Summary
הטיהור של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת, אבל ברגע מושגת, זה יכול העלול לאפשר במבחנה חקירות פונקציות ומבנים של הערוצים. כאן, אנו מתארים את נהלי stepwise הביטוי ואת טיהור bestrophin בתרבית של חלבונים, משפחה של Ca2 +-הפעלת ערוצי Cl– .
Abstract
הגנום האנושי מקודד ארבע paralogs bestrophin, כלומר BEST1, BEST2, BEST3 ו BEST4. BEST1, מקודדת על ידי הגן BEST1 , היא Ca2 +-מופעל Cl– ערוץ (CaCC) המתבטא בעיקר אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). החשיבות פיזיולוגיים ופתולוגיים של BEST1 מודגש על ידי העובדה כי מעל 200 מוטציות שונות בגן BEST1 קושרו מבחינה גנטית לקשת של פחות חמישה הפרעות ניווניות ברשתית, כמו vitelliform הטוב ביותר ניוון מקולרי (מחלת הטובה ביותר). לכן, הבנת את ביופיזיקה של ערוצי bestrophin ברמת מולקולה בודדת בעל חשיבות עליונה. עם זאת, קבלת תעלות יונים יונקים מטוהרים מהווה לעיתים קרובות משימה מאתגרת. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול עבור הביטוי של bestrophin בתרבית של חלבונים עם מערכת העברת גנים baculovirus BacMam וטיהור שלהם על ידי זיקה ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. החלבונים מטוהרים יש פוטנציאל להיות מנוצל עוקבות ניתוחים פונקציונליים ומבניים, כגון הקלטה אלקטרופיזיולוגיות השומנים bilayers ו קריסטלוגרפיה. חשוב לציין, צינור זה ניתן להתאים ללמוד את פונקציות והמבנים של תעלות יונים אחרים.
Introduction
Bestrophins הם משפחה של תעלות יונים והתפאורה דרך מינים שונים של חיידקים בני אדם1. בבני אדם, הגן BEST1 הממוקם על כרומוזום 11q12.3, מקודד חלבון הממברנה Bestrophin-1 (BEST1) מתבטאת בעיקר קרום basolateral של הפיגמנט ברשתית תאי אפיתל (RPE) של העיניים2,3 ,4. מורכבת של חומצות אמינו 585, הראשון ~ 350 מהם מאוד נשמרים בין המינים ומכילים את אזור transmembrane, BEST1 משמש CaCC בני האדם-1,-5,-6. יתר על כן, את homologs BEST1 בעופות וגם קלבסיאלה pneumoniae לפעול homopentamers7,8, מציע רמה גבוהה של שימור לאורך כל האבולוציה.
בבני אדם, מעל 200 מוטציות בגן BEST1 קלינית קושרו לקבוצה של מחלות ניוון רשתית הנקראת bestrophinopathies1,9. דווחו חמש bestrophinopathies ספציפיים, כולל מחלת הטוב ביותר, ניוון שרירים בגיל מבוגר vitelliform, vitreoretinochoroidopathy אוטוזומלית דומיננטית, אוטוזומלית bestrophinopathy רצסיבי רטיניטיס פיגמנטוזה3,4 ,10,11,12,13,14. מחלות אלו, אשר להוביל ירד ראייה ועיוורון אפילו, הם כיום חשוכת. על מנת לפתח טיפולים רפואיים ותרופות פוטנציאל אישי, זה קריטי להבין כמה מוטציות גורמי מחלות אלה BEST1 להשפיע על תפקוד ומבנה של ערוץ BEST115. לענין זה, חוקרים צריך להשיג את ערוצי bestrophin מטוהרים (פראי סוג ו/או חשבונאי) ולנהל במבחנה ניתוחים5,8.
הצעד הראשון מפתח היא הביטוי של bestrophin ערוצים מכל המינים העליונים בתאי יונקים. התמרה חושית baculovirus של תאים HEK293-F (מערכת BacMam) היא שיטה חזקה לבטא heterologously קרום חלבונים16,17, פרוטוקול זה מנצל וקטור BacMam אופטימיזציה (pEG BacMam) לביטוי חזקים של יעד חלבון18, אשר במקרה הזה הוא homolog bestrophin יונקים. וקטור זה שימש עבור הביטוי של קרום חלבונים שונים, כולל G-חלבון בשילוב קולטנים, רצפטורים גרעיניים אחרים יון ערוצי18. יש גם ראיות כי החלבונים המיוצרים מתאימים קריסטלוגרפיה18. עם רמות גבוהות של הביטוי בתאים HEK293-F, החלבונים ואז יטוהר באמצעות כרומטוגרפיה; באופן ספציפי, במקרה של bestrophins, זיקה וגם גודל הוצאת גזים יכול לשמש.
לאחר פרוטוקול זה הוא מכויל עבור ערוץ bestrophin, חלבון מטוהרים ניתן ואז לנתח אותם עבור הפונקציה שלה מבנה דרך מישורי ליפידית, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, בהתאמה5,8. בסך הכל, שיטות אלה מספקים צינור חזק חקירות פונקציונלי ומבניים של bestrophins, תעלות יונים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפקת BacMam ביטוי Baculoviruses
- להכניס את רצף קידוד של חלבון bestrophin בתרבית של הרצוי פג BacMam וקטור18 עם רצף זיהוי פרוטאז וירוס לחרוט טבק (אס), ואחריו GFP-10 x שלו-תג-קצה קרבוקסילי של החלבון.
- Transiently transfect את פלסמיד ביטוי לתוך דבק HEK293 תאים19,20,21,22,23. בדוק את הביטוי של החלבון GFP-fusion תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 10 X או 20 X הגדלה, מקור עירור 488 ננומטר מסנן פליטה nm 510 (איור 1 א').
הערה: תקנים מבוסס פולימר מתבצע באופן שגרתי עם μg 1 של פלסמיד הדנ א על צלחת 35 מ מ של תאים HEK293. - לייצר את baculoviruses בתאי חרקים Sf9 כפי שתואר לעיל16,17.
הערה: את המעבר 3 (P3) וירוס, אשר ישמש כדי להדביק את התאים HEK293-F עבור ייצור החלבון, שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש. - לקבוע את כייל נוגדנים (זיהומיות יחידות) של הנגיף P3 על ידי16,17assay היווצרות הפלאק.
הערה: כפי החלבון עניין המתויגת GFP, שיטה מהירה לבדיקת יחידות זיהומיות הוא להדביק תאים Sf9 עם דילולים טורי של הנגיף ולספור את מספר התאים פלורסנט לאחר 48 שעות.
2. חלבון ביטוי
- לשמור על התאים HEK293-F בתרבות הבולם עם המדיום ביטוי HEK293-F בחממה humidified 37 ° C עם 8% CO2. השתמש מבחנות תרבות חד פעמיים גדולים 2 - 2.5 פעמים יותר מאשר אמצעי האחסון תרבות, לסובב את התרבות על פלטפורמת מסלולית-135 סל ד.
הערה: מומלץ להדביק את התאים כאשר הם בין קטעים 5 ו- 30, כדי לבצע פעולות אלה ברדס התרבות תאים. - 24 שעות לפני זיהום ויראלי, להוסיף μL 15 של Trypan blue aliquot 15 μL של תרבית תאים, וכן לבדוק את צפיפות התאים ואת הכדאיות באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ. לדלל את התאים כדי 0.6 x 106 תאים/מ ל L 2 x 2 מבחנות כל אחד, עם 500 מ"ל של מדיום מראש חימם ב 37 º C.
הערה: תאים מתים מוכתמות. כחול Trypan blue. הכדאיות התא הרצוי הוא > 95%. - ביום של זיהום, לבדוק את צפיפות התאים ואת הכדאיות (שלב 2.2).
הערה: תא גבוהה הכדאיות של > 95% הוא חיוני עבור הביטוי זיהום וחלבון יעיל. צפיפות תא הצפוי הוא ~1.0 x 106 תאים/mL (מבוגר בלילה מ- 2 x 500 מ ל 0.6 x 10 תרבית תאים תאים למ"ל6 ). מספר התאים הכולל הצפוי הוא ~1.0 x 109. - הוסף את baculoviruses P3 התאים-ריבוי של זיהום (MOI) 5. כדי לקבוע את כמות וירוס לחסן, השתמש במשוואה הבאה:
- לנער את התאים על פלטפורמת מסלולית-135 סל ד ב חממה humidified 37 ° C עם 8% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
- להוסיף 10 מ מ של נתרן butyrate התרבות התא ולהמשיך המקננת במשך 48 שעות.
הערה: עבור כמה חלבונים, להקטין את הטמפרטורה התרבות התא עד 30 ° C לאחר תוספת butyrate נתרן עשוי לשפר את הביטוי ויציבות. - תחת מיקרוסקופ זריחה עם 10 X או 20 X הגדלה, מקור עירור 488 ננומטר, 510 ננומטר מסנן פליטה, לבדוק את אחוז והבהירות של תאים ירוק, אשר ישירות מייצגים את התשואה חלבון (bestrophin-GFP-10xHis) (איור 1B).
הערה: אחוז תאים ירוק מחושב על-ידי: 100 x (תאים תאים ירוק/סה כ). רמת ביטוי חלבון טוב מסומן על-ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק חזק מתחת למיקרוסקופ. - לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו על 1,000 x g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דק. הסר תגובת שיקוע, מחדש להשעות את כדורי תא עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) באמצעי אחסון הסופי של ~ 80 מ. פיצול התליה תא לתוך צינורות חרוט 2 x 50 מ"ל, צנטריפוגה-1000 g x ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לאחסן את כדורי תא ב-80 מעלות צלזיוס.
3. חלבון טיהור
- דגירה הצינורות חרוט שמכילה את כדורי תא באמבט מים מלהיב בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות, כך הם להפשיר. מחדש להשעות את התאים 2 x נפח (w/v) של מאגר א (טבלה 1) (למשל, 10 גרם של התא כדורי ב- 20 מ של המאגר) בתוספת מעכבי proteinase (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin ו phenylmethylsulfonyl פלואוריד) ב 0.1-1.0 מ מ. Pipet למעלה ולמטה בהרחבה כדי לקבל השעיה תא הומוגנית.
- Lyse התאים באמצעות מהמגן בלחץ גבוה. התליה תא להריץ את מהמגן ב 7-10 MPa עבור סכום כולל של 3 - 4 פעמים כדי להשיג המגון מלאה. לשמור את התא lysate על הקרח במשך 2-3 דקות בין הסיבובים.
- להוסיף אבקת [למשל, 2% w/v סול-כיתה n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] על התא lysate. דגירה עם עצבנות עבור 1 h ב- 20 ° C כדי לחלץ את החלבונים ממברנה.
הערה: הסוג של דטרגנט צריך להיות אופטימיזציה עבור כל חלבון המטרה18,24. - צנטריפוגה-150,000 x g ב- ultracentrifuge ב 4 ° C עבור 1 h.
הערה: כל הפעולות הבאות יבוצעו ב 4 º C. - לאסוף את התא ברורה lysate זרימה לעבור מ ל ני המלכודת שלו2 +נ - זיקה עמודה מראש equilibrated עם מאגר (טבלה 1).
הערה: לאחר צנטריפוגה, התא ברורה lysate להיות דחוקה בין גלולה בתחתית שכבה מעונן על העליונה. להשתמש pipet העברה של 10 מ"ל בזהירות לאסוף את lysate ברור ולאחר מכן לעבור למצב 1 מ"ל pipet האחרונה כמה מיליליטר של lysate. להימנע בגדר, אשר יכולים להיסתם הטור2 + ני; אולם, כמות קטנה של השכבה העליונה בסדר או וניתן לסנן עם מסנן 1.5 μm. - לשטוף את העמודה עם 25 מ של מאגר B ולאחר מכן 40 מ של מאגר C (לוחות 2 ו 3, בהתאמה).
הערה: זה מקום טוב לקחת הפסקה, כמו טיהור מוחלט עשוי להימשך עד 12 שעות ולא החלבון יכול להישאר יציבה בזמן מצורף לעמודה בן לילה. - לצרף את העמודה מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) חלבון מהיר, elute החלבון מן העמודה עם 13 מיליליטר מאגר D (טבלה 3) עם fractionation. לאסוף את השברים מועשרת חלבון על פי מדידה ספיגת UV.
הערה: FPLC התנאים הם כדלהלן: גודל השבר 1.0 מ"ל, אזעקת לחץ בעמודה טרום מוגדר 0.3 מגפ ס, של קצב זרימה של 0.5 mL/min. - למדוד חלבון eluted המוצר התרכזות ספקטרופוטומטרים microvolume. לקרוא את ספיגת ב 280 ננומטר.
- (אופציונלי) כדי להסיר את התג GFP-10xHis, להוסיף את פרוטאז אס ביחס מסה של 1:1, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: התג או לא משפיעה בפונקציה או מבנה של הערוץ מטוהרים. חישוב הסכום אס נפח, ריכוז החלבון שנאספו מצעדי 3.7-3.8. למשל, אם 10 מ"ל • תנאי המוצר ונשתמש נמדד ב- 0.1 מ"ג/מ"ל, החלבון סה כ המסה הוא 10 x 0.1 = 1 מ"ג, ו- 1 מ"ג של אס ישמש לעיכול. - לרכז את החלבון עם צנטריפוגלי 15מל (50 או 100 kDa) יחידת מסנן על-ידי ספינינג-g x 4,000 ב 4 ° C עד נפח סופי של 400-500 μL (עבור לולאה דגימה העמסה 2 מ ב- FPLC).
הערה: הזמן centrifuging הריכוז משתנה בהתאם הריכוז ואת גודל של החלבון. כדי למנוע ריכוז יתר, אשר עשויים לגרום חלבון משקעים, ספין 10 דקות בהתחלה, להתבונן האחסון הנותרים ואז מעריכים את הזמן לסיבוב עוקבות (למשל, 2-5 דקות), וכן הלאה, כדי להשיג את עוצמת הקול הסופי. Pipet בין מהדורות כדי לפזר את החלבון, באווסטה לתחתית של המסנן. - להעביר את חלבון מרוכז mL 1.5 חדש צינור ולהסיר כל המשקע או בועות מן המוצר מרוכז. ספין > g 12,000 x למשך 5-10 דקות ב 4 ° C ולאסוף תגובת שיקוע צינור 1.5 mL החדש.
- לטעון את המוצר הסופי עם מזרק 1 מ"ל, מחט עגול-טיפ על מערכת FPLC עבור גודל-הדרה כרומטוגרפיה העמודה גודל-הדרה equilibrated מראש באמצעות מאגר E (טבלה 5).
הערה: FPLC התנאים הם כדלהלן: גודל השבר 0.5 mL, אזעקת לחץ בעמודה טרום מוגדר כ- 2.50 MPa, נפח זרימה מוגדר כ- 30 מ של מאגר אלקטרוני (טבלה 5), קצב זרימה מוגדר על 0.5 mL/min. - שים לב חלבונים ומנומסת לרוץ כמו לשיא יחיד (איור 2 א), לאסוף את fraction(s) חלבון התואם את השיא (איור 2 א).
- לרכז את החלבון עם יחידת מסנן צנטריפוגלי 4 מ"ל או 0.5 mL (מ שרשם משקל מולקולרי זהה כמו שלב 3.10), ספין ב g x 4,000 ב 4 ° C כדי ריכוז הסופי של 5-10 μg/μL. להשתמש את ספקטרופוטומטרים לבדיקת ריכוז התוצר הסופי (שלב 3.8).
הערה: משתנה זמן צנטריפוגה, כמו נפח המוצר הסופי יכול להיות שונה בין ניסויים טיהור. בדרך כלל, צנטריפוגה לוקח 10-20 דקות. מומלץ pipet בין מהדורות כדי לפזר את החלבון, באווסטה לתחתית של המסנן. - להעביר את חלבון מרוכז צינור 1.5 מ. להסיר את כל התמיסה על ידי צריך שתוציאו > g 12,000 x למשך 5-10 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ. להפוך aliquots μL 10 עבור אחסון ב- 80 ° C ולשמור קטנים-aliquot אחד של 2-5 μL, לפעול ב- 4-15% ג'ל מרחביות-דף מעבר צבע ב V 9/ס מ (איור 2B).
- לאשר את הזהות של החלבון מטוהרים באמצעות ספקטרומטר מסה8.
הערה: ניתוח במבחנה של הפונקציה ואת המבנה של החלבון מטוהרים ניתן לבצע דרך מישורי ליפידית, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, בהתאמה5,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים transiently transfected דבק HEK293 (איור 1 א') הוא אינדיקטור טוב עבור רמת ביטוי חלבון המוקרנת בתאים HEK293-F ההשעיה (איור 1B). אם החלבון היעד אינה ביטוי היטב או הוא בזיהוי שגיאות מקומי בתאים HEK293 לאחר ארעי תרביות תאים, מומלץ לשקול שינוי הביטוי הבונה (למשל., שינוי המיקום של תג ה-GFP או יצירת מוטציות/truncations על חלבון המטרה). HEK293-F קטן ההשעיה תרבויות (למשל, תרבויות 25 מ ל) משמשים כדי למטב את התנאים עבור ביטוי חלבון, ביניהם הזיהום MOI ו culturing הטמפרטורה כבר החשובים ביותר בחוויות קודמות.
הוא מוצלח לטיהור מציינים לשיאם הראשי יחיד בתוך האחסון • תנאי הצפוי גודל-הדרה כרומטוגרפיה (איור 2 א), להקה דומיננטית אחת על ג'ל מרחביות-דף denatured (איור 2B). אם מספר פסגות מופיעה הכרומטוגרפיה גודל-הדרה, חשוב לאסוף את כל שיא ולהפעיל ג'ל יליד לקביעת שיא אשר מכיל את pentamers ערוץ פונקציונלי. יצוין, כי בין שני המבנים חלבון, רמת הביטוי, המצוינים על-ידי קרינה פלואורסצנטית עוצמת בזמנו של קציר, לא nesessarily לתאם עם התשואה הסופית, כל מבנה החלבון פועל באופן שונה במהלך טיהור. על חלבון bestrophin ומנומסת, 200-500 µg של המוצר הסופי מטוהרים בדרך כלל ניתן לקבל מ- 1 ליטר של HEK293-F ההשעיה תאים.
איור 1: ביטוי של חלבון bestrophin יונקים. תמונות מיקרוסקופיות של bestrophin יונקים מתויג GFP הביע בתאים (א) דבק HEK293 על-ידי תרביות תאים פלסמיד ולאחר ההשעיה (ב) HEK293F תאים על-ידי זיהום baculovirus. שמאלה = קרינה פלואורסצנטית ירוק; ימינה = שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: טיהור של חלבון bestrophin יונקים. (א) זיקה וניקוי חלבונים מתויג GFP ניהל על עמודה ג'ל-סינון גודל אי-הכללה של פסגה אחת הראשי. שברים בין קווים מקווקווים נאספו. (ב) המוצר הסופי חלבון רץ על ג'ל מרחביות-דף עם סולמות (עמודה שמאלית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מגיב | MW | סכום לפי 1 ליטר | סופי |
| HEPES | 238.3 | 11.9 g | 50 מ מ |
| NaCl | 58.44 | 17.529 g | 300 מ"מ |
| גליצרול | 92.09 | 50 מ | 5% (v/v) |
| Imidazole | 68.1 | 1.3616 g | 20 מ מ |
| MgCl2 | 203 | 0.20331 g | 1 מ מ |
| tris(2-carboxyethyl) פוספין | 287 | 2.5 מ ל-200 מ מ מניות | 0.5 מ מ |
טבלה 1: חלבון טיהור מאגר (מאגר Resuspension)
| מגיב | MW | סכום לפי 1 ליטר | סופי |
| HEPES | 238.3 | 11.9 g | 50 מ מ |
| NaCl | 58.44 | 17.529 g | 300 מ"מ |
| גליצרול | 92.09 | 50 מ | 5% (v/v) |
| Imidazole | 68.1 | 2.7232 g | 40 מ מ |
| MgCl2 | 203 | 1.01655 g | 5 מ מ |
| tris(2-carboxyethyl) פוספין | 287 | מניות 200 מ"מ 0.5 mL | 0.1 מ מ |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 ג'י | 0.05% (w/v) |
טבלה 2: חלבון טיהור מאגר B (קודם לשטוף את מאגר)
| מגיב | MW | סכום לפי 1 ליטר | סופי |
| HEPES | 238.3 | 5.95 g | 25 מ מ |
| NaCl | 58.44 | 29.2 g | 500 מ מ |
| גליצרול | 92.09 | 50 מ | 5% (v/v) |
| Imidazole | 68.1 | 5.1 גר' | 75 מ מ |
| tris(2-carboxyethyl) פוספין | 287 | מניות 200 מ"מ 0.5 mL | 0.1 מ מ |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 ג'י | 0.05% (w/v) |
טבלה 3: חלבון טיהור מאגר C (לשטוף שנית מאגר)
| מגיב | MW | סכום לפי 1 ליטר | סופי |
| HEPES | 238.3 | 7.74 g | 32.5 מ מ |
| NaCl | 58.44 | 11.686 g | 200 מ מ |
| גליצרול | 92.09 | 25 מ | 2.5% (v/v) |
| Imidazole | 68.1 | 17.02 גרם | 250 מ מ |
| tris(2-carboxyethyl) פוספין | 287 | מניות 200 מ"מ 0.5 mL | 0.1 מ מ |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 ג'י | 0.05% (w/v) |
טבלה 4: חלבון טיהור מאגר D (מאגר • תנאי)
| מגיב | MW | סכום לפי 1 ליטר | סופי |
| HEPES | 238.3 | 9.53 g | 40 מ מ |
| NaCl | 58.44 | 11.686 g | 200 מ מ |
| tris(2-carboxyethyl) פוספין | 287 | מניות 200 מ"מ 0.5 mL | 0.1 מ מ |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 ג'י | 0.05% (w/v) |
טבלה 5: חלבון טיהור מאגר E (ג'ל סינון מאגר)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר צינור שימושי עבור הביטוי ולטיהור bestrophin בתרבית של תעלות יונים שישמש עבור ניתוחים עתידיים במבחנה . בעוד המכשיר FPLC נדרש עבור גודל-הדרה כרומטוגרפיה, מזרק משאבה מספיקה עבור כל השלבים של כרומטוגרפיית זיקה כולל איגוד, שטיפה ו- eluting. בעת שימוש משאבת מזרק כדי לדחוף פתרונות (מזרק) דרך העמודה, חיוני ביסוד הצד האביב כדי להימנע דוחפים בועות אוויר לתוך העמודה. אם הטוהר של החלבון לאחר כרומטוגרפיית זיקה כבר מספיק בשביל הניסויים הבאים, גודל הוצאת גזים יכול להיות מושמט כך מכשיר FPLC לא ייתכן שתידרש בכלל.
כפי לוקח כשבועיים להכין את baculoviruses מן pBacMam פלסמידים, כדי להגביר את היעילות, המסך הראשוני עבור חלבון ומנומסת homologs יכול להתבצע ע י חציבת התאים HEK293 transiently transfected (למשל., מתוך קערה 60 מ מ), בדיקה כיצד באה לידי ביטוי חלבון עניין (מתויגת GFP) יתנהג דטרגנטים (למשל, DDM) עם פלורסצנטיות לזיהוי הגודל-הדרה כרומטוגרפיה (FSEC)18,24. . זה הפורה ביותר להתמקד בונה חלבון המציגים פלורסצנטיות חזקה transfected תאים HEK293, monodispersity טובים ויציבות ב- FSEC.
ישנן מספר המלצות להגדלת היבול של חלבון טיהור. ראשית, התנאים לעיכול אס ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור כל חלבון. זה יכול להיעשות על ידי מגוון של יחסי מסת חלבון-אל-אס (למשל, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 ו- 1:10) והבדיקות המקננת פעמים (למשל, h 0.5, 1 h 2 h, 5 h ובן לילה). לאחר מכן, הוא הציע להפעיל שהדגימות שטופלו מרחביות-בדף ג'ל כדי לבדוק את יעילות המחשוף. בנוסף, חשוב לא לתת כל דליפה תגובת שיקוע או eluent צנטריפוגלי מחוץ החיבורים FPLC או מזרקים. בדומה לכך, חשוב להימנע בועות כאשר pipetting חלבון מרוכז.
עוקבות במבחנה ניתוח הליכים שונים לנצל את החלבונים של פרוטוקול זה כוללים ליפידית, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, הקפאה-מיקרוסקופ, ספקטרוסקופיה, תפוקה גבוהה הקרנת8,25 , 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH EY025290, GM127652, אוניברסיטת רוצ'סטר סטארט-אפ מימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
