Summary
イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2 +の家族の浄化の段階的な手順を述べる-Cl-チャンネルを活性化します。
Abstract
人間のゲノムは、4 つの bestrophin paralogs、すなわち BEST1、BEST2、ベスト 3、ベスト 4 をエンコードします。BEST1の遺伝子によって符号化される BEST1 は、Ca2 +-アクティブに Cl-チャネル (CaCC) 主に網膜色素上皮 (RPE) で表されます。BEST1 の生理学的および病理学的意義がBEST1遺伝子の 200 以上の異なる変異が最高の卵黄など少なくとも 5 つの網膜変性疾患のスペクトルに遺伝的リンクされているという事実によって強調表示されます。黄斑ジストロフィー (疾患)。したがって、非常に大きな意義を保持 bestrophin チャネルを単一分子レベルでの生物物理を理解すること。ただし、精製された哺乳類のイオン チャネルを得ることはやりがいのある仕事ではしばしばです。ここで、哺乳類 bestrophin BacMam バキュロ ウイルスの遺伝子の転送システムと親和性とサイズ排除クロマトグラフィーの浄化蛋白質の表現のためのプロトコルを報告します。浄化された蛋白質脂質二重層と結晶の電気生理学的記録など、以降の機能・構造解析に活用される可能性があります。重要なは、このパイプラインは他のイオン チャネルの構造と機能を研究する合わせることができます。
Introduction
Bestrophins は、人間1細菌からさまざまな種を保存するイオン チャネルの家族です。ヒトでは、 BEST1の遺伝子、染色体 11q12.3 に位置するエンコード膜タンパク質 Bestrophin-1 (BEST1) 目2,3 の網膜色素上皮 (RPE) 細胞の基底膜で主に表される ,4。うち最初の 〜 350 種間保存性が高いと、膜貫通領域を含む、585 アミノ酸から成る BEST1 人間1,5,6に CaCC を果たします。さらに、鶏の BEST1 同族体および肺炎桿菌の両方として機能する homopentamers7、8、進化を通じて保全の高レベルを示唆しています。
ヒトでは、200 以上BEST1遺伝子変異を臨床的に bestrophinopathies1,9と呼ばれる網膜変性疾患のグループにリンクされています。ベスト病、成人発症卵黄状黄斑ジストロフィー、常染色体優性の支配的な vitreoretinochoroidopathy、常染色体優性劣性 bestrophinopathy、網膜色素変性症3,4 など 5 つの特定の bestrophinopathies が報告されています。 ,,1011,12,13,14。視力の低下、さらには失明につながるが、これらの病気、現在治療されます。治療上の処置および可能性のある個人化された薬を開発するために関数と BEST1 チャネル15の構造のこれらのBEST1病気を引き起こす突然変異の影響を理解するが重要です。これらの目的のための研究者の in vitro解析5,8を行い精製 bestrophin (野生型および変異) チャンネルを取得する必要があります。
最初の重要なステップは、哺乳類細胞における高い種から bestrophin チャンネルの式です。このプロトコルが堅牢な発現の最適化された BacMam ベクトル (BacMam pEG) を利用して F HEK293 細胞 (BacMam システム) のバキュロ ウイルス伝達はクローン膜タンパク質16,17を表現する強力な方法は、ターゲット蛋白質18, この場合 bestrophin 哺乳類ホモログであります。このベクターは、G タンパク質共役受容体、核内受容体、イオン チャンネル18など、各種の膜タンパク質の発現のために使用されています。また、作り出されたタンパク質が結晶18に適している証拠です。F HEK293 細胞における発現の高レベルの蛋白質できます、精製するクロマトグラフィー具体的には、bestrophins、場合親和性とサイズ排除クロマトグラフィーを使用することができます。
このプロトコルは bestrophin チャンネルの微調整が、浄化された蛋白質は関数と平面脂質二分子膜とそれぞれ5,8、x 線結晶構造解析による構造を分析できます。完全に、これらのテクニックは、bestrophins と他のイオン チャネルの構造と機能の調査のため強力なパイプラインを提供します。
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Protocol
1. 生産 BacMam 式バキュロ
- BacMam ベクトル18 GFP 10 続くタバコ Etch ウイルス (TEV) プロテアーゼ認識シーケンス、ペグに必要な哺乳類 bestrophin 蛋白質のコーディング シーケンスを挿入、タンパク質の C 末端タグ x。
- 一過性発現プラスミドを接着剤 HEK293 細胞19,20,21,22,23に transfect します。10 倍や 20 倍の倍率、488 nm 励起ソース 510 nm 発光フィルター (図 1 a) と蛍光顕微鏡下で GFP 融合タンパク質の発現を確認してください。
注: ポリマー ベースのトランスフェクションには、1 μ g のプラスミド DNA HEK293 細胞の 35 mm ディッシュ用、日常的に実行されます。 - 前述の16,17として Sf9 昆虫細胞におけるバキュロを生成します。
注: 通路 3 (P3) ウイルス、タンパク質生産のため F HEK293 細胞に感染するために使用が、4 ° C で保存できる 1 ヶ月。 - プラーク形成アッセイ16,17P3 ウイルスの力価 (感染単位) を決定します。
注: 興味の蛋白質に GFP タグは、感染ユニットを確認するより高速な方法はウイルスのシリアル希薄と Sf9 細胞に感染して 48 時間後蛍光セルの数をカウントします。
2. タンパク質発現
- 8% の CO2と 37 ° C 加湿インキュベーター HEK293 F 式培地と浮遊培養で HEK293 F 細胞を維持します。使い捨て文化フラスコ 2 〜 2.5 倍より大きい文化のボリュームよりも、回転で 135 回転軌道プラットフォーム上のカルチャを使用します。
注: お勧め 5 と 30 の通路の間にあるとき、細胞に感染して細胞文化フードの下でこれらのアクションを実行します。 - ウイルス感染前に 24 h は細胞培養の 15 μ 因数にトリパン ブルー色素の 15 μ L を追加してセル密度と生存率の顕微鏡下での検定を使用しています。各媒体の 500 ml で 37 ° C に加温 2 x 2 L フラスコに 10 の6セル/mL x 0.6 に細胞を希釈します。
注: 死んだ細胞がブルーで染色トリパン ブルー.目的のセル実行可能性は、> 95%。 - 感染の日、細胞密度と生存率 (手順 2.2) を確認します。
注: の高い細胞生存率 > 95% は効率的な感染および蛋白質の表現のために不可欠です。予想される細胞密度は、~1.0 x 106セル/mL (10 6/mL の細胞培養 x 0.6 の 2 x 500 mL から成長した一晩) です。予想される総細胞数は ~1.0 x 109です。 - 5 の感染 (MOI) の多様性で細胞に P3 バキュロを追加します。接種するウイルスの量を調べるには、するには、次の式を使用します。
- 24 h の 8% の CO2と加湿の 37 ° C のインキュベーターで 135 の rpm の軌道プラットフォーム上のセルを振る。
- 細胞培養に酪酸の 10 mM を追加し、48 時間の培養を続けます。
注: いくつかの蛋白質の細胞培養温度を 30 ° C に削減して後ナトリウム酪酸添加が式と安定性を向上します。 - 10 倍や 20 倍の倍率、488 nm 励起ソース、510 nm 発光フィルター蛍光顕微鏡、割合と直接 (図 1 b) 蛋白質 (bestrophin-GFP-10xHis) 収量を表す緑の細胞の明るさを確認します。
注: 緑の細胞の割合によって計算されます: (緑色のセル/合計セル) × 100。良いタンパク質発現レベルは、顕微鏡下で強力な蛍光グリーンで示されます。 - 4 ° C、20 分削除上清に 1,000 × g で遠心分離によって細胞を収穫し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ~ 80 mL の最終巻に、細胞ペレットを再中断します。分割 2 x 50 mL の円錐管に 4 ° C で 1,000 x g で 20 分間遠心細胞懸濁液は-80 ° C で細胞ペレットを格納します。
3. 蛋白質の浄化
- 解凍するように 10-15 分間室温で攪拌水浴の細胞ペレットを含む円錐管を孵化させなさい。0.1 〜 1.0 プロテイナーゼ阻害剤 (特異ペプスタチン A、Leupeptin アプロチニン フッ化) 補われる (w/v) 量のバッファー (表 1) (例えば、 20 mL のバッファーで細胞ペレットの 10 g) x 2 のセル中断再 mM。上下ピペット広範囲に均一な細胞の懸濁液を得る。
- 高圧ホモジナイザーを用いた細胞を溶解させます。細胞懸濁液を通すホモジナイザーの合計のための 7-10 MPa で 3-4 回完全な均質化を達成するために。ラウンドの間 2-3 分のため氷の上細胞ライセートをしてください。
- 細胞ライセートに洗剤 [例えば2 w/v ソル グレード n-ドデシル-β-D-Maltopyranoside (DDM)] を追加します。膜タンパク質を抽出する 20 の ° C で 1 時間攪拌で孵化させなさい。
注: タイプの洗剤は、各蛋白質ターゲット18,24用に最適化する必要があります。 - 1 h の 4 ° C で遠心で 150,000 × g で遠心分離機します。
注: 次の手順のすべては 4 ° C で実行されます。 - 明確な細胞ライセートと流れ、5 mL の彼のトラップ Ni2 +-国税庁アフィニ ティー ・ カラムを通してそれは事前 (表 1) のバッファーで平衡を収集します。
注: 遠心分離の後明確な細胞ライセートは下部にペレットと曇りの層の上にサンドイッチされ。10 mL のピペットを使用して、慎重にクリア ライセートを収集、ライセートの数ミリリットル最後の 1 mL ピペットに切り替えています。Ni2 +列を詰まらせることが、ペレットを避けるためただし、最上位のレイヤーの少量は大丈夫ですまたは 1.5 μ m フィルターで除外することができます。 - 洗浄バッファー B 25 mL とし、40 mL のバッファー C 列 (表 2 および 3、それぞれ)。
注: これは休憩合計浄化は最大 12 時間をかかることがあり、タンパク質は一晩の列に接続されている間安定している残ることができる良い場所です。 - タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムに列を添付し、13 mL のバッファー D を持つ列から (表 3) をもつタンパク質分画を溶出します。UV 吸光度読み出しによるとタンパク質濃縮分数を収集します。
注: 、FPLC 条件は次のとおり: 1.0 mL 分数サイズ、0.3 MPa、流量を 0.5 mL/min に設定前のカラムの圧力警報。 - 微量分光光度計で溶離されたタンパク質製品の濃度を測定します。280 吸光度を読み nm。
- (省略可能)10xHis GFP タグを削除するには、1:1 の質量比で TEV プロテアーゼを追加し、4 の ° C で 30 分間インキュベートします。
メモ: タグ、関数または浄化されたチャネルの構造には影響があります。TEV ボリューム ステップ 3.7 3.8 から収集された蛋白質の濃度から算出します。例えば、10 mL の溶出物を収集し、0.1 mg/ml、総蛋白測定質量は TEV の 10 × 0.1 = 1 mg、および 1 mg が消化に使用されます。 - (50 または 100 kDa) 15 ml 遠心蛋白質を集中 (2 mL サンプル読み込みループ FPLC) の 400-500 μ L の最終巻に 4 ° C で 4,000 x g で回してフィルター ユニット。
注: 濃度の遠心時間は濃度と蛋白質のサイズによって異なります。過集中を避けるため、可能性があります蛋白質の沈殿物を引き起こす、最初は、10 分間スピンし、残りのボリュームを観察および後続のスピンに時間を見積もる (例えば2-5 分) というように、最終的なボリュームを取得します。フィルターの下に引かれているタンパク質を分散させるためにスピン間ピペットで移しなさい。 - 新しい 1.5 mL チューブまたは削除する任意の沈殿物の泡集中製品から高濃度のタンパク質を転送します。スピン > 4 ° C および収集新しい 1.5 mL チューブに上清を 5-10 分のための 12,000 × g。
- あらかじめバッファー E (表 5) が平衡サイズ排除カラム 1 mL シリンジとサイズ排除クロマトグラフィー用 FPLC システムのラウンド チップ針で最終製品をロードします。
注: 、FPLC 条件は次のとおり: 0.5 mL 分数サイズ、2.50 MPa に設定前のカラムの圧力警報、30 mL のバッファー E に設定流量(表 5)、流量を 0.5 mL/min に設定します。 - 行儀蛋白質 (図 2 a) 単一のピークとして実行 (図 2 a) をピークに対応するタンパク質 fraction(s) を集めることに注意します。
- (ステップ 3.10 のように同じ分子量カットオフ) の 4 mL または 0.5 mL の遠心フィルター ユニットとスピンを最終濃度 5-10 μ g/μ L の 4 ° C で 4,000 x g でタンパク質を集中します。分光光度計を使用して、最終製品濃度 (ステップ 3.8) をチェックします。
注: 遠心時間、最終製品ボリュームことができます浄化試験間で異なるとは異なります。遠心分離は、通常、10 〜 20 分かかります。フィルターの下に引かれているタンパク質を分散させるためにスピン間のピペットにそれをお勧めします。 - 高濃度のタンパク質を新しい 1.5 mL チューブに転送します。遠心分離によって任意の沈殿物を削除 > 4 ° C で 5 ~ 10 分の 12,000 × g上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。ストレージのための 10 の μ 因数-80 ° c、9 V/cm (図 2 b) 4 15% 勾配 SDS ページのゲル上で実行する 1 つの 2-5 μ L 小さい因数を保存します。
- 質量8によって浄化された蛋白質のアイデンティティを確認します。
注: 関数のIn vitro解析と浄化された蛋白質の構造平面脂質二分子膜と x 線結晶構造解析、それぞれ5,8を介して実行できます。
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Representative Results
一過性トランスフェクション接着 HEK293 細胞 (図 1 a) の蛍光強度は、サスペンション F HEK293 細胞 (図 1 b) に投影されたタンパク質発現レベルの良い指標です。表現の構成要素を変更することを検討する場合はターゲット蛋白質が発現された、または、誤 HEK293 細胞にトランスフェクション後ローカライズされて、お勧め (e.gGFP タグの位置を変更する、または突然変異/切り捨て。ターゲット蛋白質のために)。小さな HEK293 F サスペンション文化 (例えば、 25 mL 文化) は、その中で MOI 感染、培養温度が過去の経験の中で最も重要なされている蛋白質の表現のための条件を最適化するために使用されます。
成功の浄化は、サイズ排除クロマトグラフィー (図 2 a) と変性の SDS ページのゲル (図 2 b) の単一の支配的なバンドで予想される溶出ボリュームで単一主要なピークで示されます。サイズ排除クロマトグラフィーに複数のピークがある場合は、各ピークを収集し、どのピークを含む機能チャネル ポリアクリルアミドゲルを決定するためのネイティブのゲルを実行することが重要です。それは、2 つの蛋白質の構造の間式レベル示されている収穫の時に蛍光強度でない nesessarily は最終的な収量と関連付ける浄化中に各蛋白質の構造が異なりますので注意してください。行儀 bestrophin 蛋白質のため、最終精製製品の 200-500 μ g は、HEK293 F 懸濁細胞の 1 L から通常入手できます。
図 1: 哺乳類 bestrophin 蛋白質発現。GFP 付けられた哺乳類 bestrophin の顕微鏡画像で表現 (A) 接着剤 HEK293 細胞 (B) 懸濁液でプラスミド トランスフェクションを HEK293F セル バキュロ ウイルス感染によって。左 = 緑の蛍光性;右 = 明るいフィールド。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 哺乳類 bestrophin タンパク質の精製します。(A) 親和性浄化された GFP 付けられた蛋白質は 1 つの主要なピークとしてサイズ排除ゲルろ過カラムに走った。破線の間の分数を集めました。(B) 最終蛋白質の製品は、はしご (左の列) と SDS ページのゲルに走った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬 | MW | 1 L あたりの金額 | 最終的な |
| HEPES | 238.3 | 11.9 g | 50 mM |
| 塩化ナトリウム | 58.44 | 17.529 g | 300 mM |
| グリセロール | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| イミダゾール | 68.1 | 1.3616 g | 20 mM |
| MgCl2 | 203 | 0.20331 g | 1 mM |
| tris(2-carboxyethyl) ホスフィン | 287 | 2.5 mL 200 mM 在庫 | 0.5 mM |
表 1: 蛋白質の浄化のバッファー (バッファー巻き上がり)
| 試薬 | MW | 1 L あたりの金額 | 最終的な |
| HEPES | 238.3 | 11.9 g | 50 mM |
| 塩化ナトリウム | 58.44 | 17.529 g | 300 mM |
| グリセロール | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| イミダゾール | 68.1 | 2.7232 g | 40 mM |
| MgCl2 | 203 | 1.01655 g | 5 mM |
| tris(2-carboxyethyl) ホスフィン | 287 | 0.5 mL 200 mM 在庫 | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
表 2: タンパク質精製バッファー B (最初洗浄バッファー)
| 試薬 | MW | 1 L あたりの金額 | 最終的な |
| HEPES | 238.3 | 5.95 g | 25 mM |
| 塩化ナトリウム | 58.44 | 29.2 g | 500 mM |
| グリセロール | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| イミダゾール | 68.1 | 5.1 g | 75 mM |
| tris(2-carboxyethyl) ホスフィン | 287 | 0.5 mL 200 mM 在庫 | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
表 3: タンパク質精製バッファー C (2 番目の洗浄バッファー)
| 試薬 | MW | 1 L あたりの金額 | 最終的な |
| HEPES | 238.3 | 7.74 g | 32.5 mM |
| 塩化ナトリウム | 58.44 | 11.686 g | 200 mM |
| グリセロール | 92.09 | 25 mL | 2.5% (v/v) |
| イミダゾール | 68.1 | 17.02 g | 250 mM |
| tris(2-carboxyethyl) ホスフィン | 287 | 0.5 mL 200 mM 在庫 | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
表 4: タンパク質精製バッファー D (溶出バッファー)
| 試薬 | MW | 1 L あたりの金額 | 最終的な |
| HEPES | 238.3 | 9.53 g | 40 mM |
| 塩化ナトリウム | 58.44 | 11.686 g | 200 mM |
| tris(2-carboxyethyl) ホスフィン | 287 | 0.5 mL 200 mM 在庫 | 0.1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0.5 g | 0.05% (w/v) |
表 5: タンパク質精製バッファー E (ゲルろ過バッファー)
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Discussion
このプロトコルでは、将来の in vitro解析に使用される哺乳類 bestrophin イオン チャネルの発現と精製に有用なパイプラインについて説明します。サイズ排除クロマトグラフィー用 FPLC デバイス、シリンジ ポンプはアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのバインド、洗濯、溶出性などのすべてのステップのために十分。列を (注射器) でプッシュ ソリューションにシリンジ ポンプを使用する場合列に空気の泡を押すことを避けるためにスプリング側をアンダーレイに欠かせません。後アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質の純度は、その後の実験のために十分が既にいる場合、FPLC デバイス可能性があります必要はありませんすべてのサイズ排除クロマトグラフィーを省略できます。
PBacMam プラスミドからバキュロを作るのに約 2 週間かかる、効率化行儀タンパク質同族体の初期画面を実現できる一時的に transfected HEK293 細胞を収穫 (e.g、60 mm ディッシュから) と。テスト方法、興味の蛋白質の表現 (例えばDDM) 洗剤の蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー (FSEC)18,24動作 (GFP タグ付き)。FSEC の安定と状単分散良い transfected HEK293 細胞で強い蛍光を示すタンパク質の構造に焦点を当てる最も生産的です。
蛋白質の浄化の収率を増加させるのにいくつかの推奨事項があります。まず、TEV 消化のための条件は、各蛋白質のために最適化する必要があります。これは、タンパク質-TEV 質量比 (例えば10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10) の範囲をテスト (など0.5 h、1 h、2 h、5 h と一晩) 回インキュベートして行うことができます。その後、開裂の効率をチェックするゲルの SDS のページで扱われたサンプルを実行することをお勧めします。また、FPLC またはシリンジの接続から遠心上清または溶離液流出をさせることが重要です。同様に、高濃度のタンパク質をピペッティング時に泡を避けるために重要です。
様々 な後続の in vitro解析手順この議定書から蛋白質を利用するは、脂質二重層、x 線結晶構造解析、クライオ電子顕微鏡、分光、ハイスループットス クリーニング8,25,26。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、立ち上げ資金のためのロチェスターの大学、GM127652、NIH 助成金 EY025290 で賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
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