Summary
Vi præsenterer en effektiv og nem at bruge protokol til forberedelse af primære cellekulturer af zebrafisk embryoner til Transfektion og levende celle billedbehandling samt en protokol til at forberede primære celler fra voksne zebrafisk hjernen.
Abstract
Zebrafisk embryoner er gennemsigtige og udvikle hurtigt uden for mor, således giver mulighed for fremragende i vivo billeddannelse af dynamiske biologiske processer i en intakt og udvikle hvirveldyr. Men den detaljerede billeddannelse af morfologier af forskellige celletyper og subcellulært strukturer er begrænset i hele mounts. Derfor, vi etableret en effektiv og nem at bruge protokollen til kultur levende primærelementer fra zebrafisk embryoner og voksent væv.
Kort sagt, er 2 dpf zebrafisk embryoner dechorionated, deyolked, steriliseret, og dissocieres til enkelt celler med collagenase. Efter en filtrering skridt, primærelementer belagt på bunden glasfade og dyrkes i flere dage. Frisk kulturer, så meget som lang sigt differenciated dem, kan bruges til høj opløsning Konfokal billeddiagnostiske undersøgelser. Kulturen indeholder forskellige celletyper, med tværstribede myocytes og neuroner er fremtrædende på poly-L-lysin belægning. Specifikt etiket subcellulært strukturer af fluorescerende markør proteiner etableret vi også en elektroporation protokol, som giver Transfektion af plasmid DNA i forskellige celletyper, herunder neuroner. Således, i overværelse af operatøren definerede stimuli, komplekse celle adfærd og intracellulære dynamikken i primære zebrafisk celler kan vurderes med høj rumlige og tidsmæssige opløsning. Derudover ved hjælp af adult zebrafisk hjerne, vise vi, at den beskrevne dissociation teknik, samt de dyrkningsbaserede rammebetingelser, også arbejde for voksen zebrafisk væv.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio, D. rerio) er en populær model hvirveldyr for talrige områder af grundlæggende og biomedicinsk forskning1. Zebrafisk embryoner udvikler hurtigt ex utero, er gennemsigtige, og pasform under et mikroskop, hvilket giver gode forudsætninger for at studere hvirveldyr udvikling i en levende organisme. På grund af den genetiske sporbarhed af zebrafisk2oprettet mange stabile transgene reporter linjer med celle type-specifikke udtryk for forskellige fluorescerende markører giver mulighed for observation af specifikke cellepopulationer. Zebrafisk samfundet tilbyder en bred vifte af såkaldte Gal4-driver linjer, som bærer en transgen udtrykker den syntetiske Kal4TA4 (eller KalTA3-ækvivalent-GalFF) genet med Gal4-DNA-bindende domæne af gær smeltet til viral transcriptional aktivering domæner under kontrol af celle typespecifikke smagsforstærkere. Disse driver linjerne krydses effektor linjer, som bærer transgener bestående af en defineret opstrøms aktiverende sekvens (UAS) smeltet til en reporter gen. Kal4TA4 protein binder sig til elementet UAS, dermed aktivering celle type-selektiv udtryk for reporter gen3,4. Denne tilgang giver mulighed for meget forskelligartede kombinatorisk undersøgelser af næsten alle tilgængelige enhancer og reporter elementer i dobbelt-transgene dyr.
Men dybdegående live imaging med fokus på individuelle celler eller deres subcellulært indhold er begrænset i et hele og konstant skiftende embryo. For at løse specifikke celle biologiske spørgsmål med højeste opløsning, er brugen af cellekulturer ofte at foretrække. Nogle cellelinjer af zebrafisk eksisterer, men de betragtes som stærkt valgte5,6,7 og deres formering er ofte tidskrævende. Derudover er alle tilgængelige cellelinjer fibroblast afledt, begrænse eksperimenter ved hjælp af cellekultur til én type af celler. Derfor, vi etableret både en effektiv og nem at bruge protokollen for at forberede primærelementer direkte fra zebrafisk embryoner og voksen zebrafisk hjernen, sammen med metoder til at øge levetiden af kulturen og at udvide mangfoldigheden af dyrkede celletyper. Derudover præsenterer vi en procedure for at transfect primære stamceller med udtryk konstruktioner for fluorescerende organelle markører. Således kan cellulære morfologier og subcellulært strukturer analyseres med høj rumlige og tidsmæssige opløsning i forskellige celletyper, som bevarer deres vigtigste funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbejde beskrevet her er i overensstemmelse med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedligeholdelse og håndtering af fisk er blevet godkendt af lokale myndigheder og dyrevelfærd repræsentant af Braunschweig University of Technology og lavere Sachsen statslige kontor for forbrugerbeskyttelse og fødevaresikkerhed (LAVES, Oldenburg, Tyskland; AZ. §4 (02.05) TSchB TU BS).
1. forberedelse af primærelementer fra zebrafisk embryoner
- Forberedelse af 2 dage post befrugtning (dpf) zebrafisk embryoner
- Dag 1: Oprette flere grænseovergange i zebrafisk stamme af valg og specifikationerne for din zebrafisk facility manager8.
- Dag 2: Mate fisk og indsamle æg8 direkte efter gydningen i en 10 cm petriskål (plast). Fjern døde eller forurenet æg med Pasteur pipette (plast). Vask æg 1 x med Danieau 30% (5,8 mM natriumchlorid, 0,07 mM kaliumchlorid, 0,04 mM magnesium sulfat, 0,06 mM calciumnitrat, 5 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre, pH 7,2)8 med 0,0001% (w/v) methylenblåt. Udveksle medium til Danieau 30% uden methylenblåt, da methylenblåt kan forårsage autofluorescence, og Inkuber æg over natten ved 28 ° C.
Bemærk: Start med mindst 100 æg pr. fisk linje for at opnå en tilstrækkelig mængde af celler. Giver ikke anledning til mere end 150 embryoner i en petriskål. - Dag 3: Fjern døde eller forurenet embryoner og udveksle medium til Danieau 30%. Bestem antallet af embryoner ved at tælle. Inkuber embryoner over natten ved 28 ° C.
Bemærk: Når du bruger en transgene linje at udtrykke en fluorescerende reporter, screening på 1 dpf eller 2 dpf kan være nødvendigt.
Bemærk: For større mængder af embryoner anbefales det at tage en sort-hvid billede af den respektive petriskål (figur 1A) og kvantificere antallet af embryoner med en billedbehandlingsprogrammer. - Dag 4: Embryoner er nu 2 dpf. At fjerne chorions, tilsættes 1 mL pronase med en koncentration på 1 mg/mL 10 mL af Danieau 30%8 og inkuberes embryoner på en shaker ved stuetemperatur, indtil alle chorions er frakoblet (20-40 min alt efter rumtemperatur). Vask med Danieau 30% til at fjerne både pronase og chorions og holde embryoner ved stuetemperatur indtil videre anvendelse.
- Forberedelse af genanvendelige poly-L-lysin belagt glas bund retter
Bemærk: Kommercielt tilgængelige glas bund retter er beregnet til engangsbrug kun og er dyre. Følgende procedure beskriver, hvordan du forbereder genanvendelige self-made glas bund retter fra standard lab materialer.- Bore et hul med en diameter på 10 mm i bunden af standard celle kultur retter (diameter 6 cm, plast) (figur 1B). Vask skål bunde grundigt med vand fra hanen til at fjerne boringen støv.
- Sprede silicium fedt omkring hul på undersiden af parabol bunde og vedhæfte en coverslip ved hjælp af fedt som lim. Sørg for, at fedt sæler kløften mellem parabol bunden og coverslip.
Bemærk: Sørg for at tykkelsen af de anvendte coverslips er passende for den senere billedbehandling ansøgning. - Vaske self-made glas bund op grundigt, men forsigtigt, med koldt vand fra hanen og sæbe. Skyl glas bund retter tre gange med deioniseret vand for at fjerne sæbe. Lufttørre parabol låg og fad bunde og gemme dem i en ren boks indtil videre brug.
- På dagen for kultur forberedelse (dag 4, se 1.1.4): fugt på indersiden af begge fad låg og fad bunde med 70% (v/v) ethanol. Placer fadet låg og fad bunde vender indersiden opad i en steril arbejdsbord med laminar flow og UV-lys. Lufttørre indtil ethanol er fordampet, derefter anvende UV-lys i 20 min. Efter denne behandling, er retter samlet og betragtes som sterile.
- For belægning, afpipetteres 200 µL af poly-L-lysin (0,1 mg/mL) i midten af hver glas bund fad og sprede flydende på coverslip ved at bryde overfladespænding med en pipette spids. Lad tørre i 60 min og derefter vaske 1 x med steril 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Fjern væsken. Holde retter under bænken indtil videre anvendelse.
Bemærk: Andre belægninger kan testes afhængigt af formålet med forsøget. Vi fandt poly-L-lysin tilstrækkelig til at støtte væksten i neuroner, hvorimod behandlet plast uden nogen yderligere belægning syntes at være gunstig for vækst af fibroblast-lignende celler (figur 1E, F).
Bemærk: Self-made glas bund retter kan bruges mange gange. For at udveksle coverslip, vask med varmt vand fra hanen, forsigtigt løsne coverslip og fjerne resterende fedt med 70% (v/v) ethanol og sæbe.
- Forberedelse og klædningen af primærelementer
- På dagen for kultur forberedelse (dag 4, se 1.1.4): overføre embryoner i en steril celle kultur skål (diameter 6 cm) ved hjælp af en frisk plast Pasteur pipette. Fjern væsken trin, indtil alle embryoner er samlet i en stor dråbe med en diameter på ca. 2 cm eller derunder.
- Placer fadet med embryoner i sterile arbejdsbord og tilføje CO2-uafhængige medie (suppleret med 10% (v/v) filtreres bovint serum, 1 x glutamin og 1,2% (v/v) 10.000 U Penicillin-Streptomycin; medium med alle kosttilskud er i følgende omtales som "cellekulturmedium") indtil skålen er halvt fyldt.
Bemærk: Alternativer til CO2-uafhængige medie kan testes afhængigt af formålet med forsøget, som for eksempel neurobasal medium, DMEM medium eller Leibovitz's L-15 medium. CO2-uafhængige medie og Leibovitz's L-15 medium har fordelen, der ikke kræver en CO2 inkubator. - Hvis du vil fjerne æggeblomme, afpipetteres embryoner op og ned ved hjælp af en 200 µL-pipette tip. Vellykket deyolking kan genkendes af uklarhed af mediet.
- Fylde en celle kultur parabol med 70% (v/v) ethanol og en anden celle kultur fad med friske cellekulturmedium. Bruge en cut-off 1.000 µL-pipette tip til at overføre embryoner til sterile celle si med håndtag (40 µm; Figur 1 c). Tag sien med håndtaget og dyppe den i skålen med ethanol, således at alle embryoner er neddykket i 5 s. umiddelbart bagefter, dykke si med embryoner i fad med friske cellekulturmedium.
Bemærk: Celle sier kan genanvendes flere gange. Ren med en blød børste under rindende vand fra hanen, store dem i 70% ethanol, og tør og UV-behandle dem under den sterile arbejde bænk direkte før brug (Se også 1.2.4). - Overføre embryoner til sterile 1,5 mL reaktion rør (ca 100 embryoner i en tube). Tilføje collagenase (Type 2) fortyndet i cellekulturmedium til en endelig koncentration på 4 mg/mL i en samlet maengde paa 1 mL. Inkuber rør med embryoner på et lodret rør rotator med 30 omdrejninger pr. min. for 45 min ved stuetemperatur.
- Adskille resterende celle klumper af pipettering embryo-collagenase blandingen op og ned med en 1.000 µL-pipette spids. Derefter filtreres cellesuspension gennem en steril celle si med udluftning slot (40 µm; Figur 1 d) ind i en 50 mL konisk rør. Skyl si med ca. 10 mL frisk cellekulturmedium.
- Pellet celler ved centrifugering i 3 min. ved 180 x g. Pellet kan være næsten usynlig. Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend celler i 200 µL frisk cellekulturmedium pr. 30 oprindeligt brugt embryoner.
Bemærk: For at opnå en synlig pellet, det anbefales at starte med et minimum af 100 embryoner. - Tilsæt 200 µL af cellesuspension fremstillet i trin 1.3.7 direkte på området glas i en self-made poly-L-lysin-belagt glas bund fad (Se 1.2). Inkuber i 60 min. ved stuetemperatur under sterile arbejdsbord. Tilføj 6 mL frisk cellekulturmedium og inkuberes primærelementer ved 28 ° C.
- Udføre den ønskede billedbehandling ansøgning ved hjælp af en omvendt mikroskop ved 28 ° C. Udveksle cellekulturmedium dagligt. Kulturer kan bruges til billeddannelse i flere dage efter plating (dap).
Figur 1: primære cellekultur zebrafisk embryoner. (A) sort-hvid billede af 1 dap embryoner, der kan behandles af et software-værktøj til at analysere antallet af embryoner. (B) celle kultur retter (diameter 6 cm) med et boret hul (diameter 10 mm) bruges til at forberede genanvendelige self-made glas bund retter. (C) celle sier (40 µm) med et enkelt håndtag bruges som "landing nets" at dyppe deyolked embryoner i ethanol og overføre dem hurtigt til frisk cellekulturmedium. (D) celle sier (40 µm) med udluftning slots bruges til at filtrere celler efter collagenase-medieret dissociation. (E) efter 5 dap, primærelementer seedede på glas belagt med poly-L-lysin primært danne neuroner med udtalt udvidelser. Skalalinjen = 100 µm. (F) efter 5 dap på behandlede plast uden belægning, fibroblast-lignende celler vokse hen over kulturen. Skalalinjen = 100 µm. (E) og (F) blev overtaget af en epifluorescerende mikroskop. (G) overførte lys billede af primærelementer afledt af vildtype zebrafisk på 1 dap. Tværstribede myocytes og klynger af neuroner udvide tynde processer kan observeres let. Skalalinjen = 50 µm. (H) kulturperler celler af transgene linje Tg (ptf1a: eGFP) jh1, der udtrykker eGFP i neuronal stamfaderen til det meste GABAergic neuroner i baghjernen og en delmængde af retinale celle populationer29, 30 , 31. skalalinjen = 50 µm. (G) og (H) blev erhvervet af en Konfokal laser scanning mikroskop ved hjælp af glas bund retter lavet som illustreret i (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. Transfektion af primær celler med Plasmid DNA
- Resuspend filtreres og pelleted celler fremstillet i trin 1.3.7 i 1 x PBS i stedet for cellekulturmedium. Plette en alikvot af cellesuspension med Trypan blå til at bestemme den celle nummer i en optælling afdeling9.
- Bland 0,5 millioner celler med 10 µg ultra-rene plasmid DNA i 1,5 mL reaktion rør og justere det samlede volumen til 100 µL med 1 x PBS.
Bemærk: For vores eksperimenter, vi hovedsageligt bruges udtrykket konstruktioner baseret på plasmidet pCS2 +10. Udtryk af åbne læserammer klonet til webstedet for flere kloning af pCS2 + er drevet af den allestedsnærværende promotor af den menneskelige cytomegalovirus (CMV promotor). Andre udtryk konstruktioner og initiativtagere kan afprøves (Se også repræsentant resultater og figur 2 og figur 3). - Overførsel celle-DNA mix straks til en elektroporation kuvette (0,4 cm), læg kuvette i en elektroporation enhed og electroporate med følgende indstillinger: engangs pulse, eksponentiel henfald, 280 V, 950 µF.
- Direkte efter elektroporation, overføre celle-DNA blandingen til en 1,5 mL reaktion tube med 300 µL af frisk cellekulturmedium.
- Plade 200 µL af cellesuspension som beskrevet i 1.3.8 og fortsætte som beskrevet i 1.3.9 afhængigt af den anvendte udtryk konstruktion, udtryk for fluorescerende proteiner må kunne påvises efter et par timer eller på den næste dag.
3. farvning af faste primærelementer
Bemærk: Subcellulært strukturer kan også visualiseres ved klassiske immunfarvning istedet for benytter fluorescerende fusion protein journalister. For zebrafisk primærelementer bruger vi følgende standard protokol til eksemplarisk pletten kerne, F-actin og acetyleret tubulin med fluorescerende markører.
- Plade celler på poly-L-lysin belagt dæksel glider placeret i en celle kultur parabol eller flerhuls plade som beskrevet ovenfor (Se 1.3.8).
- For fastsættelse af, fjerne mediet og dække celler med 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS. Inkuber celler i 10 min. ved 4 ° C på en shaker. Vask celler 3 x i 5 min. med 1 x PBS ved stuetemperatur. Sørge for, at 1 x PBS dækker cellerne helt og udføre trinene vask på en shaker.
- At blokere og permeabilize de fast celler, dække cellerne med 1 x PBS indeholdende 5% skummetmælk og 0,3% Triton X-100. Placere celler i 10 min ved stuetemperatur på en shaker. Vaske cellerne, som beskrevet i punkt 3.2.
- Hvis du vil navngive acetyleret tubulin, en markør for axoner11, fortyndes den primære antistof 1:2,000 i 1 x PBS indeholdende 1% skummetmælk. Dække celler med denne løsning og inkuberes dem over nat ved 4 ° C på en shaker. På den næste dag, vaske cellerne som beskrevet i punkt 3.2.
- Fortynd det sekundære antistof konjugeret med den grønne fluorochrom fluorescein isothiocyanat (FITC) 1: 100 i 1 x PBS indeholdende 1% skummetmælk og inkuberes celler med denne løsning i 1 time ved stuetemperatur i mørke (dække fad fx med en boks eller aluminiumsfolie) på en shaker. Vaske cellerne, som beskrevet i punkt 3.2.
- Du kan samtidig plette actin cytoskelettet og kerner, inkuberes celler i 1 x PBS suppleret med Phalloidin12 konjugeret med et rødt fluorokrom (1:50) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)13 (100 ng/mL) i 10 min på værelse temperatur i mørke på en shaker. Vaske cellerne, som beskrevet i punkt 3.2.
- For at forberede imaging celler, sat et glas objekt carrier (objektglas) på en ren overflade og placere på dråbe af montering medium på det. Tage et dække slip med fast og farvede celler ud af en parabol med pincet og placere den på drop med celler vender objekt carrier. Sørg for, at montering medium breder sig over hele området med cover slip. Lad tørre i mørke.
- Butik fast og monteret celler i mørke ved 4 ° C, indtil den ønskede billedbehandling ansøgning er udført.
Figur 2: Transfektion af udtryk konstruktioner af elektroporation. (A) formodede neuron transfekteret med pc'er-eGFP på 1 dap. (B) tværstribede myocyte (2 dap) udtrykker endoplasmatiske reticulum-målrettede protein ss-RFP-KDEL. (C) to neuroner i en neuronal klynge transfekteret med pc'er-MitoTag-YFP på 2 dap. (D) celle (2 dap) triple-transfekteret med pc'er-DCX-tdTomato, pc'er-MitoTag-YFP og pc'er-H2B-mseCFP. (E) pSK-UAS:mCherry electroporated til primærelementer (1 dap) stammer fra dobbelt-transgene embryoner med transgener Tg (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 og Tg (4xUAS:KGFPGI) hzm332 resulterer i normal god landbrugspraksis udtryk i neuronal stamfaderen til baghjernen. Skalere barer = 10 µm. (A-E) er anskaffet ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskopi ved hjælp af glas bund retter lavet som illustreret i figur 1B. (F) fluorescerende farvning af faste zebrafisk primære neuroner på 5 dap. Blå: DAPI (kernen); Red: Phalloidin (F-actin); Grøn: Acetyleret tubulin (neuroner). Skalalinjen = 10 µm. (G) Neuron-lignende celle transfekteret med pc'er-mClover. På 2 dap, ingen udvidelse er synlig. På 5 dap, en neurite-lignende struktur har dannet. Skalalinjen = 25 µm. (H) Neuron fra den samme præparat som celle i (F), omgivet af fibroblaster-lignende celler. Skalalinjen = 10 µm. (jeg) Neuron stammer fra en transgene Foster transporterer transgen Tg (XITubb: DsRed) zf14828 transfekteret med pc'er-mClover. Mellem 12 og 15 dap, neurites undergå massive degeneration. Skalalinjen = 100 µm. celler vises i (F-jeg) var seedet på poly-L-lysin coatede glas (F, H) eller plast (G, jeg), dyrket i L-15 medium i overværelse af 10% filtreres bovint serum og den neuronal supplement B-27 (fortyndet 1:50) og afbildet med en epifluorescerende mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
4. forberedelse af primære celler fra voksne zebrafisk hjerne
-
Hjernen udvinding
- Vælg en voksne fisk mindst 90 dage i alder. Hvis arbejde med en bestemt celletype er påkrævet, skal du vælge en transgene linje hvor celle-specifikke fluorescerende reporter udtryk giver mulighed for at visualisere de ønskede celler.
- Læg fisken i et bægerglas, fyldt med 200 mL af den bedøvende Tricaine8 (0,2%) i Danieau 30%. Vent indtil fisken stopper flytter. Fordybe den bedøvede fisk i et bægerglas, fyldt med 200 mL isvand for 15 min til at aflive den.
- Udfylde en petriskål (diameter 6 cm) med 70% (v/v) ethanol. Hold fisken i halen med et par pincet og dyppe den i ethanolen. Sikre, at fisken er helt nedsænket i ethanol for 5 s.
- Uddrag hjernen efter protokol af Gupta og Mullins14 med følgende tilpasninger: Brug kun autoklaveres eller sterile-pakket værktøjer og dissekere hovedet i sterile 1 x PBS.
- Direkte efter ekstraktion, placere hjernen i en petriskål (diameter 3 cm) fyldt med steril 1 x PBS og flytte parabol under sterile arbejdsbord til cellekultur.
-
Hjernen dissociation og klædningen af primærelementer
- Sted to sæt steril pincet (autoklaveres), en steril petriskål (diameter 6 cm) fyldt med 70% (v/v) ethanol, en steril petriskål (diameter 10 cm) fyldt med Leibovitz's L-15 medium suppleret med 10% (v/v) filtreres bovint serum, B-27 (1:50) og 1,2% (v / v) 10.000 U Penicillin-Streptomycin og en steril celle si med håndtag (40 µm; Figur 1 c) under den rene bænk.
- Sted celle sien i petriskålen fyldt med ethanol og sikre den flydende niveau er mindst 5 mm højere end bunden af sien.
- Hjælp af første sæt pincet, overføre hjernen i sien allerede placeret i ethanol og sikre, at det er fuldt ud omfattet af væsken. Efter 1 s, transfer si med hjernen i petriskålen indeholdende Leibovitz's L-15 medium med den ovenfor beskrevne kosttilskud.
- Ved hjælp af det andet sæt pincet, beskrevet overførsel hjerne ind i et sterile 1,5 mL reaktion rør fyldt med 500 µL Leibovitz L-15 medium med ovenstående kosttilskud. Tilføje collagenase (Type 2) til en slutkoncentration på 4 mg/mL i en samlet maengde paa 1 mL.
- Inkuber rør på et lodret rør rotator med 30 omdrejninger pr. min. i 35 min. ved stuetemperatur. Mekanisk adskille de resterende væv klumper af pipettering op og ned ved hjælp af en 1.000 µL pipette tip til at støtte dissociation processen.
- Stop dissociation, når ingen synlige partikler forbliver i opløsning. Filtrere cellesuspension gennem en steril celle si med udluftning slot (40 µm; Figur 1 d) ind i en 50 mL konisk rør. Skyl si med ca. 10 mL frisk cellekulturmedium.
Bemærk: Når enkelt cellesuspension opnås, filtrering trin er ikke så nødvendigt som i tilfælde af embryoner dissociation. Hjernen er et blødt væv og som sådan det er mere tilbøjelige til at adskilles administrationsprocedurerne i enkelt cellesuspension. - Pellet celler ved centrifugering i 5 min på 180 x g og celle resuspenderes i 1 mL frisk Leibovitz L-15 medium med de ovenfor beskrevne kosttilskud.
- Tilsæt 500 µL af cellesuspension (50% af de fremstillede celler) på en self-made poly-L-lysin coatede glas bund fad (Se 1.2) eller i et godt af en 24-godt plade. Nedskalere i tilfælde af mindre overflader (dvs., 125 µL løsning til et godt af en 96-brønd plade). Inkuber i 60 min. ved stuetemperatur under sterile arbejdsbord. Derefter tilsættes den nødvendige mængde af frisk medium fylde den specifikke container og inkuberes primærelementer ved 28 ° C.
- Udføre den ønskede billedbehandling ansøgning ved hjælp af en omvendt mikroskop ved 28 ° C. Kulturer kan bruges til billeddannelse i flere dage efter plating. Erstatte 50% af mediet på daglig basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 g viser en overførte lys billede af en typisk kultur fra vildtype embryoner med tværstribede myocytes og klynger af neuron-lignende celler bliver mest rigelige. For at identificere bestemte celletyper mere let, en transgene linje med celle type-specifikke udtryk for en fluorescerende proteiner kan være brugt (figur 1 H).
Transfektion af en pCS2 +-baseret plasmid11 kodning den forbedrede grøn fluorescerende proteiner (eGFP)15 til primærelementer af vildtype embryoner resultater i en stærk fluorescerende signal på 1 dap (figur 2A). Af transfecting pCS2 +-baseret plasmider kodning fluorescerende organelle markører som endoplasmatiske reticulum-målrettet røde fluorescerende proteiner (ss-RFP-KDEL)16 eller mitokondrier-målrettet gul fluorescerende proteiner (MitoTag-YFP)17, 18, subcellulært strukturer kan visualiseres i stor detalje (figur 2B, C). Co Transfektion af op til tre plasmider giver mulighed for simultan analyse af subcellulært lokaliseringen af flere fluorescerende fusion proteiner i den samme celle19 som MitoTag-YFP sammen med mikrotubulus markør menneskelige Doublecortin (DCX) 20 smeltet til rødt fluorescerende protein tdTomato21 og nukleare markør Histon H2B smeltet til en cyan fluorescerende proteiner (H2B-mseCFP)22,23 (figur 2D). Subcellulært strukturer kan også være afbildet med høj tidsmæssige og rumlige opløsning, som for eksempel flytning af vesikler positive for membran markør vesikel-associerede membranen protein 1 (VAMP1) smeltet til fluorescerende protein mCitrine24 , 25 (figur 3). Morfologiske ændringer over tid kan let observeres ved mærkning hele cellen ved ekspression af en lyse fluorescerende proteiner såsom mClover26 (figur 2 g, jeg). Men succesfulde Transfektion af et plasmid, baseret på pBluescriptSK-rygraden kodning rødt fluorescerende protein mCherry27 sammenvoksede til en UAS element til primærelementer stammer fra dobbelt-transgene embryoner med både en Gal4 driver konstruktion og en UAS effektor konstruere viser, at elektroporation protokollen er også velegnet til løsning af kombinatoriske genetik (figur 2E). Derudover kan faste primærelementer farves nemt ved hjælp af immunofluorescens og organelle-specifikke fluorescerende farvestoffer (figur 2F, H).
Figur 3: tid bortfalder billeddannelse af subcellulært strukturer. Wild type celle (1 dap) transfekteret med pc'er-VAMP1-mCitrine. Udvalgte billeder af en time lapse optagelse (1 frame blev taget hver 1,68 s) vises. Pilespidser og spor i ifølge farver fremhæve subcellulært dynamikken i tre særskilte VAMP1-positive vesikler. Skalalinjen = 10 µm. Tid bortfalder blev indspillet ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Dissociation teknik og grundlæggende dyrkningsbetingelserne kan også anvendes på væv af voksen zebrafisk. Her, testede vi voksen hjernevæv fra vildtype zebrafisk. Figur 4A -D viser den gradvise udvikling af et oprindeligt debris-belagt kultur til en kompleks neuronal-lignende netværk. Ved hjælp af voksen hjerne fra en transgene fisk transporterer transgen Tg (XITubb: DsRed) zf14828, fuldt differentierede DsRed-udtrykker neuroner kan undersøges i tæt detaljer (figur 4E).
Figur 4: primære cellekulturer af voksen zebrafisk hjernen. Lysfelt billeder af primærelementer stammer fra voksne zebrafisk hjernen på (A) 1 dap, (B) 3 dap, (C) 5 dap og (D) 8 dap. Fra 1 til 3 dap, døde celler og væv vragrester forsvinder mens enkelt eller grupperet neuronale celler bliver mere og mere tydeligt. På 3 dap, neuronale celler begynder at danne den første korte neurites. Fra 5 dap videre, det er muligt at observere dannelsen af et netværk med hundredvis af godt aflange neurites. Skalere barer = 50 µm. celler blev kulturperler i en poly-L-lysin-belagt 96-brønd plade. (E) kulturperler celler på 7 dap fra den voksne hjerne af transgene fisk at udtrykke transgen Tg (XITubb: DsRed) zf148. DsRed kommer til udtryk i differentierede neuroner28. Skalalinjen = 100 µm. celler blev kulturperler i en poly-L-lysin-belagt 24-godt plade. Alle billeder blev erhvervet af en epifluorescerende mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi to forskellige protokoller til kultur primærelementer fra enten 2 dpf zebrafisk embryoner eller voksen zebrafisk hjernen.
Forberedelse af primære cellekulturer fra 2 dpf zebrafisk er relativt let at udføre for nogen med erfaring i basale celle kultur teknikker. Men for at opnå god og reproducerbare resultater, et tilstrækkeligt antal embryoner som udgangspunkt materiale er afgørende (100 er et minimum). Under en forhøjelse af embryonerne, skal alle mulige kilder til forurening undgås for at holde mængden af bakterier og parasitter fra så lavt som muligt. Mest kritiske er inkubation af embryoner i ethanol-trinnet skal være lang nok til at sikre en grundig sterilisation, men ikke alt for længe enten da ethanol er et organisk opløsningsmiddel, der beskadiger celler og væv.
Timingen er også væsentligt under den enzymatiske dissociation af hjernevæv eller 2 dpf zebrafisk embryoner. I inkubationstiden ikke maa overskrides og enzym-holdige medium skal fjernes hurtigt når komplet dissociation til enkelt celle stadium er gennemført. Ikke desto mindre Type 2 collagenase skader ikke cellemembranen og det er ikke så stærkt hæmmet af FBS, som trypsin33. Takket være disse egenskaber var vi købedygtig præstere dissociation i overværelse af FBS som et vigtigt supplement understøtte cellernes levedygtighed og reducere celleskader, hvilket resulterer i højere udbytte og levedygtighed af sarte celletyper.
Som det fremgår af vores repræsentative resultater, kan forskellige celletyper være enten identificeret ved morfologi eller udtryk for celle typespecifikke transgener kodning for fluorescerende journalister. Sidstnævnte er meget praktisk, når du udfører levende celle billeddannelse af specifikke celle populationer19. Dog, vi varmt anbefale for at kontrollere udtryk mønster af de respektive forstærker i 2 dpf embryoner ved Fluorescens mikroskopi til at sikre ensartede resultater.
For at give mulighed for visualisering af subcellulært strukturer i embryonale zebrafisk primærelementer, etableret vi en elektroporation protokol for at transfect plasmid DNA kodning for et udvalg af fluorescerende organelle markører. Celler transfekteret af denne metode er relativt lav, men pålidelig og giver tilstrækkelig celle numre for levende celle imaging19. For en vellykket Transfektion er et kritisk skridt den korrekte bestemmelse af antallet af celler i suspension. I gennemsnit 106 celler kan fås fra omkring 90 2 dpf embryoner, men præcise celle tælle forudgående elektroporation er obligatorisk19. Men i forhold til almindelige pattedyr cellelinjer som Cos-7 eller HeLa, primærelementer fra 2 dpf zebrafisk embryoner er meget forskellige i størrelse, men ganske små i gennemsnit (især neuroner), der kan gøre optælling i en Neubauer kammer forholdsvis vanskeligt. Det samme gælder for efterfølgende billedbehandlingsprogrammer. For at tilfredsstillende visualisere subcellulært strukturer i disse små zebrafisk celler, er en avanceret fluorescens mikroskop med høj opløsning påkrævet, helst en Konfokal laser scanning mikroskop.
Forberedelse af primære celler fra voksne zebrafisk hjernen er mere avanceret, da det kræver uddannelse i dissekere dyret og uddrager hjernen væv14. Derudover skal sterile forhold være vedligeholdt allerede udenfor den sterile workbench ikke forurener det udtrukne hjernen. Men de efterfølgende trin vedrørende dissociation og plating er sammenlignelig med den første protokol og anvendes også til andre væv af voksne fisk som muskel eller leveren.
For begge protokoller er den vigtigste begrænsning vanskeligt at dyrke celletyper i kultur, som neuroner begrænset levedygtighed. Efter 3 dap ved hjælp af standardbetingelser, reduceres tætheden af embryonale zebrafisk primærelementer kraftigt dermed begrænse budgetcyklus for billeddannelse eksperimenter19. For det meste fiboblast-lignende celler overleve i mangel af specielt skræddersyet tiltag.
For at forbedre overlevelsesraten for kulturen i sin kompleksitet af celletyper, testede vi Leibovitz's L-15 medium. Yderligere suppleret vi det med fremme af neuron tilsætningsstof B-27 for neuronal specifikke kultur. Neuronale celler er blevet observeret at differentiere i cellekultur og overleve i flere dage, når det hidrører fra hele embryoner (figur 2F-jeg) samt fra voksne hjerne (figur 4E). Desuden forbedrer plating af primærelementer ved høje tætheder (fx 0,25 x 106 celler pr. 100 mm2) cellernes levedygtighed i modsætning til lav tætheder (G. Russo, foreløbige resultater).
Ved siden af brugen af specifikke dyrkningsmedier og kosttilskud rapporterede vi hvordan brugen af forskellige substrater har en direkte indvirkning på forskellige celletyper, som udgør den endelige kultur og kan bruges som selektiv parameter til at fremme væksten af et undersæt af celle typer. Vævskultur-behandlet plast i forhold til poly-L-lysin belægning synes at stærkt fremme fibroblast-lignende celle vedhæftning og spredning (figur 1E, F). På samme tid, de mange celletyper, der afhænger af støtte celler og specifikke adhæsionsmolekyler (som neuroner) ikke ordentligt overholder, vokse, eller differentiere på behandlet plast, men foretrækker specifikke klæbende støtte. Vi anbefaler derfor, når det ikke er hensigten at opnå en fibroblast - eller epitel-lignende kultur33, for at bruge poly-L-lysin eller andre celle-specifikke substrater til belægning celle kultur retter.
Vi anser vores protokol et udgangspunkt for brug af primære cellekulturer som et supplement til zebrafisk i vivo undersøgelser, som kan blive yderligere udviklet og tilpasset til dyrkning af specifikke celletyper og anvendes til mange forskelligartede applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde og S.-M. Tokarski for glimrende dyrs pleje og teknisk support. Vi er taknemmelige for alle medlemmer af Köster lab intens og nyttige diskussioner. Vi parlamentsarbejdet finansieringen af Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) og delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish lines | |||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | ||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | |
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | |
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective | |
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective | |
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device |
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | |
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | |
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | |
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | |
| micro pipettes | Gilson | ||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | |
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | |
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | |
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene |
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic and glass ware | |||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium |
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | |
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation |
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | |
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | |
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | |
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | |
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos |
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | |
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Reagents | |||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | |
| 4 % paraformaldehyde in 1x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes |
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | |
| methylene blue | Serva | 29198.01 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | |
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | |
| potasssion chloride | Merck | 104938 | |
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | |
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | |
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C |
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium and solutions for cell culture | |||
| 1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | |
| glutamine 100x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| PenStrep (10,000 U/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
