Summary
Rening av jonkanaler är ofta utmanande, men när uppnått, det potentiellt kan tillåta in vitro- undersökningar av funktioner och strukturer av kanalerna. Här, vi beskriver stegvis förfarandena för uttryck och rening av däggdjur bestrophin proteiner, en familj av Ca2 +-aktiverade Cl– kanaler.
Abstract
Det mänskliga genomet kodar fyra bestrophin paralogs, nämligen BEST1, BEST2, BEST3 och BEST4. BEST1, kodas av genen BEST1 , är en Ca2 +-aktiverade Cl– kanal (CaCC) huvudsakligen uttryckt i pigmentepitelet (RPE). BEST1 fysiologiska och patologiska betydelse understryks av det faktum att över 200 olika mutationer i BEST1 -genen har varit genetiskt kopplade till ett spektrum av minst fem retinala degenerativa sjukdomar, såsom bästa vitelliform makula dystrofi (bästa sjukdom). Därför innehar förstå biofysisk bestrophin kanaler på singel-molekyl nivå oerhörd betydelse. Att erhålla renat däggdjur jonkanaler är dock ofta en utmanande uppgift. Vi rapporterar här, ett protokoll för uttrycket av däggdjur bestrophin proteiner med BacMam baculoviridae gen transfersystemet och deras rening av affinitet och storlek-utslagning kromatografi. De renade proteinerna har potential att utnyttjas i efterföljande funktionella och strukturella analyser, såsom elektrofysiologiska inspelning i lipid lipidmonolager och kristallografi. Viktigast av allt, kan denna rörledning anpassas att studera de funktioner och strukturer av andra jonkanaler.
Introduction
Bestrophins är en familj av jonkanaler bevarad genom arter varierar mellan bakterier och människa1. Hos människa kodar genen BEST1 , belägen på kromosom 11q12.3, proteinet membran Bestrophin-1 (BEST1) som uttrycks huvudsakligen i basolateral membranet av retinal pigment epitel (RPE) celler av ögon2,3 ,4. Består av 585 aminosyror, de första ~ 350 som bevaras mycket bland arter och innehåller sin transmembrana region, fungerar BEST1 som en CaCC människor1,5,6. Dessutom fungera både de BEST1 homologs hos kycklingar och Klebsiella pneumoniae som homopentamers7,8, vilket tyder på en hög nivå av bevarande under hela evolutionen.
I människor, har över 200 mutationer i BEST1 -genen varit kliniskt kopplade till en grupp näthinneförtvining sjukdomar kallas bestrophinopathies1,9. Fem specifika bestrophinopathies har rapporterats, inklusive bästa sjukdom, vuxen ålder vitelliform dystrofi, autosomalt dominerande vitreoretinochoroidopathy, autosomalt recessiv bestrophinopathy och retinitis pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Dessa sjukdomar, som leder till nedsatt syn och med blindhet, är för närvarande icke behandlingsbar. För att utveckla terapeutiska behandlingar och potentiellt personlig medicin, är det viktigt att förstå hur dessa BEST1 sjukdomsframkallande mutationer påverka funktion och struktur av BEST1 kanal15. För dessa ändamål behöver forskare erhålla renat bestrophin (vildtyp eller mutant) kanaler och driva in vitro- analyser5,8.
Det första viktiga steget är ett uttryck för bestrophin kanaler från högre arter i däggdjursceller. Baculoviridae transduktion HEK293-F celler (BacMam system) är en kraftfull metod att heterologously uttrycka membranet proteiner16,17, detta protokoll använder tredjeparts en optimerad BacMam vektor (pEG BacMam) robust uttryck för den mål protein18, som i detta fall är ett däggdjur bestrophin homolog. Denna vektor har använts av uttryck för olika membranproteiner, inklusive G-proteinkopplade receptorer, nukleära receptorer och andra ion kanaler18. Det finns också bevis för att de producerade proteinerna är lämplig för kristallografi18. Med höga nivåer av uttryck i HEK293-F celler, kan proteiner sedan renas med hjälp av kromatografi; särskilt när det gäller bestrophins, kan både affinitet och storlek-utslagning kromatografi användas.
När detta protokoll är finjusterad för en bestrophin kanal, kan renat protein sedan analyseras för dess funktion och struktur genom planar lipid lipidens och röntgenkristallografi, respektive5,8. Dessa tekniker ger sammantaget en kraftfull rörledning för funktionella och strukturella undersökningar av bestrophins och andra jonkanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. producera BacMam uttryck Baculoviruses
- Infoga den kodande sekvensen av ett önskat däggdjur bestrophin protein i pEG BacMam vektor18 med en tobak Etch Virus (TEV) proteas erkännande sekvens, följt av en GFP-10 x hans-tagg på C-terminus av protein.
- Övergående transfect uttryck plasmiden i limmet HEK293 celler19,20,21,22,23. Kontrollera uttrycket av proteinet GFP-fusion i fluorescerande Mikroskop med 10 X och 20 X förstoring, en 488 nm exciteringskälla och 510 nm utsläpp filter (figur 1A).
Obs: Polymerbaserade transfection utförs rutinmässigt med 1 μg av plasmid DNA för en 35 mm maträtt av HEK293 celler. - Producera baculoviruses i Sf9 insekt celler som tidigare beskrivits16,17.
Obs: Passagen 3 (P3) virus, som kommer att användas att infektera HEK293-F cellerna för proteinproduktion, kan lagras vid 4 ° C i 1 månad. - Bestäm titern (infektiösa enheter) av P3 viruset genom den plack bildning assay16,17.
Obs: Eftersom proteinet av intresse är märkta med GFP, är en snabbare metod för att kontrollera infektiösa enheter att infektera Sf9 celler med seriespädningar av viruset och räkna antalet fluorescerande celler efter 48 h.
2. protein uttryck
- Upprätthålla HEK293-F cellerna i en suspension kultur med HEK293-F uttryck mediet i en 37 ° C befuktade inkubator med 8% CO2. Använda disponibla kultur kolvar som är 2 - 2,5 gånger större än volymen kultur och rotera kulturen på en orbital plattform vid 135 rpm.
Obs: Det rekommenderas att infektera celler när de är mellan 5 och 30 passager och utföra dessa åtgärder under en cell kultur huv. - 24 h innan virusinfektion, tillsätt 15 μL av Trypan blå till en 15 μl alikvot av cellodling och kontrollera cell densiteten och lönsamhet med hjälp av en hemocytometer under ett mikroskop. Späd cellerna till 0,6 x 106 celler/mL i 2 x 2 L flaskor varje, med 500 mL medium pre värmas vid 37 ° C.
Obs: Döda celler färgas blå av Trypan blå. Den önskade cellviabiliteten är > 95%. - På dagen för infektion, kontrollera cell densiteten och livskraft (steg 2.2).
Obs: En hög cellernas viabilitet av > 95% är avgörande för effektiv infektion och protein uttryck. Förväntade cell densiteten är ~1.0 x 106 celler/mL (odlade övernattning från 2 x 500 mL av 0,6 x 106 celler/mL cellodling). Det beräknade totala antalet celler är ~1.0 x 109. - Lägg till den P3 baculoviruses till celler på en multiplicity av infektion (MOI) 5. För att avgöra mängden virus att ympa, använda följande ekvation:
- Skaka cellerna på orbital plattform på 135 rpm i en fuktad 37 ° C inkubator med 8% CO2 för 24 h.
- Lägga till 10 mM av natrium butyrate cellkulturen och fortsätta inkubation för 48 h.
Obs: För vissa proteiner, minska cell kultur temperaturen till 30 ° C efter natrium butyrate tillägg kan förbättra uttryck och stabilitet. - I fluorescens Mikroskop med 10 X eller 20 X förstoring, en 488 nm exciteringskälla och 510 nm utsläpp filter, kontrollera procentsats och ljusstyrka av gröna celler, vilka direkt representerar protein (bestrophin-GFP-10xHis) avkastningen (figur 1B).
Obs: Procentandelen av gröna celler beräknas genom: 100 x (gröna celler sammanlagt celler). Bra protein indikeras uttryck av stark grön fluorescens under mikroskopet. - Skörda cellerna genom centrifugering vid 1 000 x g i 4 ° C i 20 min. ta bort supernatanten och slamma cell pellets med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig volym av ~ 80 mL. Split cellsuspensionen till 2 x 50 mL koniska rör och centrifugera vid 1 000 x g i 4 ° C för 20 min. lagra cell pellets vid-80 ° C.
3. protein rening
- Inkubera koniska rören som innehåller cell pellets i en omrörningsanordning vattenbad i rumstemperatur i 10-15 min så att de tinar. Slamma upp cellerna i 2 x (w/v) volym av buffert (tabell 1) (t.ex. 10 g cell pellets i 20 mL buffert) kompletterad med proteinas inhibitorer (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A och phenylmethylsulfonyl fluor) på 0,1-1,0 mM. Pipettera upp och ner i stor utsträckning för att erhålla en homogen cellsuspension.
- Lysera celler använder en högtrycks Homogenisatorer. Kör cellsuspensionen genom homogenisatorn vid 7-10 MPa för sammanlagt 3 - 4 gånger att uppnå fullständig homogenisering. Hålla cellen lysate på is i 2-3 minuter mellan omgångarna.
- Tillsätt rengöringsmedel [e.g., 2% w/v sol-grade n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)] till cell lysate. Inkubera med agitation för 1 h vid 20 ° C till extraktet membranproteiner.
Obs: Typ av tvättmedel behöver optimeras för varje protein mål18,24. - Centrifugera vid 150 000 x g i en ultracentrifugen vid 4 ° C för 1 h.
Obs: Alla följande steg utförs vid 4 ° C. - Samla in tydliga cell lysate och flöde det genom en 5 mL hans fälla Ni2 +- NTA affinitet kolumn före jämviktas med buffert (tabell 1).
Obs: Efter centrifugeringen, den tydliga cellen lysate kommer att vara inklämt mellan en pellet längst ner och en grumlig lager ovanpå. Använd en 10 mL överföring Pipettera omsorgsfullt samla den tydliga lysate och sedan växla till en 1 mL Pipettera för sista några milliliter av lysat. Undvika pelleten, som kan täppa Ni2 + kolumnen; dock en liten mängd av det översta lagret är bra eller kan filtreras bort med ett 1,5 μm filter. - Tvätta kolonnen med 25 mL buffert B och därefter 40 mL buffert C (tabellerna 2 och 3, respektive).
Obs: Detta är ett bra ställe att ta en paus, som total rening kan ta upp till 12 h och proteinet kan förbli stabila medan bifogas kolumnen över natten. - Koppla kolumnen till ett snabbt protein vätskekromatografi (FPLC) system och eluera proteinet från kolumnen med 13 mL buffert D (tabell 3) med fraktionering. Samla de proteinberikade fraktionerna enligt UV absorbansen utläsningen.
Observera: The FPLC villkoren är följande: en 1,0 mL bråkdel storlek, en före kolonninloppet alarmet inställt till 0.3 MPa och ett flöde av 0,5 mL/min. - Mäta de eluerade proteinkoncentration produkt på en microvolume spektrofotometer. Läs absorbansen vid 280 nm.
- (Valfritt) Ta bort taggen GFP-10xHis, Lägg till den TEV proteashämmaren i förhållandet 1:1 massa och inkubera vid 4 ° C i 30 min.
Obs: Taggen kan eller kan inte påverka funktion eller struktur av renad kanal. Beräkna TEV från volymen och koncentration av proteinet insamlade från steg 3,7-3.8. Exempelvis om 10 mL eluering produkt samlas in och mätt på 0,1 mg/mL, det totala proteinet massan är 10 x 0,1 = 1 mg och 1 mg TEV kommer att användas för matsmältningen. - Koncentrera sig proteinet med 15 mL centrifugal (50 eller 100 kDa) filterenheten av snurrande vid 4000 x g i 4 ° C till en slutlig volym på 400-500 μL (för en 2 mL prov-lastning loop på FPLC).
Obs: Den centrifuging tiden för koncentrationen varierar beroende på koncentration och storlek av protein. För att undvika alltför koncentrera, som kan orsaka protein nederbörd, snurra för 10 min först, och sedan iaktta den återstående volymen och uppskatta tiden för en efterföljande spin (t.ex. 2-5 min), och så vidare, att få den slutliga volymen. Pipettera mellan spins att skingra proteinet, som dras till botten av filtret. - Överföra det koncentrerat proteinet en ny 1,5 mL tub och ta bort eventuell fällning eller bubblor från koncentrerad produkt. Snurra på > 12 000 x g under 5-10 minuter vid 4 ° C och samla supernatanten i en ny 1,5 mL tub.
- Fyll den slutliga produkten med en 1 mL spruta och en runda-tip nål på ett FPLC system för storlek-utslagning kromatografi med en storlek-utslagning kolumn före jämviktas med buffert E (tabell 5).
Observera: The FPLC villkoren är följande: en 0,5 mL bråkdel storlek, en före kolonninloppet alarmet inställt till 2.50 MPa, ett flödesvolym inställd på 30 mL buffert E (tabell 5), och en flödeshastighet inställd på 0,5 mL/min. - Observera att skötsamma proteiner körs som en enskild topp (figur 2A) och samla den protein fraction(s) motsvarar det maximalt (figur 2A).
- Koncentrera sig proteinet med 4 mL eller 0,5 mL centrifugal filterenheten (av samma molekylvikt cut-off som i steg 3.10) och snurra på 4000 x g vid 4 ° C till en slutkoncentration på 5-10 μg/μL. Använda spektrofotometern för att kontrollera slutprodukten koncentrationen (steg 3.8).
Obs: Centrifugeringstiden varierar, som den slutliga produkt volymen kan skilja sig mellan rening prövningar. Vanligtvis tar centrifugering 10-20 min. Det rekommenderas att Pipettera mellan spins att skingra proteinet, som dras till botten av filtret. - Överföra det koncentrerat proteinet till en ny 1,5 mL tub. Ta bort eventuell fällning genom centrifugering på > 12 000 x g i 5-10 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till en ny 1,5 mL tub. Gör 10 μL alikvoter för lagring vid-80 ° C och spara en 2-5 μL små alikvot att köra på en 4-15% lutning SDS-PAGE gel vid 9 V/cm (figur 2B).
- Bekräfta identiteten av renat protein genom masspektrometri8.
Obs: In vitro -analys av funktion och struktur av renat protein kan utföras genom planar lipid lipidens och röntgenkristallografi, respektive5,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescensintensiteten i normalnivå transfekterade självhäftande HEK293 celler (figur 1A) är en bra indikator för nivån planerade protein uttryck i suspension HEK293-F celler (figur 1B). Om målproteinet inte är väl uttryckta eller mis är lokaliserad i HEK293 celler efter övergående transfection, det rekommenderas att överväga att ändra den uttryck konstruktion (t.ex., ändra positionen för god Jordbrukarsed etiketten eller göra mutationer/truncations på målproteinet). Små HEK293-F suspension kulturer (t.ex. 25 mL kulturer) används för att optimera förutsättningarna för proteinuttryck, bland vilka infektionen MOI och odlingsskålar temperatur har varit de viktigaste i tidigare erfarenheter.
En lyckad rening indikeras av en enda huvudsaklig topp vid förväntade elutionsvolymen i storlek-utslagning kromatografi (figur 2A) och en enda dominerande band på en denaturerad SDS-PAGE gel (figur 2B). Om flera toppar visas i storlek-utslagning kromatografi, är det viktigt att samla in varje topp och köra en native gel för att bestämma vilken topp innehåller den funktionella kanal pentamers. Det bör noteras att mellan två protein konstruerar, nivån uttryck, som anges av fluorescensintensiteten vid tiden för skörd, gör inte nesessarily korrelerar med den slutliga avkastningen, som varje protein konstruera beter sig annorlunda under reningen. För en skötsam bestrophin protein, kan 200-500 µg av renat slutprodukten vanligtvis erhållas från 1 L HEK293-F suspension celler.
Figur 1: uttryck av ett protein som däggdjur bestrophin. Mikroskopiska bilder av en GFP-märkta däggdjur bestrophin uttryckt i (A) självhäftande HEK293 celler av Plasmiden transfection och i (B) suspension HEK293F celler av baculoviridae infektion. Vänster = grön fluorescens; höger = ljusa-fältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: rening av ett protein som däggdjur bestrophin. (A) affinitet-renad GFP-märkta proteiner sprang på en storlek utslagning gelfiltrering kolumn som en främsta topp. Bråk mellan streckade linjer samlades. (B) slutliga proteinprodukter sprang på en SDS-PAGE gel med stegar (vänster kolumn). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | MW | Belopp per 1 L | Slutliga |
| HEPES | 238,3 | 11,9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | 17.529 g | 300 mM |
| Glycerol | 92,09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 1.3616 g | 20 mM |
| MgCl2 | 203 | 0.20331 g | 1 mM |
| tris(2-carboxyethyl) fosfin | 287 | 2,5 mL 200 mM lager | 0,5 mM |
Tabell 1: Protein rening buffert (Resuspension buffert)
| Reagens | MW | Belopp per 1 L | Slutliga |
| HEPES | 238,3 | 11,9 g | 50 mM |
| NaCl | 58.44 | 17.529 g | 300 mM |
| Glycerol | 92,09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 2.7232 g | 40 mM |
| MgCl2 | 203 | 1.01655 g | 5 mM |
| tris(2-carboxyethyl) fosfin | 287 | 0,5 mL 200 mM lager | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (w/v) |
Tabell 2: Protein rening buffert B (först tvätta buffert)
| Reagens | MW | Belopp per 1 L | Slutliga |
| HEPES | 238,3 | 5,95 g | 25 mM |
| NaCl | 58.44 | 29,2 g | 500 mM |
| Glycerol | 92,09 | 50 mL | 5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 5.1 g | 75 mM |
| tris(2-carboxyethyl) fosfin | 287 | 0,5 mL 200 mM lager | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (w/v) |
Tabell 3: Protein rening buffert C (andra tvätta buffert)
| Reagens | MW | Belopp per 1 L | Slutliga |
| HEPES | 238,3 | 7.74 g | 32,5 mM |
| NaCl | 58.44 | 11.686 g | 200 mM |
| Glycerol | 92,09 | 25 mL | 2,5% (v/v) |
| Imidazol | 68,1 | 17.02 g | 250 mM |
| tris(2-carboxyethyl) fosfin | 287 | 0,5 mL 200 mM lager | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (w/v) |
Tabell 4: Protein rening buffert D (eluering buffert)
| Reagens | MW | Belopp per 1 L | Slutliga |
| HEPES | 238,3 | 9.53 g | 40 mM |
| NaCl | 58.44 | 11.686 g | 200 mM |
| tris(2-carboxyethyl) fosfin | 287 | 0,5 mL 200 mM lager | 0,1 mM |
| DDM (anagrade) | 510.6 | 0,5 g | 0,05% (w/v) |
Tabell 5: Protein rening buffert E (Gel filtrering buffert)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en användbar rörledning för uttryck och rening av däggdjur bestrophin jonkanaler som ska användas för framtida in vitro- analyser. Medan FPLC enheten krävs för storlek-utslagning kromatografi, är en sprutpump tillräcklig för alla steg i affinitetskromatografi inklusive bindande, tvätt och eluering. När du använder en sprutpump till push lösningar (i en spruta) genom en kolonn, är det viktigt att underfång våren sidan för att undvika att trycka in luftbubblor i kolumnen. Om renhetsgraden av proteinet efter affinitetskromatografi är redan tillräcklig för efterföljande experiment, kan storlek-utslagning kromatografi utelämnas så att en FPLC enhet inte kanske behövs alls.
Det tar ca 2 veckor för att göra baculoviruses från pBacMam plasmider, för att öka effektiviteten, en startskärm för skötsam protein homologs kan utföras genom att skörda HEK293 övergående transfekterade cellerna (t.ex., från en 60 mm maträtt) och testa hur de uttryckte protein av intresse (GFP-märkta) uppför i rengöringsmedel (t.ex. DDM) med fluorescens-detection storlek-utslagning kromatografi (FSEC)18,24. Det är mest produktivt att fokusera på protein konstruktioner som visar stark fluorescens i transfekterade HEK293 celler och bra monodispersity och stabilitet i FSEC.
I området i närheten finns det flera rekommendationer för att öka avkastningen av protein rening. Först, villkoren för TEV matsmältningen kan behöva optimeras för varje protein. Detta kan göras genom att testa en rad protein-till-TEV massa nyckeltal (t.ex. 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 och 1:10) och ruvning gånger (t.ex. 0,5 h, 1 h, 2 h, 5 h och över natten). Sedan, det föreslås för att köra de behandlade proverna i en SDS-PAGE gel för att kontrollera klyvning effektivitet. Dessutom är det viktigt att inte låta någon centrifugal supernatanten eller eluenten läcka ur anslutningarna på FPLC eller sprutor. Likaså är det viktigt att undvika bubblor vid pipettering det koncentrerat proteinet.
Olika efterföljande in vitro- analys metoder som utnyttjar proteinerna från detta protokoll innefattar lipid lipidens, röntgenkristallografi, cryo-elektronmikroskopi, spektroskopi och hög genomströmning screening8,25 , 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt har finansierats av NIH grants EY025290, GM127652 och University of Rochester startfinansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
