Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kultur og Transfection sebrafisk primære celler

Published: August 17, 2018 doi: 10.3791/57872
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 1, 1
1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Braunschweig University of Technology, 2Department of Biotechnology, Institute of Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, Braunschweig University of Technology

Summary

Vi presenterer en effektiv og enkel å bruke protokoll for å forberede primært cellekulturer av sebrafisk embryo for transfection og levende celle bildebehandling samt en protokoll for å forberede primære celler fra voksen sebrafisk hjernen.

Abstract

Sebrafisk embryoer er gjennomsiktig og utvikle raskt utenfor mor, dermed gir for utmerket i vivo avbilding av dynamisk biologiske prosesser i en intakt og utvikle virveldyr. Men er detaljert avbilding av morphologies av forskjellige celletyper og subcellular strukturer begrenset i hele mounts. Derfor etablert vi en effektiv og enkel å bruke protokoll til kultur lever primære celler fra sebrafisk embryoer og voksen vev.

I korthet, er 2 dpf sebrafisk embryoer dechorionated, deyolked, sterilisert og avstand til enkeltceller med collagenase. Etter filtrering trinn, er primær celler belagt på glass bunn retter og dyrket i flere dager. Frisk kulturer, som lang sikt differenciated seg, kan brukes for høy oppløsning AC confocal imaging studier. Kulturen inneholder ulike celletyper, med striated myocytter og neurons blir fremtredende på poly-L-lysine belegg. Spesielt etiketten subcellular strukturer av fluorescerende markør proteiner etablert vi også en electroporation protokoll som tillater transfection av plasmider DNA i ulike celletyper, inkludert nerveceller. Således, i nærvær av operatør definerte stimuli, komplekse celle atferd og intracellulær dynamikken i primære sebrafisk celler kan vurderes med høy romlig og tidsmessige oppløsning. I tillegg bruker voksen sebrafisk hjernen, viser vi at teknikken beskrevet dissosiasjon, i tillegg til de grunnleggende culturing forholdene, også arbeide for voksen sebrafisk vev.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio, D. rerio) er en populær modell virveldyr for mange felt av grunnleggende og biomedisinsk forskning1. Sebrafisk embryo utvikle raskt ex utero, gjennomsiktig og passe under et mikroskop, noe som gir gode forutsetninger for å studere virveldyrenes utvikling i en levende organisme. På grunn av genetisk tractability sebrafisk2, har mange stabil transgene reporter linjer med celle type-spesifikk uttrykk for ulike fluorescerende etablert tillater for observasjon av bestemt celle populasjoner. Sebrafisk samfunnet tilbyr et bredt spekter av såkalte Gal4-driver linjer som bærer en transgene uttrykke den syntetiske Kal4TA4 (eller KalTA3 tilsvarende GalFF) genet med Gal4-DNA-bindende domene gjær del viral transcriptional aktivisering domener kontrollert av celle type-spesifikk enhancers. Disse driveren linjene er krysset effektor linjene som bærer effekter av transgener som består av en definert oppstrøms aktivering sekvens (UAS) smeltet til et reporter gen. Kal4TA4 protein binder UAS-elementet, og dermed aktivere celle type-selektiv uttrykk for reporter genet3,4. Denne tilnærmingen gir svært variert kombinasjon studier av nesten alle tilgjengelige enhancer og reporter elementer i dobbel-transgene dyr.

Men er grundig live bildebehandling med fokus på enkeltceller eller subcellular innhold begrenset i en hel og stadig skiftende embryo. For å håndtere bestemt celle biologiske spørsmål med høyeste oppløsningen, er bruk av cellekulturer ofte å foretrekke. Noen linjer av sebrafisk finnes, men de anses som svært valgte5,6,7 og deres forplantning er ofte tidkrevende. Videre er alle tilgjengelige celle linjene fibroblast stammer, begrense eksperimenter ved hjelp av cellekultur til én type celler. Derfor opprettet vi både en effektiv og enkel å bruke protokoll for å forberede primære celler direkte fra sebrafisk embryoer og voksen sebrafisk hjernen, sammen med tilnærminger til å øke levetiden til kultur og å utvide mangfoldet av dyrket celletyper. I tillegg presenterer vi en prosedyre for å transfect embryonale primære celler med uttrykket konstruksjoner for fluorescerende organelle markører. Dermed kan mobilnettet morphologies og subcellular strukturer analyseres med høy romlig og tidsmessige oppløsning i forskjellige celletyper som beholde sine viktige funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeidet er beskrevet her er juridiske bestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedlikehold og håndtering av fisk er godkjent av lokale myndigheter og dyrevelferd representant Braunschweig University of Technology og lavere Niedersachsen State Office of Consumer Protection og matvaresikkerhet (LAVES, Oldenburg, Tyskland; AZ. §4 (02.05) TSchB TU BS).

1. forberedelse av primære celler fra sebrafisk embryo

  1. Utarbeidelse av 2 dager legge befruktning (dpf) sebrafisk embryo
    1. Dag 1: Definere flere kryssinger av sebrafisk belastningen valgfrihet og i henhold til spesifikasjonene for sebrafisk anlegget manager8.
    2. Dag 2: Mate fisken og samle egg8 rett etter gyting i en 10 cm Petriskål (plast). Fjerne død eller forurenset egg med en Pasteur pipette (plast). Vask egg 1 x med Danieau 30% (5,8 mM natriumklorid, 0,07 mM kalium klorid, 0.04 mM Magnesiumsulfat, nitrat 0,06 mM, 5 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre, pH 7.2)8 med 0,0001% (w/v) methylene blåfarge. Utveksle mellomlang til Danieau 30% uten methylene blåfarge, siden methylene blåfarge kan forårsake autofluorescence, og ruge egg over natten på 28 ° C.
      Merk: Start med minst 100 egg per fisk linje for å få en tilstrekkelig mengde celler. Raise mer enn 150 embryo i en Petriskål.
    3. Dag 3: Fjerne død eller forurenset embryoer og utveksle mellomlang til Danieau 30%. Bestemme hvor mange embryoer ved å telle. Inkuber embryo over natten på 28 ° C.
      Merk: Når du bruker en transgene linje uttrykke fluorescerende reporter, screening ved 1 dpf eller 2 dpf kan være nødvendig.
      Merk: For større mengder embryo, det anbefales å ta et svart-hvitt bilde av respektive Petriskål (figur 1A) og kvantifisere hvor mange embryoer med en programvare.
    4. Dag 4: Embryoer er nå 2 dpf. Fjerne chorions, legge til 1 mL pronase med en konsentrasjon av 1 mg/mL 10 mL av Danieau 30%8 og ruge embryoer på en shaker ved romtemperatur før alle chorions er koblet (20-40 minutter avhengig av omgivelsestemperaturen). Vask med Danieau 30% å fjerne både pronase og chorions og holde embryo ved romtemperatur før videre bruk.
  2. Gjenbrukbare poly-L-lysine tonet glass bunn rettene
    Merk: Kommersielt tilgjengelig glass bunn retter er designet for enkelt-bruk og er dyre. Følgende fremgangsmåte beskriver hvordan du klargjør gjenbrukbare Self-Made glass bunn retter fra standard lab materialer.
    1. Bore et hull med en diameter på 10 mm i bunnen av standard celle kultur retter (diameter 6 cm, plast) (figur 1B). Vask parabol bunner grundig med vann å fjerne boring støv.
    2. Spre silisium fett rundt hullet på undersiden av parabolen bunnen og knytte en dekkglassvæske med fett som lim. Kontroller at fett tetter gapet mellom fat bunnen og dekkglassvæske.
      Merk: Kontroller at tykkelsen på den brukte coverslips er riktig for den senere bildebehandlingsprogrammet.
    3. Vaske Self-Made glass bunn grundig, men nøye, med kaldt vann og såpe. Skyll glass bunn retter tre ganger med deionisert vann for å fjerne såpe. Air-Dry rett lokk og parabol bunner og lagre dem i en ren til videre bruk.
    4. På dagen for kultur forberedelse (dag 4, se 1.1.4): fukt på innsiden av begge rett lokk og parabol bottoms med 70% (v/v) etanol. Plasser rett lokk og parabol bunner mot innsiden i et sterilt arbeidsbenk med laminær strømning og UV-lys. Air-Dry til etanol er fordampet, deretter bruke UV-lys for 20 min. Etter denne behandlingen, er retter samlet og betraktet som sterilt.
    5. Belegg, Pipetter 200 µL av poly-L-lysine (0,1 mg/mL) i hver glass bunnen rett og spre væske på dekkglassvæske ved å bryte overflatespenning med Pipetter tips. La tørke i 60 minutter, og deretter vaske 1 x sterilt 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Fjern væsken. Holde retter under benken til videre bruk.
      Merk: Andre malinger kan testes avhengig av målet for eksperimentet. Vi fant poly-L-lysine tilstrekkelig til å støtte veksten av neurons, mens behandlet plast uten noen ekstra belegg syntes å være gunstig for veksten av fibroblast-lignende celler (figur 1E, F).
      Merk: Self-made glass bunn retter kan brukes mange ganger. For utveksling av dekkglassvæske, vask med varmt vann fra springen, forsiktig koble dekkglassvæske og fjerne gjenværende fett med 70% (v/v) etanol og såpe.
  3. Forberedelse og plating primære celler
    1. På dagen for kultur forberedelse (dag 4, se 1.1.4): overføre embryo i et sterilt celle kultur parabol (diameter 6 cm) ved hjelp av en frisk plast Pasteur pipette. Fjern væsken trinnvis til alle embryoer er samlet i en stor dråpe med en diameter på ca 2 cm eller mindre.
    2. Plasser rett med embryo i den sterile arbeidsbenk og legge CO2-uavhengig medium (med 10% (v/v) filtrert bovin serum, 1 x glutamin og 1,2% (v/v) 10,000 U Penicillin-Streptomycin; medium med alle kosttilskudd er i følgende kalt "celle kultur medium") til parabolen er halv fylt.
      Merk: Alternativer til CO2-uavhengig medium kan testes avhengig av målet for eksperimentet, som for eksempel neurobasal medium DMEM medium eller Leibovitz's L-15 medium. CO2-uavhengig medium og Leibovitz's L-15 medium har fordelen av ikke krever en CO2 inkubator.
    3. Hvis du vil fjerne eggeplomme, Pipetter embryo opp og ned ved hjelp av en 200 µL-pipette tips. Vellykket deyolking kan bli gjenkjent av er clouding av mediet.
    4. Fylle en celle kultur parabol med 70% (v/v) etanol og en annen celle kultur parabol med fersk celle kultur medium. Bruke et cut-off 1000 µL-pipette tips overføre embryo i et sterilt celle sil med håndtak (40 µm; Figur 1 c). Ta silen håndtaket og dyppe den i retten med etanol slik at alle embryoer senkes 5 s. umiddelbart etterpå dukke silen med embryo i parabolen med fersk celle kultur medium.
      Merk: Cellen siler kan brukes på nytt flere ganger. Ren med en myk børste under rennende vann fra springen, lagre dem i 70% etanol, og tørr og UV-treat dem under sterilt arbeidet benk direkte før bruk (se også 1.2.4).
    5. Overføre embryo til bakteriefri 1.5 mL reaksjon rør (ca 100 embryo i en tube). Legg collagenase (Type 2) fortynnet i celle kultur medium til en siste konsentrasjon av 4 mg/mL i et totalt volum på 1 mL. Inkuber rør med embryoer på et vertikalt rør rotator med 30 omdreininger per min for 45 min ved romtemperatur.
    6. Distansere gjenværende celle klumper av pipettering embryo-collagenase blanding opp og ned med 1000 µL-pipette tips. Deretter Filtrer celle suspensjon gjennom en steril celle sil med venting spor (40 µm; Figur 1 d) i en 50 mL konisk rør. Skyll silen med ca 10 mL frisk celle kultur medium.
    7. Pellets celler med sentrifugering for 3 min 180 x g. Pellet kan være nesten usynlig. Nøye fjerne nedbryting og resuspend cellene i 200 µL frisk celle kultur medium per 30 opprinnelig brukes embryoer.
      Merk: For å få en synlig pellet, anbefales det å starte med minst 100 embryoer.
    8. Pipetter 200 µL av cellen suspensjon fikk i trinn 1.3.7 direkte på glass området et Self-Made poly-L-lysin-belagt glass bunnen rett (se 1.2). Inkuber for 60 min ved romtemperatur under den sterile arbeidsbenk. Legge til 6 mL av fersk celle kultur medium og ruge primære cellene på 28 ° C.
    9. Utføre ønsket tenkelig program bruker en invertert mikroskopet på 28 ° C. Utveksle celle kultur medium daglig. Kulturer kan brukes til bildebehandling i flere dager etter plating (dap).

Figure 1
Figur 1: primær cellekultur av sebrafisk embryo. (A) svart/hvitt bilde 1 dap embryoer, som kan behandles av en Programvareverktøyet å analysere hvor mange embryoer. (B) celle kultur retter (diameter 6 cm) med et boret hull (diameter 10 mm) brukes til å forberede gjenbrukbare Self-Made glass bunn retter. (C) cellen siler (40 µm) med et enkelt håndtak brukes som "landing nett" å dyppe deyolked embryo i etanol og overføre dem raskt til frisk celle kultur medium. (D) cellen siler (40 µm) med venting spor brukes til å filtrere celler etter collagenase-mediert dissosiasjon. (E) etter 5 dap, primær celler seeded på glass belagt med poly-L-lysine primært danne neurons med uttales utvidelser. Skala bar = 100 µm. (F) etter 5 dap på behandlet plast uten malematerialer, fibroblast-lignende celler overgrow kulturen. Skala bar = 100 µm. (E) og (F) ble kjøpt opp av en epifluorescent mikroskop. (G) overførte lys bilde av primære celler avledet fra vill type sebrafisk 1 dap. Striated myocytter og klynger av neurons utvide tynn prosesser kan lett observeres. Skala bar = 50 µm. (H) kulturperler celler av transgene linjen vs (ptf1a: eGFP) jh1, som uttrykker eGFP i neuronal progenitors av hovedsakelig GABAergic nerveceller i hindbrain og en del av netthinnens celle populasjoner29, 30 , 31. skala bar = 50 µm. (G) og (H) ble kjøpt opp av en AC confocal laserskanning mikroskop med glass bunn rettene som illustrert i (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. hva primær celler med plasmider DNA

  1. Resuspend filtrert og pelleted celler innhentet i trinn 1.3.7 i 1 x PBS i stedet for celle kultur medium. Flekk en aliquot av cellen suspensjon med Trypan blå til å fastslå hvor celle i en telling kammer9.
  2. Bland 0,5 millioner celler med 10 µg ultra ren plasmider DNA i et 1,5 mL reaksjon rør og justere det totale volumet til 100 µL med 1 x PBS.
    Merk: For våre eksperimenter, vi hovedsakelig brukes uttrykket konstruksjoner basert på plasmider pCS2 +10. Uttrykk for åpent lesing rammer klonet på flere kloning området av pCS2 + drives av allestedsnærværende arrangøren av den menneskelige cytomegalovirus (CMV promoter). Andre uttrykk konstruksjoner og arrangørene kan testes (se også representant resultater og figur 2 og Figur 3).
  3. Overføring celle-DNA blanding umiddelbart til en electroporation cuvette (0,4 cm), plasser cuvette i en electroporation enhet og electroporate med følgende innstillinger: engangs puls, eksponensiell decay, 280 V, 950 µF.
  4. Direkte etter electroporation, overføre celle-DNA blandingen i en 1,5 mL reaksjon rør med 300 µL av fersk celle kultur medium.
  5. Plate 200 µL av cellen suspensjon som beskrevet i 1.3.8 og fortsett som beskrevet i 1.3.9 avhengig av den brukte uttrykk konstruksjonen, uttrykk for fluorescerende proteiner kan være synlig etter noen timer eller neste dag.

3. farging av fast primære celler

Merk: Subcellular strukturer kan også visualiseres klassiske immunostaining stedet for å bruke fluorescerende fusion protein journalister. Sebrafisk primære celler bruker vi følgende standard protokoll eksemplarisk flekken kjernen, F-utgangen og acetylated tubulin med fluorescerende indikatorer.

  1. Plate celler på poly-L-lysine belagt cover slips plassert i en celle kultur parabol eller multiwell plate som beskrevet ovenfor (se 1.3.8).
  2. For feste, fjerne mediet og dekke cellene med 4% paraformaldehyde i 1 x PBS. Inkuber celler for 10 min på 4 ° C i en shaker. Vask cellene 3 x i 5 min hver med 1 x PBS ved romtemperatur. Kontroller at 1 x PBS dekker cellene helt og vask denne fremgangsmåten på en shaker.
  3. Blokkere og å permeabilize fast cellene, dekke cellene med 1 x PBS inneholder 5% skummet melk og 0,3% Triton X-100. Plass celler for 10 min ved romtemperatur i en shaker. Vask celler som beskrevet i 3.2.
  4. Hvis etiketten acetylated tubulin, en markør for axons11, fortynne den primære antistoff 1:2,000 i 1 x PBS med 1% skummet melk. Dekker cellene med denne løsningen og ruge dem over natten ved 4 ° C i en shaker. Neste dag, vaskes celler som beskrevet i 3.2.
  5. Fortynne sekundære antistoffer konjugert med grønne fluorochrom fluorescein isothiocyanate (FITC) 1: 100 i 1 x PBS med 1% skummet melk og Inkuber cellene med denne løsningen 1t ved romtemperatur i mørket (dekke av parabolen f.eks med en boks eller aluminiumsfolie) på en shaker. Vask celler som beskrevet i 3.2.
  6. Til samtidig stain begrepsordbok cytoskjelett og kjerner, ruge cellene i 1 x PBS med Phalloidin12 bøyd med en rød fluorochrome (1:50) og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)13 (100 ng/mL) for 10 min på rommet temperaturen i mørket på en shaker. Vask celler som beskrevet i 3.2.
  7. For å forberede celler bildebehandling, sette en glass objektet operatør (microscope skyve) på en ren overflate og plasser på slipp av montering medium på den. Ta en cover slip med faste og farget celler av en rett ved hjelp av pinsett og sett den på miste med celler mot objektet transportøren. Kontroller at montering medium sprer seg over hele området av cover slip. La tørr i mørket.
  8. Butikken fast og montert celler i mørket på 4 ° C før ønsket tenkelig program er utført.

Figure 2
Figur 2: Transfection uttrykksformer konstruksjoner av electroporation. (A) Putative neuron transfekterte med PC-eGFP på 1 dap. (B) Striated myocyte (2 dap) uttrykker endoplasmatiske retikulum målrettede protein ss-RFP-KDEL. (C) to neurons i en neuronal klynge transfekterte med PC-MitoTag-YFP på 2 dap. (D)-cellen (2 dap) triple-transfekterte med PC-DCX-tdTomato, PC-MitoTag-YFP og PC-H2B-mseCFP. (E) pSK-UAS:mCherry electroporated i primære celler (1 dap) avledet fra dobbelt-transgene embryo bærer effekter av transgener vs (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 og vs (4xUAS:KGFPGI) hzm332 resulterer i GFP uttrykk neuronal progenitors av hindbrain. Skalere barer = 10 µm. (AE) ble kjøpt av en AC confocal mikroskopi bruker glass bunn rettene som illustrert i figur 1Bfor laserskanning. (F) fluorescerende farging av fast sebrafisk primære neurons på 5 dap. Blå: DAPI (kjernen); Rød: Phalloidin (F-utgangen); Grønn: Acetylated tubulin (nevroner). Skala bar = 10 µm. (G) Nevron som cellen transfekterte med PC-mClover. 2 dap, ingen utvidelse er synlig. På 5 dap, en neurite-lignende struktur har dannet. Skala bar = 25 µm. (H) Nevron fra samme forberedelse som cellen i (F), omgitt av fibroblaster som celler. Skala bar = 10 µm. (jeg) Nevron avledet fra en transgene embryoet bærer transgene vs (XITubb: DsRed) zf14828 transfekterte med PC-mClover. Mellom 12 og 15 dap, neurites gjennomgår massiv degenerasjon. Skala bar = 100 µm. celler vises i (F-jeg) var frø på poly-L-lysine tonet glass (F, H) eller plast (G, jeg) dyrket i L-15 medium i nærvær av 10% filtrert bovin serum og neuronal supplement B-27 (fortynnes 1:50) og fotografert med en epifluorescent mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. forberedelse av primære celler fra voksen sebrafisk hjernen

  1. Hjernen utvinning
    1. Velg en voksen fisk minst 90 dager gammel. Hvis arbeider med en bestemt celle, velge en transgene linje der cellen-spesifikke fluorescerende reporter uttrykk vil tillate for å visualisere ønsket cellene.
    2. Legg fisken i et beaker fylt med 200 mL av bedøvende Tricaine8 (0,2%) i Danieau 30%. Vent til fisken stopper flytter. Fordype bedøvet fisken i et beaker fylt med 200 mL isen vann i 15 min å avlive den.
    3. Fylle en Petriskål (diameter 6 cm) med 70% (v/v) etanol. Hold fisken i halen med et par pinsett og dyppe den i etanol. Sikre fisken er helt under vann i etanol 5 s.
    4. Ekstra hjernen i henhold til protokollen Gupta og Mullins14 med følgende tilpasninger: Bruk bare autoklaveres eller sterilt-pakket og dissekere hodet i sterilt 1 x PBS.
    5. Direkte etter ekstraksjon, sette hjernen i en Petriskål (diameter 3 cm) fylt med sterilt 1 x PBS og flytte rett under en steril arbeidsbenk for cellekultur.
  2. Hjernen dissosiasjon og plating primære celler
    1. Plass to setter sterilt pinsett (autoklaveres), en steril Petriskål (diameter 6 cm) fylt med 70% (v/v) etanol, en steril Petriskål (diameter 10 cm) fylt med Leibovitz's L-15 medium med 10% (v/v) filtrert bovin serum, B-27 (1:50) og 1,2% (v / v) 10.000 U Penicillin-Streptomycin og en steril celle sil med håndtak (40 µm; Figur 1 c) under ren benken.
    2. Sted celle silen i Petriskål fylt med etanol og sikre væskenivået er minst 5 mm høyere enn bunnen av silen.
    3. Bruker det første settet med pinsett, overføre hjernen til silen allerede plassert i etanol og sikre det er fullstendig dekket av væsken. Etter 1 s, overføre silen med hjernen i Petriskål inneholder Leibovitz's L-15 medium med ovenfor beskrevet kosttilskudd.
    4. Bruker det andre settet med pinsett, beskrevet overføring hjernen til en bakteriefri 1.5 mL reaksjon rør fylt med 500 µL Leibovitz L-15 medium med ovenfor kosttilskudd. Legge til collagenase (Type 2) en siste konsentrasjon av 4 mg/mL i et totalt volum på 1 mL.
    5. Inkuber røret på et vertikalt rør rotator med 30 omdreininger per min for 35 min ved romtemperatur. Mekanisk distansere gjenværende vev klumper av pipettering opp og ned med et 1000 µL pipette tips for å hjelpe dissosiasjon prosessen.
    6. Stopp dissosiasjon når ingen synlige partikler i løsningen. Filtrere celle suspensjon gjennom en steril celle sil med venting spor (40 µm; Figur 1 d) i en 50 mL konisk rør. Skyll silen med ca 10 mL frisk celle kultur medium.
      Merk: Når enkeltcelle suspensjon er oppnådd, er ikke filtrering trinnet nødvendig i tilfelle av embryo dissosiasjon. Hjernen er en myk vev det er slik flere liggende å bli homogent atskilt i én celle suspensjon.
    7. Pellets celler med sentrifugering i 5 min på 180 x g og resuspend celle pellet i 1 mL av fersk Leibovitz L-15 medium med ovenfor beskrevet kosttilskudd.
    8. Pipetter 500 µL av cellen suspensjon (50% fått cellene) på en Self-Made poly-L-lysine tonet glass bunnen rett (se 1.2) eller i en godt av en 24-vel plate. Gjør ved mindre flater (dvs. 125 µL løsning for et godt av en 96-brønns plate). Inkuber for 60 min ved romtemperatur under den sterile arbeidsbenk. Deretter legge nødvendig volumet av frisk medium å fylle bestemte beholderen og ruge primære cellene på 28 ° C.
    9. Utføre ønsket tenkelig program bruker en invertert mikroskopet på 28 ° C. Kulturer kan brukes til bildebehandling i flere dager etter plating. Erstatte 50% av mediet på daglig basis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1G viser en overføres lett bilde av en typisk kultur avledet fra vill type embryo med striated myocytter og klynger av Nevron som cellene blir mest tallrike. For å identifisere visse celletyper lettere, en transgene linje med celle type-spesifikk uttrykk for et lysstoffrør protein kan brukes (figur 1 H).

Hva med en pCS2 +-basert plasmider11 koding forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP)15 i primære celler av vill type embryo resulterer i et sterkt fluorescerende signal på 1 dap (figur 2A). Ved transfecting pCS2 +-basert plasmider koding fluorescerende organelle markører som endoplasmatiske retikulum målrettede røde fluorescerende protein (ss-RFP-KDEL)16 eller mitokondrier målrettede gule fluorescerende protein (MitoTag-YFP)17, 18, subcellular strukturer kan visualiseres i stor detalj (figur 2B, C). Co transfection av opptil tre plasmider tillater samtidig analyse av den subcellular lokaliseringen av flere fluorescerende fusion proteiner i samme celle19 som MitoTag-YFP sammen med microtubule markøren menneskelig Doublecortin (DCX) 20 smeltet røde fluorescerende protein tdTomato21 og kjernefysiske markør histone H2B smeltet en cyan fluorescerende protein (H2B-mseCFP)22,23 (figur 2D). Subcellular strukturer kan også bli avbildet med høy timelige og romlig oppløsning, som for eksempel bevegelse av blemmer positivt for membran markør vesicle-assosiert membran protein 1 (VAMP1) del fluorescerende protein mCitrine24 , 25 (Figur 3). Morfologiske endringer over tid kan lett observeres ved merking hele cellen av uttrykket av en lys fluorescerende protein som mClover26 (figur 2 gjeg). Men vellykket transfection av en plasmider basert på pBluescriptSK-ryggraden koding den røde fluorescerende protein mCherry27 smeltet sammen til et UAS element til primære celler avledet fra dobbelt-transgene embryo bærer både en Gal4 driver konstruere og en UAS effektor konstruere viser at electroporation protokollen er også egnet for kombinasjon genetikk (figur 2E). Videre kan fast primære celler være lett farget med immunofluorescence og organelle-spesifikke fluorescerende fargestoffer (figur 2F, H).

Figure 3
Figur 3: tid forfalle avbildning av subcellular strukturer. Wild type-cellen (1 dap) transfekterte med PC-VAMP1-mCitrine. Valgt rammene av en tid lapse innspillingen (1 rammen ble tatt hver 1.68 s) vises. Pilespisser og spor i ifølge farger markere subcellular dynamikken i tre distinkte VAMP1-positive blemmer. Skala bar = 10 µm. Tidsforløp ble spilt inn med en AC confocal laserskanning mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dissosiasjon teknikken og grunnleggende kultur forhold kan også brukes på vev av voksen sebrafisk. Her testet vi voksen hjernevevet fra vill type sebrafisk. Figur 4A D viser progressiv utvikling av en opprinnelig rusk-belagt kultur til en kompleks neuronal-lignende nettverk. Ved hjelp av voksen hjernen fra en transgene fisk bærer transgene vs (XITubb: DsRed) zf14828fullt differensiert DsRed-uttrykke neurons kan undersøkes i nærheten detalj (figur 4E).

Figure 4
Figur 4: primær cellekultur av voksen sebrafisk hjernen. Lyse feltet bilder av primære celler avledet fra voksen sebrafisk hjernen på (A) 1 dap, (B) 3 dap, (C) 5 dap og (D) 8 dap. Fra 1 til 3 dap, døde celler og vev rusk forsvinner mens enkelt eller gruppert neuronal celler blir mer tydelige. 3 dap, neuronal celler begynner å danne den første kort neurites. 5 dap videre, er det mulig å observere dannelsen av et nettverk med hundrevis av godt langstrakte neurites. Skalere barer = 50 µm. celler ble kultivert i en poly-L-lysin-belagt 96-brønns plate. (E) kulturperler cellene på 7 dap fra voksen hjernen til transgene fisk uttrykke transgene vs (XITubb: DsRed) zf148. DsRed uttrykkes i differensiert neurons28. Skala bar = 100 µm. celler ble kultivert i en poly-L-lysin-belagt 24-vel plate. Alle bilder ble kjøpt opp av en epifluorescent mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi to forskjellige protokoller kultur primære celler fra 2 dpf sebrafisk embryo eller voksen sebrafisk hjernen.

Utarbeidelse av primært cellekulturer fra 2 dpf sebrafisk er relativt lett å utføre for noen med erfaring i grunnleggende celle kultur teknikker. Men for å oppnå god og reproduserbar resultat, et tilstrekkelig antall embryo som starter materiale er avgjørende (100 er minimum). Under hevingen av embryoene, må alle mulige kilder til forurensning unngås for å holde mengden bakterier og parasitter så lavt som mulig. Viktigste er inkubasjonstiden for embryoene i etanol-dette trinnet må være lang nok til å sikre grundig sterilisering, men ikke så lang heller siden etanol er en organisk løsemiddel som kan skade celler og vev.

Tidspunktet er også viktig i enzymatisk dissosiasjon hjernevev eller 2 dpf sebrafisk embryoer. Inkubasjon tiden skal ikke overskrides og enzym som inneholder mediet skal fjernes raskt når komplett dissosiasjon enkeltcelle scenen er oppnådd. Likevel Type 2 collagenase skade ikke cellemembranen, og det er ikke så sterkt hemmet av FBS, som trypsin33. Takket være disse egenskapene var vi kjøpedyktig utføre dissosiasjon i nærvær av FBS som et viktig supplement støtter cellen levedyktighet og redusere celleskader, som resulterer i høyere avkastning og levedyktigheten til delikate celletyper.

Som vist ved vår representant resultater, kan forskjellige celletyper være enten identifisert ved morfologi eller uttrykk for celle type-spesifikk effekter av transgener koding for fluorescerende journalister. Sistnevnte er svært praktisk når du utfører levende celle imaging bestemt celle populasjoner19. Men anbefaler vi for å kontrollere uttrykksmønster av de respektive enhancer i 2 dpf embryoer av fluorescens mikroskopi å sikre konsekvent resultater.

For å tillate effekten av subcellular strukturer i embryonale sebrafisk primære celler, etablerte vi en electroporation protokollen for å transfect plasmider DNA koding for et utvalg av fluorescerende organelle markører. Celler transfekterte av denne metoden er relativt lav, men pålitelig og gir tilstrekkelig cellen tallene for levende celle imaging19. For en vellykket transfection er et viktig skritt riktig fastsettelse av antall celler i suspensjon. I gjennomsnitt 106 celler kan fås fra ca 90 2 dpf embryo, men nøyaktig cellen telle før electroporation er obligatorisk19. Men sammenlignet med vanlige pattedyr cellelinjer som Cos-7 eller jakten, primær celler fra 2 dpf sebrafisk embryo er svært forskjellige i størrelse, men ganske liten i gjennomsnitt (spesielt nevroner), som kan gjøre teller i en Neubauer kammer relativt vanskelig. Det samme gjelder for påfølgende tenkelig søknadene. Å tilfredsstillende visualisere subcellular strukturer i små sebrafisk cellene, er en avansert fluorescens mikroskop med høy oppløsning nødvendig, fortrinnsvis en AC confocal laserskanning mikroskop.

Utarbeidelse av primære celler fra voksen sebrafisk hjernen er mer avansert siden det krever opplæring i dissekere dyret og utdrager hjernen vev14. I tillegg må sterile forhold vedlikeholdes allerede utenfor sterilt workbench ikke forurense utdraget hjernen. Men de påfølgende trinnene om dissosiasjon og plating er sammenlignbare med første protokollen og kan brukes også på andre vev av voksne fisk som muskel eller leveren.

For begge protokollene er Hovedbegrensningen begrenset levedyktigheten til vanskelig å dyrke celletyper i kultur, som neurons. Etter 3 dap standard betingelser, er tetthet av embryonale sebrafisk primære celler sterkt redusert dermed begrense tidsrommet for imaging eksperimenter19. Mest fiboblast-lignende celler overleve i fravær av spesielt skreddersydd expedients.

For å forbedre overlevelse av kulturen i sin kompleksitet celletyper, testet vi Leibovitz's L-15 medium. Videre supplert vi med Nevron-fremme additiv B-27 for neuronal bestemt kultur. Neuronal celler har blitt observert å skille i cellekultur og overleve i flere dager når avledet fra hele embryo (figur 2F-jeg) samt fra voksen hjernen (figur 4E). I tillegg forbedrer plating av primære celler på høye tettheter (f.eks 0,25 x 106 celler per 100 mm2) cellen levedyktighet i motsetning til lav tetthet (G. Russo, foreløpige resultater).

Ved bruk av bestemte kultur medier og kosttilskudd rapporterte vi hvordan bruk av ulike underlag har en direkte innvirkning på rekke celletyper som utgjør den endelige kulturen og kan brukes som selektiv parameter til å fremme veksten av et delsett av cellen typer. Vev kultur-behandlet plast sammenlignet med poly-L-lysine belegg synes å sterkt lette fibroblast-lignende celleadhesjon og spredning (figur 1E, F). Samtidig, de mange celletyper som støtter celler og spesifikke adhesjon molekyler (som nevroner) ikke riktig holder seg, vokser, eller skille på behandlet plast, men foretrekker bestemte lim støtte. Vi anbefaler derfor, når det ikke er ment å få til en fibroblast - eller epithelial som kultur33, for å bruke poly-L-lysine eller andre celle-spesifikke underlag belegg celle kultur retter.

Vi anser våre Protokoll utgangspunkt for bruk med primært cellekulturer som et supplement til sebrafisk i vivo studier som kan bli ytterligere utviklet og tilpasset dyrking av spesifikke celletyper og brukt til mange diversifisert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde og S.-M. Tokarski for utmerket dyr omsorg og kundestøtte. Vi er takknemlige for alle medlemmer av Köster lab for intens og nyttig diskusjoner. Vi erkjenner takknemlig støtte av Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) og Federal delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fish lines
AB (wild-type) established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC)
Tg(ptf1a:eGFP)jh1 stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007)
Tg(XITubb:DsRed)zf148 stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed  (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008)
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
centrifuge Eppendorf model 5804 R
ChemiDoc MP imaging system BioRad model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos
confocal laser scanning microscope Leica microsystems model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective
epifluorescent microscope Leica microsystems model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective
Gene Pulser Xcell with capacitance extender BioRad 1652661 electroporation device
Horizontal shaker GFL model 3011
incubator for cell culture (28 °C) Memmert model incubator I
incubator for embryos (28 °C) Heraeus type B6120
light microscope Zeiss model TELAVAL 31
micro pipettes Gilson
sterile work bench Bio Base with laminar flow and UV light
tweezers Dumont Style 5, Inox
vertical tube rotator Labinco B.V. model LD-79
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Lab Software BioRad for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad
ImageJ National Institutes of Health used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).
LAS X Leica Microsystems for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pCS-DCX-tdTomato Köster Lab # 1599 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-eGFP Köster Lab # 7 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-H2B-mseCFP Köster Lab # 2379 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-mClover Köster Lab # 3865 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-MitoTag-YFP Köster Lab # 2199 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-ss-RFP-KDEL Köster Lab # 4330 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pCS-VAMP1-mCitrine Köster Lab # 2291 based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)
pSK-UAS:mCherry Köster Lab # 1062 based on the pBluescript-backbone of Stratagene
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request.
Name Company Catalog Number Comments
Plastic and glass ware
BD Falcon Cell Strainer (40 µm) FALCON REF 352340 distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium
1.5 mL reaction tubes Sarstedt 72690550
24-well plate Sarstedt 83.3922
50 mL falconic tube Sarstedt 62.547.004
96-well plate Sarstedt 83.3924.005
EasyStrainer (40 µm) Greiner Bio-One 542 040 with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation
electroporation cuvette (0.4 cm) Kisker 4905022
glass coverslips Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1051201
Microscope slides Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) 631-0845
Neubauer chamber Henneberg-Sander GmbH 9020-01
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) A. Hartenstein PP05
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) Sarstedt 821473 for zebrafish embryos
pipette tips Sarstedt Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) TPP Techno Plastic Products AG 93040
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) Sarstedt 72690550
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) Sarstedt 83.3902 for brain dissection
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and Reagents
sodium chloride Roth 0601.1
4 % paraformaldehyde in 1x PBS Sigma-Aldrich 16005
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
calcium nitrate tetrahydrate Sigma-Aldrich C1396
ethanol p.a. 100% Sigma-Aldrich 46139
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated Thermo Fisher Scientific 31547
HEPES Roth 9105.4
high vacuum grease DOW CORNING 3826-50 silicon grease used for self-made glass bottom dishes
magnesium sulfate heptahydrate Merck 105886
methylene blue Serva 29198.01
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody Sigma-Aldrich T6793
Aqua-Poly/Mount (mounting medium) Polyscience 18606
poly-L-lysine Biochrom L 7240
potasssion chloride Merck 104938
Skim milk Roth 68514-61-4
Texas Red-X Phalloidin Thermo Fisher Scientific T7471
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate
Triton X-100 BioRad 1610407
Trypan Blue Gibco by Life Technologies 15250061
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
collagenase (Type 2) Thermo Fisher Scientific 17101015 dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C
pronase (from Streptomyces griseus) Roche 11459643001 distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C
Name Company Catalog Number Comments
Medium and solutions for cell culture
1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco by Life Technologies 14190-169 distributed by Thermo Fisher Scientific
CO2-independent medium Gibco by Life Technologies 18045054 distributed by Thermo Fisher Scientific
filtrated bovine serum (FBS) PAN-Biotech individual batch
glutamine 100x Gibco by Life Technologies 25030081 distributed by Thermo Fisher Scientific
Leibovitz's L-15 medium Gibco by Life Technologies 11415049 distributed by Thermo Fisher Scientific
PenStrep (10,000 U/mL) Gibco by Life Technologies 15140148 distributed by Thermo Fisher Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
  2. Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
  3. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
  4. Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).
  5. Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).
  6. Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
  7. Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  8. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).
  9. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
  10. Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
  11. Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
  12. Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
  13. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
  14. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
  15. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  16. Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
  17. Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
  18. Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
  19. Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).
  20. Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
  21. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
  22. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
  23. Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
  24. Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
  25. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  26. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
  28. Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
  29. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
  30. Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
  31. Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
  32. Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
  33. Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 138 sebrafisk Danio rerio primær cellekultur electroporation hva levende celle imaging organelle dynamics
Kultur og Transfection sebrafisk primære celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Russo, G., Lehne, F., Pose… More

Russo, G., Lehne, F., Pose Méndez, S. M., Dübel, S., Köster, R. W., Sassen, W. A. Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells. J. Vis. Exp. (138), e57872, doi:10.3791/57872 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter