Summary
Este protocolo mostra como configurar um método confiável de HFS em camundongos. Neurônios em todo giro denteado do hipocampo são estimulados eletricamente por HFS diretamente e indiretamente em vivo. Atividade neuronal e sinalização molecular são examinados por c-fos e coloração imunofluorescente Notch1, respectivamente; neurogênese é quantificada pela bromodeoxyuridine para ensaio de rotulagem.
Abstract
Estimulação elétrica de alta frequência (HFS), utilizando eletrodos implantados visando diversas regiões do cérebro, tem sido comprovada como tratamento eficaz para várias desordens neurológicas e psiquiátricas. HFS na região profunda do cérebro, também chamado de estimulação profunda do cérebro (DBS), está se tornando cada vez mais importante em ensaios clínicos. Recentes progressos no campo da cirurgia de alta frequência (HF-DBS) de DBS começou a espalhar a possibilidade de utilizar esta técnica invasiva para outras situações, como tratamento para o transtorno de depressão maior (MDD), transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) e assim no.
Apesar destas indicações em expansão, os mecanismos subjacentes dos efeitos benéficos do HF-DBS permanecem enigmáticos. Para resolver esta questão, uma abordagem é usar eletrodos implantados que ativam escassamente distribuídas subpopulações de neurônios por HFS. Tem sido relatado que HFS no núcleo anterior do tálamo poderia ser usado para o tratamento da epilepsia refratária na clínica. Os mecanismos subjacentes podem estar relacionados com a neurogênese aumentada e alteraram a atividade neuronal. Portanto, estamos interessados em explorar as alterações fisiológicas de detecção de atividade neuronal, bem como a neurogênese no giro denteado do rato (DG) antes e após o tratamento de HFS.
Este manuscrito, descrevemos as metodologias para HFS direcionar a ativação da DG em camundongos, diretamente ou indiretamente e de forma aguda ou crônica. Além disso, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de fatias de cérebro para c-fos e Notch1 imunofluorescência coloração para monitorar a atividade neuronal e ativação de sinalização e para bromodeoxyuridine (BrdU) rotulagem para determinar o neurogênese após a indução de HF-DBS. A ativação da atividade neuronal e neurogênese após o tratamento de HF-DBS fornece evidência direta Neurobiológica e potenciais benefícios terapêuticos. Particularmente, esta metodologia pode ser modificada e aplicada para atingir outras regiões do cérebro interessados como os gânglios basais e regiões subtalâmica para distúrbios cerebrais específicas na clínica.
Introduction
HF-DBS é uma tecnologia neurocirúrgica para estimulação elétrica no cérebro, o que tem sido desenvolvido desde a década de 18701. Na década de 1980, HFS foi usado primeiramente como uma potencial intervenção terapêutica para a doença de Parkinson e distúrbios do movimento outro2. Nas últimas décadas, HF-DBS tem sido mais amplamente utilizada no tratamento de distúrbios cerebrais, que são atualmente incurável por uma estratégia terapêutica tradicional. Particularmente, devido a melhoria na precisão do eléctrodo HFS, resultados altamente eficazes e efeitos colaterais mínimos, o número de distúrbios cerebrais tratados por HF-DBS aumentou significativamente nas últimas décadas3,4, 5. Por exemplo, HF-DBS foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da doença de Parkinson (PD), demência do tipo Alzheimer, tremor essencial e outros tipos de movimento transtornos2,6, 7. em pacientes com DP, o medicamento dopaminérgico é reduzido até 50% durante HF-DBS8. Além do sucesso do tratamento dos distúrbios do movimento, HF-DBS também demonstrou seus poderosos efeitos no tratamento de doenças psiquiátricas na clínica e para o aumento do cognitivo como bem2,9, 10 , 11. Note-se que a pesquisa de HFS para o tratamento de outros transtornos psiquiátricos estão em vários estágios, oferecendo muita promessa para pacientes12.
Embora muitos estudos têm demonstrado que um focal HFS tem efeitos locais e remotos em todo o cérebro13, os mecanismos neurológicos e moleculares dos efeitos permanecem indescritível2,14. Na clínica, terapêutica HF-DBS geralmente é aplicado de forma a longo prazo para o tratamento da doença de Parkinson e dor crônica, etc. , que muitas opiniões são levantadas para explicar a melhoria gerada por um tratamento de HF-DBS, entre os qual uma possibilidade que a corrente HFS modula a actividade de rede neuronal, provavelmente por uma despolarização repetitiva de axônios nas proximidades do eletrodo implantado de HFS. Ou, HF-DBS pode alterar a taxa de descarga dos neurônios de saída e as metas projetadas. Também, HF-DBS pode levar a alterações sinápticas a longo prazo, incluindo a potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), que podem contribuir para uma melhora sintomática. Até agora, ainda não está claro se o HFS influences os principais eventos moleculares que regulam o celular processa tais como neurogénese adulta em vivo. Várias linhas de estudos têm demonstrado que o HFS em roedores poderia imitar respostas neurais semelhantes de clinicamente aplicada DBS15,16. Para entender os mecanismos celulares subjacentes de HF-DBS, neste estudo, primeiro montamos um na vivo metodologia HFS em ratos em uma aguda (um dia) ou a forma crônica (cinco dias). Em segundo lugar, montamos uma metodologia de análise por ativação para determinar a alteração da atividade neuronal e neurogênese após uma entrega de HF-DBS.
Dado que a produção neuronal de células-tronco neurais é abundante durante o desenvolvimento embrionário, mas continua ao longo da vida adulta, a zona subgranular hippocampal é uma das principais áreas onde ocorre a neurogênese. O processo de neurogênese é influenciado por vários factores fisiológicos e patológicos. Em certos casos de epilepsia, a neurogênese do hipocampo é drasticamente diminuída17,18. Além disso, uma única eletroconvulsoterapia poderia aumentar significativamente a produção neuronal no giro denteado19. Estas observações sugerem que a atividade eletrofisiológica desempenha um papel crítico na regulação da neurogénese adulta e plasticidade sináptica no hipocampo neurônios. Portanto, para demonstrar ainda mais os efeitos de HF-DBS na atividade neuronal e neurogênese, primeiro realizamos um ensaio de imunocoloração do imediato início gene (IEG) c-fos que é um conhecido marcador de atividade neuronal a curto prazo resultantes da experiência de20. Sinalização de Notch1 é detectado também para monitorar a sinalização ativação após a entrega HFS21,22. Além disso, podemos também detectar a produção neuronal por um BrdU rotulagem análise após a indução de HF-DBS em várias maneiras, embora BrdU coloração também pode ser um marcador para gliogenesis.
No presente estudo, duas metodologias HFS são adaptadas para a ativação da DG hippocampal de destino diretamente e indiretamente. O eletrodo é implantado para a DG diretamente ou implantou no caminho de perforant medial (PP), que envia projeções para ativar os neurônios da DG. Para a indução de HF-DBS, um estimulador programável é apresentado para uma estimulação contínua através do eletrodo fixo sobre a cabeça de rato. Para determinar os efeitos de HFS na ativação neuronal e neurogênese, detectamos a expressão de c-fos e Notch1 por coloração imunofluorescente e o número de neurônios positivos BrdU-incorporada na região DG hippocampal, respectivamente, após a o tratamento de HFS. Particularmente, os efeitos sobre a neurogênese na DG o HF-DBS são comparados entre aguda e uma forma de estimulação crônica, ou entre uma direta e uma forma de estimulação indireta, respectivamente.
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Protocol
Procedimentos experimentais animais seguiram as orientações institucionais de Pequim Instituto de básico ciências médicas (Beijing, China) e os regulamentos governamentais chineses para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Os ratos (adulto masculino, 26 ~ 30 g) foram instalados e mantidos a uma temperatura constante de 23 ° C, com água e comida ad libitum, sob um ciclo escuro do luz/12-h 12-h (luzes acesas às 07:00). Todos os procedimentos experimentais foram realizados durante o ciclo de luz.
1. Preparação cirúrgica
Nota: Um eletrodo personalizado foi caseiro usando o método modificado de Halpern relatório23.
- Use 2 microfios de cobre (com um diâmetro externo de 200 µm) como o eletrodo bipolar paralelo. Enrole os eléctrodos em torno de si para formar eletrodos cilíndricos para a estimulação.
Nota: Aqui, o comprimento do eletrodo dentro do PP ou DG era variado de acordo com a profundidade anatômica do núcleo. - Esterilize os eletrodos usando um gabinete de desinfecção de óxido de etileno. Manipular e armazenar os eléctrodos de microfio 2 canais caseiros sem qualquer contaminação. Os eléctrodos devem ser rigorosamente esterilizados antes de qualquer implantação cirúrgica.
- Autoclave os instrumentos cirúrgicos.
- Antes da cirurgia, injete o mouse com pentobarbital (20-50 mg/kg) intraperitonealmente, para alcançar um plano cirúrgico da anestesia.
- Injete o mouse com suspensão estéril penicilina G procaína (75.000 U, I.M.) e um agente analgésico (carprofeno, 0,05 - 1 mg/kg, SC) para diminuir o risco de infecções e dor, respectivamente,24.
- Após a anestesia do animal, aplique um lubrificante de olho para ambos os olhos para evitar ressecamento do olho. Certifique-se a indução de sedação e a profundidade da anestesia por reflexos do animal em resposta a toe beliscar e prosseguir com a operação somente quando não há resposta ocorre.
Nota: Vet pomada é outra opção para evitar ressecamento do olho. - A maioria do pelo no topo da cabeça de rato a barba com máquina de cortar cabelo elétrica ou uma lâmina de barbear, esterilizar a área depilada com três esfrega alternadas de 70% de álcool e betadine solução e prosseguir com a operação, depois do betadine seca na pele.
2. alta frequência estimulação cirurgia25,26
Nota: Nesta etapa, é um eletrodo implantado unilateralmente para a DG dorsal ou medial área PP, uma parte do hipocampo com cargos críticos na aprendizagem episódica e a memória.
- Coloque o mouse anestesiado sobre a armação estereotáxica. Para manter a cabeça do rato imóvel, alinhar as barras de ouvido corretamente e instalá-los rapidamente. Aperte suavemente as barras de orelha para que eles oferecem suporte a cabeça centrada e segura o mouse um pouco.
- Use uma almofada termostática para manter a temperatura do corpo do animal a 37 ± 0,5 ° C.
- Use a pinça para agarrar a pele anterior orelhas de rato e cortá-lo com uma tesoura esterilizada para remover sobre área de 1 cm2 de pele no topo do crânio do rato.
Nota: Uma pequena quantidade de sangramento pode ser observada ao longo das bordas da pele cortada. - Retire o músculo e outro anexo sobrejacente do crânio com um cotonete de algodão para expor a superfície do crânio. Utilize um cotonete de algodão e dissecação formão para limpar todas periósteo, tendões e tecido conjuntivo de superfície completamente para identificar o sagital do crânio e linhas de suturas de lambda.
- Identifica o bregma e o lambda ponto. A interseção da sutura coronal e a sutura sagital na porção média superior da calvaria é onde se encontra o bregma. A interseção da sutura lambdoid pela sutura sagital é onde o lambda é visível. Use o bregma como o ponto original para definir a posição do núcleo.
- Após a identificação da posição de bregma e o lambda no crânio, ajuste estes dois pontos no nível horizontal. Certifique-se que a altura destes dois pontos é quase o mesmo no sentido dorso-ventral (erros devem ser < 0,05 mm). Além disso, certifique-se de que o crânio é de nível na direção médio-lateral na mesma maneira26.
- Para uma cirurgia unilateral, monte um caseiro 2-canal cobre microarame eletrodo no porta-eletrodo rotativo na armação estereotáxica cirúrgica.
- Coloque o eléctrodo verticalmente acima do ponto de bregma em primeiro lugar e defini-lo como o site original. Use o digital exibida estereotáxico quadro cirúrgico para indicar o ântero-posterior (AP), médio-lateral (ML), e dorso-ventral (DV) posições.
Nota: Para evitar que o eletrodo ficar dobrada, não toque a ponta do eletrodo sobre o crânio durante a operação. - Mova o eletrodo suavemente para a posição correcta (figura 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 para DG e AP-3.8/ML ± 3.0 para PP, respectivamente)27 acima do crânio sem qualquer toque. Quando o site desejado foi identificado para a inserção do eléctrodo, utilize os ajustes dorsoventral estereotáxico para maior o suporte de eletrodos e marcar a posição com um marcador preto.
Nota: A localização exata em referência as coordenadas estereotáxicos pode variar por sexo, peso e tensão de rato. Ratos adultos do mesmo sexo devem ser usados para minimizar qualquer variação no local. Se possível, pré-operacional exames anatômicos devem ser usados para identificar o local em um assunto individual base27. - Use uma broca Hand-Held micromanipulador-assistida (burr tamanho = 0,5 mm) para fazer buracos no crânio na posição marcado precisamente. Esterilize a ponta da rebarba com etanol a 70% antes da perfuração. Mova para cima a mini broca através do crânio ao longo do eixo z 0.8 - 1.0 mm sem alterar sua posição X-Y. Use um algodão estéril para parar qualquer sangramento durante a operação.
Nota: Para evitar excesso de perfuração e excessiva geração de calor durante a perfuração, certifique-se a velocidade de rotação é 15.000-18.000 rotações por minuto (RPM) e frequentemente retirar a broca de trepanação cada 8-10 s. - Manter a perfuração até a dura-máter é exposta. Utilize uma agulha torta para remover quaisquer restos de osso que são gerados durante a perfuração e fazem um furo sobre a dura-máter sem danificar o tecido de cérebro mole subjacente.
Nota: Para evitar danificar o tecido cerebral, a agulha romba torta também pode ser substituída com uma pinça bem contundente. - Para confirmar que a trepanação foram feita corretamente na posição desejada, reduzir a altura do eletrodo por um ajustamento do quadro de cirurgia estereotáxica e certifique-se de que o eletrodo pode ser inserido suavemente através do orifício de trépano sem tocar os obstáculos. Em caso afirmativo, inserir lentamente os eletrodos a uma profundidade de 1,8 mm para a DG (ou 3,0 mm para o PP) da superfície do crânio localizado no PP medial para a DG (PP-DG).
Nota: Limpe qualquer líquido cefalorraquidiano ou saídas de sangue da trepanação com algodão estéril durante o processo de implantação do eletrodo. - Depois de inserir o microfio eléctrodo no orifício do crânio, segure-o no lugar com cimento dental adequado, utilizando uma espátula pequena. O cimento rarefaz, moldá-lo ao redor do eletrodo inserido e parafusos para formar um belo boné liso. Debride e desinfectar as bordas da ferida.
- Desengate o elétrodo do porta-eletrodo. Retire o mouse da armação estereotáxica e devolvê-lo para uma gaiola quente.
Nota: Após a cirurgia, espera-se com o retorno dos animais à suas gaiolas até que eles tenham recuperado da anestesia com consciência suficiente. - Deixe o mouse mover-se livremente e deixe-o recuperar por 2 dias na gaiola. Em seguida, conecte o eletrodo implantado no rato do cérebro de um estimulador programável através de leva. Configura a interface do software, tal como apresentado na Figura 2. Definir os parâmetros HFS como 6 séries de 6 trens de 6 pulsos a 400 Hz (Figura 1B, 100 ms entre os trens, 20 s entre as séries)28. Defina a intensidade de estimulação para 200 μA.
- Entrega um HFS para o período desejado de tempo conforme definido. Entregar a estimulação 2 x por dia às 08:00 e às 20:00
- Para o grupo de controle, implante de eletrodos nos ratos e não realizar uma estimulação.
- Para a coloração de c-fos , estimular os ratos experimentais aguda (2x por dia). Para a rotulagem de BrdU, divida os ratos experimentais em um grupo de estimulação aguda (aplicado 2x por dia) e um grupo de estimulação crônica (aplicada x 10 em 5 dias, 2x por dia). Durante o curso da estimulação, certifique-se que o mouse está acordado. Lembre-se de assegurar que os contatos não estão torcidos.
Nota: No último dia do procedimento, os ratos no grupo de estimulação aguda foram estimulados simultaneamente. - Quando a estimulação é feita, cuidadosamente desconecte o pino do eletrodo o eléctrodo e o conector do sistema de gravação.
3. imunofluorescência coloração e Bromodeoxyuridine rotulagem29
- Para o c-fos e coloração Notch1, cerca de 3 h após o último estímulo HF-DBS, anestesiar os ratos injetando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para alcançar um plano cirúrgico da anestesia.
- Para a rotulagem de BrdU, cerca de 12 h após o último estímulo HF-DBS, dê 6 injeções de BrdU para o controle e os ratos estimulados em intervalos de 2-h (50 mg/kg em soro fisiológico a 0,9%, I.P.). 36 h após a última injecção, anestesiar os ratos injetando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para alcançar um plano cirúrgico.
- Faça incisões usando um bisturi pela caixa torácica para expor o coração e passar uma agulha de calibre 22 perfusão contundente para o ventrículo esquerdo. Faça uma pequena incisão no átrio direito. Transcardially-perfundir com 50 mL de frio fosfato salino (PBS) seguido por 50 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) em 1X PBS (pH 7,4).
Nota: Mude a PBS para o PFA quando o rato sangue na vivo é substituído e o fluido corre claro. Uma boa perfusão pode ser julgado pelo esclarecimento do fígado. A perfusão deve ser interrompida uma vez que foram observados30tremores de fixação. - Decapitar o mouse com tesouras oftálmicas, fazer uma incisão na pele e expor o crânio. Usando fórceps, lascar-se ligeiramente fora do crânio e cuidadosamente dissecar o cérebro de rato inteiro. Post-fix do cérebro em paraformaldeído 4% por mais 2 dias e transferi-lo para uma solução de 30% de sacarose a 4 ° C durante a noite.
- Usando um criostato, corte o cérebro em secções coronais de 20 µm. Transferência e montar as seções para a lâmina de vidro com uma escova e armazená-los a-20 ° C.
Nota: Animais com misplacements eletrodo ou danos mecânicos excessivos serão excluídos da análise posterior. - Transferir os slides em PBS normal (0,1 M, pH 7,4) não contendo nenhum fixador. Lave as fatias com PBS para 3-4 x por 5 min cada para remover qualquer excesso fixador. Para o grupo de BrdU-etiquetadas, incubar as secções no 2-N HCl por 30 min a 37 ° C e lavá-los em um tampão de borato de 0,1 M (pH 8,4; 10 min). Em seguida, lave as fatias 2 x por 5 min em PBS.
Nota: Immunostaining então é executada. - Trate as fatias de incubação em solução (soro de cabra normal de 1%, 3% albumina de soro bovino < BSA >, 0,5% Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente (RT) de bloqueio.
- Incube as fatias com anti -c-fos polyclonal do anticorpo (1: 500; coelho), anticorpo anti-Notch1 (01:50; cabra) ou anticorpo anti-BrdU (1:800; rato) na solução de bloqueio a 4 ° C durante a noite.
- Lave as fatias 3 x em PBS, incube-os então com Alexa Fluor 568-conjugado anticoelho (1: 500), Alexa Fluor 488-conjugado anticabra (1:1, 000), ou anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 anti-rato (1: 500) por 1h no RT
- Lavar as amostras 3 x em PBS (10 min cada vez). Cobrir as seções do cérebro imuno-rotulados usando um meio de montagem antidesbotamento reagente contendo DAPI. Deixe as fatias de secar ao ar e armazená-los, protegido da luz a 4 ° C.
- Adquira imagens das áreas dos lados do cérebro com um multi-canal de alta resolução (sequencial) microscópio confocal estimuladas e unstimulated hippocampal. Defina os parâmetros de imagem consistentemente entre os grupos experimentais e controle.
- Executar uma imagem de mosaico usando um objectivo de alta ampliação (20 X ar objetivo, at 0,45) para adquirir contínua 3D (XYZ) imagens de campos adjacentes de visão usando o palco motorizado e utilizar software apropriado para costurá-los juntos para fazer grande composição imagens.
Nota: Funções de telha incluem verdadeira costura e suavização de opções para imagens sem emenda melhoradas. Rapidamente e facilmente, imagens compostas são preparadas usando a função de costura, para formar uma imagem sobre uma vasta área. - Para c-fos e coloração Notch1, realizar uma análise quantitativa de núcleos positivos da imunofluorescência densidade21 das imagens costuradas. Aleatoriamente, selecione 3 áreas nas sub-regiões hippocampal rostrais, dorsais e ventrais do DG e medir a densidade de imunofluorescência de forma duplo-cego usando Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
- Para um BrdU rotulagem, analise as fatias em torno do ponto de perfuração através do hipocampo dorsal (-1,70 mm a-2,70 mm em relação ao bregma) de modo duplo-cego.
- Conte apenas positivo BrdU neurônios em DG. Incluem as células deitado dentro de diâmetros de 2-célula da célula grânulo na contagem.
Nota: Aqui, contando foi realizada usando um 40 X objetivo de ar. Aleatoriamente, 3-5 seções por animal foram contadas, e as contagens foram em média e expressa como meio por DG19.
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Representative Results
Após a estimulação de HF-DBS para a sub-região DG hippocampal diretamente ou a sub-região PP para ativar o DG indiretamente através de inseridos eletrodos usando os ajustes estereotáxico, os roedores foram anestesiados com pentobarbital e amostragem 3h após a estimulação de HF-DBS ontem para o c-fos e Notch1 immunostaining. Para a coloração de BrdU, 36 h após a última injecção de BrdU após 1 dia ou 5 dias de estimulação de HF-DBS, os roedores foram anestesiados com pentobarbital para a preparação das seções do cérebro. A Figura 3 mostra que a expressão de c-fos foi significativamente aumentada no lado ipsilateral da DG. Além disso, a expressão de c-fos no lado contralateral da DG também foi upregulated em comparação com os controles de estimulação não-HF-DBS que mostrou quase sem expressão de um sinal de c-fos . Baseado no Notch1 específico imunofluorescência de coloração em fatias do cérebro, como mostrado na Figura complementar 1, mais demonstramos que a sinalização de Notch1 poderia também ser ativada no DG hippocampal adulto após a estimulação de HFS por uma indução da despolarização de neurônios em PP (consulte também os dados brutos fornecidos como arquivo suplementar 1).
Além da estimulação direta do HF-DBS na sub-região DG, a Figura 4 mostra a posição e o local de estimulação de HF-DBS da ponta do eletrodo, que foi instalado no PP. medial Figura 4B demonstrou que o HF-DBS estimulação em PP não só aumentou significativamente o nível de expressão de c-fos no lado ipsilateral da DG, mas também aumentou a expressão de c-fos no lado contralateral da DG em comparação com a estimulação não-HF-DBS controles.
Baseia a BrdU rotulagem análise as fatias do cérebro, como mostrado nas figuras 5A - 5C, estamos ainda mais demonstrado que essa neurogênese pode também ser ativado no DG hippocampal adulto após uma estimulação crônica (5 dias) HF-DBS a DG diretamente. Uma estimulação crônica de HF-DBS no DG não apenas significativamente upregulated a neurogênese no ipsilateral lado mas também aumento da neurogênese no lado contralateral, em comparação com os controles de estimulação não-HF-DBS. No entanto, a estimulação aguda (1 dia) não conseguiu induzir um upregulation da neurogênese no lado ipsilateral ou no lado contralateral da DG. Como mostrado na Figura 5D, no grupo de estimulação aguda ou no grupo de estimulação crônica, uma indireta HF-DBS em PP não poderia mudar o nível de neurogênese no hipocampo DG.
Figura 1 . Representação esquemática dos alvos de cérebro da ponta do eletrodo e parâmetros do HFS. Caminho de perforant (A) a projeção neuronal da medial em uma lâmina inferior de giro do pectínea é indicado. A posição dos eléctrodos inseridos (em roxo) para estimular a DG diretamente ou a sub-região PP são indicados. (B), o parâmetro HFS é indicado como 6 séries de 6 trens de 6 pulsos a 400 Hz, com 100 ms entre os trens e 20 s entre as séries. CA = o Cornu Ammonis; DG = o giro denteado; PP = o caminho de perforant. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Interface e parâmetros do multistimulator. o estimulador foi conectado a um conversor digital-analógico e ativado pelo software proprietário. O tipo de estímulo do HFS foi monofásico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Ativação neuronal na DG em resposta ao tratamento de HF-DBS diretamente. (A), a ponta do eletrodo (caixa vazia branca) foi posicionado acima da região DG diretamente (AP-2.1 / ± 1,0 ML / DV 1,8) com ou sem o HFS. Este painel mostra o immunostaining da seção coronal das fatias de cérebro com anticorpo deum c-fos no controle e os grupos HFS. Coloração de DAPI azul foi usada para indicar a localização dos núcleos hippocampal. Barra de escala = 100 µm. (B), este painel mostra uma análise quantitativa da densidade do sinal de imunofluorescência. No lado ipsilateral da DG, os neurônios foram ativados significativamente com uma alta expressão de c-fos, e a expressão de c-fos no lado contralateral da DG é também relativamente maior em comparação com a expressão de c-fos de controle de ratos sem um tratamento de HFS. Significa ± SEM, One-Way ANOVA, F2,24 = 216, P < 0,0001, teste post hoc de Bonferroni, * * *P < 0,001, n,n-sti = 9 (3 fatias de 3 ratos), nContra HFS = 9 (3 fatias/mouse da 3 ratos), nIPS HFS = 9 (3 fatias/mouse de 3 ratos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Ativação neuronal na DG em resposta ao HFS na sub-região PP. (A), a ponta do eletrodo (caixa vazia branca) foi posicionado em PP medial na posição do AP-3.8, ML ±3.0 e DV +3.0, com ou sem o HFS. (B), este painel mostra o immunostaining da seção coronal das fatias de cérebro com anticorpo deum c-fos no controle e os grupos HFS. Coloração de DAPI azul foi usada para indicar a localização dos núcleos hippocampal. Barra de escala = 100 µm. (C), este painel mostra uma análise quantitativa da densidade imunofluorescência. O tratamento de HFS em PP significativamente poderia ativar neurônios ipsilaterais da DG com uma alta expressão de c-fos. A expressão de c-fos no DG contralateral é também relativamente maior em comparação com a expressão de c-fos dos ratos controle sem um tratamento de HFS. Significa ± SEM, One-Way ANOVA, F2,24 = 189.3, P < 0,0001, teste post hoc de Bonferroni, * * *P < 0,001, n,n-sti = 9 (3 fatias de 3 ratos), nContra HFS = 9 (3 fatias/mouse de 3 ratos), nIPS HFS = 9 (3 fatias/mouse de 3 ratos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Ativação distinta de neurogênese na DG em resposta ao HFS em DG e PP respectivamente. (A), este painel mostra uma paradigma experimental para o tratamento de HFS e a geração de neurônios proliferando BrdU-etiquetadas em DG. Os animais foram divididos em aguda e um grupo de crônico. No grupo agudo, os ratos foram submetidos a um tratamento de HFS 2 x no dia 5. No grupo de crônica, os ratos foram submetidos a um tratamento de HFS durante 5 dias (do dia 1 a dia 5, 2x por dia). Em seguida, os animais em ambos os grupos foram injetados com BrdU (50 mg/kg, 6 x por intervalos de 2-h) no dia 6. No dia 8, os animais foram anestesiados e pintados para a preparação das seções do criostato. (B) este painel mostra a coloração imunofluorescente de BrdU (em verde) post-HF-DBS em DG. (C) A análise quantitativa da produção neuronal indicou que a aguda (2x em 1 dia) estimulação no DG não poderia reforçar a neurogênese, enquanto a crônica estimulação (10 x dentro de 5 dias) no DG significativamente upregulated a neurogênese. O número de BrdU rotulagem células aumentadas significativamente na crônica comparado ao grupo controle, grupo ambos no hemisfério ipsilateral e contralateral. Barra de escala = 100 µm. meios ± SEM, ANOVA de duas vias, estimulação tipo efeito F2, 14 = 97,09, P < 0,0001, hemisfério efeito F1, 14 = 1.137, P = 0.3044, teste post hoc de Bonferroni, * * *P < 0,001, n Controle = 3 (3 fatias de 3 ratos), n1 dia = 4 (4 fatias de 3 ratos), n5 dias = 3 (3 fatias de 3 ratos). (D) este painel mostra a mancha da imunofluorescência de BrdU (em verde) post-HF-DBS na sub-região PP. (E) A análise quantitativa da produção neuronal indicou que a aguda (duas vezes em um dia) ou crônica (10 x 5 dias) estimulação em PP não poderia aumentar significativamente a neurogênese. O número de BrdU rotulagem células foi relativamente estável, com ou sem o tratamento de HFS. Barra de escala = 100 µm. meios ± SEM, ANOVA de duas vias, estimulação tipo efeito F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, hemisfério efeito F1, 16 = 1.402, P = 0.2537, teste post hoc de Bonferroni, P > 0,05, n Controle = 3 (3 fatias de 3 ratos), n1 dia = 3 (3 fatias de 3 ratos), n5 dias = 5 (5 fatias de 3 ratos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Expressão de Notch1 na DG em resposta ao tratamento de HF-DBS. (A) este painel mostra a coloração imunofluorescente de Notch1 (em verde) 3 h após o HF-DBS em DG. Esta figura foi citada e modificada a partir relatório21 do Feng. (B) uma análise quantitativa da fluorescência indicou que o HFS em DG poderia aumentar a expressão de Notch1. Barra de escala = 100 µm. meios ± SEM, estudante t-teste, t = 12, * * *P < 0,001, n,n-sti = 9 (3 fatias/mouse de 3 ratos), nHFS = 9 (3 fatias/mouse de 3 ratos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar arquivo 1. Dados brutos. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A técnica de HF-DBS tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta poderosa para o tratamento de muitos distúrbios neurológicos, desde a década de 1990. Até agora, o trabalho de Marco de HF-DBS é para o tratamento da doença de Parkinson e tremor essencial, que atraiu muita atenção e interesse, tanto na comunidade científica e clínica. Existem vários tipos de estudos em andamento de HF-DBS por muitos grupos para aplicação terapêutica do HF-DBS em certas desordens neurológicas e psiquiátricas32,33. Alguns desses estudos são atualmente em vários estágios de ensaios clínicos2,34. Embora HF-DBS deve trazer um benefício significativo, efeitos colaterais de estimulação pode ocorrer mesmo com um perfeito posicionamento do cérebro, tais como mudanças negativas no humor e pensamento, etc., que são reversíveis e podem ser evitados com modificações do configurações de estimulação.
Além dos progressos significativos da tecnologia HF-DBS acumulada de ensaios clínicos nas últimas décadas, os estudos de HF-DBS em animais vivos também apresenta a oportunidade de entender as mudanças fisiológicas e neurobiológicos mecanismos induzidos pela estimulação elétrica. Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia modificada de HF-DBS realizada em camundongos para estimular hippocampal sub-região DG com um HFS, direta ou indiretamente. Embora o protocolo descrito é executado em roedores, HFS resposta estudos também têm sido com sucesso realizados em outros organismos-modelo, incluindo porcos35. Para esta técnica, cirurgia estereotáxica pode também ser usada para uma estimulação de núcleo-alvo potencial para testar a eficácia do HFS usando certos modelos animais com doenças neurológicas e psiquiátricas. As conclusões de tais estudos devem traduzir facilmente para a clínica, especificamente para o refinamento do HFS em alvos existentes. Observe que, em contraste com a série de exposições múltiplas do HF-DBS na clínica, neste estudo metodológico, escolhemos uma exposição única e a curto prazo de HFS para estimular e induzir a atividade neuronal no hipocampo DG, parâmetro e parte do paradigma do que foi relatado anteriormente, para induzir a LTP das fatias de hipocampo21,28, HFS.
Limitações gerais de HF-DBS têm sido extensivamente revisado em outro lugar24,25. Um dos desafios para o experimento aqui também é a necessidade de uma excelente técnica cirúrgica e o contínuo cuidado cirúrgico locus anatômico. Para corretamente e precisamente do implante do eletrodo para o núcleo do alvo para a estimulação, um dos processos-chave é uma cirurgia bem sucedida por um técnico especializado para evitar ferimentos desnecessários dos vasos sanguíneos e a má colocação do eletrodo. Além disso, a posterior análise anatômica e histológica do espécime cérebro também é necessária para confirmar o direcionamento adequado do eletrodo após um HFS. Isto também é uma das vantagens desta abordagem, para demonstrar claramente a segmentação corrigida do eletrodo após a operação em um cérebro animal intacto. Muitos dos detalhes fornecidos neste protocolo podem ser facilmente adaptados para um longo prazo estimulação através de um estimulador implantado no animal. Note que também é passível de parâmetros de estimulação alternativa em potenciais alvos terapêuticos cérebro com diferentes padrões de entrega HFS. No entanto, este artigo relatou um HFS aguda unitárias, entregado por uma unidade de estimulador programável para entender as mudanças celulares após a estimulação elétrica.
Apesar de HF-DBS serve como uma opção alternativa para o tratamento de desordens neurológicas e psiquiátricas na clínica há vários anos, os mecanismos subjacentes a sua eficácia permanecem mal compreendidos. Considerando o uso e melhorias futuras de HF-DBS, é necessária uma abordagem mais pragmática. Como uma ferramenta de desenvolvimento, a técnica HFS precisa ainda mais inovação técnica e descoberta mecanicista. Para estudar os mecanismos celulares e moleculares de HF-DBS, uma análise global do transcriptoma baseada em tecnologias de sequenciamento do elevado-throughput irá fornecer informações importantes para entender os eventos moleculares e sinalização alterações após uma indução de HF-DBS 36. além da estratégia de seleção imparcial, baseada no exame dos candidatos moleculares existentes que têm sido provada a responder a despolarização neuronal, será provavelmente também fornecem pistas importantes para identificar as chaves efetores responsável por HFS com. C-fos é upregulated em resposta à atividade neuronal intrínseca, então olhando sua expressão teria pelo menos fornecer-em uma paisagem de neurônios recentemente demitido37. No entanto, c-fos não deve somente ser usado para refletir apenas atividades desde que parece também marcar os neurônios passando por LTP37. Trabalhos anteriores, incluindo a nossa, têm demonstrado que Notch1 desempenha um papel crítico na plasticidade sináptica em neurônios hippocampal maduros e é essencial para a neurogénese adulta na vivo21,22. Em termos de situação, uma localização quantitativa e spatiotemporal detalhada de chave candidatos devem ser cuidadosamente caracterizados e descritos pre- e post-HFS indução por uma análise imuno-histoquímica da expressão de c-fos . Estudos como este irão fornecer evidência direta para demonstrar as alterações dos padrões de expressão de gene em várias regiões do cérebro em resposta a um HFS21, que também será benéfico para revelar as alterações celulares como a ativação neuronal, neurogênese, ou neurodegeneração.
Também deve ser notado que apesar das vantagens de um aplicativo de HF-DBS na clínica, devido ao fato de que os resultados do efeito de estimulação são fortemente associados com os parâmetros de estimulação e localização no cérebro, o celular e molecular-alvo os mecanismos subjacentes efeitos do HFS podem ser muito complicados. Neste estudo, realizamos mais BrdU rotulagem para investigar os efeitos agudos e crônicos de HFS sobre neurogénese adulta. Embora BrdU coloração pode ser um marcador para neurogênese e gliogenesis, com base em relatórios anteriores, a maioria de aumento BrdU neurônios positivos observados o SGZ após um tratamento de HF-DBS deve ser o proliferativa progenitores neurais adulto21 , 38 , 39. independentemente da complexidade dos mecanismos subjacentes ao tratamento HFS, os métodos e resultados que descrevemos neste manuscrito fornecem evidência direta que repetitivos estimulação elétrica de alta frequência para ativar a DG hippocampal significativamente poderia induzir a ativação da neuronal de atividade e neurogênese em vivo.
Em resumo, temos demonstrado que um HF-DBS pode melhorar a atividade neuronal e a neurogênese de ratos, em comparação com a atividade neuronal e a neurogênese de ratos controle que não se submetem a um HF-DBS. Isto pode avançar o conhecimento científico sobre os efeitos cognitivos e padronização de estimulação do HFS na vivo. A identificação de ativação neuronal após uma aguda tratamento HF-DBS diretamente ou indiretamente na vivo demonstra que um tratamento de HFS tem efeitos significativos sobre a transmissão sináptica de ligações locais e de longa distância. A indução rápida de ativação neuronal após um tratamento de HF-DBS fornece uma ferramenta poderosa para manipular a transmissão sináptica prejudicada ou desynchronization em muitas desordens neurológicas e psiquiátricas, tais como o MDD. Por outro lado, a indução de neurogênese após um tratamento de HF-DBS crônica e direta, mas não aguda ou indireta sugere a eficácia distinta e variabilidade funcional entre modos diferentes de estimulação elétrica. Tais achados fornecem evidência direta para a modulação neural e potenciais benefícios terapêuticos de HFS no futuro. Tomados em conjunto, HF-DBS irá apresentar vantagens substanciais para o tratamento de desordens neurológicas e psiquiátricas, integrando os avanços tecnológicos feitos na clínica e os progressos mecanicista no laboratório.
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Disclosures
Os autores não têm nada a declarar.
Acknowledgments
Apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China bolsas, 31522029, 31770929 e 31371149 (para Haitao Wu), programa 973 (2014CB542203) do programa estadual de desenvolvimento chave para a pesquisa básica da China (a Haitao Wu) e Grant Z161100000216154 do Beijing Municipal ciência e tecnologia Comissão (Haitao Wu). Os autores agradecer todos os membros do laboratório Haitao Wu para seu encorajamento e discussões. Os autores são extremamente gratos ao Zhenwei Liu por sua ajuda com o aparelho de depuração.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
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