Summary
A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .
Abstract
O genoma humano codifica quatro paralogs de bestrophin, nomeadamente BEST1, BEST2, BEST3 e BEST4. BEST1, codificada pelo gene BEST1 , é um Ca2 +-ativado Cl– canal (CaCC) predominantemente expressado no epitélio pigmentar da retina (RPE). O significado fisiológico e patológico de BEST1 é realçado pelo fato de que mais de 200 mutações diferentes no gene BEST1 foram geneticamente ligadas a um espectro de pelo menos cinco doenças degenerativas da retina, como a melhor vitelliform Distrofia macular (doença melhor). Portanto, compreendendo a biofísica dos canais bestrophin no nível do único-molécula tem enorme significado. No entanto, obtenção de canais iônicos de mamíferos purificada é muitas vezes uma tarefa desafiadora. Aqui, nós relatamos um protocolo para a expressão de proteínas de mamíferos bestrophin com o sistema de transferência do gene de baculovirus BacMam e sua purificação por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas purified têm o potencial para ser utilizado em posteriores análises funcionais e estruturais, tais como gravação eletrofisiológica no bilayers do lipid e Cristalografia. Importante, este gasoduto pode ser adaptado para estudar as funções e estruturas de outros canais iônicos.
Introduction
Bestrophins é uma família de canais iônicos conservada através da espécie, variando de bactérias a seres humanos1. Em humanos, o gene BEST1 , localizado no cromossoma 11q12.3, codifica a proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expressa predominantemente na membrana basolateral das células do epitélio (RPE) pigmento da retina dos olhos2,3 ,4. Composto de 585 aminoácidos, o primeiro ~ 350 dos quais são altamente conservadas entre as espécies e conter sua região transmembrana, BEST1 atua como um CaCC em seres humanos1,5,6. Além disso, os BEST1 homologs em galinhas Klebsiella pneumoniae ambos funcionam como homopentamers7,8, sugerindo um alto nível de conservação ao longo da evolução.
Nos seres humanos, mais de 200 mutações no gene BEST1 clinicamente têm sido associadas a um grupo de doenças de degeneração da retina chamado bestrophinopathies1,9. Cinco bestrophinopathies específicos têm sido relatados, incluindo doença melhor, distrofia vitelliform adulto-início, autossômica dominante vitreoretinochoroidopathy, autossômica recessiva bestrophinopathy e retinite pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Estas doenças, que levam a diminuição da acuidade visual e até mesmo cegueira, são atualmente incurável. A fim de desenvolver tratamentos terapêuticos e medicina potencialmente personalizada, é de fundamental importância compreender como essas mutações causam doenças de BEST1 influenciam a função e a estrutura do BEST1 canal15. Para estes fins, os pesquisadores precisam obter canais bestrophin purificado (tipo selvagem e/ou mutante) e conduta em vitro análises5,8.
O primeiro passo fundamental é a expressão de canais de bestrophin de espécies superiores em células de mamíferos. Como transdução de baculovirus de células HEK293-F (sistema BacMam) é um método poderoso para heterologously express de16,de proteínas de membrana17, este protocolo utiliza um vetor de BacMam (pEG BacMam) otimizado para expressão robusta do alvo da proteína18, que neste caso é um homólogo de mamíferos bestrophin. Este vetor tem sido usado para a expressão de várias proteínas de membrana, incluindo G-receptores, receptores nucleares e outros canais de íon18. Há também evidências de que as proteínas produzidas são apropriadas para cristalografia18. Com altos níveis de expressão em células HEK293-F, as proteínas podem então ser purificadas usando cromatografia; especificamente, no caso de bestrophins, tanto a afinidade e a cromatografia de exclusão de tamanho podem ser usados.
Uma vez que este protocolo é aperfeiçoá-lo para um canal de bestrophin, a proteína purificada pode ser analisada para sua função e estrutura através da bicamada lipídica planar e cristalografia de raios x, respectivamente,5,8. No total, essas técnicas fornecem um poderoso pipeline para investigações funcionais e estruturais de bestrophins e outros canais de íon.
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Protocol
1. produzindo BacMam expressão Baculoviruses
- Inserir a sequência de codificação de uma proteína desejada bestrophin mamíferos no pEG BacMam vector18 com uma sequência de reconhecimento de protease tabaco Etch vírus (TEV), seguida por um GFP-10 x sua marca no C-terminal da proteína.
- Transitoriamente, transfect o plasmídeo de expressão em adesivo HEK293 células19,20,21,22,23. Verifique se a expressão da proteína GFP-fusão sob um microscópio fluorescente com 10 X ou 20 X de ampliação, uma fonte de excitação 488 nm e um filtro de emissão 510 nm (figura 1A).
Nota: Baseado em polímero de transfeccao é realizado rotineiramente com 1 μg de DNA de plasmídeo por um prato de 35 milímetros de células HEK293. - Produzi o baculoviruses em células de inseto Sf9 como descrito anteriormente,16,17.
Nota: A passagem 3 (P3) vírus, que serão usado para infectar as células HEK293-F para a produção de proteína, podem ser armazenadas a 4 ° C por 1 mês. - Determine o título (unidades infecciosas) do vírus P3 pela placa formação ensaio16,17.
Nota: Como a proteína de interesse é marcada com as boas práticas agrícolas, um método mais rápido para verificar unidades infecciosas é infectar células Sf9 com diluições em série do vírus e contar o número de células fluorescentes após 48 h.
2. expressão da proteína
- Manter as células HEK293-F em uma cultura de suspensão com o meio de expressão HEK293-F numa incubadora umidificado de 37 ° C, com 8% de CO2. Use frascos de cultura descartável que são 2 - 2,5 vezes maior do que o volume de cultura e giram a cultura em uma plataforma orbital a 135 rpm.
Nota: É recomendável para infectar as células quando elas são entre 5 e 30 passagens e para realizar essas ações sob um capuz de cultura de células. - 24 h antes da infecção viral, adicionar 15 μL de Trypan azul para uma alíquota de 15 µ l de cultura de células e verificar a densidade celular e a viabilidade usando um hemocytometer sob um microscópio. Diluir as células de 0,6 x 106 células/mL em frascos de 2 x 2 L cada, com 500 mL de meio de pré aquecida a 37 ° C.
Nota: As células mortas são manchadas de azul de Trypan azuis. A viabilidade da célula desejada é > 95%. - No dia de infecção, verificar a densidade celular e a viabilidade (passo 2.2).
Nota: Uma alta viabilidade celular de > 95% é essencial para a expressão eficiente de infecção e proteína. A densidade celular esperado é ~1.0 x 106 células/mL (adulta durante a noite de 2 x 500 mL da 0,6 x cultura de pilha 106 células/mL). O esperado número total de células é ~1.0 x 109. - Adicione o baculoviruses P3 para as células em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. Para determinar a quantidade de vírus para inocular, use a seguinte equação:
- Agite as células na plataforma orbital a 135 rpm numa incubadora umidificado 37 ° C, com 8% de CO2 por 24 h.
- Adicionar 10 mM de butirato de sódio à cultura de pilha e continuar incubando por 48 h.
Nota: Para algumas proteínas, reduzindo a temperatura de cultura celular para 30 ° C após adição de butirato de sódio pode melhorar a expressão e estabilidade. - Sob um microscópio de fluorescência com 10x ou 20x ampliação, uma fonte de excitação 488 nm e um filtro de emissão 510 nm, verificar a percentagem e o brilho das células verdes, que representam diretamente o rendimento de proteína (10xHis-bestrophin-GFP) (figura 1B).
Nota: A percentagem de células verdes é calculada por: 100 x (células células verdes/Total). Nível de proteína boa expressão é indicada pela forte fluorescência verde sob o microscópio. - Recolher as células por centrifugação a 1.000 x g em 4 ° C por 20 min. remover o sobrenadante e ressuspender as pelotas de célula com tampão fosfato salino (PBS) até um volume final de ~ 80 mL. Split a suspensão de células nos tubos cônicos de 2 x 50 mL e centrifugar a 1.000 x g em 4 ° C por 20 min. Guarde as pelotas de célula a-80 ° C.
3. purificação de proteínas
- Incube os tubos cónicos contendo as pelotas de células em um banho de água a agitação à temperatura ambiente por 10-15 min, para que eles descongelar. Ressuspender as células em 2 x volume (p/v) reserva um (tabela 1) (por exemplo, 10 g de pellets de célula em 20 mL de tampão) suplementado com inibidores da protease (fluoreto de aprotinina, Leupeptin, Pepstatin A e phenylmethylsulfonyl) em 0.1-1.0 mM. Pipeta sobem e descem extensivamente para obter uma suspensão homogênea.
- Lise as células usando um homogeneizador de alta pressão. Executar a suspensão de células através do homogenizador em 7-10 MPa para um total de 3 - 4 vezes para alcançar a completa homogeneização. Deixe o celular lisado no gelo durante 2-3 minutos entre os rounds.
- Adicione detergente [por exemplo, 2% w/v sol grau n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM)] para o lisado celular. Incube com agitação durante 1 h a 20 ° C, para extrair as proteínas de membrana.
Nota: O tipo de detergente deve ser otimizado para cada proteína alvo18,24. - Centrifugar a 150.000 x g em um se a 4 ° C, durante 1 h.
Nota: Todas as seguintes etapas são executadas a 4 ° C. - Recolha o lisado de células claras e fluxo passar uma 5ml sua armadilha Ni2 +- NTA coluna de afinidade previamente incubado com buffer um (tabela 1).
Nota: Após centrifugação, a lisado de células claras irão ser imprensada entre um sedimento no fundo e uma camada de nublado em cima. Use uma pipeta de transferência de 10 mL para recolher cuidadosamente a clara lisado e alterne para uma pipeta de 1 mL para o último poucos mililitros de lisado. Evitar a pelota, que pode obstruir a coluna do Ni2 + ; no entanto, uma pequena quantidade de camada superior é fina ou pode ser filtrada com um filtro de 1,5 μm. - Lavar a coluna com 25 mL de tampão B e, em seguida, 40 mL de tampão C (tabelas 2 e 3, respectivamente).
Nota: Este é um bom lugar para fazer uma pausa, como a purificação total pode levar até 12 h e a proteína pode permanecer estável enquanto anexado à coluna durante a noite. - Unir a coluna para um sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida e eluir a proteína da coluna com 13 mL de tampão D (tabela 3) com fracionamento. Recolha as frações enriquecidos com proteína de acordo com a leitura de absorbância UV.
Nota: o FPLC condições são como segue: um tamanho de fração de 1,0 mL, um alarme de pressão de pré-coluna definido de 0,3 MPa e uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. - Medir a concentração de produto de proteína eluted no espectrofotómetro microvolume. Ler a absorbância em 280 nm.
- (Opcional) Para remover a marca de GFP-10xHis, adicione a protease do PEV na proporção 1:1 em massa e incubar a 4 ° C por 30 min.
Nota: A tag pode ou não pode afetar a função ou estrutura do canal purificado. Calcule a quantidade TEV de volume e concentração da proteína coletada de passos 3.7-3.8. Por exemplo, se 10 mL de produto de eluição é coletado e medido em 0,1 mg/mL, a proteína total massa é 10 x 0,1 = 1 mg e 1 mg de TEV será usado para a digestão. - Concentrar a proteína com uma centrífuga de 15 mL (50 ou 100 kDa) unidade de filtro por fiação a 4.000 x g em 4 ° C, até um volume final de 400-500 μL (para um loop de carregamento de amostra de 2 mL em FPLC).
Nota: O tempo de centrifugação para concentração varia de acordo com a concentração e o tamanho da proteína. Para evitar excesso de concentração, que pode causar precipitação de proteínas, girar por 10 min em primeiro lugar, em seguida, observar o volume restante e estimar o tempo para uma rodada subsequente (por exemplo, 2-5 min), e assim por diante, para obter o volume final. Pipeta entre spins para dispersar a proteína, que é puxada para o fundo do filtro. - Transferi a proteína concentrada para uma nova 1,5 mL tubo e remover qualquer precipitado ou bolhas do produto concentrado. Rotação em > 12.000 x g por 5-10 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL.
- Carrega o produto final com uma seringa de 1 mL e uma agulha de ponta redonda em um sistema FPLC para cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna de tamanho-exclusão previamente incubada com buffer E (tabela 5).
Nota: o FPLC condições são como segue: um tamanho de fração de 0,5 mL, um alarme de pressão de pré-coluna definido para 2,50 MPa, um volume de fluxo definido para 30 mL de tampão E (tabela 5), e uma taxa de fluxo definido como 0,5 mL/min. - Observe que proteínas bem-comportado executar como um único pico (Figura 2A) e recolher a fraction(s) proteína correspondente a esse pico (Figura 2A).
- Concentre a proteína com uma unidade de filtro centrífugo 4 mL ou 0,5 mL (de mesmo peso molecular recorte como na etapa 3.10) e girar a 4.000 x g a 4 ° C, a uma concentração final de 5-10 μg/μL. Use o espectrofotômetro para verificar a concentração do produto final (etapa 3.8).
Nota: O tempo de centrifugação varia, conforme o volume de produto final pode ser diferente entre ensaios de purificação. Normalmente, a centrifugação leva 10-20 min. Recomenda-se a pipeta entre spins para dispersar a proteína, que é puxada para o fundo do filtro. - Transferi a proteína concentrada para um novo tubo de 1,5 mL. Remover qualquer precipitado por centrifugação em > 12.000 x g por 5-10 min a 4 ° C. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Faça 10 alíquotas μL para armazenamento a-80 ° C e salve um 2-5 μL pequena parte alíquota para executar em um gel de SDS-PAGE 4-15% gradiente em 9 V/cm (Figura 2B).
- Confirme a identidade da proteína purificada por espectrometria de massa8.
Nota: Análise In vitro da função e estrutura da proteína purificada podem ser realizadas através da bicamada lipídica planar e cristalografia de raios x, respectivamente,5,8.
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Representative Results
A intensidade de fluorescência em transitoriamente transfectadas adesivas células HEK293 (figura 1A) é um bom indicador para o nível de expressão de proteínas projetadas em células HEK293-F de suspensão (figura 1B). Se a proteína do alvo não for bem expressa ou mis está localizada em células HEK293 depois de transfecção transiente, é aconselhável considerar modificando o conceito de expressão (EG., mudando a posição da marca de GFP ou fazendo mutações/truncamentos sobre a proteína do alvo). Pequenas culturas de suspensão HEK293-F (por exemplo, culturas de 25 mL) são usadas para otimizar as condições para a expressão da proteína, entre os quais a infecção MOI e temperatura de cultivo têm sido o mais importante em experiências anteriores.
Uma bem sucedida purificação é indicada por um único pico principal no volume de eluição esperado em cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 2A) e uma única banda dominante em um gel de SDS-PAGE desnaturado (Figura 2B). Se vários picos aparecem na cromatografia de exclusão de tamanho, é importante coletar cada pico e executar um gel nativo para determinar qual pico contém o canal funcional pentamers. Note-se que entre duas construções de proteína, o nível de expressão, indicado pela intensidade de fluorescência no momento da colheita, não nesessarily correlacionar com o rendimento final, cada construção de proteínas se comporte de forma diferente durante a purificação. Uma proteína de bestrophin bem comportados, 200-500 µ g do produto final purificado normalmente podem ser obtidos de 1 L de células de suspensão HEK293-F.
Figura 1: expressão de uma proteína de mamíferos bestrophin. Imagens microscópicas de um bestrophin de mamíferos GFP-etiquetado expressaram nas células (A) adesivo HEK293 por transfeccao Plasmideo e em (B) suspensão HEK293F células por infecção de baculovirus. Esquerda = fluorescência verde; direita = brilhante-campo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: purificação de uma proteína de mamíferos bestrophin. (A) afinidade-purified proteínas GFP-etiquetado funcionou em uma coluna de gel filtração de exclusão de tamanho, como um pico principal. Foram coletadas frações entre linhas tracejadas. (B) produto de proteína final correu em um gel de SDS-PAGE com escadas (coluna esquerda). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | MW | Quantidade por 1 L | Final |
| HEPES | 238,3 | 11,9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | g 17,529 | 300 mM |
| Glicerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | g 1,3616 | 20 mM |
| MgCl2 | 203 | g 0,20331 | 1 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) fosfina | 287. | 2,5 mL caldo de 200 mM | 0.5 mM |
Tabela 1: Purificação da proteína de Buffer (Buffer de ressuspensão)
| Reagente | MW | Quantidade por 1 L | Final |
| HEPES | 238,3 | 11,9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | g 17,529 | 300 mM |
| Glicerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | g 2,7232 | 40 mM |
| MgCl2 | 203 | g 1,01655 | 5 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) fosfina | 287. | 0,5 mL caldo de 200 mM | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (p/v) |
Tabela 2: Buffer de purificação de proteínas B (primeiro lavar Buffer)
| Reagente | MW | Quantidade por 1 L | Final |
| HEPES | 238,3 | g 5,95 | 25 mM |
| NaCl | 58.44 | 29,2 g | 500 mM |
| Glicerol | 92.09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 5,1 g | 75 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) fosfina | 287. | 0,5 mL caldo de 200 mM | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (p/v) |
Tabela 3: Buffer de purificação da proteína C (segundo lavar Buffer)
| Reagente | MW | Quantidade por 1 L | Final |
| HEPES | 238,3 | 7,74 g | 32,5 mM |
| NaCl | 58.44 | g 11,686 | 200 mM |
| Glicerol | 92.09 | 25 mL | 2,5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 17,02 g | 250 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) fosfina | 287. | 0,5 mL caldo de 200 mM | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (p/v) |
Tabela 4: Buffer de purificação de proteínas D (tampão de eluição)
| Reagente | MW | Quantidade por 1 L | Final |
| HEPES | 238,3 | 9,53 g | 40 mM |
| NaCl | 58.44 | g 11,686 | 200 mM |
| Tris(2-carboxyethyl) fosfina | 287. | 0,5 mL caldo de 200 mM | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (p/v) |
Tabela 5: Buffer de purificação da proteína E (Gel filtração Buffer)
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Discussion
Este protocolo descreve um pipeline útil para expressão e purificação dos canais de íon bestrophin mamíferos deve ser usado para análises futuras em vitro . Enquanto o dispositivo FPLC é necessário para a cromatografia de exclusão de tamanho, uma bomba de seringa é suficiente para todas as etapas da cromatografia de afinidade, incluindo vinculação, lavagem e eluição. Ao usar uma bomba de seringa para soluções de impulso (em uma seringa) através de uma coluna, é essencial a subjacência de lado para evitar empurrando as bolhas de ar na coluna de primavera. Se a pureza da proteína após cromatografia de afinidade já é suficiente para os experimentos subsequentes, cromatografia de exclusão de tamanho pode ser omitida para que um dispositivo FPLC não pode ser exigido em tudo.
Como demora cerca de 2 semanas para fazer o baculoviruses de pBacMam de plasmídeos, para aumentar a eficiência, uma tela inicial para homologs bem-comportado de proteína pode ser realizada pela colheita das células HEK293 transitoriamente transfectadas (ex., de um prato de 60 mm) e testes como o expresso da proteína de interesse (GFP-etiquetado) se comporta em detergentes (por exemplo, DDM) com fluorescência-deteção tamanho-exclusão cromatografia (FSEC)18,24. É mais produtivo concentrar-se nas construções de proteína que exibem forte fluorescência em transfectadas células HEK293 e boa monodispersity e estabilidade no FSEC.
Existem várias recomendações para aumentar o rendimento de purificação de proteínas. Em primeiro lugar, as condições para a digestão do PEV podem precisar de ser otimizado para cada proteína. Isso pode ser feito por testes de uma variação da proporção de massa de proteína-para-PEV (por exemplo, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 e 01:10) e incubando vezes (por exemplo, 0,5 h, 1 h, 2 h, 5 h e durante a noite). Em seguida, sugere-se para executar que as amostras tratadas em um SDS-PAGE gel para verificar a eficiência de clivagem. Além disso, é importante não deixar qualquer fuga de líquido sobrenadante ou eluente centrífuga fora as ligações na FPLC ou seringas. Da mesma forma, é importante evitar bolhas quando Pipetar a proteína concentrada.
Vários subsequentes em vitro análise os procedimentos que utilizam as proteínas do presente protocolo incluem bicapa lipídica, cristalografia de raios x, crio-microscopia, espectroscopia e alto throughput screening8,25 , 26.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projecto foi financiado pelo NIH subsídios EY025290, GM127652 e da Universidade de Rochester financiamento de start-up.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
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