Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Pipet Ucu yöntemine damlacık mikrosıvısal platformlar tohum hücrenin temel

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/57848
Automatic Translation
*1, *1, *2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Bu makale damlacıkları hücrelerinde yüksek kapsülleme verimliliğini sağlamak için pipet-ipuçları için damlacık mikrosıvısal aygıtları kullanarak hücre kıt nüfus tohum için bir protokol sunar.

Abstract

Sık sık hücresel analiz için kullanılan çeşitli mikrosıvısal platformu tasarımlar arasında damlacık-Havacilik yalıtma ve hücresel harici faktörlerin etkisi ortadan kaldırarak hücreleri tek hücre düzeyinde çözümleme için güçlü bir araç sağlar. microenvironment. Kapsülleme damlacıkları hücrelerinin Poisson dağılımı tarafından her damlacık mevcut hücre sayısı ve hücre damlacık birim başına ortalama sayısı bir fonksiyonu olarak belirlenir. Primer hücre, özellikle bağışıklık hücreleri veya klinik örneklerin kıt olabilir ve hücre kaybı daha az kapsülleme zorlu kalır. Bu yazıda, biz pipet-ipuçları hücreleri mikrosıvısal damlacık tabanlı cihazlara hücreleri önemli kaybı olmadan yüklemek için kullandığı yeni bir yöntem mevcut. Çeşitli hücre tiplerinin ile yakından Poisson dağılımı tarafından öngörülen kapsülleme verimliliği karşılık gelen etkin hücre katma damlacıkları göstermektedir. Bizim Yöntem mikrosıvısal platformları için hücre kaybı daha az yük sağlar ve aşağı akım tek hücre analizi, farklı hücre tipleri arasında hücresel etkileşimlerin kodunu çözmek için Örneğin, kolayca adapte edilebilir.

Introduction

Son yıllarda hızla artan1tek hücre düzeyinde hücresel analiz sağlam ve çok yönlü bir platform olarak Havacilik kullanımı vardır. Bu platformlar tek hücreleri ve biyolojik moleküllerin yüksek hassasiyetli ve çok küçük örnek cilt2,3,4kullanarak hassasiyeti ile yüksek-den geçerek tarama sağlar. Mikrosıvısal tasarımları farklı türleri arasında damlacık tabanlı platformlar yüksek üretilen iş analizi tek hücre hücresel üzerinde kesin ve doğru kontrol sağlar bir immiscible faz çevrili bir sulu faz damlacık içinde yalıtarak etkinleştirmek microenvironment5,6. Damlacık tabanlı Havacilik verir esneklik tek izole veya çoklu-hücreleri hem de, sulu ve hidrojel damlacıkları ve protein salgılanması veya hücresel etkileşimlerin7, gibi karmaşık hücresel davranış sondalama değerlidir 8 , 9. sinyal ve çapraz-hadis bağışıklık hücreleri arasında etkilemiştir microenvironment10diğer hücrelerle etkileşimler tarafından. Yalıtım damlacıkları tek hücrelerinin etkili bir noise etkisinden uzak analitik laboratuvar, daha verimli ve doğru sonuçlar11,12dış çevre faktörlerinin etkisi arınmış sağlar. Birden çok giriş ile bir damlacık-mikrosıvısal platform tasarımını değiştirme hücresel etkileşimler yoluyla hücre eşleştirme12,13eğitim için birden çok hücre tiplerinin kapsülleme sağlar.

Damlacıkları hücrelerinin kapsülleme işlemi rasgele ve kapsülleme hücre oranı istatistiksel Poisson dağılımı14,15için formül kullanarak belirlenebilir. Bu oran kapsüllemenin hücre damlacık kavşağında varış ortalama oranı göz önüne alınarak tahmin edilebilir ve her hücre varış diğer varış bağımsız olduğunu varsayarak16hücreleri. Bağımsız hücre varış garanti edilemez olsa da, seyrek dağıtılmış hücreleri durumlarda, bağımsızlık varsayımı kabul edilebilir ve bir veya daha fazla hücre içeren bir damlacık olasılık fonksiyonu hücre sayısı olarak tahmin edilebilir mevcut her damlacık ve damlacık16,17başına ortalama sayısı. Bu tahmini damlacıkları hücresel kapsüllemenin bağımlı hücreleri her damlacık mevcut olduğu için bir giriş, hücre konsantrasyonu artan hücre her damlacık mevcut ortalama sayısı artacak önerebilirsiniz 16. bu nedenle, tek hücre kapsülleme emin olmak için hücre konsantrasyonları bu sık sık olur çok sayıda boş damlacıkları18azaltılmalıdır.

Eki, sedimantasyon, ve/veya şırıngada topaklanma, boru veya üretim aygıt tarafından yükleme sırasında hücrelerinin kaybı yaygın dezavantajı düşük tahmin edilen kapsülleme değerleri19 sorumlu gerçek kapsülleme değerler sapma için olduğunu . Bu sorun daha fazla zaman nadir bağışıklık hücreleri veya klinik numune olarak zaten nüfus azdır ve yalnızca birkaç hücreleri, çok daha düşük encapsulation beklenenden daha yeterli veri deneysel analizi için sağlamaz tohum abartılı. Plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) vardır sadece teşkil eden nadir bir alt kümesini bağışıklık hücreleri yaklaşık 0.2 - yüzde 0,6 tüm beyaz kan hücre nüfusu20. Bu hücreler büyük miktarda salgılar interferonlar etkinleştirme üzerine yazın ve böylece bağışıklık yanıtı21' kritik bir rol oynamaktadır. Damlacıkları nadir böyle hücrelerde hücresel davranışını okurken, tohum hücre ve kapsülleme22sırasında hücre kaybı önlemek için zorunludur. Orada birkaç tasarım akustik veya elektrik kuvvetleri gibi farklı fiziksel güçleri içeren damlacıklar oluşturulmasında kullanmak etkin saklama yöntemleri kullanarak damlacıkları tek kişilik hücrelerde encapsulation emin olduğunuzda ilgili gelişmeler tek-hücreleri23,24. Ancak, bu yöntemlerin damlacık üretim16açısından kendi kısıtlamaları var.

Bu çalışmada, tek veya birden çok hücre mikrosıvısal cihazlara yüklenmesi için geleneksel yöntemler eksikliklerin kaçınmanızı sağlar güçlü ve basit bir yöntem kurduk. Bizim Yöntem, Rho tarafından vd., ilham damlacık mikrosıvısal platformlara önemli örnek kaybı olmadan nadir bağışıklık hücreleri küçük hacimli tohum için farklı boy pipet ipuçları kullanır ve teorik ile tutarlı sonuçlar vermiştir tahminler25. Bu metodoloji kolayca olabilir ve başarılı bir şekilde damlacık tabanlı Havacilik içeren çeşitli uygulamalar için uyarlanmış ve çok çeşitli hücre tipleri veya hatta microparticles için uygulanır.

Protocol

1. 3-giriş Polydimethylsiloxane (PDMS) cihaz imalat

  1. Klima karıştırıcı PDMS tabanının 40 g ölçmek Kupası ve 4 g PDMS kür Ajan temel reaktif Kupası için dikkatli bir şekilde, bir damlalık kullanarak ekleyin.
  2. Kupası Klima Mikser tutucuya yerleştirin ve Kupası toplam ağırlığı ile sahibi ölçmek. Santrifüj denge ağırlığı üzerinde Klima Mikser buna göre ayarlayın.
  3. 2.000 devirde Klima karıştırıcı 2 dk 2 min için 2.000 devirde de-köpük tarafından takip için temel ve kür Ajan karıştırın.
  4. Bir alüminyum tekne, çapı yaklaşık aynı boyutta bir 100 mm silikon gofret, hazırlayın. Sürecinde alüminyum tekne kalıp yineleme için fabrikasyon silikon gofret yerleştirin ve bu kurulum bir Petri tabak koyun (çapı = 120 mm, yükseklik = 20 mm).
    Not: Silikon gofret boyutuna Petri kabına boyutuna bağlıdır.
  5. Sahibinden kupayı kaldırmak ve önceden tedavi PDMS karışımı (içeriği Kupası), dikkatle, silikon gofret dökün.
  6. Hava kabarcıkları kaldırmak için desiccator için yaklaşık 20 dk içinde önceden tedavi PDMS karışımı ile silikon gofret içeren Petri kabına yerleştirin.
  7. Petri kabına 20 dk ve onay için kaldırılabilmesi için kalan herhangi bir hava kabarcıkları sonra kaldırın.
  8. 65 ° C, en az 3 h için ayarlanan bir fırın, Petri kabına yerleştirin.
  9. Petri kabına 3 h sonra fırından çıkarın ve dikkatle tedavi PDMS silikon gofret üzerinden soyma.
  10. PDMS aygıtları bir bıçak ya da bir neşter kullanarak kesme çizgisinde kesti. Giriş ve çıkış 1,2 mm zımba kullanarak her aygıtın, delikler. Her bant PDMS toz veya kalan parçalarını kaldırmak için PDMS aygıtıyla temiz.
    1. İsteğe bağlı olarak, kalan PDMS adet kaldırmak için azot ile darbe.
  11. Cam slaytlar sabun-su, ardından isopropanol ve azot ile Kuru ile temizleyerek hazırlayın.
  12. Temiz bir PDMS aygıt ile a temiz cam kaymak bir plazma bağ asher akışı satırlarının kapatmak için. Kullanma ertesi gün koyma: güç: 50 W, saat: 45 s, taşma payı gecikme süresi: 2 s, işlem gaz: gaz 1 (hava), havalandırma: her iki Subaplar, kısıtlı zaman delik: 60 s, pompa spin aşağı zaman: 10 s, havalandırma tutun zaman: 0 s, gaz kapatma zaman: 1 s, etkin pompalama Turbo : 0. tüm diğer boru hatları kesin.
    Not: asher asher plazma marka göre değişebilir plazma için kullanılan ayarlar kullanılır.
  13. Silane çözüm silane (1 H, 1 H, 2 H, 2 H-Perfluorooctyltriethoxysilane) 50 µL ekleyerek flüorlu 950 µL için petrol hazırlayın.
    Not: Silane zehirlidir. Lütfen duman başlık altında çalışır.
  14. Teflon Hortum bağlı bir şırınga hazır silane çözüm çizmek.
  15. Cihazın çıkış aygıtının ile hazırlanmış silane çözüme temizlenerek salinize.
  16. Aygıt için 30 dk 65 ° C'de ayarla bir fırında yerleştirin.
  17. Salinized aygıt Fırından çıkarın ve cihazın dışında aşırı silane Fluor yağı ile yıkayın.
  18. Geri bir fırın yapıştırma işlemini tamamlamak en az 1 h için 65 ° C'de ayarla, cihazın yerleştirin.
    Not: Protokol burada duraklatılmış.

2. kaybı daha az hücre kapsülleme

  1. Hücre hasat
    1. Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta 1.0x106 hücre/mL, 2.0x106 hücre/mL, 4.0x106 hücre/mL ve 8.0x106 hücre/mL konsantrasyonlarda Jurkat T hücreleri yeniden askıya alma; PDC hematopoetik serum serbest Kültür Medya (örneğin, X-VIVO 15) 1.3x106 hücre/mL, 3.0x106 hücre/mL ve 13.0x106 hücre/mL konsantrasyonlarda; A549 hücreleri bir konsantrasyon 1.0x106 hücre/mL, Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) içinde.
      Not: Hücreleri ve hücre toplama türünü deneme göre değişebilir. Hücreleri etiketleme da deneme göre yapılabilir.
  2. İpucu-yükleme sulu damlacık üretimi için
    1. Fluorlu petrol % 3 biyouyumlu yüzey aktif karışımı ile flüorlu petrol 2 mL yüzey aktif 3 mL ekleyerek hazırlayın.
      Not: Flüorlu petrol eklendi yüzey aktif konsantrasyonu emülsiyon istikrar için farklı kuluçka dönemleri belirler. Yüzey aktif konsantrasyonu belirli hücre tipleri için kullanılan ortamı bağlı olarak değişir.
    2. Yağ faz karışımı bir şırınga (1 mL) çizin. Hava kabarcıkları şırıngadan çıkarın ve uygun boy bir Teflon boru döşeme bağlayın.
    3. Bir örnek şırınga çizim biyouyumlu madeni yağ bir şırınga hazırlayın. Hava kabarcıkları kaldırmak ve şırınga için uygun uzunlukta bir Teflon hortum bağlamak.
    4. Bir tedavi PDMS levha üzerinden 5 mm çapında bir PDMS fiş yumruk.
      Not: Tedavi PDMS levha adımları 1.1-1,9 kullanarak hazır olun. Düz Silikon gofret fabrikasyon silikon gofret yerine kullanın.
    5. Başka bir delik 1 mm zımba ile eklenti ortasına.
    6. Öyle ki sıkı bir şekilde uyuyor bir ipucunda 200 µL pipet, daha büyük ucundan takın.
      Not: 1.000 µL pipet ucu örnek hacmin daha büyük ve daha büyük hücreler için kullanın. 1000 µL pipet ucu, çapı 5 mm ve 7 mm arasında değişen prizler kullanılabilir. Çapı 5 mm, numune hacmi yaklaşık 400 bir fiş ile µL pipet ucu Aspire. Daha büyük çaplı bir fiş kullanılan (7 mm) ise, daha fazla numune hacmi (900 µL) Aspire.
    7. Şırınga için bağlı tüp takılı pipet ucu PDMS fişi ekleyin. Yavaş yavaş bağlı pipet ucu mineral yağ ile doldurmak için şırınga pistonu itin. Artık hava dışarı pipet uç--dan itin.
    8. Pipet Ucu, şırıngada örnek çözümü bağlı alt ve örnek ipucunda yaklaşık 150 µL Aspire edin.
    9. 2.2.4-2.2.8 ikinci bir örnek şırınga hazırlamak için adımları yineleyin.
    10. Dikkatle tüm üç hazır şırınga şırınga pompa üzerinde yer.
    11. Örnekte iki iç alıcılar PDMS çipin içeren her iki pipet uçları, yerleştirin. Dış giriş petrol faz karışımı içeren tüp takın.
    12. Akış oranları şırınga pompa üzerinde aşağıdaki gibi ayarlayın: sürekli aşama çözüm: 600 µL/h, hücre örnekleri: 100 µL/h, her. Girin ve şırınga boyutlarını ayarlayın.
      Not: ayarları değişir çapı şırınga türüne bağlı.
    13. Örnek çözüm cihazın dış kanal üzerinden aygıt ve petrol aşamasının iç kanallardan temizlemek için pompa başlatın.
    14. Damlacık oluşumu istikrarlı olduğunda damlacıkları toplamaya başlamak için çıkış için uygun uzunlukta tüp takın. Koleksiyon zaman deneme bağlı olarak değişir.
    15. Bir kilit tüp damlacıkları toplamak. RPMI Orta (serum) olmadan 200 µL üzerine toplanan damlacıkları ekleyin ve örnek kuluçkaya.
      Not: kuluçka süresi toplanan damlacıkları değişir denemeyi dayalı. Akış Sitometresi tabanlı analiz veya yalıtım emülsiyon kırarak damlacıkları hücreleri aldıktan sonra gerçekleştirildiğinde damlacıkları kilit tüpte toplanır. Damlacık mikroskopik analiz deneme gerektiriyorsa, bir cam odasında damlacıkları toplamak mümkündür.
  3. Akış sitometrik çözümlemesi için kırılma ve hücre alma emülsiyon
    1. % 20 hazırlamak 1H, 1H, 2H, 2H-Perfloro-1-octanol (PFO) çözüm (v/v) PFO 2 mL 10 mL flourinated yağı ekleyerek flüorlu yağda.
    2. Aşırı yağ damlacıkları, bir şırınga kullanarak içeren koleksiyon tüp alttan kaldırın.
    3. 100 µL % 20 PFO çözüm emülsiyon kırmaya ve sulu faz kapsüllenmiş hücrelere yayın emülsiyon ekleyin. Dokunun ve kısa bir süre karıştırın. Bu noktada değil girdap yapmak. 1-2 min için kuluçkaya.
      Not: Eklendi PFO damlacıkları üretilen miktarı bağlıdır. Yağ tabakası tamamen eriyene kadar ek PFO eklemeye devam. PFO hücreler için toksik ve hücre ölümü çok yüksek PFO konsantrasyonları veya PFO içinde çok uzun bir kuluçka için neden olabilir artırılması göz önünde bulundurun.
    4. Belgili tanımlık eriyik kısa bir süre vasıl 30 için en düşük olası rcf spin s.
    5. 100 mL soğuk Phosphate-Buffered serum fizyolojik (PBS) çözüm ile % 2 takıma hazırlamak Fetal buzağı Serum (FCS) (PBS 98 ml FCS 2 mL).
    6. Sulu fraksiyonunun 550 µL hemen sonra Santrifüjü pipet ve 2.3.5 adımda hazırlanan 500 µL % 2 FCS ile desteklenmiş soğuk PBS çözüm içeren yeni bir kilit tüp aktarmak. Herhangi bir kalıntı petrol izin lavabo alt kısmına yeni kilit tüp.
    7. Bu kilit tüp hücrelerden dikkatli bir şekilde, herhangi bir kalıntı petrol aspirating olmadan içeren sulu faz 950 µL Aspire edin ve çözüm için yeni bir kilit tüp aktarın.
    8. Spin aşağı yeni kilit tüpü 10 min için hücrelerinde.
    9. 300 µL % 2 FCS ile desteklenmiş soğuk PBS çözüm hücrelerde 2.3.5 adımda hazırlanan yeniden askıya alma.
      Not: Hücreleri de medyaya bağlı olarak deney gibi başka uygun bir çözüm olarak yeniden askıya alınabilir. Akış Sitometresi Analizi için deneme dayalı hücreleri, leke.

3. hücre eşleştirme

  1. Hücre hasat ve boyama
    1. Jurkat T hücrelerden kültür flask, say ve 5 min için 1500 rpm'de hücreleri aşağı spin.
    2. 1 mL 1.0x106 hücre/mL bir konsantrasyon almak için PBS 1.0x106 hücreleri yeniden askıya alma ve süpernatant çıkarın. PBS eklendi hücre sayısı üzerinde bağlıdır.
    3. 3.1.1-3.1.2 Jurkat T-hücreleri ikinci bir örnek aynı hücre konsantrasyonu ile hazırlamak için adımları yineleyin.
    4. Her iki örnekleri iki kez PBS 1 mL 5 min için 1500 rpm ile yıkayın.
    5. Bir hücre örneği 1,25 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) boya ve diğer hücre örneği 1,25 µM kadar kırmızı boya veya 1,25 µM hücre proliferasyonu boya ile 1.0x106 hücre/mL bir hücre konsantrasyonu yeniden askıya alma. Çözüm boyama 1.0x106 hücreler için 1 mL toplamdır.
      Not: Hücreleri akış sitometresi veya floresan mikroskop filtrelere bağlı olarak farklı boyalar ile etiketli.
    6. Hücre örnekleri 37 ° C'de 10 dakika boyaları ile kuluçkaya
    7. 10 dakika sonra buz soğuk FCS 1 mL ekleyerek boyama reaksiyonu durdurmak.
    8. Hücre örnekleri iki kez PBS 1 mL 5 min için 1500 rpm ile yıkayın.
    9. Hücre örnekleri RPMI medya 10.0x106 hücre/mL, her renk için bir konsantrasyon, yeniden askıya alma.
  2. İpucu-yükleme için üretim hücre eşleştirme için özel hidrojel damlacıkları
    Not: özel hidrojel damlacıkları kullanarak eşleştirme hücre için 27 ° C ve hydrogels gelling engellemek ve hücresel canlılığı9garanti için damlacık üretimi ve toplama işlemi boyunca 37 ° C arasında sistem sıcaklığını korumak.
    1. Ultra düşük jelleşme sıcaklık özel 75 ° C'ye kadar PBS içinde bir konsantrasyon % 4 (w/v), Isıtma tarafından dağıtılması ve 20 dk için karışımı ilave edin.
    2. Özel çözüm ile etiketli Jurkat T hücreleri bir özel konsantrasyonu % 2 (w/v) verim için karıştırın. Farklı etiketli hücreleri ile diğer örnek için yineleyin.
    3. Fluorlu petrol % 2 yüzey aktif karışımı ile yüzey aktif 20 mL 30 mL flüorlu petrol (petrol faz karışımı) ekleyerek hazırlayın.
    4. 2.2.2 - 2.2.14 adımları.
      Not: yapışkan yapısı düşük erime özel ve istikrarlı damlacık üretimi sağlamak için akış oranları şırınga pompalar üzerinde aşağıdaki gibi ayarlayın: petrol faz karışımı: 2.000 µL/h, hücre örnekleri: 200 µL/h. girin ve şırınga boyutlarını ayarlayın.
    5. Bir kilit tüp damlacıkları toplamak ve 60 dk 4 ° C'de damlacıkları kuluçkaya.
  3. Kırma emülsiyon ve özel boncuk alma FACS analizi için
    1. Sonra kuluçka için 60 dk damlacıkları aşırı yağ damlacıkları, bir şırınga kullanarak içeren kilit tüpünden kaldırın.
    2. 200 µL PFO petrol Interphase damlacıkları kaldırmak için ekleyin.
      Not: Tüp eklendi PFO damlacıkları üretilen miktarı bağlıdır. Yağ tabakası tamamen eriyene kadar ek PFO eklemeye devam.
    3. 1 mL yağ Santrifüjü 10 dk 1500 rpm'de tarafından tamamen kaldırmak için soğuk PBS ile iki kez toplanan özel boncuk yıkayın.
    4. Akış Sitometresi kullanarak toplanan özel boncuk analiz.
      Not: Boncuk floresan mikroskop altında gözlemlemek mümkündür.

Representative Results

Bizim deneyler için 25 mikron (Şekil 1) yüksekliği ile 3-giriş PDMS tabanlı mikrosıvısal aygıt kullandık. Bu aygıt kurulum, biz dış giriş için hücre süspansiyonlar veya medya ile sulu aşamaları kızarma yağı yüzey aktif ve iki iç alıcılar ile kızarma için kullanılır. Önce aşağı akım analizi kullanarak akış sitometresi üretimi ve koleksiyon sonra damlacıkları için birkaç saat çip kapalı inkübe. Kuluçka dönemi sırasında serum bileşenleri medyada mevcut yüzey aktif ile etkileşim ve kararsız olmak ve parçalanmaya damlacıkları neden. Bu nedenle yüzey aktif en iyi duruma getirilmiş bir konsantrasyon flüorlu yağ eklemek önemlidir. Hematopoetik serum serbest kültür ortamı farklı yüzey aktif flüorlu yağda konsantrasyonları ile % 2 insan serumu ile takıma içeren monodispersed damlacıkları kararlılığını test ettik. Anlaşılmaktadır olabilir bu monodispersed damlacıkları son derece olan Şekil 2 den istikrarlı için 24 saat zaman en az % 3 yüzey aktif petrol aşamaya eklenir. Benzer sonuçlar RPMI medya ile ve % 10 FCS (veri gösterilmez) ek olmadan ile elde edilmiştir. Bu nedenle, damlacık istikrar Kültür Medya ve serum bileşenleri farklı kaynakları ile çalışırken en iyi yüzey aktif konsantrasyonları üzerinde son derece bağlıdır.

Yaklaşımımız kapsülleme verimliliğini göstermek için ilk hücreleri (Şekil 3A) tohum için en geleneksel yaklaşım şırınga için bağlı boru kullanarak hücreleri tohumlari. Biz Jurkat T hücrelerinin 1.0x106 hücre/mL, 2.0x106 hücre/mL ve 4.0x106 hücre/mL farklı konsantrasyonlarda hasat ve tahmini değerleri (Şekil 3B) düşük bir kapsülleme verimlilik elde. 1.0x106 hücre/mL, tek bir hücre içerdiği damlacıkları kısmını %2.5, hatta daha yüksek hücre konsantrasyonları kullanarak üzerine artmamıştır yapıldı. Hücre-yükleme verimliliğini artırmak için biz önceki yaklaşımımız değiştirilme tarihi ve yükseltilmiş bir tripod için yarım uzunlukta, boru monte ve PDMS aygıta (Şekil 4A) bağlı yarı hücre süspansiyon yüklü. Bu yaklaşımı kullanarak, biz Jurkat T hücrelerinin farklı konsantrasyonlarda 1.0x106 hücre/mL, 2.0x106 hücre/mL, ve 4.0x106 hücre/mL hem 1.0x106 hücre/ml farklı konsantrasyonlarda nadir PDC'ler kapsüllü, 2.0x106 hücre/mL ve 12.0x106 hücre/mL. Biz gelişmiş saklama oranları bu yöntemle hücre sedimantasyon engelleyerek bekleniyor. Ancak, test konsantrasyonları deneysel sonuçlar öngörülen Poisson değerleri (Şekil 4B ve Şekil 4C) çok daha düşük.

Deneysel sonuçlar istatistiksel olarak öngörülen değerleri (Şekil 5A) ile tutarlı elde etmek için hücre kapsülleme oranları optimize bizim ipucu-yükleme yaklaşımı kullanarak. İçin farklı konsantrasyonlarda Jurkat T hücrelerinin elde edilen kapsülleme verimliliği tüm konsantrasyonlarda (Şekil 5B) hesaplanan Değerlerimiz eşleştirdi. Dikkat çekici, bile yığın eğilimindedir, A549 tümör hücreleri gibi yapışık hücreleri ile biz 1.0x106 hücre/mL (Şekil 5C) hücresel bir konsantrasyon biraz gelişmiş kapsülleme verimlilikle gözlenen. Biz de daha az kullanılabilir ve kıt PDC 1.0x106 hücre/mL, 3.0x106 hücre/mL ve 13.0x106 hücre/mL (Şekil 5D) farklı hücre konsantrasyonlarda kapsüllemek için bizim sistem etkinliğini değerlendirildi. Muhtemelen daha büyük birimleri 200 µL aşan yüklenmesini kolaylaştırmak için hücre hatları veya daha bol birincil bağışıklık hücreleri, çalışırken Örneğin, biz de hücre kapsülleme verimliliği 1000 µL ipuçları (mavi) kullanarak araştırdık. Bu 1.000 µL ipuçları 200 µL ipuçları (sarı) (Şekil 5E) ile karşılaştırıldığında benzer bir kapsülleme verimliliği verdiğini gösterdi.

Yonga tasarım ve araştırma sorusu elinizin üzerinde bağımlı, teknik yükleme bizim ipucu hücreleri hücresel heterojenite problama için bir giriş ya da paralel hücresel etkileşimlerin şifresini çözmek için birden çok giriş üzerinden yüklemek için kullanılabilir. Biz Jurkat T hücrelerden (10.0x106 hücre/mL konsantrasyonu) adlı bir giriş iki farklı etiketli nüfus Jurkat T hücrelerinin yüklenmesini göre (10.0 kombine bir konsantrasyon, x106 hücre/mL) iki giriş (Şekil 6 dan A ve Şekil 6B). Kapsülleme sırasında Ultra düşük jelleşme sıcaklık özel kullanarak ve daha sonraki aşağı akım analiz yoluyla mikroskobu ve akış sitometresi (Şekil 6 izin formu özel hidrojel boncuk için üretimden sonra genellikle damlacıkları oluşturulan C ve Şekil 6D). Mikroskobik analizlerin yapıldığı ortaya koydu (Şekil 6C) eşleştirme yüksek üretilen iş hücre için gösteren farklı kombinasyonlar, hücre eşleştirme sağlandı. Ayrıca, aynı nüfus hidrojel boncuk tarafından Akış Sitometresi Analizi hücre olmadan boncuk boncuk ayrı ileri (FSC, boyutu) ve sideward dayalı hücreleri (SSC, taneciklik) ile ayrılmış ortaya koydu dağılım deseni (Şekil 6 D). Boncuk olmadan hücrelerin nüfus çoğunluğuna hücre kapsülleme eksikliği floresan sinyallerini yokluğunda tarafından doğruladı. Ayrıca, hücreleri ile boncuk nüfus çoğunluğuna farklı etiketli Jurkat T hücrelerinin Kapsülleme için birden çok alt nüfus göstergesi varlığını ortaya koymuştur. Etkin hücre eşleştirme, mikroskobik hem dayalı elde edilebilir akış sitometrik analiz ve Poisson tahmin (Şekil 6E) karşılaştırıldığında biraz artan kapsülleme verimliliği gösterdi ki bizim sonuçlar gösterilmektedir.

Figure 1
Resim 1 . Üç giriş ve bir çıkış dayalı PDMS damlacık mikrosıvısal aygıtla. Cihazın üç giriş sürekli yağ faz, hücre kültürü medya ve hücre süspansiyon, sırasıyla oluşur. Oluşturulan damlacıkları çıkış yeri toplanır. Örnekleri laminarly nerede damlacıkları içinde saklanmış akışı odaklanarak kavşağı için akış. Alıcılar, protein gibi büyük parçacıkları filtre yapıları tutun veya hücre toplamları geri. Filtre yapısı boşluklar çapı mavi çizgilerle gösterilir. Üretim meme salgılarını çapını kırmızı çizgilerle gösterilir. Kanal yüksekliği tüm yonga üzerinde 25 µm. oldu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Damlacık istikrar üzerinden 24 saat. Hematopoetik serum serbest Kültür medya + % 2 insan serumu, yüzey aktif üç farklı konsantrasyonlarda için zaman içinde içeren damlacıklar alan grafikler gösterirken A) % 0.5 B) % 3 C) % 5. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Tüp bağlı hücre yaklaşım yükleniyor. Jurkat-T hücreleri boru için bağlı bir şırınga kullanılarak aygıta farklı konsantrasyonlarda yüklenir. A) deneysel kurulum gösterilmektedir B) ışık mikroskobu tarafından belirlenen hücre sarma hızı. Noktalar: deneysel olarak değerleri belirlenir; Kapalı hatları: Poisson dağılımı. Hata çubuğu ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Çeşitli hücre tiplerinin farklı konsantrasyonlarda dikey bir tüp yaklaşım yükleme kullanarak kapsülleme. Jurkat T hücreleri ve PDC (Toplam farklı konsantrasyonlarda) hücre kapsülleme verimliliğini belirlemek için kapsüllü. A) yaklaşım yükleme dikey tüpü deneysel kurulum gösterilmektedir. B) grafik kapsülleme verimlilik Jurkat t hücreleri gösterir. C) PDC'ler kapsülleme verimliliğini grafik gösterir. Noktalar: deneysel olarak değerleri belirlenir; Kapalı hatları: Poisson dağılımı. Hata çubuğu ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Yaklaşım yükleme farklı hücre türleri kapsüllemek için ipucu. A) tekniği yükleme ipucu şematik gösterimi. B) Jurkat hücreleri kapsülleme verimliliğini grafik gösterir. C) A549 hücreleri kapsülleme verimliliğini grafik gösterir. D) PDC'ler kapsülleme verimliliğini grafik gösterir. E) grafik Jurkat T kapsülleme verimliliğini 200 µL pipet ipuçları (sarı) ve 1000 µL pipet ipuçları (mavi) kullanarak hücreleri gösterir. Noktalar: deneysel olarak değerleri belirlenir; Kapalı hatları: Poisson dağılımı. Hata çubuğu ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 . Hücre içinde damlacıkları eşleştirme. A) yaklaşım damlacıkları 2 alıcılar farklı hücrelerden eşleştirme için yükleme ipucu şematik gösterimi. B) grafik Jurkat T encapsulation bir giriş veya paralel iki giriş kullanarak hücreleri gösterir. Hücre toplama için bir uç 2.0x106 hücre/mL ve her iki 1.0x106 hücre/mL iki hücre toplama ipuçları. Noktalar: deneysel olarak değerleri belirlenir; Kapalı hatları: Poisson dağılımı. C) hidrojel boncuk ve etiketli Jurkat T hücreleri floresan mikroskobik bindirmeleri. D) Grafik eşlenmiş hücreleri akış sitometrik analizinde özel hidrojel boncuklar gösterir. Arsa ileri dağılım ve yana dağılım gösterir. E) özel hidrojel hücre sayıları karşılaştırma boncuk floresans mikroskobu ve akış sitometresi tarafından tespit gibi. Çubuklar: değer anlamına gelir; Bıyık: demek, n ≥ 4 standart hatası. Hata çubuğu ortalama standart hatasını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu protokol, yük ve damlacıkları yüksek üretilen iş, tek hücreli analiz için hücrelerde saklanması ve kontrollü hücre hücresel etkileşim çalışmaları için eşleştirme gerçekleştirmek için bir etkili ve basit tekniği göstermiştir. Ayrıca, hücrelere mikrosıvısal aygıtları yüklemek için birkaç geleneksel yaklaşım ile karşılaştırıldığında var ve bizim ipucu yaklaşım yükleme diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha verimli bir tekniktir gösterdi.

Eğitim Klinik numune veya nadir hücre tipleri kıt damlacık tabanlı Havacilik tarafından numarasında doğal bazı zorluklar sahip. Biz de göstermiştir gibi hücreleri tortu şırınga ve yüzey hortumunun, böylece, hücresel Kapsülleme için öngörülen değerleri uygun önleme eğilimindedir. Bu sorun kaçınmak için bazı gruplar şırıngalarda karıştırma çubuklarını kullanın. Ancak, nadir ve sınırlı hücre popülasyonlarının kullanırken, toplam hücre hacmi de böylece, büyük şırıngalar kullanımını sınırlama ve barlar karıştırarak sınırlıdır. Ayrıca, biz de hücre eki önlemek için boru Teflon coated daha yaygın olarak kullanılan boru yerine ama bu yöntem sonuçları iyileştirmek değil ve tüp çok uzun ise, (veri gösterilmez) hücre eki sorunu aggravates. Alternatif olarak, biz yaklaşım yükleme dikey bir tüp nerede hücreleri tüp ve değil belgili tanımlık tenkıye büyük şırınga cilt hücrelerinin kaybı önlemek için yüklenen kullanılır. Bu tekniği kullanarak, küçük numune hacmi hücrelerle yüklenebilir, Örneğin, nadir ve sınırlı olan PDC'ler. Ayrıca, tüp örnekten dikey hücre sedimantasyon önlemek için aygıta yüklenir. Tohum hücre için kullanılan boru küçük boyutları vardır ve mikro için karşılaştırılabilir. Akış tüp içinde basınç tahrik ve bir parabolik hız profili26izler. Bu maksimum akım hızı tüp merkezindedir ve en az hız boru27kenarlarında olduğunu anlamına gelir. Tüp ile hücreleri nüfusu kızarma hız degrade sınır hızda sıfıra yakın olduğu için onlar sakin nerede kenarlara doğru itilmiş hücreleri neden olur. Böylece, sedimantasyon veya hesap görme hücrelerinin kablo kanalları, kapsülleme verimliliği nerede deneysel veri ile tahmin edilen modeli eşleşmedi temsilcisi sonuçları gösterildiği gibi azaltır.

Damlacık Havacilik ile çalışan bilim adamları tarafından kullanılan başka bir yaygın olarak adapte ilavesi yoğunluğu reaktifler hücre sedimantasyon şırınga19önlemek için Iodinaxol gibi eşleşen hücre kültür ortamının yoğunluğu artırmak için çözümdür. Ancak, reaktifler eşleşen yoğunluğu hücresel davranışını etkileyebilir ve olumsuz etkiler sitokin salgı hücreleri tarafından (veri gösterilmez)28.

Birçok küçük ve büyük değişikliği teknikleri yükleme geleneksel hücredeki küçük iyileştirmeler kapsülleme verimliliği gösterdi rağmen elde edilen deneysel sonuçlar hala teorik hesaplamalar aynı değil. Ancak, yaklaşım yükleme ucuyla biz üstesinden sınırlamaları kapsülleme etkinlik ve önceki yöntemleri yönetilen Poisson istatistikleri tarafından olabilir. Bu teknik sadece süspansiyon hücre yüklemek için avantajlı değil ama aynı zamanda birincil Lenfositi ve mikrosıvısal çip için A549 gibi yapışık hücreleri yüklemek için uygulanabilir. Bol hücre satırları, örneğin A549, K562, vb, kullanırken daha büyük örnek hacmi kullanılabilir. Bu nedenle, örnek hacmi, bağlı olarak farklı boy pipet-ipuçları-ebilmek da var kullanılmış ve bu basit tekniği tek hücreli saklama ve birden çok hücre Kapsülleme için adapte edilebilir.

Düşük hücre konsantrasyonu damlacıkları tek kişilik hücrelerde encapsulation sağlamak için gerekli bir uygulama iken, hücre hücre eşleştirme için ilgili çalışmaları için her damlacık içinde kapsüllü ortalama sayısını artırmak için daha yüksek hücreleri konsantrasyonları istenen. Daha önce çift bağışıklık hücreleri mikrosıvısal çip veya microfabricated nanowells29,30,31tarif edilmiştir birkaç tek hücreli yöntem vardır. Damlacık Havacilik Poisson istatistikler için iki farklı hücre tipleri eşleştirme 1:1 hücre optimum hücre konsantrasyonları elde edilebilir belirler. Poisson tahmin üzerinde bağlı olarak, Ayrıca var. damlacıkları diğer kombinasyonları içerebilir bir olasılık 1:1 cep çifti tek hücre düzeyinde ve sonuçları artan hücresel anlamada hücresel etkileşimlerin çalışmaya arzu olabilir iken, birden çok hücre eşleştirme büyük avantajları da vardır. Birden çok hücre, bir hücre tür etkisi diğer hücre tipi anlamak sağlar. Çapraz konuşma farklı bağışıklık hücreleri arasında çeşitli enfeksiyonlar ve patojenlere karşı etkili bir bağışıklık yanıtı oluşturmak için yardım ve sağlamlık için bizim bağışıklık sistemi32de ekler. Bu nedenle, hücresel iletişim, farklı bağlamlarda, Örneğin, 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1yüksek hassasiyetle sorguya çekilmeyi. nasıl tek verimli artan anlayış ya da hücre çiftleri bağışıklık yanıtı indüksiyon denetler. Bu örneğin seri olarak onların anılan sıraya göre hedef hücreleri öldürmek için kapasite doğal katil hücrelerin veya sitotoksik T hücreleri incelemek özellikle ilginçtir.

Tartışılan damlacıkları, hücre birden çok Kapsülleme için daha yüksek hücre konsantrasyonları istenen. Ancak, hücre hücre Kapsülleme için bir giriş üzerinden yüklenirken, hücre hücre örnek daha yüksek konsantrasyonlarda neden olabilir, koya toplanacak. Bu kapsülleme oranları daha düşük ve daha yüksek teorik değerleri sapma olur. Bu sorun kaçınmak için hücreleri de iki ayrı giriş yüklenebilir. Teorik olarak, nerede bir ortalama hücre sayısı x garanti daha üst seviyelere hücre kapsüllemenin elde etmek için birden fazla giriş ile diğer mikrosıvısal aygıtlar geliştirmek mümkün olacaktır. Bu çalışmada biz ne zaman bir giriş ve iki giriş aynı toplam konsantrasyon kullanarak yüklenen ve benzer kapsülleme verimliliği elde Jurkat T hücrelerinin kapsülleme verimliliği araştırdık. Bu değişiklik araştırmacılar çift farklı hücre tipleri için yonga üzerinde sağlar.

Hücreleri hücre önemli kaybı olmadan mikrosıvısal cihazlara yükleme bu yöntem AIDS olsa akılda tutulması gereken bazı önlemler vardır. Şırıngaları madeni yağ ve Pipet uçları hücre örnek aspirating ile doldururken,-meli var olmak kaçmak hava kabarcıkları birleşme ve tüm sistem-meli var olmak ücretsiz air. Mineral yağ ile örnek karıştırmayın akılda tutmak önemlidir. Pipet ipuçları, örnekleri, içeren sıkıca mikrosıvısal aygıtla kaçağı ve daha fazla hava kabarcıkları birleşmesiyle önlemek için son derece önlem, alıcılar takılmalıdır. Özetlemek gerekirse, ipucu-hücresel davranış yoluyla hücre hücre kapsülleme önemli bir kayıp olmadan yüksek üretilen iş analizi için maliyet-etkin bir şekilde sağlayan basit, ancak, sağlam tekniği yüklenmesidir. Giriş, en iyi örnek konsantrasyonları ile kullanıldığında, pipet-ipuçları içeren hücreleri yükleme bu yaklaşım çok esnek ve yüksek kapsülleme verimlilik, yakın elde etmek için farklı hücre tipleri için ender birincil bağışıklık hücreleri, özellikle için adapte edilebilir tahmin edilen modelleri.

Disclosures

İfşa etmek yok.

Acknowledgments

Eindhoven University of Technology cömert desteği için teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
  2. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
  3. Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
  4. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  5. Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
  6. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  7. Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
  8. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  9. Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740 (2013).
  10. den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
  11. Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732 (2009).
  12. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  13. Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43 (2013).
  14. Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  15. Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  16. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  17. Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881 (2012).
  18. Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110 (2008).
  19. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  20. Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
  21. Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
  22. Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317 (2018).
  23. Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898 (2008).
  24. Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139 (2007).
  25. Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
  26. Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
  27. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42 (2001).
  28. Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
  29. Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
  30. Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
  31. Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175 (2012).
  32. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).

Tags

Mühendislik sayı: 144 damlacıkları havacilik ipucu yükleme Poisson dağılımı hücre kapsülleme hücre eşleştirme hücresel etkileşimlerin
Pipet Ucu yöntemine damlacık mikrosıvısal platformlar tohum hücrenin temel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F.,… More

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter