Summary
Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo's voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.
Abstract
Zebravis embryo's transparant zijn en snel te ontwikkelen buiten de moeder, waardoor voor uitstekende in vivo imaging van dynamische biologische processen in een gewerveld dier intact en de ontwikkelingslanden. De gedetailleerde beeldvorming van de morphologies van verschillende celtypes en subcellular structuren wordt echter beperkt in hele mounts. Daarom opgericht wij een efficiënte en easy-to-use protocol om cultuur levende primaire cellen van zebravis embryo's en volwassen weefsel.
2 dpf zebrafish embryo's zijn in het kort, dechorionated, deyolked, gesteriliseerd, en losgekoppeld op enkele cellen met collagenase. Na een filtratie stap, zijn primaire cellen vergulde op glazen bodem gerechten en geteeld voor meerdere dagen. Verse culturen, zo veel als lange termijn differenciated ones, kunnen worden gebruikt voor hoge resolutie confocal imaging studies. De cultuur bevat verschillende soorten cellen, met gegroefde myocytes en neuronen worden prominente op poly-L-lysine coating. Wij vastgesteld tot een specifiek label subcellular structuur door fluorescerende marker eiwitten een electroporation protocol waarmee de transfectie van plasmide DNA in verschillende soorten cellen, met inbegrip van neuronen. Dus, in aanwezigheid van de exploitant gedefinieerd prikkels, het gedrag van de complexe cel en intracellulaire dynamiek van primaire zebrafish cellen kan worden beoordeeld met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Bovendien, met behulp van volwassen zebrafish hersenen, we laten zien dat de techniek beschreven dissociatie, evenals de basisvoorwaarden kweken, ook voor volwassen zebrafish weefsel werken.
Introduction
De zebrafish (Danio rerio, D. rerio) is een populair model gewervelde voor tal van gebieden van fundamenteel en biomedisch onderzoek1. Zebravis embryo's ontwikkelen snel ex utero, transparant, en fit onder een Microscoop, waardoor uitstekende voorwaarden voor het bestuderen van gewervelde ontwikkeling in een levend organisme. Als gevolg van de genetische werkwillig van zebravis2, zijn veel stabiele transgene verslaggever regels met cell type-specifieke uitdrukking van verschillende fluorescente markeringen vastgesteld rekening houdend met de waarneming van specifieke cel populaties. De zebravis Gemeenschap biedt een breed scala van zogenaamde Gal4-driver regels waaraan een uiting van de synthetische Kal4TA4 (of de GalFF van het KalTA3-equivalent) transgenic gen met het Gal4-DNA-bindende domein van gist gesmolten virale transcriptionele activering domeinen onder de controle van cel type-specifieke versterkers. Deze bestuurder lijnen zijn overgestoken naar effector lijnen waaraan transgenen dat bestaat uit een gedefinieerde upstream activerend reeks (UAS) gesmolten tot een verslaggever-gen. De Kal4TA4 proteïne bindt aan de UAS-element, dus het activeren van de cel type-selectieve uitdrukking van de verslaggever gen3,4. Deze aanpak zorgt voor zeer uiteenlopende combinatorische studies van bijna alle beschikbare enhancer en verslaggever elementen in dubbel-transgene dieren.
Diepgaande live beeldbewerking met focus op afzonderlijke cellen of hun subcellular inhoud wordt echter beperkt in een geheel en voortdurend veranderende embryo. Om aan te pakken bepaalde cel biologische vragen met de hoogste resolutie, is het gebruik van celculturen handiger. Sommige cellijnen van zebravis bestaan, maar ze worden beschouwd als zwaar geselecteerde5,6,7 en hun voortplanting is vaak tijdrovend. Bovendien zijn alle beschikbare cellijnen fibroblast afgeleid, experimenten met behulp van celkweek voor één soort cellen te beperken. Dus vastgesteld we beide een efficiënte en easy-to-use protocol ter voorbereiding van primaire cellen rechtstreeks vanuit de zebravis embryo's en volwassen zebrafish hersenen, samen met benaderingen te verhogen de levensduur van de cultuur en aan het verbreden van de diversiteit van de gecultiveerde celtypes. Daarnaast presenteren wij een procedure om te transfect van embryonale primaire cellen met expressie constructies voor fluorescerende organel markeringen. Dus, cellulaire morphologies en subcellular structuren kunnen worden geanalyseerd met hoge ruimtelijke en temporele resolutie in verschillende celtypen, die hun belangrijkste functies te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk hier beschreven is in overeenstemming met wettelijke voorschriften (EU-richtlijn 2010/63). Onderhoud en de verwerking van vis is goedgekeurd door de lokale autoriteiten en door de vertegenwoordiger van de Braunschweig University of Technology en de lagere Saksen staat Office van bescherming van de consument en de voedselveiligheid (LAVES, Oldenburg, Duitsland; dierenwelzijn §4 van AZ. (02.05) TSchB TU BS).
1. bereiding van primaire cellen van embryo's de zebravis
- Voorbereiding van 2 dagen post bevruchting (dpf) zebrafish embryo 's
- Dag 1: Opzetten van verscheidene kruisingen van de zebravis stam van keuze en volgens de specificaties van uw zebrafish facility manager8.
- Dag 2: Mate vis en eieren8 verzamelen direct na het kuit schieten in een 10 cm petrischaal (plastiek). Het verwijderen van dode of besmette eieren met een pipet van Pasteur (plastiek). Wash eieren 1 x met Danieau 30% (5.8 mM natriumchloride, kaliumchloride van 0,07 mM 0,04 mM magnesium-sulfaat, calciumnitraat 0.06 mM, 5 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic zuur, pH 7,2)8 met methyleenblauw 0,0001% (m/v). Wisselen van de middellange-tot Danieau 30% zonder methyleenblauw, omdat methyleenblauw kan autofluorescence veroorzaken, en eieren uit te over nacht bij 28 ° C. broeden
Opmerking: Starten met een minimum van 100 eieren per vis lijn met het oog op een voldoende hoeveelheid cellen. Meer dan 150 embryo's in een petrischaal niet verhogen. - Dag 3: Verwijder dode of besmette embryo's en wisselen de middellange tot Danieau 30%. Bepaal het aantal embryo's door te tellen. Incubeer embryo 's nachts bij 28 ° C.
Opmerking: Wanneer u een transgene lijn uiting geven aan een fluorescerende verslaggever, screening op 1 dpf of 2 dpf kan noodzakelijk zijn.
Opmerking: Voor grotere bedragen van embryo's, het is aanbevolen om een zwart-wit beeld van de respectieve petrischaal (figuur 1A) en te kwantificeren van het aantal embryo's met een imagingsoftware. - Dag 4: Embryo's zijn nu 2 dpf. Verwijderen van chorions, voeg 1 mL pronase met een concentratie van 1 mg/mL 10 ml van de Danieau 30%8 en incubeer embryo's op een shaker bij kamertemperatuur totdat alle chorions zijn vrijstaand (20-40 min afhankelijk van omgevingstemperatuur). Wassen met Danieau 30% tot Verwijder zowel pronase als chorions en houden van embryo's bij kamertemperatuur tot verder gebruik.
- Herbruikbare poly-L-lysine gecoate glazen bodem gerechten bereiden
Opmerking: Verkrijgbare glazen bodem gerechten zijn ontworpen voor eenmalig gebruik alleen en zijn duur. De volgende procedure wordt beschreven hoe voor te bereiden van herbruikbare zelf-gemaakte glazen bodem gerechten uit standaard lab materialen.- Boor een gat met een diameter van 10 mm in de bodem van standaard cel cultuur gerechten (diameter 6 cm, kunststof) (figuur 1B). Wassen schotel bodems grondig met leidingwater om boren stof te verwijderen.
- Verspreiding van siliconen vet rond het gat in de onderkant van de schotel bodems en hechten een dekglaasje aan met behulp van het vet als lijm. Zorg ervoor dat het vet zeehonden de kloof tussen de onderkant van de schotel en dekglaasje aan.
Opmerking: Zorg ervoor dat de dikte van de gebruikte coverslips geschikt voor de later imaging-toepassing is. - Grondig, maar zorgvuldig, zelf-gemaakte glazen bodem vaat wassen met koud leidingwater en zeep. Spoel het glas onder gerechten driemaal met gedeïoniseerd water te verwijderen van de zeep. Schotel deksels drogen en schotel bodems en bewaar ze in een schone vak tot verder gebruik.
- Op de dag van cultuur voorbereiding (dag 4, zie 1.1.4): Bevochtig de binnenkant van beide schotel deksels en schotel bodems met ethanol 70% (v/v). Plaats van de schotel deksels en schotel bodems de innerlijke zijde naar boven in een steriele werk bankje met laminaire flow en UV-licht. Drogen tot de ethanol is verdampt, dan geldt UV-licht voor 20 min. Na deze behandeling, zijn gerechten geassembleerd en beschouwd als steriel.
- Afdekhoes, Pipetteer 200 µL van poly-L-lysine (0,1 mg/mL) in het midden van elk glas onder gerecht en verspreid de vloeistof op het dekglaasje aan door het breken van de oppervlaktespanning met een pipet tip. Laten drogen voor 60 min, dan wassen 1 x met steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De vloeistof afzuigen. Houd gerechten onder de Bank tot verder gebruik.
Opmerking: Andere coatings kunnen afhankelijk van het doel van het experiment worden getest. We vonden poly-L-lysine voldoende ter ondersteuning van de groei van neuronen, terwijl behandeld kunststof zonder extra coatings leek te zijn gunstig voor de groei van cellen van de fibroblast-achtige (figuur 1E, F).
Opmerking: Zelf-gemaakte glazen bodem gerechten kunnen vele malen gebruikt. Om te wisselen van het dekglaasje aan, wassen met warm leidingwater, zorgvuldig loskoppelen van het dekglaasje aan en overige vet met 70% (v/v) ethanol en zeep verwijderen.
- Voorbereiding en beplating van primaire cellen
- Op de dag van cultuur voorbereiding (dag 4, zie 1.1.4): Transfer van embryo's in een steriele cel cultuur schotel (diameter 6 cm) met behulp van een verse plastic pipet van Pasteur. Verwijder de vloeistof stapsgewijze totdat alle embryo's zijn verzameld in een grote daling met een diameter van ongeveer 2 cm of minder.
- Plaats van de schotel met embryo's in de Bank steriele werk en voeg CO2-onafhankelijke medium (aangevuld met 10% (v/v) gefiltreerd runderserum, 1 x glutamine en 1,2% (v/v) 10.000 U penicilline-streptomycine; medium met alle supplementen is in de volgende "cel kweekmedium" genoemd) tot de schotel half gevuld is.
Opmerking: Alternatieven voor CO2-onafhankelijke medium kan worden getest afhankelijk van het doel van het experiment, bijvoorbeeld neurobasal medium, DMEM medium of Leibovitz van L-15 medium. CO2-onafhankelijke medium en Leibovitz van L-15 medium hebben het voordeel dat niet vereist een CO2 incubator. - Pipetteer embryo's op en neer met behulp van een tip van 200 µL-pipet als u wilt verwijderen van de dooier. Succesvolle deyolking kan worden herkend door het vertroebelt van het medium.
- Vul een cel cultuur schotel met ethanol 70% (v/v) en een andere schotel van de cultuur van de cel met verse cel kweekmedium. Een licht-donkerscheiding 1.000 µL-pipet tip gebruiken voor het overbrengen van embryo's in een steriele cel zeef met handvat (40 µm; Figuur 1 c). Neem de zeef door het handvat en dompel het in de schotel met ethanol zodat alle embryo's zijn ondergedompeld 5 s. onmiddellijk daarna het onderdompelen van de zeef met embryo's in de schotel met verse cel kweekmedium.
Opmerking: Cel vulinrichtingen kunnen hergebruikt worden meerdere malen. Schoon met een zachte borstel onder stromend leidingwater, slaan ze in 70% ethanol en droog en UV-traktatie bench hen onder de steriele werk direct vóór gebruik (Zie ook 1.2.4). - Pipetteer embryo's in steriele 1,5 mL reactie buizen (ongeveer 100 embryo's in één buis). Voeg collagenase (Type 2) in een kweekvloeistof cel om een eindconcentratie van 4 mg/mL in een totaal volume van 1 mL verdund. Buizen met embryo's op een verticale buis rotator met 30 omwentelingen per min gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Distantiëren resterende cel klontjes door pipetteren het embryo-collagenase mengsel op en neer met een 1.000 µL-pipet-tip. Filtreer vervolgens de celsuspensie door een zeef steriele cel met ontluchting sleuf (40 µm; Figuur 1 d) in een conische buis van 50 mL. Spoel de zeef met ongeveer 10 mL verse cel kweekmedium.
- Pellet cellen door centrifugeren gedurende 3 minuten op 180 x g. Het is mogelijk dat de pellet bijna onzichtbaar is. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 µL verse cel kweekmedium per 30 oorspronkelijk gebruikte embryo's.
Opmerking: Voor het verkrijgen van een zichtbare pellet, is het raadzaam om te beginnen met een minimum van 100 embryo's. - Pipetteer 200 µL van de celsuspensie verkregen in stap 1.3.7 rechtstreeks op het gebied van glas van een zelf-gemaakte poly-L-lysine-gecoate glazen bodem schotel (zie 1.2). Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur onder de steriele werk-Bank. Voeg 6 mL verse cel cultuurmedium en incubeer primaire cellen bij 28 ° C.
- Uitvoeren van de gewenste imaging-toepassing met behulp van een omgekeerde Microscoop bij 28 ° C. Het kweekmedium cel dagelijks wisselen. Culturen kunnen worden gebruikt voor imaging voor enkele dagen na de plating (dap).
Figuur 1: primaire celculturen van embryo's de zebravis. (A) zwart-wit foto van 1 dap embryo's, die kunnen worden verwerkt door een softwaretool voor het analyseren van het aantal embryo's. (B) cel cultuur gerechten (diameter 6 cm) met een geboord gat (diameter 10 mm) worden gebruikt voor herbruikbare zelf-gemaakte glazen bodem gerechten bereiden. (C) cel vulinrichtingen (40 µm) met een eenvoudige handvat worden gebruikt als "landing netten" duik deyolked embryo's in ethanol en snel overbrengen naar verse cel kweekmedium. (D) cel vulinrichtingen (40 µm) met ontluchting van "slots" worden gebruikt voor het filteren van cellen na collagenase-gemedieerde dissociatie. (E) na 5 dap, primaire cellen ontpit op glas bedekt met poly-L-lysine voornamelijk vormen van neuronen met uitgesproken extensies. Schaal bar = 100 µm. (F) na 5 dap op behandelde kunststof zonder conserveren, fibroblast-achtige cellen de cultuur overwoekeren. Schaal bar = 100 µm. (E) en (F) werden verworven door een Microscoop epifluorescerende. (G) overdraagbare licht beeld van primaire cellen afgeleid van wild type zebravis op 1 dap. Locustella myocytes en clusters van neuronen uitbreiding van dunne processen kunnen gemakkelijk worden waargenomen. Schaal bar = 50 µm. (H) gekweekte cellen van de transgene lijn GS (ptf1a: eGFP) jh1, die spreekt van eGFP in neuronale voorlopercellen van meestal GABAergic neuronen in de hindbrain en een subset van retinale cel populaties29, 30 , 31. schaal bar = 50 µm. (G) en (H) werden verworven door een confocale laser scanning microscoop met behulp van de glazen bodem gerechten zoals geïllustreerd in (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
2. de transfectie van primaire cellen met plasmide DNA
- Resuspendeer gefiltreerd en Ingehuld cellen verkregen stap 1.3.7 in 1 x PBS in plaats van de cel kweekmedium. Vlek een aliquoot gedeelte van de celsuspensie met Trypan blauw om te bepalen van het aantal cellen in een tellen kamer9.
- Meng 0,5 miljoen cellen met 10 µg Ultra zuivere plasmide DNA in een 1,5 mL reactiebuis en het totale volume aan 100 µL met 1 x PBS.
Opmerking: Voor onze experimenten, hebben we voornamelijk gebruikt expressie constructies op basis van de plasmide pCS2 +10. Expressie van open lezing frames gekloond in de site meerdere klonen van pCS2 + wordt gedreven door de alomtegenwoordige promotor van de menselijke cytomegalovirus (CMV promotor). Andere expressie constructies en initiatiefnemers kunnen worden getest (Zie ook vertegenwoordiger resultaten en Figuur 2 en Figuur 3). - Overdracht de cel-DNA mix onmiddellijk naar een electroporation cuvette (0,4 cm), plaats de cuvette in een electroporation apparaat en electroporate met de volgende instellingen: eenmalige puls, exponentiële afname, 280 V, 950 µF.
- Breng de mix van cel-DNA in een reactiebuis 1,5 mL met 300 µL cultuurmedium verse cel direct na de electroporation.
- Plaat 200 µL van de celsuspensie zoals beschreven in 1.3.8 en ga verder zoals beschreven in 1.3.9 afhankelijk van de gebruikte expressie construct, uitdrukking van fluorescente proteïnen detecteerbare kan worden na een paar uur of de volgende dag.
3. kleuring van vaste primaire cellen
Opmerking: Subcellular structuren kunnen ook worden gevisualiseerd door klassieke immunokleuring in plaats van met behulp van fluorescerende fusion eiwit verslaggevers. Voor zebrafish primaire cellen gebruiken we de volgende standaard protocol inzake voorbeeldige vlek nucleus, F-actine en geacetyleerd tubuline met fluorescente markeringen.
- Plaat cellen op poly-L-lysine gecoate cover slips geplaatst in een cel cultuur schotel of multiwell plaat, zoals eerder beschreven (zie 1.3.8).
- Voor de vaststelling, verwijder het medium en dekking van de cellen met 4% paraformaldehyde in 1 x PBS. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 4 ° C op een shaker. Wash cellen 3 x voor 5 minuten, elk met 1 x PBS bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de PBS 1 x de cellen volledig omvat en de wassen stappen uitvoert op een shaker.
- Te blokkeren en te permeabilize de vaste cellen, de cellen te dekken met 1 x PBS met 5% afgeroomde melk en 0,3% Triton X-100. Plaats de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een shaker. Wassen cellen zoals beschreven in punt 3.2.
- Verdun het primaire antilichaam-1:2,000 in 1 x PBS, met 1% afgeroomde melk om geacetyleerd tubuline, een marker voor axonen11, van een label. Dekking van de cellen met deze oplossing en hen uit te broeden over nacht bij 4 ° C op een shaker. De volgende dag wassen cellen zoals beschreven in punt 3.2.
- Verdun het secundaire antilichaam geconjugeerd met de groene fluorochrom fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) 1:100 in 1 x PBS, met 1% afgeroomde melk en Incubeer de cellen met deze oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker (dekken de schotel bv met een doos of aluminiumfolie) op een shaker. Wassen cellen zoals beschreven in punt 3.2.
- Als u wilt tegelijkertijd vlek de actine cytoskelet en de kernen, Incubeer de cellen in 1 x PBS aangevuld met Phalloidin12 geconjugeerd met een rode fluorescerende (1:50) en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)13 (100 ng/mL) gedurende 10 minuten op kamer temperatuur in het donker op een shaker. Wassen cellen zoals beschreven in punt 3.2.
- Cellen om voor te bereiden imaging, zet een glas object drager (microscoopglaasje) op een schoon oppervlak en plaats bij het neerzetten van montage op het medium. Neem een cover slip met vaste en gekleurde cellen uit een schotel met pincet en plaats het op de daling met de cellen die zijn geconfronteerd met de vervoerder object. Ervoor te zorgen dat de middellange-montage verspreidt zich over het hele gebied van de cover slip. Laat drogen in het donker.
- Winkel vast en gemonteerd van cellen in het donker bij 4 ° C, totdat de gewenste imaging-toepassing wordt uitgevoerd.
Figuur 2: transfectie van meningsuiting construeert door electroporation. (A) Putative neuron transfected met pCS-eGFP bij 1 dap. (B) Locustella myocyte (2 dap) uiting geven aan het endoplasmatisch reticulum-gerichte eiwit ss-RFP-KDEL. (C) twee neuronen binnen een neuronale cluster transfected met pCS-MitoTag-YFP op 2 dap. (D) cel (2 dap) triple-transfected met pCS-DCX-tdTomato, pCS-MitoTag-YFP en PC-H2B-mseCFP. (E) pSK-UAS:mCherry electroporated in primaire cellen (1 dap) afgeleid van dubbel-transgene embryo's met de transgenen GS (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 en GS (4xUAS:KGFPGI) hzm332 resulterend in GFP expressie in neuronale voorlopercellen van de hindbrain. Schaal bars = 10 µm. (A-E) werden verworven door een confocale laser scanning microscopie met behulp van de glazen bodem gerechten zoals geïllustreerd in figuur 1B. (F) fluorescerende vlekken van vaste zebrafish primaire neuronen op 5 dap. Blauw: DAPI (nucleus); Rood: Phalloidin (F-actine); Groen: Geacetyleerd tubuline (neuronen). Schaal bar = 10 µm. (G) Neuron-achtige cel transfected met pCS-mClover. Op 2 dap, zonder extensie zichtbaar is. Dap op 5, een neurite-achtige structuur heeft gevormd. Schaal bar = 25 µm. (H) Neuron uit de dezelfde voorbereiding als de cel in (F), omringd door fibroblasten-achtige cellen. Schaal bar = 10 µm. (ik) Neuron afgeleid van een transgene embryo de transgenic GS uitvoering (XITubb: DsRed) zf14828 transfected met pCS-mClover. Tussen 12 en 15 dap, de neurites ondergaan enorme degeneratie. Schaal bar = 100 µm. cellen weergegeven in (F-Ik) werden zaadjes op poly-L-lysine gecoat glas (F, H) of kunststof (G, I), gekweekt in L-15 medium in aanwezigheid van 10% gefiltreerd runderserum en de neuronale aanvulling B-27 (verdund 1:50) en beeld met een Microscoop epifluorescerende. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. bereiding van primaire cellen van volwassen Zebrafish hersenen
-
Extractie van de hersenen
- Selecteer een volwassen vis van ten minste 90 dagen oud. Als werken met een specifieke celtype vereist is, kiest u een transgene lijn in die cel-specifieke fluorescerende verslaggever expressie zal toestaan om te visualiseren van de gewenste cellen.
- Plaats de vis in een bekerglas gevuld met 200 mL van de verdoving tricaïne8 (0,2%) in Danieau 30%. Wacht totdat de vis niet meer beweegt. Dompel de narcose vis in een bekerglas gevuld met 200 mL ijswater gedurende 15 minuten naar het euthanaseren.
- Vul een petrischaal (diameter 6 cm) met 70% (v/v) ethanol. Houd de vis door de staart met een pincet en dompel het in de ethanol. Zorgen dat de vis wordt volledig ondergedompeld in ethanol voor 5 s.
- Pak de hersenen volgens het protocol van Gupta en Mullins14 met de volgende aanpassingen: gebruik alleen gesteriliseerde met autoclaaf of steriele boordevol hulpmiddelen en het ontleden van het hoofd in steriele 1 x PBS.
- Plaats direct na extractie, de hersenen in een petrischaal (diameter 3 cm) gevuld met steriele 1 x PBS en verplaatsen van de schotel onder een steriele werk bankje voor celkweek.
-
Hersenen dissociatie en beplating van primaire cellen
- Plaats twee sets van steriel pincet (gesteriliseerde met autoclaaf), een steriele petrischaal (diameter 6 cm) gevuld met 70% (v/v) ethanol, een steriele petrischaal (diameter 10 cm) gevuld met Leibovitz van L-15 medium aangevuld met 10% (v/v) gefiltreerd runderserum, B-27 (1:50) en 1,2% (v / v) 10.000 U penicilline-streptomycine en een steriele cel zeef met handvat (40 µm; Figuur 1 c) onder de schone Bank.
- Plaats de zeef van de cel in de petrischaal gevuld met ethanol en zorgen dat het vloeistofniveau is ten minste 5 mm hoger dan de onderkant van de zeef.
- Met behulp van de eerste set pincetten, breng de hersenen in de zeef al geplaatst in de ethanol en zorgen dat voor de volledige financiering door de vloeistof. Na 1 s, overdracht de zeef met de hersenen in de petrischaal met Leibovitz van L-15 medium met de hierboven beschreven supplementen.
- Met behulp van de tweede set pincetten, beschreven overdracht de hersenen in een steriele 1,5 mL reactiebuis gevuld met 500 µL Leibovitz L-15 medium met de hierboven supplementen. Collagenase (Type 2) toevoegen om een eindconcentratie van 4 mg/mL in een totaal volume van 1 mL.
- Incubeer de buis op een verticale buis rotator met 30 omwentelingen per min gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur. Mechanisch distantiëren de resterende weefsel klontjes door pipetteren op en neer met behulp van een 1.000 µL Pipetteer tip om te helpen het proces dissociatie.
- Stop de dissociatie wanneer geen zichtbare deeltjes in oplossing blijven. Filtreer de celsuspensie door een zeef steriele cel met ontluchting sleuf (40 µm; Figuur 1 d) in een conische buis van 50 mL. Spoel de zeef met ongeveer 10 mL verse cel kweekmedium.
Opmerking: Wanneer één celsuspensie wordt bereikt, de filtratie stap is niet zo nodig zoals in geval van embryo's dissociatie. Het brein is een weke delen en als zodanig is het gevoeliger voor homogeen in één celsuspensie worden losgekoppeld. - Pellet cellen door centrifugeren gedurende 5 min. op 180 x g en resuspendeer de cel pellet in 1 mL van de verse Leibovitz L-15 medium met de hierboven beschreven supplementen.
- Pipetteer 500 µL celsuspensie (50% van de verkregen cellen) op een zelf-gemaakte poly-L-lysine gecoate glazen bodem schotel (zie 1.2) of in een put van een 24-well-plate. Verkleinen in geval van kleinere oppervlakken (dat wil zeggen, 125 µL oplossing voor een goed van een 96-wells-plaat). Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur onder de steriele werk-Bank. Voeg vervolgens de nodige hoeveelheid verse medium te vullen de specifieke container en incubeer primaire cellen bij 28 ° C.
- Uitvoeren van de gewenste imaging-toepassing met behulp van een omgekeerde Microscoop bij 28 ° C. Culturen kunnen worden gebruikt voor imaging voor enkele dagen na de beplating. Vervangen 50% van het medium op een dagelijkse basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1G toont een doorvallend licht beeld van een typische cultuur afgeleid van wild type embryo's met gegroefde myocytes en clusters van neuron-achtige paneeltechnologie overvloedigste. Voor de identificatie van bepaalde celtypen gemakkelijker zijn een transgene lijn met cel type-specifieke expressie van een fluorescente proteïne kan worden gebruikt (Figuur 1 H).
De transfectie van een pCS2 +-based plasmide11 codering van de verbeterde groen fluorescent proteïne (eGFP)15 in primaire cellen van wild type embryo's leidt tot een sterke fluorescent signaal bij 1 dap (figuur 2A). Door transfecting pCS2 +-op basis van plasmiden codering fluorescerende organel markeringen zoals endoplasmatisch reticulum-gerichte rood fluorescerende eiwit (ss-RFP-KDEL)16 of mitochondriën-gerichte gele fluorescerende eiwit (MitoTag-YFP)17, 18, subcellular structuren kunnen worden gevisualiseerd in groot detail (figuur 2B, C). Co transfectie van maximaal drie plasmiden, zorgt voor de gelijktijdige analyse van de subcellular localisatie van verschillende TL fusion eiwitten in de zelfde cel19 zoals MitoTag-YFP samen met de markering microtubulus menselijke Doublecortin (DCX) 20 gesmolten tot aan de rode fluorescerende eiwit tdTomato21 en de nucleaire marker Histon H2B gesmolten aan een cyaan fluorescente proteïne (H2B-mseCFP)22,23 (figuur 2D). Subcellular structuren kunnen ook worden beeld met hoge temporele en ruimtelijke resolutie, zoals bijvoorbeeld het verkeer van blaasjes positief voor het membraan marker membraan van het vesikel-geassocieerde eiwit 1 (VAMP1) gefuseerd tot de fluorescente proteïne mCitrine24 , 25 (Figuur 3). Morfologische veranderingen na verloop van tijd kunnen gemakkelijk worden waargenomen door het labelen van de hele cel door de uitdrukking van een helder fluorescerende eiwitten zoals mClover26 (Figuur 2 g, ik). Echter succesvol transfectie van een plasmide gebaseerd op de pBluescriptSK-backbone codering het rood fluorescerende eiwit mCherry27 UAS-element in de primaire cellen gesmolten afgeleid van dubbel-transgene embryo's met zowel een Gal4-stuurprogramma Construct en een UAS effector construct toont aan dat het protocol electroporation is ook geschikt voor combinatorische genetica (2E figuur). Bovendien, vaste primaire cellen kan gemakkelijk worden gekleurd met immunofluorescentie en organel-specifieke fluorescente kleurstoffen (figuur 2F, H).
Figuur 3: Time lapse beeldvorming van subcellular structuren. Wild type cel (1 dap) transfected met pCS-VAMP1-mCitrine. Frames van een time lapse opname hebt geselecteerd (1 beeld werd genomen elke 1,68 s) worden weergegeven. Pijlpunten en tracks in volgens kleuren markeren de subcellular dynamiek van drie verschillende VAMP1-positieve blaasjes. Schaal bar = 10 µm. De time-lapse werd opgenomen met behulp van een confocale laser scanning microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De dissociatie-techniek en de cultuur van de fundamentele voorwaarden kunnen ook worden toegepast op het weefsel van volwassen zebrafish. Hier, we volwassen hersenweefsel van wild type zebrafish getest. Figuur 4A -D toont de geleidelijke ontwikkeling van een cultuur van aanvankelijk puin-gecoat met een complex netwerk van neuronale-achtige. Met behulp van de volwassen hersenen van een transgene vis de transgenic GS uitvoering (XITubb: DsRed) zf14828, volledig gedifferentieerde DsRed-uiten neuronen kunnen worden onderzocht in nauwe detail (figuur 4E).
Figuur 4: de cultuur van de primaire cel van volwassen zebrafish hersenen. Helder veld beelden van primaire cellen afgeleid van volwassen zebrafish hersenen op (A) 1 dap, (B) 3 dap, (C) 5 dap en (D) 8 dap. Van 1 tot 3 dap, dode cellen en weefsel puin verdwijnen terwijl één of geclusterde neuronale cellen duidelijker geworden. Op 3 dap, neuronale cellen beginnen te vormen van de eerste korte neurites. Van 5 dap verder, is het mogelijk om te observeren van de vorming van een netwerk met honderden goed verlengde neurites. Schaal bars = 50 µm. cellen werden gekweekt in een poly-L-lysine-coated 96-wells-plaat. (E) gekweekte cellen op 7 dap van de volwassen hersenen van een transgene vis uiten de transgenic GS (XITubb: DsRed) zf148. DsRed wordt uitgedrukt in gedifferentieerde neuronen28. Schaal bar = 100 µm. cellen werden gekweekt in een 24-well poly L-lysine-beklede plaat. Alle beelden werden verworven door een Microscoop epifluorescerende. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we twee verschillende protocollen cultuur primaire cellen uit 2 dpf zebrafish embryo's of volwassen zebrafish hersenen.
De bereiding van primaire celculturen van 2 dpf zebrafish is relatief eenvoudig voor iemand met ervaring in fundamentele cel cultuur technieken uit te voeren. Echter, met het oog op een goede en reproduceerbare resultaten, een voldoende aantal embryo's als grondstof is belangrijk (100 is het minimum). Tijdens het verhogen van de embryo's, moeten alle mogelijke bronnen van verontreiniging worden vermeden om de hoeveelheid bacteriën en parasieten zo laag mogelijk te houden. Belangrijkst is de incubatie van de embryo's in ethanol — deze stap moet lang genoeg om te zorgen voor grondige sterilisatie, maar niet te lang hetzij omdat ethanol is een organisch oplosmiddel die schadelijk is voor cellen en weefsels.
Timing is ook essentieel tijdens de enzymatische dissociatie van hersenweefsel of 2 dpf zebrafish embryo's. De incubatietijd mag niet worden overschreden en enzym-bevattende medium wordt geschrapt snel zodra volledige dissociatie tot eencellige fase wordt verwezenlijkt. Niettemin Type 2 collagenase beschadigt niet het celmembraan en het is niet zo sterk geremd door FBS, als trypsine33. Dankzij deze eigenschappen konden we voor het uitvoeren van de dissociatie in aanwezigheid van FBS als een essentiële aanvulling ter ondersteuning van de levensvatbaarheid van de cellen en het verminderen van celschade, wat resulteert in hoger rendement en levensvatbaarheid van delicate celtypes.
Zoals blijkt uit onze representatieve resultaten, kunnen er verschillende celtypes dat hetzij door morfologie of door de uitdrukking van de cel type-specifieke transgenen codering voor fluorescerende verslaggevers geïdentificeerd. Dit laatste is erg handig bij het uitvoeren van de levende cel beeldvorming van specifieke cel populaties19. Echter, wij raden om te controleren of het expressiepatroon van de respectieve enhancer in 2 dpf-embryo's door fluorescentie microscopie om consistente resultaten.
Als u wilt toestaan voor de visualisatie van subcellular structuren in embryonale zebrafish primaire cellen, opgericht wij een electroporation protocol transfect plasmide DNA-codering voor een selectie van fluorescerende organel markers. Het aantal cellen transfected door deze methode is relatief laag, maar betrouwbare en biedt voldoende cel nummers voor levende cellen imaging19. Voor een succesvolle transfectie is een cruciale stap de juiste bepaling van het aantal cellen in suspensie. In gemiddelde, 106 cellen ongeveer 90 2 dpf embryo's kunnen worden verkregen, maar nauwkeurige cel tellen voorafgaande electroporation is verplicht19. Echter, vergeleken met gemeenschappelijke zoogdieren cellijnen zoals Cos-7 of HeLa, primaire cellen uit 2 dpf zebrafish embryo's zijn zeer verschillend in grootte, maar heel klein in gemiddelde (vooral neuronen), die kan maken tellen in een kamer Neubauer relatief moeilijk. Hetzelfde geldt voor latere beeldbewerkingstoepassingen. Om te visualiseren op bevredigende wijze subcellular structuren in die kleine zebrafish cellen, is een geavanceerde fluorescentie Microscoop met hoge resolutie vereist, bij voorkeur een confocale laser scanning microscoop.
De bereiding van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen is geavanceerder aangezien het vereist opleiding in de ontrafeling van het dier en het uitpakken van de hersenen weefsel14. Daarnaast moeten steriele omstandigheden al buiten de steriele workbench niet besmetten de uitgepakte hersenen worden vastgehouden. Echter, de latere stappen met betrekking tot dissociatie en plating zijn vergelijkbaar met het eerste protocol en kunnen ook worden toegepast op andere weefsels van volwassen vis zoals spieren of lever.
Voor beide protocollen is de belangrijkste beperking de beperkte levensvatbaarheid van moeilijk te cultiveren celtypes in cultuur, als neuronen. Na 3 dap met behulp van standaardvoorwaarden, is de dichtheid van embryonale zebrafish primaire cellen sterk verminderde waarbinnen de tijdsspanne voor imaging-experimenten19te beperken. Meestal fiboblast-achtige cellen overleven in de afwezigheid van specifiek op maat gesneden redmiddelen.
Ter verbetering van de overlevingskansen van de cultuur in al haar complexiteit van celtypes, we met succes getest Leibovitz van L-15 medium. Verder aangevuld wij het met de neuron-bevordering van additieve B-27 voor neuronale specifieke cultuur. Neuronale cellen hebben waargenomen om te differentiëren in celkweek en om te overleven voor meerdere dagen, wanneer afgeleid uit hele embryo's (figuur 2F-Ik) zo goed als van de volwassen hersenen (figuur 4E). Bovendien verbetert de beplating van primaire cellen bij hoge dichtheden (bijvoorbeeld 0,25 x 106 cellen per 100 mm2) de levensvatbaarheid van de cellen in tegenstelling tot lage dichtheden (G. Russo, voorlopige resultaten).
Naast het gebruik van specifieke cultuurmedia en supplementen meldden we hoe het gebruik van verschillende substraten heeft een directe impact op de verscheidenheid van celtypes die vormen de laatste cultuur en als selectieve parameter kan worden gebruikt ter bevordering van de groei van een subset van de cel typen. Weefselkweek behandeld kunststof in vergelijking met poly-L-lysine coating lijkt sterk vergemakkelijken fibroblast-achtige cel adhesie en proliferatie (figuur 1E, F). Op hetzelfde moment, de talrijke celtypes die afhankelijk zijn van steun cellen en specifieke celadhesie-moleculen (zoals neuronen) niet goed aanhangen, groeien, of differentiëren op behandelde plastic, maar liever specifieke zelfklevende steun. Daarom wordt aangeraden, wanneer het is niet bedoeld om het verkrijgen van een fibroblast - of epitheliale-achtige cultuur33, voor het gebruik van poly-L-lysine of andere cel-specifieke substraten voor coating van cel cultuur gerechten.
We overwegen ons protocol een uitgangspunt voor het gebruik van primaire celculturen als een aanvulling op de zebravis in vivo studies, die verder kunnen worden ontwikkeld en aan de teelt van bepaalde celtypen aangepast en voor vele gevarieerde toepassingen gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken T. Fritsch, A. Wolf-Asseburgu, I. Linde en S.-M. Tokarski voor de uitstekende verzorging van de dieren en technische ondersteuning. We zijn dankbaar voor alle leden van de Köster lab voor intense en nuttige discussies. Wij erkennen dankbaar steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) en de federale staat van Neder-Saksen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish lines | |||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | ||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | |
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | |
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective | |
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective | |
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device |
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | |
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | |
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | |
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | |
| micro pipettes | Gilson | ||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | |
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | |
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | |
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene |
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic and glass ware | |||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium |
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | |
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation |
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | |
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | |
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | |
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | |
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos |
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | |
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Reagents | |||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | |
| 4 % paraformaldehyde in 1x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes |
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | |
| methylene blue | Serva | 29198.01 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | |
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | |
| potasssion chloride | Merck | 104938 | |
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | |
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | |
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C |
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium and solutions for cell culture | |||
| 1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | |
| glutamine 100x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| PenStrep (10,000 U/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T.
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al.
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
