Summary
Questo protocollo viene illustrato come impostare un metodo affidabile di HFS in topi. Neuroni nel giro dentato dell'ippocampo sono stimolati elettricamente da HFS direttamente e indirettamente in vivo. Attività neuronale e induzione di segnali molecolari sono esaminate dal c-fos e macchiatura immunofluorescente Notch1, rispettivamente; neurogenesi è quantificata mediante analisi di etichettatura della bromodeossiuridina.
Abstract
Stimolazione elettrica ad alta frequenza (HFS), utilizzando elettrodi impiantati in varie regioni del cervello, il targeting è stata dimostrata come un efficace trattamento per vari disturbi neurologici e psichiatrici. HFS nella regione profonda del cervello, anche denominato stimolazione cerebrale profonda (DBS), sta diventando sempre più importante negli studi clinici. Recenti progressi nel campo della chirurgia DBS (HF-DBS) ad alta frequenza ha iniziato a diffondersi la possibilità di utilizzare questa tecnica invasiva ad altre situazioni, come trattamento per il disturbo di depressione maggiore (MDD), disturbo ossessivo-compulsivo (OCD) e così su.
Nonostante queste indicazioni in espansione, i meccanismi degli effetti benefici di HF-DBS rimangono enigmatici. Per rispondere a questa domanda, un approccio consiste nell'utilizzare elettrodi impiantati che attivano scarsamente distribuite sottopopolazioni di neuroni di HFS. È stato segnalato che HFS nel nucleo anteriore del talamo potrebbe essere usato per il trattamento dell'epilessia refrattaria in clinica. I meccanismi di fondo potrebbero essere collegati con il neurogenesis aumentato e alterata attività neuronale. Pertanto, siamo interessati ad esplorare le alterazioni fisiologiche tramite la rilevazione di attività neuronale, come pure la neurogenesi nel giro dentato (DG) del mouse prima e dopo trattamento di HFS.
In questo manoscritto, descriviamo metodologie per HFS indirizzare l'attivazione della DG in topi, direttamente o indirettamente e in maniera acuta o cronica. In più, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di fette del cervello per c-fos e Notch1 immunofluorescente macchiatura per monitorare l'attività neuronale e l'attivazione di segnalazione e per bromodeossiuridina (BrdU) etichettatura per determinare la neurogenesi dopo l'induzione HF-DBS. L'attivazione dell'attività neuronale e neurogenesi dopo il trattamento di HF-DBS fornisce la prova diretta neurobiologica e potenziali benefici terapeutici. In particolare, questa metodologia può essere modificata e applicata per altre regioni del cervello interessati quali i gangli basali e subtalamica regioni per disturbi cerebrali specifiche nella clinica di destinazione.
Introduction
HF-DBS è una tecnologia neurochirurgica per la stimolazione elettrica del cervello, che è stato sviluppato dal 1870s1. Nel tardo 1980, HFS venne usata come intervento terapeutico potenziale per il morbo di Parkinson e disordini di altri movimento2. Negli ultimi decenni, HF-DBS è stato più ampiamente utilizzato nel trattamento dei disordini del cervello che sono attualmente incurabili di una strategia terapeutica tradizionale. In particolare, grazie al miglioramento della precisione dell'elettrodo HFS, i risultati altamente efficaci e gli effetti collaterali minimi, il numero di disturbi cerebrali trattati da HF-DBS ha aumentato significativamente negli ultimi decenni3,4, 5. Ad esempio, HF-DBS è stato approvato da la US Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento della malattia di Parkinson (MDP), demenza di tipo Alzheimer, tremore essenziale e altri tipi di movimento disturbi2,6, 7. nei pazienti del Palladio, il farmaco dopaminergico è ridotto fino al 50% durante la HF-DBS8. Oltre il riuscito trattamento dei disordini di movimento, HF-DBS ha dimostrato anche i suoi potenti effetti nel trattamento di malattie psichiatriche nella clinica e per l'incremento cognitivo come ben2,9, 10 , 11. si deve osservare che la ricerca di HFS per il trattamento di altri disturbi psichiatrici sono in varie fasi, offrendo molta promessa a pazienti12.
Anche se molti studi hanno dimostrato che un HFS focale ha effetti sia locali che remoti in tutto il cervello13, i meccanismi neurologici e molecolari degli effetti rimangono sfuggente2,14. Nella clinica, terapeutica HF-DBS è solitamente applicato in un modo a lungo termine per il trattamento del morbo di Parkinson e dolore cronico, ecc. , che molte opinioni sono sollevate per spiegare il miglioramento generato da un trattamento di HF-DBS, tra cui una possibilità che la corrente HFS modula l'attività di rete neuronale, probabilmente da una depolarizzazione ripetitiva degli assoni in prossimità dell'elettrodo HFS impiantato. In alternativa, HF-DBS possono modificare il tasso di scarico di neuroni di output e gli obiettivi previsti. Inoltre, HF-DBS può portare a cambiamenti sinaptici a lungo termine, tra cui Long-term potentiation (LTP) e depressione a lungo termine (LTD), che può contribuire a un miglioramento sintomatico. Finora, non è ancora chiaro se tali processi di HFS influenze chiavi eventi molecolari che regolano il cellulare come nella neurogenesi adulta in vivo. Parecchie linee di studi hanno dimostrato che HFS in roditori potrebbero imitare simili risposte neurali di clinicamente applicata DBS15,16. Per comprendere i meccanismi cellulari di HF-DBS, in questo studio, abbiamo innanzitutto impostare un in vivo metodologia HFS nei topi in un acuto (un giorno) o cronica (cinque giorni) modo. In secondo luogo, abbiamo istituito una metodologia di analisi di attivazione per determinare l'alterazione dell'attività neuronale e neurogenesi dopo una consegna di HF-DBS.
Dato che la produzione di un neurone da cellule staminali neurali è abbondante durante lo sviluppo embrionale ma continua per tutta la vita adulta, la zona subgranulare hippocampal è una delle principali aree dove si verifica la neurogenesi. Il processo di neurogenesi è influenzato da molti fattori fisiologici e patologici. In alcuni casi epilettici, il neurogenesis hippocampal è drammaticamente in diminuzione17,18. Inoltre, una singola terapia electroconvulsive potrebbe aumentare considerevolmente la produzione neuronale nel giro dentato19. Queste osservazioni suggeriscono che l'attività elettrofisiologica svolge un ruolo critico nella regolazione della neurogenesi adulta e plasticità sinaptica nei neuroni dell'ippocampo. Pertanto, per illustrare ulteriormente gli effetti di HF-DBS sull'attività neuronale e neurogenesi, prima eseguiamo un'analisi immunostaining del inizio immediato gene (IEG) c-fos che è un indicatore ben noto dell'attività neuronale a breve termine derivanti da Esperienza di20. Segnalazione di Notch1 viene rilevato anche per monitorare l'attivazione di segnalazione dopo il HFS consegna21,22. Inoltre, rileviamo anche la produzione di un neurone di un BrdU etichettatura analisi dopo l'induzione HF-DBS in vari modi, anche se BrdU colorazione può anche essere un indicatore per gliogenesis.
Nello studio presente, due metodologie di HFS sono adattati per l'attivazione della DG hippocampal di destinazione direttamente e indirettamente. L'elettrodo è impiantato nella DG direttamente o impiantato nel percorso perforant mediale (PP) che invia proiezioni per attivare i neuroni DG. Per l'induzione HF-DBS, uno stimolatore programmabile è presentato per una stimolazione continua attraverso l'elettrodo fisso sulla testa del mouse. Per determinare gli effetti di HFS su attivazione neuronale e neurogenesi, rileviamo l'espressione di c-fos e Notch1 dalla macchiatura immunofluorescente e il numero di neuroni positivi incorporato BrdU DG della regione ippocampale, rispettivamente, dopo il trattamento di HFS. In particolare, gli effetti del HF-DBS sulla neurogenesi nella DG vengono confrontati tra un acuto e un modo di stimolazione cronica, o tra un telefono e un modo di stimolazione indiretta, rispettivamente.
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Protocol
Procedure sperimentali animali seguito le indicazioni istituzionali di il Beijing Institute di scienze mediche di base (Pechino, Cina) e i regolamenti governativi cinesi per la cura e l'uso di animali da laboratorio. I topi (uomo, adulto 26 ~ 30g) erano stabulati e tenuti ad una temperatura costante di 23 ° C, con acqua e cibo ad libitum, sotto un ciclo di 12-h luce/12-h scuro (luci accese alle 7:00). Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate durante il ciclo di luce.
1. preparazione chirurgica
Nota: Un elettrodo personalizzato era fatta in casa utilizzando il metodo modificato di Halpern relazione23.
- Utilizzare 2 micro-cavi in rame (con un diametro esterno di 200 µm) come l'elettrodo bipolare parallela. Avvolgere gli elettrodi intorno a vicenda per formare gli elettrodi cilindrici per la stimolazione.
Nota: Qui, la lunghezza dell'elettrodo all'interno PP o DG era varia secondo la profondità anatomica del nucleo. - Sterilizzare gli elettrodi utilizzando un armadietto di disinfezione di ossido di etilene. Maneggiare e conservare gli elettrodi di micro-filo 2 canali fatti in casa senza alcuna contaminazione. Gli elettrodi devono essere rigorosamente sterilizzati prima di qualsiasi impianto chirurgico.
- Autoclave gli strumenti chirurgici.
- Prima della chirurgia, iniettare il mouse con pentobarbital (20-50 mg/kg) per via intraperitoneale, per realizzare un aereo chirurgico di anestesia.
- Iniettare il mouse con una sospensione di sterile penicillina G procaina (75.000 U, I.M.) e un agente analgesico (carprofen, 0.05 - 1 mg/kg, SC) per diminuire il rischio di infezioni e dolore, rispettivamente24.
- Dopo l'anestesia degli animali, è possibile applicare un lubrificante di occhio in entrambi gli occhi per prevenire la secchezza degli occhi. Garantire l'induzione della sedazione e della profondità dell'anestesia dai riflessi dell'animale in risposta a pizzicare le dita e procedere con l'operazione solo quando si verifica alcuna risposta.
Nota: Vet unguento è un'altra opzione per prevenire la secchezza degli occhi. - Radere la maggior parte della pelliccia sulla sommità della testa del mouse con il tagliacapelli elettrico o una lama di rasoio, sterilizzare la zona rasata con tre scrub alternati di soluzione 70% alcool e betadine e procedere con l'operazione dopo il betadine è asciugato sulla pelle.
2. ad alta frequenza stimolazione chirurgia25,26
Nota: In questo passaggio, un elettrodo è unilateralmente impiantato in DG dorsale o mediale PP zona, una parte dell'ippocampo con ruoli critici nell'apprendimento episodico e memoria.
- Posizionare il mouse anestetizzato sul telaio stereotassica. Per mantenere la testa del mouse immobile, le barre di orecchio sono allineate correttamente e installarli rapidamente. Stringere le barre dell'orecchio in modo che essi sostengono la testa centrata e garantire il mouse leggermente.
- Utilizzare un tampone termostatico per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 ± 0,5 ° C.
- Utilizzare pinze per afferrare la pelle anteriore le orecchie da Topolino e tagliare con forbici sterilizzate per rimuovere circa 1 cm2 zona di pelle sulla parte superiore del cranio del mouse.
Nota: Una piccola quantità di sanguinamento potrebbe essere osservata lungo i bordi del taglio pelle. - Rimuovere il muscolo e altri allegati che ricopre il cranio con un tampone di cotone per esporre la superficie del cranio. Usare un batuffolo di cotone e scalpello per dissezione per pulire tutti i periostio, tendini e tessuto connettivo dalla superficie completamente per identificare la sagittale linee suture lambda e del cranio.
- Identificare il bregma e punto di lambda. All'incrocio della sutura coronale e la sutura sagittale sulla porzione superiore centrale di calvaria è dove si trova il bregma. All'incrocio della sutura lamboidea dalla sutura sagittale è dove la lambda è visibile. Utilizzare il bregma come punto originale per impostare la posizione del nucleo.
- Dopo l'identificazione della posizione bregma e lambda sul cranio, regolare questi due punti a livello orizzontale. Assicurarsi che l'altezza di questi due punti è quasi lo stesso in senso dorso-ventrale (eventuali errori dovrebbero essere < 0,05 mm). Inoltre, assicurarsi che che il cranio sia a livello in direzione mediale-laterale nel stesso modo26.
- Per un intervento unilaterale, è necessario montare un elettrodo in micro-filo rame 2 canali fatti in casa nel porta-elettrodo rotante sul telaio chirurgico stereotassica.
- Posizionare l'elettrodo in posizione verticale sopra il punto di bregma in un primo momento e impostarlo come sito originale. Utilizzare il digitale viene visualizzato cornice stereotassica chirurgico per indicare l'antero-posteriore (AP), mediale-laterale (ML), e dorso-ventrale (DV) posizioni.
Nota: Per impedire che l'elettrodo sempre piegato, non toccare la punta dell'elettrodo sul cranio durante l'operazione. - Spostare delicatamente l'elettrodo nella posizione corretta (Figura 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 per DG e AP-3.8/ML ± 3.0 per PP, rispettivamente)27 sopra il cranio senza alcun contatto. Quando per inserimento dell'elettrodo è stato identificato il sito desiderato, utilizzare adattamenti stereotactic dorsoventral superiore la porta elettrodi e segnare la posizione con un pennarello nero.
Nota: La posizione esatta in riferimento le coordinate stereotassiche può variare da sesso, peso e razza del topo. Topi adulti dello stesso sesso dovrebbero essere usati per ridurre al minimo qualsiasi variazione nella posizione. Se possibile, scansioni anatomiche pre-Operational devono essere utilizzati per identificare la posizione su un singolo soggetto base27. - Usare un trapano portatile micromanipolatore-assistita (dimensione della bava = 0,5 mm) per rendere i fori della bava la posizione contrassegnata precisamente. Sterilizzare la punta della bava con etanolo al 70% prima di forare. Spostarsi verso l'alto la punta del trapano mini attraverso il cranio lungo l'asse z 0,8 - 1,0 mm senza modificarne la posizione X-Y. Utilizzare un cotone sterile per bloccare qualsiasi emorragia durante l'operazione.
Nota: Per evitare sovra-foratura ed eccessiva generazione di calore durante la perforazione, verificare la velocità di perforazione è di 15.000-18.000 giri al minuto (RPM) e frequentemente ritirare la punta del trapano dal foro della bava ogni 8-10 s. - Mantenere perforazione fino a quando la dura madre è esposto. Utilizzare un ago piegato per rimuovere eventuali frammenti di osso che vengono generati durante la perforazione e fare un foro stenopeico su dura senza danneggiare il tessuto cerebrale morbido sottostante.
Nota: Per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale, l'ago smussato piegato può essere sostituito con un forcipe smussato fine. - Per verificare che i fori della bava sono stati fatti correttamente nella posizione desiderata, ridurre l'altezza di elettrodo di una regolazione del telaio chirurgia stereotassica e assicurarsi che l'elettrodo può essere inserito senza intoppi attraverso il foro della bava senza toccare gli ostacoli. In questo caso, inserire lentamente gli elettrodi ad una profondità di 1,8 mm per la DG (o 3,0 mm per i PP) dalla superficie del cranio situato al PP mediale per la DG (PP-DG).
Nota: Pulire qualsiasi liquido cerebrospinale o il deflusso di sangue dai fori della bava con cotone sterile durante il processo dell'impianto elettrodo. - Dopo l'inserimento di micro-filo-elettrodo nel foro del cranio, tenerlo in posizione con cemento dentale adeguata con una piccola spatola. Come il cemento si ispessisce, la muffa intorno l'elettrodo inserito e viti per formare un bel cappello liscio. Sbrigliare e disinfettare i bordi della ferita.
- Disinnestare l'elettrodo dalla pinza porta elettrodo. Rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica e tornare a una gabbia calda.
Nota: Dopo la chirurgia, aspettare con restituzione degli animali al loro gabbie fino a quando non hanno pienamente recuperato dall'anestesia con sufficiente coscienza. - Lasciare che il mouse muoversi liberamente e consentire di recuperare per 2 giorni nella gabbia. Quindi, collegare l'elettrodo impiantato nel topo cervello per un stimolatore programmabile via conduce. Impostare l'interfaccia del software, come illustrato nella Figura 2. Impostare i parametri HFS come 6 serie di 6 treni di 6 impulsi a 400 Hz (Figura 1B, 100 ms tra i treni, 20 s tra le serie)28. Impostare l'intensità di stimolazione a 200 μA.
- Consegnare un HFS per il periodo desiderato come set up. Consegnare la stimolazione 2 volte al giorno alle 8:00 e alle 20:00
- Per il gruppo di controllo, dell'impianto di elettrodi nei topi e non eseguire una stimolazione.
- Per la colorazione di c-fos , stimolare i topi sperimentali acutamente (2 volte al giorno). Per l'etichettatura di BrdU, dividere i topi sperimentali in un gruppo di stimolazione acuta (applicato 2 volte al giorno) e un gruppo di stimolazione cronica (applicato x 10 a 5 giorni, 2 volte al giorno). Nel corso della stimolazione, assicurarsi che il mouse è sveglio. Ricordarsi di verificare che i cavi non siano attorcigliati.
Nota: All'ultimo giorno della procedura, i topi nel gruppo stimolazione acuta sono stati stimolati simultaneamente. - Quando la stimolazione avviene, staccare con cautela il pin elettrodo dalla pinza porta elettrodo ed il connettore di sistema di registrazione.
3. immunofluorescenza e bromodeossiuridina etichettatura29
- Per il c-fos e colorazione di Notch1, circa 3 h dopo l'ultima stimolazione di HF-DBS, anestetizzare i topi iniettando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) per realizzare un aereo chirurgico di anestesia.
- Per l'etichettatura di BrdU, circa 12 h dopo l'ultima stimolazione di HF-DBS, dare 6 iniezioni di BrdU per il controllo e i topi stimolati a intervalli di 2-h (50 mg/kg in soluzione fisiologica allo 0,9%, I.P.). 36 h dopo l'ultima iniezione, anestetizzare i topi iniettando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) per ottenere un piano chirurgico.
- Fare delle incisioni con un bisturi attraverso la gabbia toracica per esporre il cuore e poi passare un ago di calibro 22 smussato aspersione al ventricolo sinistro. Praticare una piccola incisione nell'atrio di destra. Via e irrorare con 50 mL di freddo tampone fosfato salino (PBS) seguita da 50 mL di freddo paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 1X (pH 7.4).
Nota: Passare il PBS a PFA quando il mouse sangue in vivo viene sostituito e il fluido esce pulito. Una buona perfusione può essere giudicata dallo schiarimento del fegato. La perfusione deve essere interrotto una volta tremori di fissazione sono stati osservati30. - Decapitare il mouse con le forbici oftalmiche, fare un'incisione sulla pelle ed esporre il cranio. Usando il forcipe, scheggiare fuori il cranio leggermente e attentamente sezionare il cervello di topo intero. Post-fix il cervello in paraformaldeide al 4% per altri 2 giorni e trasferirlo in una soluzione di saccarosio al 30% a 4 ° C durante la notte.
- Utilizzando un criostato, tagliare i cervelli in sezioni coronali di 20 µm. Trasferire e montare i profili sul vetrino con un pennello e conservarli a-20 ° C.
Nota: Gli animali con misplacements dell'elettrodo o danni meccanici eccessivi saranno esclusi dall'analisi successive. - Trasferire i vetrini in PBS normale (0,1 M, pH 7.4) non contenente alcun fissativo. Lavare le fette con PBS per 3-4 x per 5 minuti ciascuno per rimuovere qualsiasi fissativo in eccesso. Per il gruppo di BrdU-etichettati, incubare le sezioni in HCl 2-N a 37 ° C per 30 minuti e sciacquarli in un tampone borato di 0.1 M (pH 8,4; 10 min). Lavare quindi le fette 2 x per 5 min in PBS.
Nota: Immunostaining viene quindi eseguita. - Trattamento di fette di incubazione nella soluzione (siero di capra normale 1%, 3% di sieroalbumina bovina < BSA >, 0,5% Triton X-100 e 0,02% di sodio azide in PBS 1X) per 1 h a temperatura ambiente (TA) di blocco.
- Incubare le fette con anti -c-fos anticorpo policlonale (1: 500; coniglio), anticorpo anti-Notch1 (01:50; capra) o l'anticorpo anti-BrdU (1: 800; ratto) nella soluzione di blocco a 4 ° C durante la notte.
- Lavare le fette 3 x in PBS, poi li incubare con Alexa Fluor 568-coniugato anti-coniglio (1: 500), Alexa Fluor 488-coniugato anti-capra (1:1, 000), o anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 488 anti-ratto (1: 500) per 1 h a TA.
- Lavare i campioni 3 x in PBS (10 minuti ogni volta). Coprire le sezioni di cervello immuno-identificati utilizzando un mezzo di montaggio anti-dissolvenza reagente contenente DAPI. Lasciate le fette asciugare all'aria e conservarli al riparo dalla luce a 4 ° C.
- Acquisire immagini delle zone hippocampal dai lati stimolati e non stimolate del cervello con un multicanale ad alta risoluzione (sequenziale) microscopio confocale a scansione. Impostare i parametri di imaging costantemente tra controllo e nei gruppi sperimentali.
- Eseguire un imaging di mosaico utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento (obiettivo X aria 20, NA 0,45) di acquisire immagini (XYZ) 3D continue di adiacenti campi di vista utilizzando il tavolino motorizzato e utilizzare il software adatto a cucire insieme per rendere grande composito immagini.
Nota: Tiling funzioni includono vero impunture e opzioni per immagini migliorate senza giunte di smussatura. Immagini composite sono rapidamente e facilmente preparati utilizzando la funzione di cucitura, per formare un'immagine su una vasta area. - Per c-fos e colorazione di Notch1, eseguire un'analisi quantitativa di nuclei positivi del immunofluorescente densità21 delle immagini cucite. In modo casuale selezionare 3 aree nelle sottoregioni DG hippocampal rostrale dorsale e ventrale e misurare la densità immunofluorescente in modo doppio cieco utilizzando Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
- Per un BrdU etichettatura, analizzare le fette attorno al punto di perforazione attraverso l'ippocampo dorsale (-1,70 mm a-2,70 mm rispetto il bregma) in un modo doppio accecato.
- Contano solo i neuroni di BrdU-positivi nella DG. Comprendono le cellule che si trovano all'interno di diametri 2-cellulari della cellula del granello nel conteggio.
Nota: Qui, conteggio è stato effettuato usando un 40 X obiettivo di aria. Casualmente, 3-5 sezioni per animale sono stati contati, e i conteggi sono stati in media ed espresso come mezzi per DG19.
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Representative Results
Dopo la stimolazione di HF-DBS per la sottoregione hippocampal di DG direttamente o la sottoregione PP per attivare il DG indirettamente tramite inserito elettrodi utilizzando le regolazioni stereotassica, i roditori sono stati anestetizzati con pentobarbital e campionate 3h dopo l'ultima stimolazione di HF-DBS per il c-fos e Notch1 immunostaining. Per la colorazione di BrdU, 36 h dopo l'ultima iniezione di BrdU dopo 1 o 5 giorni di stimolazione HF-DBS, i roditori sono stati anestetizzati con pentobarbital per la preparazione di sezioni del cervello. La figura 3 Mostra che l'espressione di c-fos è stata aumentata significativamente nel lato ipsilateral della DG. Inoltre, l'espressione di c-fos nel lato controlaterale della DG è stato anche aumentato rispetto ai controlli no-HF-DBS stimolazione che ha mostrato quasi nessuna espressione di un segnale di c-fos . Basato sulle specifiche Notch1 immunofluorescenza colorazione nelle fette del cervello, come illustrato nella Figura 1 complementare, abbiamo ulteriormente dimostrato che la segnalazione di Notch1 può anche essere attivata nella DG hippocampal adulto dopo la stimolazione di HFS di un'induzione di depolarizzazione dei neuroni in PP (riferirsi ai dati grezzi forniti come complementare File 1).
Oltre alla stimolazione diretta di HF-DBS nella sottoregione DG, Figura 4A indica la posizione e il sito di HF-DBS stimolazione della punta dell'elettrodo, che è stato installato in PP mediale Figura 4B hanno dimostrato che la HF-DBS stimolazione in PP non solo ha aumentato significativamente il livello dell'espressione c-fos nel lato ipsilateral della DG, ma inoltre ha aumentato l'espressione di c-fos nel lato controlaterale della DG rispetto alla stimolazione no-HF-DBS controlli.
Basato sulla BrdU etichettatura analisi delle fette del cervello, come mostrato nelle figure 5A - 5C, abbiamo ulteriormente dimostrato che la neurogenesi può essere attivata anche nella DG hippocampal adulto dopo una stimolazione di HF-DBS cronico (5 giorni) della DG direttamente. Una stimolazione cronica di HF-DBS nella DG non soltanto significativamente sovraregolati la neurogenesi nel ipsilateral lato ma anche aumentato la neurogenesi nel lato controlaterale rispetto ai controlli no-HF-DBS stimolazione. Tuttavia, la stimolazione acuta (1 giorno) non è riuscito a indurre un upregulation della neurogenesi nel lato ipsilateral o nel lato controlaterale della DG. Come illustrato nella Figura 5D, o nel gruppo di stimolazione acuta o nel gruppo di stimolazione cronica, un indiretto HF-DBS in PP non poteva modificare il livello di neurogenesi nella DG hippocampal.
Figura 1 . Rappresentazione schematica degli obiettivi del cervello della punta dell'elettrodo e parametri della HFS. (A), la proiezione di un neurone del mediale perforant percorso verso una lama inferiore della circonvoluzione dentata è indicato. La posizione degli elettrodi inseriti (in viola) per stimolare sia la DG direttamente o sottoregione PP sono indicati. (B), il parametro HFS è indicato come 6 serie di 6 treni di 6 impulsi a 400 Hz, con 100 ms tra i treni e 20 s tra le serie. CA = il Cornu Ammonis; DG = gyrus dentate; PP = il percorso perforant. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Interfaccia e parametri del multistimulator. Lo stimolatore è stato collegato ad un convertitore digitale-analogico e attivato dal software proprietario. Il tipo di stimolo della HFS era monofasica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Attivazione neuronale della DG in risposta al trattamento HF-DBS direttamente. (A), la punta dell'elettrodo (riquadro bianco non riempito) era posizionato direttamente sopra la regione DG (AP -2.1 / ± 1,0 ML / DV + 1,8) con o senza la HFS. Questo pannello mostra immunostaining della sezione corona delle fette del cervello conun c-fos anticorpo nel controllo e i gruppi HFS. Macchiatura di DAPI blu era usata per indicare la posizione dei nuclei hippocampal. La barra della scala = 100 µm. (B), questo pannello mostra un'analisi quantitativa della densità del segnale di immunofluorescenza. Nel lato ipsilateral della DG, i neuroni significativamente sono stati attivati con un'alta espressione di c-fose l'espressione di c-fos nel lato controlaterale della DG è anche relativamente maggiore rispetto all'espressione di c-fos topi di controllo senza un trattamento di HFS. Significa ± SEM, One-way ANOVA, F2,24 = 216, P < 0,0001, Bonferroni post hoc test, * * *P < 0,001, nn-sti = 9 (3 fette da 3 topi), nHFS Contra = 9 (3 fette/mouse da 3 topi), nHFS IPS = 9 (3 fette del mouse da 3 topi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Attivazione neuronale della DG in risposta a HFS nella sottoregione PP. (A), la punta dell'elettrodo (riquadro bianco non riempito) è stato posizionato in PP mediale nella posizione dell'AP -3,8 ML ± 3.0 e DV + 3,0, con o senza la HFS. (B), questo pannello mostra immunostaining della sezione corona delle fette del cervello conun c-fos anticorpo nel controllo e i gruppi HFS. Macchiatura di DAPI blu era usata per indicare la posizione dei nuclei hippocampal. La barra della scala = 100 µm. (C), questo pannello mostra un'analisi quantitativa della densità immunofluorescente. Il trattamento di HFS in PP significativamente potrebbe attivare i neuroni ipsilateral della DG con un'alta espressione di c-fos. L'espressione di c-fos nella DG controlaterale è anche relativamente aumentata rispetto all'espressione di c-fos di topi di controllo senza un trattamento di HFS. Significa ± SEM, One-way ANOVA, F2,24 = 189,3, P < 0,0001, Bonferroni post hoc test, * * *P < 0,001, nn-sti = 9 (3 fette da 3 topi), nHFS Contra = 9 (3 fette/mouse da 3 topi), nHFS IPS = 9 (3 fette del mouse da 3 topi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Attivazione distinto della neurogenesi nella DG in risposta a HFS in DG e PP rispettivamente. (A), questo pannello mostra un paradigma sperimentale per il trattamento di HFS e la generazione di BrdU-labeled proliferanti neuroni nella DG. Gli animali sono stati divisi in un acuto e un gruppo cronico. Nel gruppo acuto, i topi sono stati sottoposti ad un trattamento di HFS 2 x il giorno 5. Nel gruppo cronico, i topi sono stati sottoposti ad un trattamento di HFS per 5 giorni (dal giorno 1 al giorno 5, 2 volte al giorno). Quindi, gli animali in entrambi i gruppi sono stati iniettati con BrdU (50 mg/kg, 6 x da intervalli di 2 h) il giorno 6. Il giorno 8, gli animali sono stati anestetizzati e irrorati per la preparazione di sezioni al criostato. (B) questo pannello mostra la macchiatura immunofluorescente di BrdU (in verde) post-HF-DBS nella DG. (C) A analisi quantitativa della produzione neuronale ha indicato che l'acuta (x 2 in 1 giorno) stimolazione della DG potrebbe non migliorare la neurogenesi, mentre la cronica (10 x entro 5 giorni) stimolazione della DG ha aumentato significativamente la neurogenesi. Rispetto al gruppo di controllo, il numero di cellule è aumentato significativamente nella cronica di etichettatura di BrdU gruppo entrambi nell'emisfero ipsilaterale e controlaterale. La barra della scala = 100 µm. mezzi ± SEM, ANOVA a due vie, stimolazione tipo effetto F2, 14 = 97,09, P < 0,0001, emisfero effetto F1, 14 = 1.137, P = 0.3044, Bonferroni post hoc test, * * *P < 0,001, n Controllo = 3 (3 fette da 3 topi), n1 giorno = 4 (4 fette da 3 topi), n5 giorni = 3 (3 fette da 3 topi). (D) questo pannello mostra la colorazione di immunofluorescenza di BrdU (in verde) post-HF-DBS nella sottoregione PP. (E) A analisi quantitativa della produzione neuronale ha indicato che l'acuta (due volte in un giorno) o cronica (10 x 5 giorni) stimolazione in PP non potrebbe migliorare significativamente la neurogenesi. Il numero di cellule di etichettatura di BrdU è rimasta relativamente stabile, con o senza il trattamento di HFS. La barra della scala = 100 µm. mezzi ± SEM, ANOVA a due vie, stimolazione tipo effetto F2, 16 = 0.9025, P = 0.4252, emisfero effetto F1, 16 = 1.402, P = 0.2537, Bonferroni post hoc, prova, P > 0.05, n Controllo = 3 (3 fette da 3 topi), n1 giorno = 3 (3 fette da 3 topi), n5 giorni = 5 (5 fette da 3 topi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1. Espressione di Notch1 nella DG in risposta al trattamento di HF-DBS. (A) questo pannello mostra la macchiatura immunofluorescente di Notch1 (in verde) 3 h dopo la HF-DBS nella DG. Questa figura è stata citata e modificata da Feng rapporto21. (B) un'analisi quantitativa della fluorescenza indicato che la HFS nella DG potrebbe rafforzare l'espressione di Notch1. La barra della scala = 100 µm. mezzi ± SEM, student t-test, t = 12, * * *P < 0,001, nn-sti = 9 (3 fette/mouse da 3 topi), nHFS = 9 (3 fette del mouse da 3 topi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementari 1. Dati grezzi. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La tecnica di HF-DBS è stato ampiamente utilizzata come un potente strumento per il trattamento di molti disturbi neurologici dal 1990. Finora, il lavoro di pietra miliare di HF-DBS è per il trattamento della malattia di Parkinson e tremore essenziale, che ha attirato molta attenzione e interesse sia nella comunità scientifica e clinica. Ci sono vari tipi di studi di HF-DBS in corso da molti gruppi per applicazione terapeutica di HF-DBS in alcuni disturbi neurologici e psichiatrici32,33. Alcuni di questi studi sono attualmente in varie fasi di prove cliniche2,34. Anche se HF-DBS dovrebbe portare beneficio significativo, gli effetti collaterali della stimolazione può verificarsi anche con un posizionamento perfetto del cervello, come variazioni negative di umore e pensiero, ecc., che sono reversibili e possono essere evitati con le modifiche della impostazioni di stimolazione.
Oltre i significativi progressi della tecnologia HF-DBS accumulato dagli studi clinici negli ultimi decenni, gli studi di HF-DBS animali vivi presenta anche l'opportunità di comprendere i cambiamenti fisiologici e neurobiologica meccanismi indotti dalla stimolazione elettrica. In questo manoscritto, abbiamo descritto una metodologia di HF-DBS modificata eseguita in topi per stimolare la sottoregione hippocampal di DG con un HFS, direttamente o indirettamente. Sebbene il protocollo descritto viene eseguito nei roditori, gli studi di reazione HFS anche sono stati condotti con successo in altri organismi di modello, tra cui suini35. Per questa tecnica, la chirurgia stereotassica utilizzabile anche per una stimolazione mirata di nucleo potenziale per testare l'efficacia di HFS utilizzando alcuni modelli animali con disturbi neurologici e psichiatrici. Le conclusioni tracciate da tali studi dovrebbero tradurre prontamente alla clinica, specificamente per la raffinatezza di HFS a obiettivi esistenti. Si noti che, in contrasto con la serie di esposizioni multiple di HF-DBS in clinica, in questo studio metodologico, abbiamo scelto un'esposizione singola e a breve termine di HFS per stimolare e indurre l'attività neuronale nella DG hippocampal, parametro e parte del paradigma di HFS che precedentemente è stata segnalata per indurre LTP nell'ippocampo fette21,28.
Limitazioni generali di HF-DBS sono stati ampiamente Recensito altrove24,25. Una delle sfide per l'esperimento di qui è anche la necessità di una tecnica chirurgica eccellente e per la costante cura chirurgica locus anatomico. Correttamente e precisamente dell'impianto l'elettrodo nel nucleo bersaglio per la stimolazione, uno dei processi chiave è un'operazione riuscita da un tecnico specializzato per evitare la lesione del vaso sanguigno inutili e l'errato posizionamento dell'elettrodo. Inoltre, ulteriori analisi anatomica e istologica dell'esemplare del cervello inoltre è necessaria per confermare il corretto targeting dell'elettrodo dopo un HFS. Questo è anche uno dei vantaggi di questo approccio, per dimostrare chiaramente l'orientamento corretto dell'elettrodo dopo il funzionamento in un cervello animale intatto. Molti dei dati forniti nel presente protocollo può essere facilmente adattati per un lungo periodo la stimolazione tramite uno stimolatore impiantato nell'animale. Si noti che è anche favorevole a parametri di stimolo alternativo in potenziali bersagli terapeutici cervello con diversi modelli di distribuzione HFS. Tuttavia, questo articolo segnalato su una singola unità acuta HFS consegnato da un'unità di stimolatore programmabile per capire i cambiamenti cellulari dopo la stimolazione elettrica.
Sebbene HF-DBS serve come un'opzione alternativa per il trattamento di disturbi neurologici e psichiatrici in clinica per diversi anni, i meccanismi che sottendono la sua efficacia rimangano capiti male. Considerando l'uso e i futuri miglioramenti di HF-DBS, è necessario un approccio più pragmatico. Come strumento di sviluppo, la tecnica HFS ha bisogno di ulteriore innovazione tecnica e meccanicistico scoperta. Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di HF-DBS, un'analisi del trascrittoma globale basata su tecnologie di sequenziamento di alto-rendimento fornirà importanti informazioni per comprendere gli eventi molecolari e segnalazione modifiche dopo un'induzione HF-DBS 36. oltre la strategia di screening imparziali, basata sull'esame dei candidati molecolari esistenti che hanno dimostrato di rispondere alla depolarizzazione neuronale, sarà probabilmente anche fornire importanti indizi per identificare gli effettori chiavi responsabile per HFS con. C-fos è upregulated in risposta all'attività neuronale intrinseca, così guardando la sua espressione almeno ci fornirebbe un paesaggio di neuroni licenziato recentemente37. Tuttavia, c-fos dovrebbe essere usato non soltanto per riflettere solo attività poiché sembra anche per contrassegnare i neuroni in fase di LTP37. Opere precedenti, compreso il nostro, hanno dimostrato che Notch1 svolge un ruolo critico nella plasticità sinaptica nei neuroni ippocampali di maturi ed è essenziale per la neurogenesi adulta in vivo21,22. In termini di questa situazione, una dettagliata localizzazione quantitativa e spaziotemporali di chiave i candidati dovrebbero essere attentamente caratterizzati e descritto pre- e post-HFS induzione da un'analisi immunohistochemical dell'espressione c-fos . Studi come questo fornirà la prova diretta per dimostrare i cambiamenti del pattern di espressione genica in varie regioni del cervello in risposta a un HFS21, che sarà anche utile per rivelare i cambiamenti cellulari quali attivazione neuronale, neurogenesi, o neurodegenerazione.
Dovrebbe anche essere notato che nonostante i vantaggi di un'applicazione di HF-DBS nella clinica, dovuto al fatto che i risultati dell'effetto di stimolazione sono strettamente associati con i parametri di stimolazione e percorso nel cervello, i cellulari e molecolari di destinazione meccanismi alla base effetti di HFS potrebbero essere molto complicati. In questo studio, abbiamo effettuato ulteriormente di BrdU etichettatura per studiare gli effetti acuti e cronici di HFS sulla neurogenesi adulta. Anche se BrdU colorazione può essere un indicatore per neurogenesi e gliogenesis, basato su rapporti precedenti, la maggior parte di BrdU aumentata neuroni positivi osservati a SGZ dopo un trattamento di HF-DBS dovrebbe essere il proliferativa progenitori neurali adulto21 , 38 , 39. indipendentemente dalla complessità dei meccanismi che il trattamento di HFS, i metodi e i risultati che abbiamo descritto in questo manoscritto forniscono la prova diretta che ripetitiva ad alta frequenza stimolazione elettrica per attivare la DG hippocampal in modo significativo potrebbe indurre l'attivazione di un neurone di attività e nella neurogenesi in vivo.
In sintesi, abbiamo dimostrato che un HF-DBS può migliorare l'attività neuronale e la neurogenesi dei topi, rispetto all'attività neuronale e la neurogenesi dei topi di controllo che non hanno subito un HF-DBS. Questo può avanzare la comprensione scientifica per quanto riguarda gli effetti conoscitivi e stimolazione patterning di HFS in vivo. L'identificazione di attivazione neuronale dopo un trattamento acuto di HF-DBS direttamente o indirettamente vivo dimostra che un trattamento di HFS ha effetti significativi sulla trasmissione sinaptica delle connessioni locali e a lungo raggio. L'induzione rapida di attivazione neuronale dopo un trattamento di HF-DBS fornisce un potente strumento per manipolare la trasmissione sinaptica alterata o ad eliminare la desincronizzazione a molti disturbi neurologici e psichiatrici come MDD. D'altra parte, l'induzione della neurogenesi dopo un trattamento di HF-DBS cronico e diretto, ma non acuto o indiretto suggerisce l'efficacia distinta e la variabilità funzionale tra le maniere differenti di stimolazione elettrica. Tali risultati forniscono la prova diretta per la modulazione neurale e potenziali benefici terapeutici di HFS in futuro. Presi insieme, HF-DBS presenterà notevoli vantaggi per il trattamento di disturbi neurologici e psichiatrici integrando i progressi tecnologici compiuti in clinica e i progressi meccanicistico in laboratorio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali di sovvenzioni Cina 31522029, 31770929 e 31371149 (a Haitao Wu), programma 973 (2014CB542203) dal programma di sviluppo chiave dello stato per la ricerca di base della Cina (a Haitao Wu) e Grant Z161100000216154 dalla Beijing Municipal scienza e tecnologia della Commissione (a Haitao Wu). Gli autori ringraziano tutti i membri del laboratorio Haitao Wu per il loro incoraggiamento e discussioni. Gli autori sono estremamente grati al Zhenwei Liu per il suo aiuto con l'apparato di debug.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
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