحديد عيار (وحدات المعدية) من الفيروس P3 باللوحة تشكيل المقايسة16،17.
ملاحظة: كما هو معلم بروتين اهتمام بالتجارة والنقل، هو أسلوب أسرع للتحقق من وحدات المعدية تصيب الخلايا Sf9 مع تخفيف المسلسل من الفيروس، وحساب عدد الخلايا الفلورسنت بعد 48 ساعة.
2-بروتين التعبير
- الحفاظ على الخلايا و HEK293 في ثقافة تعليق مع وسيلة التعبير و HEK293 في حاضنة هوميديفيد مع 8% CO237 درجة مئوية. استخدام قوارير المتاح الثقافة التي هي أكبر من 2-2.5 مرات من حجم الثقافة وتدوير ثقافة على منصة مداري 135 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: من المستحسن لتصيب الخلايا عندما يكونون بين الفقرات 5 و 30، والقيام بهذه الإجراءات تحت غطاء ثقافة خلية. - 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية، إضافة 15 ميكروليتر من تريبان الأزرق إلى قاسمة 15 ميكروليتر ثقافة الخلية، والتحقق من كثافة الخلية وجدوى استخدام هيموسيتوميتير تحت مجهر. تمييع الخلايا إلى 0.6 × 106 خلايا/مل في قوارير ل 2 × 2 مع 500 مل متوسطة كل استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: الخلايا الميتة هي الملون الأزرق قبل تريبان الأزرق. بقاء الخلايا المطلوب > 95%. - اليوم من الإصابة، تحقق من كثافة الخلية والبقاء (الخطوة 2، 2).
ملاحظة: خلية عالية جدوى من > 95% ضروري لكفاءة التعبير العدوى والبروتين. وتبلغ كثافة الخلية المتوقعة ~1.0 x 106 خلايا/مل (نمت بين عشية وضحاها من 2 × 500 مل 0.6 × 106 خلايا/مل خلية الثقافة). هو العدد الإجمالي المتوقع للخلايا ~1.0 x 109. - إضافة باكولوفيروسيس P3 للخلايا في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 5. لتحديد كمية الفيروس تطعيم، تستخدم المعادلة التالية:
- اهتزاز الخلايا على منصة المداري في 135 دورة في الدقيقة في حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية مع نسبة 8% CO2 ح 24.
- إضافة 10 مم بوتيراتي الصوديوم في ثقافة الخلية وتستمر حضانة ح 48.
ملاحظة: لبعض البروتينات، وتقليل درجة حرارة ثقافة الخلية إلى 30 درجة مئوية بعد إضافة butyrate الصوديوم قد يحسن التعبير والاستقرار. - تحت مجهر الأسفار مع 10 X أو 20 X التكبير، التحقق من مصدر إثارة 488 نانومتر، وعامل تصفية انبعاثات 510 نانومتر، النسبة المئوية والسطوع من الخلايا الخضراء، التي تمثل مباشرة إنتاج البروتين (بيستروفين-التجارة والنقل-10xHis) (الشكل 1B).
ملاحظة: يتم حساب النسبة المئوية للخلايا الخضراء ب: 100 × (الخلايا الخضراء إلى مجموع الخلايا). تتم الإشارة إلى مستوى التعبير البروتين جيدة بقوى ومضان أخضر تحت المجهر. - حصاد الخلايا التي سينتريفوجينج في غ س 1,000 في 4 درجات مئوية عن 20 دقيقة إزالة المادة طافية وإعادة تعليق الكريات الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لوحدة تخزين نهائي ~ 80 مل. انقسام تعليق خلية في أنابيب مخروطية 2 × 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 ز س في 4 درجات مئوية 20 دقيقة لتخزين الكريات الخلية في-80 درجة مئوية.
3. تنقية البروتين
- احتضان هذه الأنابيب المخروطية التي تحتوي على حبيبات الخلية في حمام مائي إثارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة حتى أن كانوا ذوبان الجليد. إعادة تعليق الخلايا في 2 x (w/v) حجم المخزن المؤقت (الجدول 1) (مثلاً، 10 غم كريات الخلية في 20 مل من المخزن المؤقت) وتستكمل مع مثبطات البروتيناز (أبروتينين، ليوبيبتين، بيبستاتين أ وفينيلميثيلسولفونيل الفلوريد) في 0.1-1.0 مم. بيبيت صعودا وهبوطاً على نطاق واسع للحصول على تعليق خلية متجانسة.
- الخلايا باستخدام الخالطون الضغط العالي. تشغيل تعليق خلية عن طريق الخالطون في 7-10 الآلام والكروب الذهنية لمجموعة من 3-4 مرات لتحقيق التجانس الكامل. تبقى الخلية ليستي على الجليد لمدة 2-3 دقائق بين الجولتين.
- إضافة المنظفات [مثلاً 2% w/v سول-الصف n-دوديسيل-β-د-مالتوبيرانوسيدي (DDM)] إلى الخلية ليساتي. احتضان بالتحريض ح 1 في 20 درجة مئوية لاستخراج البروتينات الغشاء.
ملاحظة: نوع المنظفات يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل البروتين الهدف18،24. - الطرد المركزي في 150,000 ز العاشر في أولتراسينتريفوجي في 4 درجات مئوية عن ح 1.
ملاحظة: يتم إجراء كافة الخطوات التالية في 4 درجات مئوية. - جمع الخلية واضحة ليستي والتدفق من خلال 5 مل "صاحب فخ ني"2 +-جاتا تقارب عمود قبل اكويليبراتيد مع المخزن المؤقت (الجدول 1).
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، سوف تقع الخلية واضحة ليستي بين بيليه في الجزء السفلي وطبقة غائمة على أعلى. استخدام بيبيت نقل 10 مل لجمع بعناية واضحة، ثم التبديل إلى بيبيت 1 مل لآخر قليل ملليلتر من ليستي. تجنب بيليه، التي يمكن أن تسد ني2 + العمود؛ ومع ذلك، كمية صغيرة من الطبقة العليا على ما يرام، أو يمكن أن تخرج مع عامل تصفية 1.5 ميكرومتر. - أغسل العمود مع 25 مل من المخزن المؤقت ب ثم 40 مل من المخزن المؤقت ج (الجداول 2 و 3، على التوالي).
ملاحظة: هذا مكان جيد لأخذ قسط من راحة، كما تنقية الكلي قد يستغرق ما يصل إلى 12 س والبروتين يمكن أن تظل مستقرة بينما يعلق على العمود بين عشية وضحاها. - إرفاق العمود إلى نظام لوني سائل (فبلك) بروتين سريعة والوت البروتين من العمود مع 13 مل من المخزن المؤقت د (الجدول 3) مع وجود. جمع الكسور بروتين عالي التخصيب وفقا لقراءات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: "فبلك" شروط كالتالي: حجم كسر مل 1.0، إنذار ضغط عمود قبل تعيين إلى 0.3 الآلام والكروب الذهنية، ومعدل تدفق من 0.5 مل/دقيقة. - قياس تركيز البروتين الوتيد المنتج المعني جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي. قراءة امتصاص في 280 نانومتر.
- (اختياري) لإزالة علامة 10xHis التجارة والنقل، إضافة حوزتي الإجمالية بنسبة 1:1 شامل واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: العلامة قد أو قد لا تؤثر على وظيفة أو هيكل لقناة المنقي. حساب الكمية الإجمالية من حجم وتركيز البروتين التي تم جمعها من الخطوات 3.7-3.8. على سبيل المثال، إذا جمعت 10 مل من شطف المنتج ويقاس على 0.1 مغ/مل، البروتين الكلي الشامل 10 × 0.1 = 1 ملغ، و 1 ملغ من TEV ستستخدم الهضم. - تركيز البروتين مع 15 مل الطرد مركزي (كاتشين 50 أو 100) وحدة التصفية بالغزل في 4,000 س ز في 4 درجات مئوية إلى وحدة تخزين نهائي من 400-500 ميكروليتر (لحلقة تحميل عينة 2 مل على فبلك).
ملاحظة: يختلف الوقت سينتريفوجينج لتركيز اعتماداً على تركيز وحجم من البروتين. لتجنب الإفراط في التركيز، الذي قد يسبب ترسيب البروتين وتدور لمدة 10 دقائق في البداية، ثم مراقبة حجم المتبقية وتقدير الوقت لتدور لاحقة (مثلاً، 2-5 دقائق)، وهلم جرا، للحصول على وحدة التخزين النهائي. بيبيت بين يدور لتفريق البروتين، التي يتم سحبها إلى الجزء السفلي من عامل التصفية. - نقل البروتين تتركز أنبوب مل 1.5 جديد وإزالة أي ترسبات أو فقاعات من مركزة للمنتج. تدور في > ز س 12,000 لمدة 5-10 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة.
- تحميل المنتج النهائي مع 1 مل حقنه وابرة نصيحة الجولة على نظام فبلك لحجم الاستبعاد اللوني مع استبعاد حجم عمود قبل متوازن مع المخزن المؤقت ه (الجدول 5).
ملاحظة: "فبلك" شروط كالتالي: حجم كسر 0.5 مل، إنذار من ضغط ما قبل عمود تعيين إلى 2.50 الآلام والكروب الذهنية، وحجم تدفق تعيين إلى 30 مل من المخزن المؤقت ه (الجدول 5)، وتعيين معدل تدفق إلى 0.5 مل/دقيقة. - ملاحظة أن البروتينات حسن تصرف تشغيل كذروة واحدة (الشكل 2A)، وجمع fraction(s) البروتين المقابل لتلك الذروة (الشكل 2A).
- التركيز البروتين مع وحدة الطرد المركزي تصفية 4 مل أو 0.5 مل (لوقف الوزن الجزيئي نفسها كما في الخطوة 3، 10) وتدور في 4,000 س ز عند 4 درجة مئوية إلى تركيز نهائي من 5-10 ميكروغرام/ميكروليتر. استخدام جهاز المطياف الضوئي للتحقق من أن تركيز المنتج النهائي (الخطوة 3، 8).
ملاحظة: يختلف الوقت الطرد المركزي، كما يمكن أن يختلف حجم المنتج النهائي بين المحاكمات تنقية. عادة، يأخذ الطرد المركزي 10-20 دقيقة. من المستحسن بيبيت بين يدور لتفريق البروتين، التي يتم سحبها إلى الجزء السفلي من عامل التصفية. - نقل البروتين تتركز على أنبوب 1.5 مل جديدة. إزالة أي ترسبات من سينتريفوجينج في > ز س 12,000 لمدة 5-10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. 10 ميكروليتر مختبرين للتخزين في-80 درجة مئوية وحفظ واحد 2-5 ميكروليتر قاسمة الصغيرة لتشغيل على جل صحيفة بيانات السلامة-صفحة 4-15% تدرج في 9 V/سم (الشكل 2).
- تأكيد هوية البروتين المنقي من الطيف الكتلي8.
ملاحظة: تحليل في المختبر لوظيفة وهيكل البروتين المنقي تتم عبر بلير الدهن مستو والبلورات بالأشعة السينية، على التوالي5،8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كثافة fluorescence في عابر transfected الخلايا HEK293 لاصقة (الشكل 1A) مؤشر جيد لمستوى التعبير البروتين المتوقعة في تعليق HEK293 و الخلايا (الشكل 1B). إذا ليس جيدا عن البروتين المستهدف أو هو سوء المترجمة في الخلايا HEK293 بعد تعداء عابرة، فمن المستحسن أن تنظر في تعديل بنية التعبير (على سبيل المثال-أو تغيير موضع العلامة بروتينات فلورية خضراء أو صنع الطفرات/ترونكيشنز على البروتين المستهدف). صغير و HEK293 تعليق الثقافات (مثلاً 25 مل الثقافات) تستخدم لتحسين شروط التعبير البروتين، التي كانت العدوى موي واستزراع درجة الحرارة الأكثر أهمية في التجارب السابقة.
يتم الإشارة إلى تنقية ناجحة ذروة رئيسية واحدة في حجم شطف المتوقعة في حجم الاستبعاد اللوني (الشكل 2A) وعصابة مهيمنة واحدة في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة التشويه والتحريف (الشكل 2). في حالة ظهور قمم متعددة في حجم الاستبعاد اللوني، من المهم جمع كل ذروة وتشغيل هلام أصلي لتحديد الذروة التي تحتوي على بينتاميرس القناة الفنية. تجدر الإشارة إلى أن بين اثنين بنيات البروتين، على مستوى التعبير، أوضحت بشدة الأسفار في وقت الحصاد، نيسيساريلي لا ترتبط بالمحصول النهائي، كما يختلف سلوك كل بناء البروتين خلال تنقية. لبروتين بيستروفين حسن تصرف، يمكن عادة الحصول على 200-500 ميكروغرام للمنتج النهائي المنقي من 1 لتر من HEK293 و تعليق الخلايا.
رقم 1: التعبير عن البروتين الثدييات بيستروفين. الصور المجهرية من بيستروفين الثدييات معلم بروتينات فلورية خضراء أعرب عن في الخلايا (A) لاصقة HEK293 بلازميد تعداء، وفي (ب) تعليق الخلايا HEK293F باكولوفيروس العدوى. اليسار = الفلورية الخضراء؛ حق = مشرق الميدانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تنقية بروتين الثدييات بيستروفين. (أ) تقارب تنقية البروتينات بروتينات فلورية خضراء معلم ركض على عمود هلام ترشيح استبعاد حجم كواحدة من الذروة الرئيسية. وتم جمع الكسور بين الخطوط المتقطعة. (ب) منتج البروتين النهائي ركض على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع سلالم (العمود الأيمن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | ميغاواط | المبلغ لكل 1 لتر | النهائي |
| حبيس | 238.3 | ز 11.9 | 50 مم |
| كلوريد الصوديوم | 58.44 | ز 17.529 | 300 ملم |
| الجلسرين | 92.09 | 50 مل | 5% (v/v) |
| ايميدازول | 68.1 | ز 1.3616 | 20 مم |
| مجكل2 | 203 | ز 0.20331 | 1 مم |
| tris(2-carboxyethyl) الفوسفين | 287 | الأسهم 200 ملم 2.5 مل | 0.5 مم |
الجدول 1: تنقية البروتين المخزن المؤقت (المخزن المؤقت استثارة)
| كاشف | ميغاواط | المبلغ لكل 1 لتر | النهائي |
| هيبيس | 238.3 | ز 11.9 | 50 مم |
| كلوريد الصوديوم | 58.44 | ز 17.529 | 300 ملم |
| الجلسرين | 92.09 | 50 مل | 5% (v/v) |
| ايميدازول | 68.1 | ز 2.7232 | 40 مم |
| مجكل2 | 203 | ز 1.01655 | 5 مم |
| tris(2-carboxyethyl) الفوسفين | 287 | مل 0.5 مم 200 الأسهم | 0.1 مم |
| DDM (أناجرادي) | 510.6 | ز 0.5 | 0.05% (w/v) |
الجدول 2: البروتين تنقية المخزن المؤقت ب (يغسل أولاً العازلة)
| كاشف | ميغاواط | المبلغ لكل 1 لتر | النهائي |
| حبيس | 238.3 | ز 5.95 | 25 مم |
| كلوريد الصوديوم | 58.44 | ز 29.2 | 500 مم |
| الجلسرين | 92.09 | 50 مل | 5% (v/v) |
| ايميدازول | 68.1 | ز 5.1 | 75 مم |
| tris(2-carboxyethyl) الفوسفين | 287 | مل 0.5 مم 200 الأسهم | 0.1 مم |
| DDM (أناجرادي) | 510.6 | ز 0.5 | 0.05% (w/v) |
الجدول 3: مخزن تنقية البروتين ج (ثاني يغسل المخزن المؤقت)
| كاشف | ميغاواط | المبلغ لكل 1 لتر | النهائي |
| هيبيس | 238.3 | ز 7.74 | 32.5 ملم |
| كلوريد الصوديوم | 58.44 | ز 11.686 | 200 ملم |
| الجلسرين | 92.09 | 25 مل | 2.5% (v/v) |
| ايميدازول | 68.1 | ز 17.02 | 250 ملم |
| tris(2-carboxyethyl) الفوسفين | 287 | مل 0.5 مم 200 الأسهم | 0.1 مم |
| DDM (أناجرادي) | 510.6 | ز 0.5 | 0.05% (w/v) |
الجدول 4: البروتين تنقية العازلة د (شطف المخزن المؤقت)
| كاشف | ميغاواط | المبلغ لكل 1 لتر | النهائي |
| حبيس | 238.3 | ز 9.53 | 40 مم |
| كلوريد الصوديوم | 58.44 | ز 11.686 | 200 ملم |
| tris(2-carboxyethyl) الفوسفين | 287 | مل 0.5 مم 200 الأسهم | 0.1 مم |
| DDM (أناجرادي) | 510.6 | ز 0.5 | 0.05% (w/v) |
الجدول 5: البروتين تنقية المخزن المؤقت ه (هلام الترشيح العازلة)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا البروتوكول خط أنابيب مفيدة للتعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات التي ستستخدم مستقبلا في المختبر التحاليل. بينما الجهاز فبلك مطلوب لحجم الاستبعاد اللوني، مضخة الحقن كافية لجميع خطوات التقارب اللوني بما في ذلك ملزم، والغسيل والتينج. عند استخدام مضخة الحقن إلى حلول دفع (في حقنه) عن طريق عمود، من الضروري أن تقوم عليها الجانب الربيع لتجنب دفع فقاعات الهواء داخل العمود. إذا كان الفعل نقاء البروتين بعد التقارب اللوني كافية للتجارب اللاحقة، يمكن إهماله حجم الاستبعاد اللوني حيث أن جهاز فبلك قد لا يكون مطلوباً على الإطلاق.
كما يستغرق حوالي 2 أسابيع لجعل باكولوفيروسيس من البلازميدات بباكمام، زيادة الكفاءة، شاشة أولى للبروتين حسن تصرف homologs يمكن أن تتم من قبل الحصاد عابر transfected الخلايا HEK293 (مثلاً.، من طبق 60 مم) و اختبار كيف أعرب عن البروتين للفائدة (معلم بروتينات فلورية خضراء) يتصرف في المنظفات (مثلاً، DDM) مع الأسفار-الكشف عن حجم الاستبعاد اللوني (فسك)،من1824. والأكثر إنتاجاً للتركيز على ثوابت البروتين التي تعرض fluorescence قوية في transfected الخلايا HEK293 وحسن مونوديسبيرسيتي والاستقرار في فسيك.
وهناك العديد من التوصيات لزيادة العائد لتنقية البروتين. أولاً، قد تحتاج شروط TEV الهضم الأمثل لكل البروتين. يمكن أن يتم هذا باختبار مجموعة من نسب البروتين إلى TEV الشامل (مثلاً، 10:1، 5:1، 2:1، 1:1، 1:2 و 1:5 و 01:10) وتفرخ مرات (مثلاً 0.5 ح، ح 1، ح 2، 5 ح، وبين عشية وضحاها). بعد ذلك، اقترح لتشغيل العينات المعالجة في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل للتحقق من كفاءة الانقسام. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم لا للسماح لأي تسرب المادة طافية أو الوينت الطرد المركزي من الاتصالات على فبلك أو الحقن. وبالمثل، من المهم تجنب فقاعات عند بيبيتينج البروتين مركزة.
اللاحقة في المختبر تحليل الإجراءات المختلفة التي تستخدم البروتينات من هذا البروتوكول تشمل بلير الدهن والبلورات بالأشعة السينية والميكروسكوب الإلكتروني البرد، والتحليل الطيفي وإنتاجية عالية فحص8،25 , 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا المشروع من المعاهد الوطنية للصحة منح EY025290، GM127652، وجامعة روتشستر بدء التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
